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Bioengineering

सजातीय सेल वितरण के लिए त्रि-आयामी बायोप्रिंटिंग में बहुस्तरीय हाइड्रोजेल बायोइंक का उपयोग करना

doi: 10.3791/60920 Published: May 2, 2020

Summary

यहां, हमने समझाया कोशिकाओं के तलछट को रोकने के लिए तरल की तरह बायोइंक (कम चिपचिपाहट के साथ जिलेटिन मेथाक्रिलोइल) के लिए एक उपन्यास बहुस्तरीय संशोधित रणनीति विकसित की।

Abstract

एक्सट्रूशन-आधारित त्रि-आयामी बायोप्रिंटिंग प्रक्रिया के दौरान, कम चिपचिपाहट वाले तरल जैसे बायोइंक कोशिकाओं को कतरनी तनाव से प्रेरित झिल्ली क्षति से बचा सकते हैं और एनकैप्सुलेटेड कोशिकाओं के अस्तित्व में सुधार कर सकते हैं। हालांकि, जलाशय में तेजी से गुरुत्वाकर्षण-संचालित कोशिका तलछट बायोप्रिंटेड संरचनाओं में एक असंगत कोशिका वितरण का कारण बन सकता है और इसलिए तरल जैसे बायोइंक के आवेदन में बाधा डालता है। यहां, हमने एन्केसेटेड कोशिकाओं के तलछट को रोकने के लिए तरल-जैसे बायोइंक (जैसे, कम चिपचिपाहट के साथ जिलेटिन मेथाक्रिलोइल) के लिए एक उपन्यास बहुस्तरीय संशोधित रणनीति विकसित की। इंटरफेशियल रिटेंशन प्रदान करने के लिए मल्टीलेयर बायोइंक में कई तरल इंटरफेस में हेरफेर किया गया था। नतीजतन, बहुस्तरीय प्रणाली में आसन्न परतों के पार जा रही कोशिका तलछट कार्रवाई बायोइंक जलाशय में मंद थी। यह पाया गया कि इंटरफेशियल रिटेंशन कोशिकाओं के तलछट पुल की तुलना में बहुत अधिक था, जो कोशिका तलछट को रोकने और बहुस्तरीय बायोइंक में कोशिकाओं के अधिक सजातीय फैलाव को बढ़ावा देने में अंतर-मांशियल प्रतिधारण की महत्वपूर्ण भूमिका का प्रदर्शन करता है।

Introduction

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त्रि-आयामी (3 डी) बायोप्रिंटिंग बायोफैब्रिकेशन और पुनर्योजी,दवा1,2,3में देशी ऊतकों की जटिल वास्तुशिल्प और कार्यात्मक प्रतिकृतियों के निर्माण के लिए एक आशाजनक तरीका रहा है।, इंकजेट, एक्सट्रूशन और स्टीरियोलिथोग्राफी प्रिंटिंग सहित बायोप्रिंटिंग की साझा रणनीतियों में विभिन्न दृष्टिकोणों से पेशेवरों और विपक्ष हैं4। इन तकनीकों में, एक्सट्रूशन प्रक्रिया का उपयोग आमतौर पर इसकी लागत-प्रभावशीलता के कारण किया जाता है। बायोइंक एक्सट्रूशन बायोप्रिंटिंग की प्रक्रिया स्थिरता में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। आदर्श सेल से लदे बायोइंक न केवल जैव संगत होना चाहिए बल्कि यांत्रिक गुणों के लिए भी उपयुक्त होना चाहिए5। कम चिपचिपाहट वाले बायोइंक आमतौर पर तरल जैसी स्थिति के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं। इन बायोइंक को आसानी से और जल्दी से जमा किया जा सकता है और एक्सट्रूशन के दौरान उच्च कतरनी तनाव से प्रेरित सेल झिल्ली क्षति से बचा जा सकता है। हालांकि, दीर्घकालिक मुद्रण अवधि की आवश्यकता वाले जटिल मामलों में, कम चिपचिपाहट अक्सर बायोइंक जलाशय में एनकैप्सुलेटेड कोशिकाओं के अपरिहार्य तलछट को जन्म देती है, जो आमतौर पर गुरुत्वाकर्षण से प्रेरित होती है और बायोइंक6,,7में एक असंगत कोशिका फैलाव की ओर ले जाती है। नतीजतन, इन्होमोजेनियस सेल फैलाव के साथ एक बायोइंक एक कार्यात्मक ऊतक निर्माण के इन विट्रो बायोप्रिंटिंग में बाधा डालता है।

बायोनिक्स पर ध्यान केंद्रित करने वाले हाल के कई अध्ययनों ने एनकैप्सुलेटेड कोशिकाओं के समरूप फैलाव को बढ़ावा देने की सूचना दी है। एक्सट्रूसियन बायोप्रिंटिंग8के लिए ड्यूल-स्टेज क्रॉसलिंकिंग पर आधारित एक संशोधित एल्गिनेट बायोइंक का उपयोग किया गया था। इस अध्ययन में पेप्टाइड्स और प्रोटीन के साथ एक एल्गिनेट पॉलीमर को संशोधित किया गया था। कोशिकाओं ने पेप्टाइड्स और प्रोटीन द्वारा प्रदान की जाने वाली लगाव साइटों के कारण आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले एल्गिनेट की तुलना में इस संशोधित एल्गिनेट में अधिक सजातीय वितरण प्रस्तुत किया। वैकल्पिक रूप से, बायोइंक में कोशिकाओं के तलछट को हल करने के लिए मिश्रित बायोइंक का उपयोग किया गया है। एक मिश्रित बायोइंक जिसमें पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) और जिलेटिन या जिलेटिन या जिलेटिन मेथाक्रिलोइल (जेल्मा) बेहतर यांत्रिक मजबूती के साथ एक अन्य अध्ययन9में उपयोग किया गया था। समझाया कोशिकाओं ने मुख्य रूप से एक सजातीय वितरण प्रस्तुत किया क्योंकि मिश्रित बायोइंक की चिपचिपाहट में सुधार हुआ था। सामान्य तौर पर, बायोइंक में एनक्लोजर कोशिकाओं की फैलाव को प्रभावित करने वाले कई कारक होते हैं, जैसे बायोइंक की चिपचिपाहट, कोशिकाओं की गंभीरता, कोशिकाओं का घनत्व, और कार्य अवधि की अवधि। इन कारकों में, कोशिकाओं की गंभीरता तलछट को बढ़ावा देने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । चिपचिपा बायोइंक द्वारा प्रदान किए गए उछाल और घर्षण की जांच10तारीख तक गुरुत्वाकर्षण के विरुद्ध मुख्य बलों के रूप में की गई है ।

इसके साथ ही, हमने बायोइंक जलाशय में कई तरल इंटरफेस में हेरफेर करके बायोइंक में एनकैप्सुलेटेड कोशिकाओं की सजातीय फैलाव को बढ़ावा देने के लिए एक उपन्यास रणनीति विकसित की। बायोइंक के बहुस्तरीय संशोधन द्वारा बनाए गए ये तरल इंटरफेस न केवल इंटरफेशियल अवधारण प्रदान कर सकते हैं, जो कोशिकाओं के तलछट को मंद करता है, बल्कि बायोइंक के उपयुक्त जैव अनुकूलता और रियोलॉजिकल व्यवहार को भी बनाए रखता है। व्यवहार में, हमने एक बहुस्तरीय तरीके से रेशम फाइब्रोइन (एसएफ) के साथ जलीय जेल्मा समाधान (5%, w/v) को संशोधित किया ताकि मिश्रित बायोइंक में अंतरअनुजातीय तनाव प्रदान किया जा सके। नतीजतन, कोशिकाओं पर गुरुत्वाकर्षण लोड िंग मानव निर्मित अंतर-सन्नादार तनाव द्वारा ऑफसेट की गई थी, और कोशिकाओं की आसन्न परतों में कम तलछट के कारण बायोइंक में एनकैप्सुलेटेड कोशिकाओं का लगभग सजातीय फैलाव प्राप्त किया गया था। तरल बायोइंक में इंटरफेशियल रिटेंशन में हेरफेर करके एनकैप्सुलेटेड कोशिकाओं के तलछट को धीमा करने के लिए कोई समान प्रोटोकॉल आज तक सूचित नहीं किया गया है । हम बायोप्रिंटिंग में सेल तलछट को हल करने के लिए एक नया तरीका प्रदर्शित करने के लिए यहां अपना प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

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Protocol

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1. सेल से लदे एसएफ-गेल्मा की तैयारी

  1. 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर इकाइयों का उपयोग करके सभी सामग्रियों को स्टरलाइज करें। जैविक सुरक्षा कैबिनेट में सभी चरणों को करें।
  2. गर्म 1x पीबीएस 50 डिग्री सेल्सियस करने के लिए, और सरगर्मी के साथ गर्म 1x पीबीएस में जिलेटिन भंग। पीबीएस में जिलेटिन की अंतिम एकाग्रता 10% (w/v) होनी चाहिए ।
  3. जिलेटिन समाधान में मेथेक्रिलिक एंहाइड्राइड जोड़ें (0.6 से 1 के जिलेटिन में मेथाक्रिलिक एंहाइड्राइड का वजन अनुपात) धीरे-धीरे सरगर्मी के साथ, और कम से कम 1 घंटे (50 डिग्री सेल्सियस) के लिए परिसर को मिलाएं। आमतौर पर, 12 ग्राम मेथाक्रिलिक एंहाइड्राइड के साथ 10% जिलेटिन समाधान के 200 एमएल तैयार करें; मात्रा अध्ययन की जरूरतों पर निर्भर करती है।
  4. जिलेटिन और मेथाक्रिलिक एंहाइड्राइड युक्त मिश्रित समाधान को 50 एमएल बाँझ ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. 3,500 x ग्रामपर मिश्रित समाधान सेंट्रलाइज करें। यह आमतौर पर दो परतों को प्राप्त करने के लिए 3-5 मिनट लेता है । ऊपरी परत (जेल्मा) को इकट्ठा करें और नीचे की परत (अप्रतिक्रियार्थी मेथाक्रिलिक एंहाइड्राइड) को त्यागें।
  6. डिएकीकृत पानी (40−50 डिग्री सेल्सियस) के दो खंडों के साथ चरण 1.5 में प्राप्त ऊपरी परत समाधान को पतला करें।
  7. 5−7 दिनों (40−50 डिग्री सेल्सियस) के लिए डिओनाइज्ड पानी के खिलाफ 12-14 केडीए आणविक वजन कटऑफ डायलिसिस झिल्ली के साथ चरण 1.6 में प्राप्त समाधान को डायलाइज करें। हर दिन दो बार पानी बदलें।
  8. रात भर −80 डिग्री सेल्सियस पर GelMA समाधान को इकट्ठा करें और फ्रीज करें।
  9. Lyophilize एक फ्रीज ड्रायर में 3−5 दिनों के लिए GelMA समाधान -45 डिग्री सेल्सियस करने के लिए सेट तापमान और दबाव 0.2 mbar करने के लिए सेट के साथ।
  10. lyophilized GelMA भंग (लगभग 75%) 1x पीबीएस में 10% एफबीएस (भ्रूण गोजातीय सीरम, वी/वी), 25 एमएम एचईपीई (एन-2-हाइड्रोक्सीथाइलपिपेराज़ीन-एन-एथेन-सल्फोनिक एसिड), और फोटोनिइटिएटर (0.5%, w/v) में गेल्मा बायोइंक तैयारी प्राप्त करने के लिए।
    नोट: GelMA के प्रतिस्थापन की डिग्री एक ninhydrin परख3द्वारा गणना की जा सकती है ।
  11. एसएफ के विभिन्न सांद्रता के साथ एसएफ-गेल्मा बायोइंक प्राप्त करने के लिए प्रारंभिक एसएफ समाधान (5%, w/v) और 1x पीबीएस के विभिन्न खंडों के साथ गेल्मा समाधान (10%, w/v) मिलाएं। विभिन्न बायोइंक में गेल्मा और एसएफ समाधान के प्रति 1 एमएल अनुपात तालिका 1में प्रस्तुत किया गया है।
    नोट: सभी बायोइंक में 5% (w/v) GelMA की अंतिम एकाग्रता होनी चाहिए, लेकिन एस एफ की एकाग्रता भिन्न होती है: 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, और 1.5% (w/v) विभिन्न एसएफ-गेल्मा बायोिंक्स में। एसएफ-एम-लेयर-गेल्मा का उपयोग लेयर-बाय-लेयर तरीके से एसएफ के साथ संशोधित गेल्मा बायोइंक शब्द के लिए करें। एस एफ-एक्स-जेल्मा का उपयोग एक सजातीय तरीके से एस एफ के साथ संशोधित उन GelMA शब्द का प्रयोग करें (उदाहरण के लिए, 1% एसएफ के संशोधन के साथ GelMA एस एफ-1-GelMA कहा जाता था) ।
  12. 10-20 मिनट के लिए सभी बायोइंकर्स को सोनिकेट करें।
  13. डीएमईएम (दुल्बेको के संशोधित ईगल माध्यम) का उपयोग करके NIH3T3 कोशिकाओं को बढ़ाएं जिसमें 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन एक इनक्यूबेटर (5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस) शामिल हैं। 1:3 के अनुपात में कोशिकाओं को पारित करना जब घनत्व 80% तक पहुंच जाता है।
  14. 5 मिनट के लिए 1500 आरपीएम पर NIH3T3 कोशिकाओं के निलंबन अपकेंद्रित्र। 15 एमएल बाँझ ट्यूब में ताजा बायोइंक समाधान के साथ सेल पेलेट को सक्शन और रीसस्टल के साथ सुपरनिटेंट को हटा दें।
    नोट: बायोइंक में एनकैप्सुलेटेड कोशिकाओं की एकाग्रता 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल होनी चाहिए, और एकाग्रता की गणना साइटोमीटर के साथ की जानी चाहिए ।
  15. विभिन्न सेल से लदे बायोइंक प्राप्त करने के लिए सेल छर्रों को निलंबित करने के लिए विभिन्न एसएफ-गेल्मा बायोइंक के 2 एमएल का उपयोग करें।

2. एसएफ-एम-लेयर्ड-गेल्मा का लोडिंग, रीहीटिंग और बायोप्रिंटिंग

  1. सिरिंज की निचली परत में सेल से लदे एसएफ-0.5-जेल्मा का 0.4 एमएल लोड करें।
    नोट: इस अध्ययन में बायोइंक जलाशय के रूप में 2 मिलील सिरिंज का उपयोग करें। एक परत-दर-परत तरीके से सिरिंज में विभिन्न एसएफ-जेल्मा बायोइंक लोड करें।
  2. सिरिंज को 5 मिनट के लिए बर्फ के पानी के स्नान (0 डिग्री सेल्सियस) में रखें ताकि निचले परत बायोइंक को जेल राज्य में बदल सके।
  3. नीचे की परत के ऊपर सेल-लादेन एसएफ-0.75-GelMA बायोइंक के 0.4 एमएल लोड करें।
  4. 5 मिनट के लिए एक बर्फ के पानी के स्नान (0 डिग्री सेल्सियस) में बायोइंक की दो परतों के साथ सिरिंज रखें ताकि बायोइंक की दो परतों को जेल राज्य में बदल सके।
  5. विभिन्न परतों में एस एफ की विभिन्न सांद्रता के साथ एक बहुस्तरीय बायोइंक प्रणाली प्राप्त करने के लिए शेष 3 प्रकार के बायोइंक (एसएफ-गेल्मा, एसएफ-1.25-जेल्मा, एसएफ-1.5-जेल्मा) के साथ लोडिंग और कूलिंग चरणों को एक और 3 बार बढ़ाएं। सभी बायोइंक की लोडिंग के लिए उपयोग की जाने वाली मात्रा 0.4 एमएल होनी चाहिए।
  6. बायोप्रिंटिंग से पहले 30 मिनट के लिए एक इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस) में सिरिंज रखकर बहुस्तरीय बायोइंक को फिर से गरम करें।
  7. 27 जी प्रिंटिंग नोजल के साथ बायोइंक जलाशय के रूप में 2 एमएल सिरिंज का उपयोग करें। प्रवाह की गति 50 माइक्रोन/मिनट पर सेट करें, नोजल की गति 2 मिमी/s पर, और नोजल की ऊंचाई 1 मिमी पर निर्धारित करें । कमरे के तापमान (लगभग 20 डिग्री सेल्सियस) पर बायोप्रिंटिंग प्रक्रिया का प्रदर्शन करें ।
    1. हमारे पिछले अध्ययनों से अनुकूलित मापदंडों के तहत कस्टम-निर्मित बायोप्रिंटर का उपयोग करके एक निष्कासन तरीके से ऊतक का निर्माण करें11,,12
  8. बायोप्रिंटेड टिश्यू निर्माण को क्रॉसलिंक करने के लिए 40 एस के लिए पराबैंगनी प्रकाश (365 एनएम, 800 एमडब्ल्यू) का उपयोग करें।
  9. संस्कृति डीएमईएम (दुल्बेको के संशोधित ईगल माध्यम) में क्रॉसलिंक्ड ऊतक का निर्माण जिसमें 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन एक इनक्यूबेटर (5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस) शामिल हैं। पहले 2 दिनों के दौरान और उसके बाद हर 2-3 दिनों में हर 8 घंटे में माध्यम बदला जाता था।

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Representative Results

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सेल से लदे बायोइंस की तैयारी की एक योजनाबद्ध चित्रा 1में दिखाया गया है । विभिन्न बायोइंक तैयार करने के बाद, लोडिंग, रीहीटिंग और बायोप्रिंटिंग(चित्रा 2)किया गया। बायोइंक जलाशय में एनकैप्सुलेटेड कोशिकाओं के वितरण का मूल्यांकन करने के लिए, तीन 96-वेल प्लेटों(चित्रा 3 ए)में तीन अलग-अलग सेल-लादेन बायोइंक का उपयोग करके एक बायोप्रिंटिंग प्रक्रिया की गई थी। दो नियंत्रण समूहों (प्राचीन GelMA और एस एफ-1-GelMA bioinks) और प्रायोगिक समूह (एस एफ-एम स्तरित-GelMA बायोइंक) का उपयोग एनकैप्सुलेटेड कोशिकाओं(चित्रा 3 बी)की फैलाव की जांच करने के लिए किया गया था। सेल से लदे बायोइंक के ६० माइक्रोलीटर को तीन ९६-वेल प्लेटों के हर कुएं में निकाला गया था । तीन तरह के बायोइंक की कुल मात्रा 2 मिलील थी और नतीजतन बायोप्रिंटिंग की अवधि 30 मिनट से ज्यादा थी । मुद्रण (30 मिनट) से पहले अतिरिक्त इनक्यूबेशन के साथ, कुल कार्य अवधि 1 घंटे से अधिक थी और बड़े ऊतकों और अंगों को बायोप्रिंटिंग के लिए उपयुक्त निर्माण अवधि माना जाता था। तीन प्लेटों में चित्रा 3 एमें लेबल किए गए लक्ष्य कुओं में कोशिकाओं की संख्या गिनी गई । विभिन्न कुओं में कोशिकाओं की गिनती विभिन्न समूहों के बीच समझाया कोशिकाओं की फैलाव को प्रतिबिंबित कर सकता है । परिणामों से पता चला है कि जैसे-जैसे बायोप्रिंटिंग प्रक्रिया आगे बढ़ी, सभी समूहों में लक्षित कुओं में कोशिकाओं का घनत्व कम हो गया। एसएफ-0-गेल्मा समूह में, कुल प्रक्रिया के बाद लगभग 70% कोशिकाएं निचली परत में जमा की गई थीं। एस एफ-1-गेल्मा समूह में, लगभग 40% कोशिकाएं निचली परत में जमा की गई थीं, और लगभग 5% कोशिकाएं शीर्ष परत में जमा की गई थीं। एसएफ-एम-लेयर्ड-गेल्मा समूह में, समझाया कोशिकाओं का जमाव नियंत्रण समूहों(चित्रा 3सी और 3 डी)की तुलना में अधिक सजातीय था।

Figure 1
चित्रा 1: एस एफ-GelMA बायोइंक तैयारी की योजनाबद्ध। एसएफ-गेल्मा को सिल्क फाइब्रोइन (एसएफ) और जेल्मा/फोटोनििएटर (पीआई) कॉम्प्लेक्स को मिलाकर तैयार किया गया था और इसके बाद 10-20 मिनट के लिए अल्ट्रासोनिक ट्रीटमेंट किया गया । इसके बाद सेल लदी एसएफ-जेल्मा बायोइंक तैयार करने के लिए एसएफ-गेल्मा मिक्सचर में टारगेट सेल को सस्पेंड कर दिया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: लोडिंग, रीहीटिंग और बायोप्रिंटिंग प्रक्रिया। सेल लादेन एसएफ-गेल्मा, बायोइंक (aq) के रूप में, बायोइंक जलाशय में लोड किया गया था और कूलिंग प्रक्रिया से जेल राज्य में तब्दील हो गया था। लोडिंग और कूलिंग प्रक्रिया को एसएफ (0.5, 0.75, 1.0, 1.25, और 1.5%) की विभिन्न सांद्रता के साथ बायोइंक (एक्यू) का उपयोग करके 5 बार दोहराया गया था एसएफ-मल्टीलेयर्ड-जेल्मा (एसएफ-एम-लेयर्ड-गेल्मा) प्राप्त करने के लिए। जेल स्टेट एसएफ-एम-लेयर्ड-गेल्मा को बायोइंक को 30 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में रखकर फिर से गर्म किया गया । जेल स्टेट बायोइंक इनक्यूबेशन के बाद तरल स्थिति में बदल गया। फिर, तैयार बायोइंक का उपयोग 27 जी प्रिंटिंग नोजल के साथ बायोइंक जलाशय के रूप में 2 मिलील सिरिंज का उपयोग करके प्रिंटिंग के लिए किया जाता था। यूवी लाइट का उपयोग करके मुद्रित ऊतक निर्माण को क्रॉसलिंक किया गया था। Aq का अर्थ है जलीय समाधान। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: बायोप्रिंटिंग प्रक्रिया में तीन अलग-अलग सेल-लादेन बायोनिंक का उपयोग किया गया। (ए), बायोइंक के साठ माइक्रोलीटर को प्रति मिनट इसी ९६-अच्छी प्लेट में बाहर निकाला गया था, और ९६-अच्छी प्लेट में बायोप्रिंटिंग प्रक्रिया को प्राप्त करने में 30 मिनट से अधिक समय लगा । (ख), बायोप्रिंटिंग प्रक्रिया में एनकैप्सुलेटेड कोशिकाओं की फैलाव की जांच करने के लिए तीन विभिन्न प्रकार के बायोइंक का उपयोग किया गया था: दो नियंत्रण समूह (प्राचीन गेल्मा और एसएफ-1-गेल्मा बायोइंक) और प्रयोग समूह (एसएफ-एम-लेयर्ड-गेल्मा बायोइंक)। (सी-डी), तीन प्लेटों में नंबर 1, 5, 10, 15, 20, 25 और 30 कुओं के सेल घनत्व को धुंधला करने के साथ पाया गया, जिसमें तीन बायोकिंस में एनकैप्सुलेटेड कोशिकाओं का वितरण दिखाया गया था, और एसएफ-एम-लेयर्ड-जेल्मा समूह में एनकैप्सुलेटेड कोशिकाओं का जमाव अधिक सजातीय था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

बायोइंक सामग्री (एमएल)
जेल्मा एस एफ Pbs
एस एफ-0.5-जेल्मा 0.5 0.1 0.4
एस एफ-0.75-जेल्मा 0.5 0.15 0.35
एस एफ-1.0-जेल्मा 0.5 0.2 0.3
एस एफ-1.25-जेल्मा 0.5 0.25 0.25
एस एफ-1.5-जेल्मा 0.5 0.3 0.2

तालिका 1: एस एफ-गेल्मा बायोइंक की तैयारी

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Discussion

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बहुस्तरीय प्रणाली की स्थिरता इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक करने के लिए एक महत्वपूर्ण बिंदु है। हमने सैद्धांतिक रूप से नौमान के अध्ययन13के आधार पर जेल्मा समाधान में एस एफ अणुओं के प्रसार की गणना की । यह पाया गया कि समाधान में प्रोटीन का प्रसार उनके आणविक वजन से संबंधित था। गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) का औसत आणविक वजन (मेगावाट) 66.5 केडीए है, और इसका प्रसार गुणांक 64-72 माइक्रोन2/s है। फिब्रिनोजेन का औसत मेगावाट 339.7 केडीए है, और इसका प्रसार गुणांक 23-34 माइक्रोन2/s है। हमारे अध्ययन में एस एफ अणुओं का औसत मेगावाट लगभग 100 केडीए है। नौमान के अध्ययन के परिणामों के आधार पर, एकल एसएफ अणु का प्रसार गुणांक 25 डिग्री सेल्सियस पर पानी में23-72 माइक्रोन 2/s के बीच होता है । स्टोक्स-आइंस्टीन समीकरण के अनुसार, प्रसार गुणांक इस प्रकार परिभाषित किया गया है:

Equation 1

जहां डी प्रसार गुणांक है, कश्मीर स्थिरता है, टी पूर्ण तापमान है, समाधान की चिपचिपाहट है, और डी व्यास है। यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि पानी में और GelMA समाधान में एस एफ अणुओं के प्रसार गुणांक में अंतर इन दो आसपास के समाधान के चिपचिपाहट में अंतर से निर्धारित होता है । इसके अलावा, प्रसार त्रिज्या की गणना इस प्रकार की जा सकती है:

Equation 2

जहां आर प्रसार त्रिज्या है, डी प्रसार गुणांक है, और टी प्रसार समय है । शुद्ध पानी 8.9 x 10-4 Pa·s पर एक चिपचिपाहट प्रस्तुत करता है, और हमारे अध्ययन में शून्य कतरनी दर पर GelMA की चिपचिपाहट 1000 Pa·s से अधिक थी। इसलिए, 25 डिग्री सेल्सियस पर एक एसएफ अणु का प्रसार त्रिज्या जेलमा समाधान में 0.66-1.18 मीटर/घंटा से कम है। यह इंगित करता है कि एस एफ शायद ही एस एफ-एम-स्तरित-GelMA प्रणाली में आसन्न परतों में फैलाना कर सकते हैं, जो बहुस्तरीय प्रणाली की स्थिरता को दर्शाता है ।

तरल की तरह बायोइंप के साथ बायोप्रिंटिंग होने पर एनकैप्सुलेटेड कोशिकाओं का गुरुत्वाकर्षण-चालित तलछट अपरिहार्य है। हमारे अध्ययन में, हमने इंटरफेशियल रिटेंशन बनाकर कोशिकाओं के तलछट को मंद करने के लिए चक्रीय लोडिंग-कूलिंग के साथ कम चिपचिपाहट जेल्मा बायोइंक का एक उपन्यास संशोधन विकसित किया। बहुस्तरीय अंतरजातीय प्रतिधारण को समझाया कोशिकाओं के गुरुत्वाकर्षण की कार्रवाई की भरपाई करने के लिए माना जाता है और फलस्वरूप बायोइंक जलाशय में आसन्न परतों में एनकैप्सुलेटेड कोशिकाओं के तलछट को रोकने के लिए । विभिन्न परतों में भरे विभिन्न बायोइंक के रियोलॉजिकल व्यवहार के बीच अंतर के कारण प्रत्येक आसन्न परत के बीच बायोइंक जलाशय में अंतरअनुमानीय रूप से अंतर प्रस्तुत किया गया था। जैसे ही एनकैप्सुलेटेड कोशिकाओं को इंटरफेस पर तलछट किया जाता है, ये अंतर-facial तनाव काम करने लगे । नतीजतन, गुरुत्वाकर्षण पुल ऑफसेट था, और तलछट बंद कर दिया गया था । यद्यपि यह प्रोटोकॉल उपन्यास है, लेकिन अन्य तरल जैसे बायोइंक सिस्टम में इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने वाले अधिक अनुप्रयोगों को पदोन्नति और अनुकूलन के लिए अध्ययन किया जाना चाहिए।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81771971, 81970442) से अनुदान स्वीकार करते हैं, 81703470 और 81570422), चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2018YFC1005002), शंघाई नगर पालिका के विज्ञान और प्रौद्योगिकी आयोग (17JC1400200), शंघाई नगर विज्ञान और प्रौद्योगिकी प्रमुख परियोजना (अनुदान संख्या 2017SHZDZX01), और शंघाई नगर शिक्षा आयोग (नवाचार कार्यक्रम 2017-01-0 7-00-07-E00027) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959) TCI M64BK-QD
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Gibco 15630080
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Gibco 10569044
fetal bovine serum (FBS) Gibco 10091
Gelatin Sigma-Aldrich V900863MSDS
Methacrylic anhydride (MA) Sigma-Aldrich 276685MSDS
Penicillin–streptomycin antibiotics Gibco 15140163
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 10010049
Silk fibroin Advanced BioMatrix 5154

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References

  1. Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nature Protocol. 11, (10), 1775-1781 (2016).
  2. Heinrich, M. A., et al. 3D bioprinting: from benches to translational applications. Small. 1805510 (2019).
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सजातीय सेल वितरण के लिए त्रि-आयामी बायोप्रिंटिंग में बहुस्तरीय हाइड्रोजेल बायोइंक का उपयोग करना
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Chen, N., Zhu, K., Yan, S., Li, J., Pan, T., Abudupataer, M., Alam, F., Sun, X., Wang, L., Wang, C. Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution. J. Vis. Exp. (159), e60920, doi:10.3791/60920 (2020).More

Chen, N., Zhu, K., Yan, S., Li, J., Pan, T., Abudupataer, M., Alam, F., Sun, X., Wang, L., Wang, C. Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution. J. Vis. Exp. (159), e60920, doi:10.3791/60920 (2020).

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