Summary
Här utvecklade vi en ny flerskiktad modifierad strategi för vätskeliknande bioinks (gelatinmetakryloyl med låg viskositet) för att förhindra sedimentering av inkapslade celler.
Abstract
Under den extruderingsbaserade tredimensionella bioprintingprocessen kan vätskeliknande bioinkar med låg viskositet skydda celler från membranskador som orsakas av skjuvstress och förbättra överlevnaden för de inkapslade cellerna. Den snabba gravitationsdrivna cellsedimenteringen i reservoaren kan dock leda till en inhomogen cellfördelning i biotryckta strukturer och därmed hindra tillämpningen av vätskeliknande bioinks. Här utvecklade vi en ny flerskiktad modifierad strategi för vätskeliknande bioinks (t.ex. gelatinmetakryloyl med låg viskositet) för att förhindra sedimentering av inkapslade celler. Flera flytande gränssnitt manipulerades i multilayered bioink att ge interfacial retention. Följaktligen var cell sedimentering åtgärder som går över intilliggande lager i flerskiktade systemet fördröjs i bioink reservoaren. det konstaterades att den interfacialretentionen var mycket högre än sedimental dragningskraften hos celler, vilket visar på en kritisk roll för den interfaciala retentionen när det gäller att förhindra cellsedimentation och främja en mer homogen spridning av celler i den flerskiktade bioinken.
Introduction
Tredimensionell (3D) bioprinting har varit en lovande metod för att tillverka komplexa arkitektoniska och funktionella kopior av inhemska vävnader i biofabricering och regenerativ medicin1,2,3. De gemensamma strategier för bioprinting, inklusive bläckstråleskrivare, extrudering och stereolitografi utskrift, har för-och nackdelar från olika perspektiv4. Bland dessa tekniker är extruderingsproceduren oftast används på grund av dess kostnadseffektivitet. Bioink spelar en nyckelroll i processen stabilitet extrudering bioprinting. Den idealiska cell-lastad bioink bör inte bara vara biokompatibel utan också vara lämplig för mekaniska egenskaper5. Bioinks med låg viskositet presenteras vanligtvis som ett flytande-liknande tillstånd. Dessa bioinks kan enkelt och snabbt deponeras och undvika cellmembranskador framkallas av hög skjuvning stress under extrudering. Men i komplexa fall som kräver långsiktiga tryckperioder, ger låg viskositet ofta upphov till den oundvikliga sedimenteringen av de inkapslade cellerna i bioinkbehållaren, som vanligtvis drivs av gravitationen och leder till en inhomogen cellspridning i bioink6,7. Följaktligen hämmar en bioink med inhomogen cell dispersitet in vitro bioprinting av en funktionell vävnad konstruktion.
Flera nyligen genomförda studier med fokus på bioinks har rapporterat främjande av homogen spridning av inkapslade celler. En modifierad alginatbioink baserad på dubbelstegstvärbindning användes för extrudering av bioprinting8. En alginatpolymer modifierades med peptider och proteiner i denna studie. Celler presenterade en mer homogen fördelning i denna modifierade alginat än i den vanliga alginat på grund av de tillbehör platser som tillhandahålls av peptiderna och proteinerna. Alternativt har blandade bioinks använts för att lösa sedimentering av celler i bioink. En blandad bioink som innehåller polyetylenglykol (PEG) och gelatin eller gelatinmetakryloyl (GelMA) med förbättrad mekanisk robusthet användes i en annan studie9. De inkapslade cellerna presenterade en homogen fördelning främst på grund av viskositeten hos den blandade bioink förbättrades. I allmänhet finns det flera faktorer som påverkar spridningen av de inkapslade cellerna i bioink, såsom viskositeten hos bioink, cellernas gravitation, cellernas densitet och arbetsperiodens varaktighet. Bland dessa faktorer spelar cellernas gravitation en avgörande roll för att främja sedimentering. Den flytkraft och friktion som den trögflytande bioink har undersökts som de viktigaste krafterna mot gravitationen hittills10.
Häri utvecklade vi en ny strategi för att främja homogen spridning av inkapslade celler i bioink genom att manipulera flera flytande gränssnitt i bioink reservoaren. Dessa flytande gränssnitt som skapats av flerskiktade modifiering av bioink kan inte bara ge interfacial retention, som fördröjer sedimentering av celler, men också upprätthålla en lämplig biokompatibilitet och reologiska beteende bioink. I praktiken modifierade vi vattenhaltig GelMA-lösning (5%, w/v) med silkefibroin (SF) på ett flerskiktat sätt för att längsgående producera fyra gränssnitt, vilket ger interfaciala spänningar i den blandade bioink. Som ett resultat, allvaret belastning på cellerna kompenserades av konstgjorda interfacial spänning, och en nästan homogen spridning av inkapslade celler i bioink erhölls på grund av mindre sedimentering över intilliggande lager av celler. Inget liknande protokoll för att bromsa sedimentering av inkapslade celler genom att manipulera interfacial retention i flytande bioinks har rapporterats hittills. Vi presenterar vårt protokoll här för att visa ett nytt sätt att lösa cellsedimentation i bioprinting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av cell-lastad SF-GelMA
- Sterilisera alla material med hjälp av 0,22 μm sprutfilterenheter. Utför alla steg i ett biologiskt säkerhetsskåp.
- Värm 1x PBS till 50 °C och lös upp gelatin i den uppvärmda 1x PBS med omrörning. Den slutliga koncentrationen av gelatin i PBS bör vara 10% (w/v).
- Tillsätt metakrylic anhydride i gelatinlösningen (viktförhållandet mellan metakrylicanhydrid till gelatin på 0,6 till 1) långsamt under omrörning och blanda komplexet i minst 1 h (50 °C). Typiskt, förbereda 200 ml 10% gelatinlösning med 12 g metakrylic anhydrid; volymen beror på studiens behov.
- Överför den blandade lösningen som innehåller gelatin och metakrylic anhydrid till ett 50 ml sterilt rör.
- Centrifugera den blandade lösningen vid 3 500 x g. Det tar vanligtvis 3-5 min för att få två lager. Samla det övre lagret (GelMA) och kasta det nedre lagret (oreagerad metakrylic anhydrid).
- Späd den övre lagerlösning som erhålls i steg 1.5 med två volymer av avjoniserat vatten (40−50 °C).
- Dialysera den lösning som erhålls i steg 1.6 med ett 12-14 kDa molekylvikt cutoff dialysmembran mot avjoniserat vatten i 5−7 dagar (40−50 °C). Byt vatten två gånger varje dag.
- Samla in och frys GelMA-lösningen vid −80 °C över natten.
- Lyofilisera GelMA-lösningen i 3−5 dagar i en frystork med temperaturen inställd på -45 °C och trycket inställt på 0,2 mbar.
- Lös upp den frystorkade GelMA (grad av substitution på cirka 75%) i 1x PBS innehållande 10% FBS (fetala bovin serum, v/ v), 25 mM HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-etan-sulfonic syra), och photoinitiator (0,5%, w /v) för att erhålla GelMA bioink preparatet.
OBS: Graden av substitution av GelMA kan beräknas med en ninhydrin analys3. - Blanda GelMA-lösningen (10%, w/v) med olika volymer av initial SF-lösning (5%, w/v) och olika volymer på 1x PBS för att erhålla SF-GelMA bioinks med olika koncentrationer av SF. Andelen per 1 ml GelMA- och SF-lösning i de olika bioinkerna presenteras i tabell 1.
OBS: Alla bioinks måste innehålla en slutlig koncentration av 5% (w /v) GelMA, men koncentrationen av SF varierar: 0,5, 0,75, 1,0, 1,25 och 1,5% (w /v) i de olika SF-GelMA bioinks. Använd SF-M-Layered-GelMA för att benämna GelMA bioink modifierad med SF på ett lager-för-lager-sätt. Använda SF-X-GelMA att benämna de GelMA ändrat med SF i ett homogent sätt (e.g., GelMA med ändring av 1% SF kallades SF-1-GelMA). - Sonicate alla bioinks för 10-20 min.
- Odla NIH3T3 celler med DMEM (Dulbecco modifierade Eagle medium) som innehåller 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin i en inkubator (37 °C med 5% CO2). Passage cellerna i ett förhållande av 1:3 när densiteten når 80%.
- Centrifugera suspensionen av NIH3T3-celler vid 1500 rpm i 5 min. Ta bort supernatanten med sug och resuspend cellpelleten med färsk bioinklösning i ett 15 ml sterilt rör.
OBS: Koncentrationen av de inkapslade cellerna i bioink bör vara 1 x 106 celler/ml, och koncentrationen måste beräknas med en cytometer. - Använd 2 ml olika SF-GelMA bioinks att avbryta cellpellets för att få olika cell-lastad bioinks.
2. Lastning, återupphettning och bioprintning av SF-M-Layered-GelMA
- Fyll 0,4 ml celllastad SF-0,5-GelMA i sprutans bottenskikt.
OBS: Använd en 2 ml-spruta som bioinkbehållare i denna studie. Lasta olika SF-GelMA bioinks i sprutan i ett lager-för-lager sätt. - Placera sprutan i isvattenbad (0 °C) i 5 min för att få bioflänsen i bottenskiktet att förvandlas till ett geltillstånd.
- Ladda 0,4 ml celllastad SF-0,75-GelMA bioink ovanför bottenskiktet.
- Placera sprutan med de två skikten av bioinks i ett isvattenbad (0 °C) i 5 min för att få de två skikten av bioinks att förvandlas till ett geltillstånd.
- Cykla lastnings- och kylningsstegen ytterligare 3 gånger med de återstående 3 typerna av bioinks (SF-1-GelMA, SF-1.25-GelMA, SF-1.5-GelMA) för att erhålla ett flerskiktat bioinksystem med olika koncentrationer av SF i de olika skikten. Den volym som används för lastning av alla bioinks bör vara 0,4 ml.
- Värm upp den flerskiktade bioinnen genom att placera sprutan i en inkubator (37 °C) i 30 min före biotryck.
- Använd en 2 ml-spruta som bioinkbehållare med ett 27 G-utskriftsmunstycke. Ställ in flödeshastigheten på 50 μL/min, munstyckets rörliga hastighet vid 2 mm/s och munstyckets höjd vid 1 mm. Utför biotrycksproceduren vid rumstemperatur (ca 20 °C).
- Skriv ut vävnadskonstruktionen på ett extruderingssätt med hjälp av en skräddarsydd bioskrivare under de parametrar som anpassats från våra tidigare studier11,12.
- Använd ultraviolett ljus (365 nm, 800 mW) för 40 s för att korsa den biotryckta vävnadskonstruktionen.
- Odla den tvärbundna vävnadskonstruktionen i DMEM (Dulbeccos modifierade Eagle medium) som innehåller 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin i en inkubator (37 °C med 5% CO2). Mediet ändrades var 8:e timme under de första 2 dagarna och därefter var 2-3 dagar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett schema för beredningen av celllastade bioinks visas i figur 1. Efter beredning av de olika bioinks, lastning, uppvärmning och bioprinting utfördes (figur 2). För att utvärdera fördelningen av de inkapslade cellerna i bioinkbehållaren utfördes ett bioprintingförfarande med tre olika celllastade bioinks i tre 96-brunnsplattor (figur 3A). Två kontrollgrupper (orörda GelMA och SF-1-GelMA bioinks) och den experimentella gruppen (SF-M-Layered-GelMA bioink) användes för att undersöka spridningen av de inkapslade cellerna (figur 3B). Sextio mikroliter av cell-lastad bioink var extruderad i varje brunn av de tre 96-väl plattor. Den totala volymen av de tre typerna av bioink var 2 ml, och som ett resultat var perioden för bioprinting mer än 30 min. Med den ytterligare inkubationen före tryckningen (30 min) var den totala arbetsperioden mer än 1 h och ansågs vara en lämplig tillverkningstid för bioprintning av stora vävnader och organ. Antalet celler i målbrunnarna, märkta i figur 3A,i de tre plattorna räknades. Antalet celler i olika brunnar kan återspegla spridningen av de inkapslade cellerna mellan de olika grupperna. Resultaten visade att när bioprinting förfarandet fortskred, minskade tätheten av celler i målbrunnarna i alla grupper. I SF-0-GelMA-gruppen deponerades cirka 70% av cellerna i det nedre lagret efter det totala förfarandet. I SF-1-GelMA-gruppen deponerades cirka 40% av cellerna i det nedre lagret, och cirka 5% av cellerna deponerades i det översta lagret. I SF-M-Layered-GelMA-gruppen var nedfallet av inkapslade celler mer homogent än kontrollgruppernas (figur 3C och 3D).
Figur 1: Schematisk för bioinkberedningen av SF-GelMA. SF-GelMA utarbetades genom att blanda silke fibroin (SF) och GelMA/photoinitiator (PI) komplex följt av ultraljud behandling för 10-20 min. Sedan, målet cellerna i SF-GelMA blandningen avbröts för att förbereda cellen lastad SF-GelMA bioink. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Inläsnings-, återuppvärmnings- och bioprintningsproceduren. Cellen lastad SF-GelMA, som bioink (aq), lastades in i bioink reservoaren och omvandlas till gel tillstånd från kylning förfarandet. Lastnings- och kylningsproceduren upprepades 5 gånger med bioinks (aq) med olika koncentrationer av SF (0,5, 0,75, 1,0, 1,25 och 1,5 %) för att erhålla SF-Multilayered-GelMA (SF-M-Layered-GelMA). Gel staten SF-M-Layered-GelMA värmdes upp genom att placera bioink i en inkubator i 30 min. Gel tillstånd bioink förvandlas till ett flytande tillstånd efter inkubation. Sedan användes den beredda biobehållaren för utskrift med en 2 ml spruta som bioinkbehållare med ett 27 G-utskriftsmunstycke. Den tryckta vävnadskonstruktionen var tvärbunden med hjälp av UV-ljus. Aq betyder vattenlösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Bioprinting-förfarandet använde tre olika celllastade bioinks. (A), Sextio mikroliter av bioink extruderades till motsvarande 96-brunnsplatta per minut, och det tog mer än 30 minuter att uppnå bioprintingförfarandet i 96-brunnsplattan. (B), Tre olika typer av bioinks användes för att undersöka spridningen av de inkapslade cellerna i bioprinting förfarandet: två kontrollgrupper (orörda GelMA och SF-1-GelMA bioinks) och experimentgruppen (SF-M-Layered-GelMA bioink). (C-D), Celltätheterna i nr 1, 5, 10, 15, 20, 25 och 30 brunnar i de tre plattorna upptäcktes med färgning, som visar fördelningen av inkapslade celler i de tre bioinks, och nedfallet av de inkapslade cellerna i SF-M-Layered-GelMA gruppen var mer homogen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Bioinks | Material (ml) | ||
| GelMA (gelma) | Sf | Pbs | |
| SF-0,5-GelMA | 0.5 | 0.1 | 0.4 |
| SF-0,75-GelMA | 0.5 | 0.15 | 0.35 |
| SF-1,0-GelMA | 0.5 | 0.2 | 0.3 |
| SF-1,25-GelMA | 0.5 | 0.25 | 0.25 |
| SF-1,5-GelMA | 0.5 | 0.3 | 0.2 |
Tabell 1: Beredning av SF-GelMA bioinks
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stabiliteten i det flerskiktade systemet är en viktig punkt för att utföra det här protokollet. Vi beräknade teoretiskt spridningen av SF-molekyler i GelMA-lösningen baserat på Naumans studie13. Det konstaterades att spridningen av proteiner i lösning var relaterad till deras molekylvikt. Den genomsnittliga molekylvikten (MW) av bovint serumalbumin (BSA) är 66,5 kDa och dess diffusionskoefficient är 64-72 μm2/s. Den genomsnittliga MW av fibrinogen är 339,7 kDa, och dess diffusionskoefficient är 23-34 μm2/s. Den genomsnittliga MW av SF molekyler i vår studie är cirka 100 kDa. Baserat på resultaten av Naumans studie är diffusionskoefficienten för en enda SF-molekyl mellan 23-72 μm2/s i vatten vid 25 °C. Enligt ekvationen Stokes–Einstein definieras diffusionskoefficienten på följande sätt:
där D är diffusionskoefficienten, K är konsistensen, T är den absoluta temperaturen, η är lösningens viskositet och d är diametern. Slutsatsen kan dras att skillnaden i diffusionskoefficient för SF-molekyler i vatten och i GelMA-lösning bestäms av skillnaden i viskositet hos dessa två omgivande lösningar. Dessutom kan spridningsradien beräknas på följande sätt:
där R är diffusionsradien, D är diffusionskoefficienten och T är diffusionstiden. Rent vatten uppvisar en viskositet vid 8,9 x 10-4 Pa ·s, och viskositeten hos GelMA vid noll skjuvfrekvens i vår studie var högre än 1000 Pa·s. Därför är diffusionsradien för en enda SF-molekyl vid 25 °C mindre än 0,66-1,18 μm/timme i GelMA-lösningen. Detta tyder på att SF knappast kan sprida sig över de intilliggande skikten i SF-M-Layered-GelMA-systemet, vilket visar stabiliteten i det flerskiktade systemet.
Gravitationsdriven sedimentering av de inkapslade cellerna är oundviklig vid bioprintning med vätskeliknande bioinks. I vår studie utvecklade vi en ny modifiering av låg viskositet GelMA bioink med cykliska lastning-kylning för att fördröja sedimentering av celler genom att skapa interfacial retention. Den multilayered interfacial retention är tänkt att kompensera effekten av allvaret i inkapslade celler och därmed förhindra sedimentering av inkapslade celler över intilliggande skikt i bioink reservoaren. Interfacial lagring presenterades longitudinellt i bioink reservoaren mellan varje intilliggande skikt på grund av skillnaden mellan det reologiska beteendet hos olika bioinks lastas i olika lager. Dessa interfacial spänningar började fungera så snart de inkapslade cellerna sedimenterade till gränssnittet. Som ett resultat, gravitationen dra kompenserades, och sedimentering stoppades. Även om detta protokoll är nytt, fler program som använder detta protokoll i andra flytande-liknande bioink system bör studeras för marknadsföring och optimering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner bidrag från National Natural Science Foundation of China (81771971, 81970442, 81703470 och 81570422), Kinas nationella nyckelprogram för forskning och utveckling (2018YFC1005002), Vetenskaps- och teknikkommissionen i Shanghai kommun (17JC1400200), Shanghai Municipal Science and Technology Major Project (bidrag nr 2017SHZDZX01) och Shanghai Municipal Education Commission (Innovation Program 2017-01-07-00-07-E00027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959) | TCI | M64BK-QD | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco | 15630080 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 10569044 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10091 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | V900863MSDS | |
| Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 276685MSDS | |
| Penicillin–streptomycin antibiotics | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010049 | |
| Silk fibroin | Advanced BioMatrix | 5154 |
References
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nature Protocol. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Heinrich, M. A., et al. 3D bioprinting: from benches to translational applications. Small. , 1805510 (2019).
- Daniela, L., et al. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
- Pedde, R. D., et al. Emerging biofabrication strategies for engineering complex tissue constructs. Advanced Materials. 29 (19), (2017).
- Holzl, K., Lin, S., Tytgat, L., Van Vlierberghe, S., Gu, L., Ovsianikov, A. Bioink properties before, during and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).
- Guillotin, B., Guillemot, F. Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication. Trends in Biotechnology. 29 (4), 183-190 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32, 773-785 (2014).
- Dubbin, K., Hori, Y., Lewis, K. K., Heilshorn, S. C. Dual-stage crosslinking of a gel-phase bioink improves cell viability and homogeneity for 3D bioprinting. Advanced Healthcare Materials. 5 (19), 2488-2492 (2016).
- Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Advanced Materials. 27 (9), 1607-1614 (2015).
- Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions. Biotechnology and Bioengineering. 109 (11), 2932-2940 (2012).
- Chen, N., et al. Hydrogel bioink with multilayered interfaces improves dispersibility of encapsulated cells in extrusion bioprinting. ACS Applied Materials & Interfaces. 11, 30585-30595 (2019).
- Zhu, K., et al. A general strategy for extrusion bioprinting of bio-macromolecular bioinks through alginate-templated dual-stage crosslinking. Macromolecular Bioscience. 18 (9), 1800127 (2018).
- Nauman, J. V., Campbell, P. G., Lanni, F., Anderson, J. L. Diffusion of insulin-like growth factor-I and ribonuclease through fibrin gels. Biophysical Journal. 92 (12), 4444-4450 (2007).
