इस लेख में, हम एक्सॉन लंघन के बाद डिस्ट्रोफिन एमआरएनए और प्रोटीन के स्तर की बहाली का मूल्यांकन करने के लिए MYOD1-परिवर्तितमूत्र-व्युत्पन्न कोशिकाओं का उपयोग करके ड्यूचेर्न मस्कुलर डिस्ट्रॉफी मांसपेशियों के कुशल मॉडलिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
ड्यूचेर्न मस्कुलर डिस्ट्रॉफी (डीएमडी), एक प्रगतिशील और घातक मांसपेशियों की बीमारी, डीएमडी जीन में उत्परिवर्तन के कारण होती है जिसके परिणामस्वरूप डिस्ट्रोफिन प्रोटीन की अनुपस्थिति होती है। आज तक, हमने मॉर्फोलिनो ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के प्रणालीगत इंजेक्शन के आधार पर न्यूरोलॉजी और मनोरोग के राष्ट्रीय केंद्र में एक अन्वेषक-प्रारंभिक प्रथम-इन-ह्यूमन अध्ययन पूरा कर लिया है जो एक्सोन-53 लंघन से ग्रस्त हैं। डीएमडी के प्रभावी उपचार के लिए, डीएमडी रोगियों से प्राप्त मायोब्लास्ट के साथ इन विट्रो परीक्षण दवाओं को स्क्रीन करने और नैदानिक परीक्षण शुरू करने से पहले रोगी पात्रता का आकलन करना आवश्यक माना जाता है। हाल ही में, हमने डीएमडी के सेलुलर मॉडल के रूप में हिस्टोन मिथाइलट्रांसफरेन्से अवरोधक (3-deazaneplanocin A हाइड्रोक्लोराइड) के साथ इलाज किया गया एक नया MYOD1-परिवर्तितमूत्र-व्युत्पन्न सेल (यूडीसी) की सूचना दी। नए ऑटोलॉगस यूडीसी डीएमडी के रोग-विशिष्ट फेनोटाइप की फेनोकॉपी दिखा सकता है, जिससे मांसपेशियों से संबंधित विभिन्न बीमारियों में सटीक दवा का उपयोग हो सकता है। इस लेख में, हम एक्क्रोन लंघन के बाद डिस्ट्रोफिन एमआरएनए और प्रोटीन के स्तर की बहाली का मूल्यांकन करने के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिटेज़ पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर), वेस्टर्न ब्लॉटिंग और इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के साथ MYOD1-परिवर्तितयूडीसी का उपयोग करके डीएमडी मांसपेशी कोशिकाओं के कुशल मॉडलिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
ड्यूचेर्न मस्कुलर डिस्ट्रॉफी (डीएमडी), एक प्रगतिशील, घातक मांसपेशी रोग, डीएमडी जीन में फ्रेम-शिफ्ट म्यूटेशन के कारण होता है जिसके परिणामस्वरूप डिस्ट्रोफिन प्रोटीन1की अनुपस्थिति होती है। एंटीसेंस ओलिगोन्यूक्लियोटाइड आधारित एक्सोन लंघन चिकित्सा डीएमडी के लिए वादा करने के लिए सोचा है । यह थेरेपी डीएमडी रीडिंग फ्रेम2को बहाल करने के लिए प्री-एमआरएनए स्प्लिकिंग में फेरबदल करके गंभीर डीएमडी फेनोटाइप को मामूली बेकर मस्कुलर डिस्ट्रॉफी जैसी फेनोटाइप में बदलने पर आधारित है। हमने हाल ही में फॉस्फोरोडिडेट मॉर्फोलिनो ओलिगोमर (पीएमओ) विल्टोलरसेन के बार-बार नसों में प्रशासन के आधार पर एक पहला मानव अध्ययन पूरा किया है, जो डीएमडी में एक्सोन 53 लंघन को प्रेरित कर सकता है, और एक उत्कृष्ट सुरक्षा प्रोफ़ाइल, आशाजनक प्रभावकारिता, और स्वीकार्य फार्माकोकिनेटिक पैरामीटर (यूएमआईएन के रूप में पंजीकृत: 000010964 और ClinicalTrials.gov: एनसीटीएनसी020811111) का प्रदर्शन कियाहै।
हालांकि, रोग के लिए लागत प्रभावी और कुशल उपचार विकसित करने के लिए, डीएमडी रोगियों से प्राप्त प्राथमिक मांसपेशी कोशिकाओं का उपयोग करइन विट्रो परीक्षणनैदानिक परीक्षण शुरू करने से पहले दवा स्क्रीनिंग और रोगी पात्रता सत्यापन के लिए आवश्यक हैं, साथ ही बायोमार्कर जो मानव परीक्षणों के दौरान लंघन उपचार ों की प्रभावकारिता को दर्शाते हैं4। हाल ही में, हमने डीएमडी7के प्राथमिक मायोब्लास्ट मॉडल के रूप में रोगी-विशिष्ट MYOD1-परिवर्तितमूत्र-व्युत्पन्न कोशिकाओं (यूडीसी)5,,6 को विकसित करने के लिए एक उपन्यास तकनीक की सूचना दी। इस प्रकार, मायोब्लास्ट उत्पन्न करने के लिए, केवल रोगियों से मूत्र के संग्रह की आवश्यकता होती है और किसी आक्रामक प्रक्रिया की आवश्यकता नहीं होती है। इस लेख में, हम एक्पोन लंघन के बाद बहाल डिस्ट्रोफिन एमआरएनए और प्रोटीन का मूल्यांकन करने के लिए 3-deazaneplanocin एक हाइड्रोक्लोराइड के साथ इलाज MYOD1-परिवर्तितयूडीसी का उपयोग करDMD मांसपेशी के कुशल मॉडलिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
यहां, हम डीएमडी रोगियों से प्राप्त MYOD1-परिवर्तितयूडीसी में एक्सोन लंघन के विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। परख प्रणाली का उपयोग करते हुए, हमने इष्टतम एंटीसेंस दृश्यों की कुशलता से जांच की। हम मानते हैं कि MYOD1-परिवर्तितयूडीसी रोग के रोगविज्ञान की जांच के लिए उपयोगी हो सकता है।
एमआरएनए स्तर पर रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाओं का उपयोग करके लंघन करने वाले एक्सोन का मूल्यांकन नई दवाओं की स्क्रीनिंग और नैदानिक परीक्षण शुरू करने से पहले रोगी पात्रता का आकलन करने के लिए अपरिहार्य है । एक्सोन लंघन दक्षता की गणना केवल एमआरएनए स्तर पर मूल्यांकन किया जा सकता है।
प्रोटीन के स्तर पर लंघन एक्सोन का मूल्यांकन भी महत्वपूर्ण है क्योंकि डिस्ट्रोफिन बहाली एक किराए के बायोमार्कर के रूप में महत्वपूर्ण है एक्सॉन लंघन के लाभों की भविष्यवाणी करने के लिए । आज तक, एंटीसेंस ओलिगोन्यूक्लियोटाइड दृश्यों की स्क्रीनिंग अक्सर प्राथमिक मांसपेशी कोशिका रेखाओं का उपयोग करके की जाती है या मानव rhabdomyosarcoma (RD) कोशिकाओं सहित myoblast सेल लाइनों को अमर कर दिया जाता है, लेकिन हम मांसपेशियों की कोशिका रेखाओं या आरडी सेल लाइनों का उपयोग करके डिस्ट्रोफिन के स्तर की वसूली को माप नहीं सकते क्योंकि वे इस प्रोटीन को एंडोजेनेस से व्यक्त करते हैं। हम स्पष्ट रूप से डीएमडी रोगी-व्युत्पन्न MYOD1-UDCsमें डिस्ट्रोफिन की बहाली का पता लगा सकते हैं। हमारे नए परख में, हम मानते है कि पश्चिमी दाग द्वारा बहाल प्रोटीन का मूल्यांकन मात्रात्मकता में बेहतर है । दूसरी ओर, इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री द्वारा मूल्यांकन 96 अच्छी प्लेटों का उपयोग करके एक साथ कई उम्मीदवार यौगिकों की स्क्रीनिंग के लिए आदर्श है।
इस लेख में, हम एक कुशल मॉडलिंग DMD मांसपेशी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन MYOD1का उपयोग कर-आरटी-पीसीआर, पश्चिमी दाग के साथ UDCs परिवर्तित, और इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के साथ एकण लंघन के बाद mRNA और प्रोटीन के स्तर पर बहाल डिस्ट्रोफिन का मूल्यांकन करने के लिए । यूडीसी को गैर-आक्रामक रूप से और आसानी से एकत्र किया जा सकता है। इसलिए, हम मानते हैं कि मांसपेशियों के विकारों के प्रकार की परवाह किए बिना ब्रांड-न्यू इन विट्रो परख को बुनियादी और अनुवादअध्ययन की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को जापान सोसायटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस ग्रांट-इन-एड फॉर साइंटिफिक रिसर्च (सी) [ग्रांट नंबर 18के07544 से वाईए] का समर्थन किया गया था, तंत्रिका और मानसिक विकारों पर अनुसंधान के लिए अनुदान में सहायता [वाईए को अनुदान संख्या 28-6], और चिकित्सा अनुसंधान और विकास के लिए जापान एजेंसी [अनुदान नग 18ek0109239h0002, 18lm020303066h0001, और 18lm0203069h0001 को]
1% P/S Solution Stabilized | Thermo Fisher | 15070-063 | Cell culture |
Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942 | |
Anti-dystrophin | Abcam | ab15277 | Western blot (WB) |
Anti-dystrophin | Leica | NCL-DYS1 | Immunocytochemistry(ICC) |
Anti-mouse IgG, Dylight 488 | Vector Laboratories | DK-2488 | ICC |
Anti-α-tubulin | Sigma | T6199 | Western bot and ICC |
BZ-X800 | KEYENCE | BZ-800 | Fluorescent microscope |
CELLBANKER | ZENOAQ | CB011 | Cell stock in liquid nitrogen |
ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | 170-8280J1 | WB |
CloneAmp HiFi PCR premix | Clontech | 639298 | Retroviral production |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | Protein extraction for WB |
E.coli DH5 α Competent Cells | TAKARA | 9057 | |
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE healthcare | RPN2232 | WB |
EGF | Peprotech | AF-100-15 | Cell culture |
Endo-Porter | GeneTools | 2922498000 | ASO transfection |
Extra Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703965 | WB |
EzFastBlot HMW | Atto | AE-1460 | WB |
fibroblast growth factor-basic | Sigma-Aldrich | F0291 | Cell culture |
Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Cell culture |
GP2-293 packaging cells | Clontech | 631458 | Retroviral production |
Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | Cell culture |
High glucose DMEM with GlutaMAX-I | Thermo Fisher Scientific | 10569-010 | Cell culture |
High glucose DMEM without sodium pyruvate | GE Healthcare | SH30022.01 | Cell culture |
HiSpeed Plasmid Purification Kit | QIAGEN | 12643 | Retroviral production |
Histofine Simple Stain MAX PO | NICHIREI BIOSCIENCE INC. | 424151 | WB |
Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | ICC |
Human PDGF-AB | Peprotech | 100-00AB-10UG | Cell culture |
iBind Flex Solution | Thermo Fisher Scientific | SLF2020 | WB |
iBind Flex Western Device | Thermo Fisher Scientific | SLF2000 | WB (Automated mestern-processing device) |
Immobilon-P Transfer Membrane (PVDF) | MERCK | IPVH304F0 | WB |
In-Fusion HD cloning Kit | Clontech | 639648 | Retroviral production |
ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146 | Cell culture |
MILTEX HV 0.45 μm filter | MERCK | SLHV033RS | Retroviral production |
MultiNA | SHIMADZU | MCE-202 | Microchip electrophoresis |
MYOD1 (GFP-tagged) | ORIGENE | RG209108 | Retroviral production |
NanoDrop | Thermo Fisher | ND-ONE-W | Spectrophotometer |
Nonessential amino acids | Thermo Fisher | 11140-050 | Cell culture |
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Clontech | 740986.20 | PCR clean up |
NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels | Invitrogen | EA03785BOX | WB |
NuPAGE Antioxidant | Invitrogen | NP0005 | WB |
NuPAGE LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | WB |
NuPAGE Sample Reducing Agent | Invitrogen | NP0009 | WB |
NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Invitrogen | LA0041 | WB |
One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit | TAKARA | RR066A | Titer check of retroviral vector |
PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Cell culture |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | WB |
Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003 | Retroviral infection |
pRetroX-TetOne-Puro Vector | Clontech | 634307 | Retroviral vecor |
Puromycin | Clontech | 631305 | Cell culture |
QIAGEN OneStep RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | PCR |
REGM Bullet Kit | Lonza | CC-3190 | Material for growth medium of UDCs |
REGM SingleQuots | Lonza | CC-4127 | Material for primary medium of UDCs |
Retrovirus Titer Set | TAKARA | 6166 | Titer check of retroviral vector |
Retro-X Concentrator | Clontech | 631455 | Retroviral production |
RIPA buffer | Thermo Fisher Scientific | 89901 | WB |
RNeasy kit | Qiagen | 74104 | RNA extraction for PCR |
Tetracycline-free foetal bovine serum | Clontech | 631106 | Cell culture |
Triton-X | MP Biomedicals | 9002-93-1 | ICC |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | Cell culture |
XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | WB |
Xfect transfection reagent | Clontech | 631317 | Transfection of plasmids into packaging cells |