Summary
Целью этой работы является разработка метода воспроизводимой изоляции кардиомиоцитов от взрослого сердца и измерения содержания и нуклеации ДНК.
Abstract
Сердце взрослого млекопитающего состоит из различных типов клеток, включая кардиомиоциты, эндотелиальные клетки и фибробласты. Так как трудно надежно определить ядра кардиомиоцитов на гистологических участках, многие группы полагаются на изоляцию жизнеспособных кардиомиоцитов до фиксации для выполнения иммуностения. Тем не менее, эти живые методы изоляции кардиомиоцитов требуют оптимизации, чтобы максимизировать урожайность, жизнеспособность и качество образцов, с присущими колебаниям от образца к образцу, несмотря на максимальную оптимизацию. Здесь мы сообщаем воспроизводимый протокол, включающий фиксацию до энзиматического пищеварения сердца, что приводит к максимальной урожайности при сохранении морфологии виво отдельных кардиомиоцитов. Мы также разработали автоматизированную платформу анализа для определения количества ядер и содержания ДНК на ядро для отдельных кардиомиоцитов. После разоблачения грудной полости, сердце было арестовано в диастоле перфузией с 60 мМ ККл в PBS. Затем сердце было зафиксировано в растворе параформальдегида (PFA), а затем переварено раствором коллагеназы 60 мг/мл. После пищеварения клетки были сингуляризованы тритурацией, а фракция кардиомиоцитов обогащалась с помощью дифференциальной центрифугации. Изолированные кардиомиоциты были окрашены для Troponin T α-актинина для оценки чистоты полученной популяции. Кроме того, мы разработали платформу анализа изображений для определения нуклеации кардиомиоцитов и статуса плоиди после окрашивания DAPI. Оценки, основанные на изображениях, привели к последовательным и воспроизводимым результатам. Таким образом, с помощью этого протокола можно сохранить родную морфологию отдельных кардиомиоцитов, чтобы позволить иммуноцитохимии и анализа содержания ДНК при достижении максимальной урожайности.
Introduction
Сердечные заболевания были основной причиной смерти в большинстве западных стран на протяжении многих десятилетий1,2. Хотя многие улучшения в лечении сердечно-сосудистых заболеваний улучшили выживание, Есть в настоящее время нет лечения, которые могут заменить потерянные кардиомиоциты. Таким образом, исследования, связанные с функцией кардиомиоцитов, пролиферации, апоптоза и гипертрофии были и продолжают быть одним из основных направлений научного сообщества. Так как сердце взрослого млекопитающего имеет очень ограниченную регенеративную способность, с оценочной скоростью обновления кардиомиоцитов менее 1% в год, крайне важно надежно определить кардиомиоциты пролиферативныхсобытий 3,4. Большинство стратегий, которые измеряют пролиферативные события, полагаются либо на окрашивание для включенных аналогов нуклеотида ДНК для оценки предыдущего или текущего распространения, либо пятно на ядерных маркерахактивного распространения 5. Особенно важно надежно определить пролиферативные события кардиомиоцитов, так как общее количество пролиферативных кардиомиоцитовнастолько низко 3,,6. Например, на основе 1% скорость обновления эндогенных кардиомиоцитов в год, можно ожидать, чтобы найти между 25 и 50 кардиомиоцитов, которые будут пролиферативы в любой момент времени во взросломсердце мыши 7,8. Любые неточности в идентификации ядер кардиомиоцитов могут привести к ложноположим результатам. Поэтому крайне важно надежно определить ядра кардиомиоцитов, которые оказались сложными и ненадежными из гистологических разделов9. Идентификация кардиомиоцитов является гораздо более точным из одиночных клеток, чем из тканей разделов, как это может быть трудно отличить кардиомиоцитов от других типов клеток, даже при использовании маркеров, таких как α-актинин, хотя PCM1 может быть надежным маркером ядер кардиомиоцитов в гистологическихразделах 10.
Текущие протоколы полагаются на изоляцию живых кардиомиоцитов до фиксации, которая, как известно, приводит к смерти по крайней мере 30% кардиомиоцитов, и может привести к непреднамеренному отбору конкретных популяций кардиомиоцитов11. Кроме того, эти протоколы, как известно, трудно оптимизировать, чтобы обеспечить воспроизводимые результаты. Даже оптимизированные методы изоляции, как правило, могут производить не более 65% живых, стержневидных кардиомиоцитов с различнойурожайностью 12.
Чтобы преодолеть эти проблемы, мы разработали протокол, который позволяет исследователям изолировать фиксированные кардиомиоциты. Так как образцы фиксируются до изоляции, урожайность максимизируется, и морфология in vivo хорошо сохраняется. Кроме того, с помощью этого протокола можно изолировать кардиомиоциты из клинических образцов, которые обычно фиксируются сразу после закупки. Кроме того, для выявления вновь генерируемых кардиомиоцитов, важно измерить нуклеацию и статус плоиди отдельных кардиомиоцитов, так как только диплоидные кардиомиоциты, как правило, предполагается, что вновь образованные. Цитометрия потока не может отличать мультинуклеацию от полиплоидии и является относительно трудоемким протоколом. Ручное изложение и измерение ядер в изображениях является очень низкой пропускной способностью и подвержено человеческому уклону. Автоматизированная количественная оценка изображений фиксированных, изолированных кардиомиоцитов DAPI решает обе эти проблемы. Определение нуклеаций и плоидных дистрибутивов на основе изображений может быть получено с минимальным временем и реагентами с использованием основного оборудования.
Protocol
Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с Национальными институтами здравоохранения руководящих принципов и одобрены Университетом Миннесоты институционального ухода за животными и использования комитета (IACUC).
1. Подготовка растворов и хирургического оборудования
- Перед изоляцией стерилизовать хирургическое оборудование с помощью 70% этанолового раствора.
- Добавьте 2,24 г KCl к 500 мл фосфатного буферного солевого раствора (PBS), чтобы получить окончательную концентрацию 60 мМ. Храните раствор KCl-PBS при комнатной температуре. Используйте 3 мл решения KCl-PBS на мышь.
- Разбавить 32% параформальдегида (PFA) раствор с PBS в для получения окончательной концентрации 4% PFA. Подготовка 10 мл 4% PFA в PBS на мышь. Разбавленный раствор PFA можно хранить при 4 градусах Цельсия в течение 2-3 недель в стеклянной таре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовленное решение 4% PFA может храниться при -20 градусов по Цельсию в течение более длительных периодов времени. - Приготовьте 1 мл раствора коллагеназы на мышь, добавив 60 мг коллагеназы, типа 2 на 1 мл PBS.
2. Перфузия и фиксация сердца
- Обезболивать животное с помощью 2-5% изофлюрана с скоростью потока кислорода 1 л/мин. Подтвердите анестезию, подтвердив отсутствие движения и более низкую скорость дыхания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекционные гепарин (100-500 U/kg) перед эвтаназией может увеличить качество клеток и выход, предотвращая образование тромбов, тем самым позволяя более эффективной перфузии сердца с фиксацией. - Усыворить животное в соответствии с утвержденными методологиями.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы следовали руководящим принципам Американской ветеринарной медицинской ассоциации по эвтаназии животных и получили местное одобрение МАКУК на эвтаназию. - Поместите усыпляемое животное в положение лежа, и лента вниз расширенные конечности.
- Вырезать через грудь, чтобы разоблачить сердце с помощью тупых ножниц. Вырезать нисходящую аорту и нижняя каваль вена.
- Perfuse сердце путем впрыскивания 3 мл раствора KCl-PBS через левый желудочек с скоростью потока 3 мл/мин с помощью перистальтического насоса, прикрепленного к набору настоя с иглой бабочки 23 G (26 G для новорожденных). Убедитесь в том, чтобы не пробить перегородку.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы используйте иглу, прикрепленную к шприцу, для инъекций растворов. - Перелить сердце путем введения 10 мл 4% раствора PFA в течение 10 минут с помощью перистального насоса со скоростью 1 мл/мин.
- Удалите все сердце с помощью ножниц. После удаления сердца, можно изолировать определенную область сердца путем инцизинга. Поместите сердце, или его сегмент в микроцентрифугную трубку 1,5 мл, содержащую 1 мл 4% раствора PFA. Инкубировать сердце на рокер при комнатной температуре со скоростью качания между 20-30 об /мин за 1 ч.
3. Изоляция фиксированных кардиомиоцитов
- Поместите сердце в чашку Петри, содержащую раствор PBS. Сожмите сердце, чтобы избавиться от любых PFA оставшихся в желудочках, и мыть в PBS.
- Поместите фиксированное сердце в новую микроцентрифугную трубку 1,5 мл, содержащую раствор коллагеназы (60 мг/мл). Поместите трубку на рокер (20-30 об/мин) при 37 градусов по Цельсию для ночной инкубации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продлить инкубационные время до 1 недели и пополнить раствор коллагеназы каждые два дня, чтобы уменьшить возможные изменения в урожайности, если сердца, как ожидается, фиброзные, которые могут потребовать более длительного времени пищеварения коллагеназы, чтобы переварить внеклеточный коллаген. - Положите раствор коллагеназы и сердце в 35 мм чашку Петри. Разобщить сердце на 1 мм штук с помощью миппов или ножниц.
- Используйте передачу пипетки для дальнейшего тритурата диссоциированной ткани в течение 2 мин. Если частицы ткани все еще остаются в тарелке, используйте перенесите пипетки с более узким отверстием и продолжайте тритурацию. Продолжайте до тех пор, пока большая часть ткани не будет разбита.
ПРИМЕЧАНИЕ: Над trituration причиняет индивидуальные cardiomyocytes сломать. Убедитесь в том, чтобы не более тритурата, регулярно проверяя под микроскопом. - Поместите нейлоновую сетку 200-600 мкм над отверстием 15 мл центрифуги трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для гипертрофированных кардиомиоцитов рекомендуется использовать нейлоновую сетку 400 мкм вместо 200 мкм. - Добавьте 5 мл PBS в чашку Петри, содержащую диссоциированные клетки, и отфильтруйте раствор через нейлоновую сетку, включая частицы тканей. Вымойте нейлоновую сетку, пройдя дополнительные 4 мл PBS.
- Центрифуга фильтрованного раствора при 10-100 х г в течение 1 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: 100 х г центрифугации не даст 100% чистой популяции кардиомиоцитов, и некоторые не-кардиомиоцитов клетки, вероятно, будут включены. g - Отбросьте supernatant если одно не хочет запятнать/оценить non-cardiomyocytes сердечные клетки также. Повторное окрашивание гранул в 10 мл PBS до окрашивания.
4. Окрашивание кардиомиоцитов
- Соберите клетки путем центрифугации при 100 x g в течение 1 мин и добавьте 5 мл раствора промеабилизации (например, 0,5% Triton X-100 в PBS). Инкубировать в течение 20 минут при комнатной температуре на рокер.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для шагов 4.1, 4.2 и 4.4 используйте 15 mL центрифуг трубки, как легче удалить супернатант, не нарушая гранулы клетки по сравнению с 1,5 мл микроцентрифуг труб. - Соберите клетки путем центрифугации при 100 x g в течение 1 мин, добавьте 5 мл блокирующего буфера (например, 3% бычьего альбумин сыворотки (BSA) в PBS) и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре на рокере.
- Соберите клетки путем центрифугации при 100 x g в течение 1 мин и добавьте 1 мл первичного раствора антитела (в PBS) с соответствующим коэффициентом разбавления. Перенесите раствор в микроцентрифугную трубку 1,5 мл и инкубировать кардиомиоциты в первичном растворе антител в оптимизированных условиях (например, 4 градуса по Цельсию за ночь).
- Перенесите кардиомиоциты с первичным раствором антител в центрифугу 15 мл трубки и добавьте 9 мл PBS. Инкубировать кардиомиоциты в течение 10 минут при комнатной температуре на рокер.
- Соберите клетки путем центрифугации при 100 x g в течение 1 мин и добавьте 10 мл PBS. Инкубировать кардиомиоциты в течение 10 минут при комнатной температуре на рокер. Повторите этот шаг еще раз.
- Соберите клетки путем центрифугации при 100 x g в течение 1 мин и добавьте вторичный раствор антител, содержащий DAPI. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре на рокер, а затем повторить шаг 4,5 дважды мыть кардиомиоцитов.
- Поместите клетки либо на крышки или микроскоп-совместимых пластин и приступить к визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения, включенные в рукопись, были сделаны с целями 10x и 40x. Лазеры были использованы: 405 нм для DAPI, 561 нм для альфа актинина и 640 нм для Эду.
5. Настройка программного обеспечения для визуализации
ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте вместе с этими шагами с помощью дополнительного файла 1-SoftwareScreenshots.pdf.
- Скачать Фиджи распределения ImageJ.
- Откройте Фиджи. Нажмите на справку и обновление... Управлять обновлениями сайтов. Проверьте "IJPB-плагины" и "Biomedgroup" обновления сайтов для загрузки зависимостей плагины Ellipse Сплит и Morpholibj.
- Нажмите Закрыть. Фиджи следует начать загрузку зависимостей. Перезагрузить Фиджи, когда закончите.
- Скачать Rstudio и открыть его.
- Копировать install.packages(c("ggplot2", "autothresholdr", "dplyr", "purrr", "jsonlite", "shiny")в командную строку R консоли и нажмите клавишу Enter. Введи "y" в ответ на все подсказки для установки всех зависимостей R (Скриншот 1 в дополнительном файле 1).
6. Количественная оценка изображений
- Откройте Фиджи и перетащите "AnalyzeNucleation.py" (поставляется в качестве дополнительного файла кода) в статус-бар Фиджи. Это откроет окно редактирования скриптов. Нажмите Вы запустите в левом нижнем углу, чтобы начать его (Скриншот 2 в дополнительном файле 1).
- Диалоговое окно будет всплывающее (Дополнительный файл 1: Скриншот 3), с просьбой о местонахождении каталога выходных данных. Все аналитические данные, цифры и другие данные, используемые этим программным обеспечением, будут храниться в этой папке. Другой, больший диалоговое окно будет всплывающее, отображая все настройки анализа изображений (Дополнительный файл 1: Скриншот 4).
- Выберите место каталога, содержащего изображения, которые будут проанализированы.
- Введите формат имена файла изображения, используя обычные выражения. Введите формат имена файла изображения, указав, какие части имени файла соответствуют строке, столбец, канал, и (по желанию) сайт в скобках, используя регулярные выражения. Не поставить пробелы в скобках. Окружите переменные части формата файлового имени в скобках. Способ хранимых файлов зависит от программного обеспечения для визуализации, и этот шаг позволит получить соответствующую информацию из имени файла изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, строка формата
r" Плита 1-(? Пялт;роу-гт; «А-За-зи»)?? Пя lt;колонка-gt;0-9")-(? Пя lt;канал-gt; "А-За-зз").
описывается имя файла, которое начинается с "Плита 1",за которым следует одна или несколько алфавитных букв с указанием строки, за которой следует одна или несколько цифр, указывающих на столбец, за которым следует "-", за которым следует одна или несколько букв, указывающих на канал, за которым следует ".tif". Буквы в угловых скобках, такие как "Lt;gt;" являются переменными именами и автоматически копируются в данные при сборе. Одним из переменных имен должно быть "Lt;канал"gt;" - Укажите название каналов, в которых видно ядерное пятно и где видны кардиомиоциты. Эти имена должны быть точно такими же, как они находятся в части, сотканной с переменной "Lt;channel"gt;" в обычных именах файлов выражения.
- Укажите, как изображения должны быть сгруппированы с помощью запятых разделенных переменных имен. Все изображения в данной группе будут открыты и проанализированы в одной партии. Например, если изображения разделены на наборы для каждой колодец, и есть колодец для каждого уникального сочетания строки и столбца, то напишите "строка, столбец" в этой области.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти переменные группировки должны быть подмножеством переменных, используемых в строке формата. Не используйте "канал" в качестве переменной группировки, это будет отделять соответствующие изображения канала друг от друга. - Укажите, сшиваются ли изображения вместе в одном изображении или они отделены друг от друга для каждого сайта. В первом случае сайт не должен быть указан в строке формата filename.
- Выберите, какой метод порогового значения использовать для отделяния ядер от фона. Все стандартные методы пороговых значений Фиджи доступны. Проверьте различные методы порогового значения, чтобы определить, какой из них лучше всего подходит для набора изображений. В этом примере выберите метод Otsu.
- Укажите, следует ли пересчитывать порог для каждого изображения сайта или же один и тот же порог должен использоваться для каждого изображения в группе. Укажите, являются ли изображения кардиомиоцитов ярким полем или используйте флуоресцентный маркер.
- Укажите метод порога кардиомиоцитов. Если яркое поле было выбрано на предыдущем этапе, этот пороговый метод будет применяться к изображениям с ярким полем, отфильтрованным краями. Укажите, следует ли пересчитывать порог для каждого изображения сайта или же один и тот же порог должен использоваться для каждого изображения в группе.
- Укажите количество рядов изображений сайта, которые охватывают каждую колодец. Укажите количество столбцов изображений сайта, которые охватывают каждую колодец. Укажите минимальную площадь ядер в пикселях. Используйте щедро низкий минимальный размер, более высокий и более точный порог будет рассчитан на этапе анализа. Укажите минимальную площадь кардиомиоцитов.
- После выбора нужных настроек щелкните OK.
- Изображения, напоминающие изображения, найденные на рисунке 3 и рисунке 4, появятся на экране, показывая различные этапы анализа трубопровода. Проинспектировать эти изображения, чтобы убедиться, что пороговые значения и сегментации происходят должным образом.
- Выбранная папка результатов теперь должна быть заполнена даннымианализа (Дополнительный файл 1: Скриншот 5). Файлы, кроме аналитических данных, можно безопасно хранить в этой папке до тех пор, пока их имена не начинаются с "cm_", "nuclei_" или "nucleilink_".
7. Анализ данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Csv файлы, которые производятся могут быть проанализированы вручную. Каждый анализируемый подмножество изображений производит триплет csv файлов под названием "ядра (метаданные).csv", "nucleilink (метаданные).csv", и "кардиомиоциты (метаданные), csv", где (метаданные) заменяется последовательностью именных пар значения формы "(имя)" (значение) (Например, если строка и столбец были указаны в именах файлов, то будут присутствовать такие строки, как "_row'F" и "_column'8"). Неназванный левый столбец каждого ядра и файла nucleilink является идентификационным номером ядра. "Мин" колонка файла nucleilink является идентификатор кардиомиоцита, который содержал сказал ядро полностью или 0 в противном случае. "Макс" колонка ядер является идентификатором с наибольшим числом кардиомиоцитов, которые содержали сказал ядро в части, или 0 иным образом. "Средняя" колонка файла кардиомиоцитов является кардиомиоцитом идентификационный номер.
- Откройте "AnalyzeMultinucleatedServer.R" в Rstudio (предоставляется в качестве дополнительного файла кода).
- В верхней части этого файла находится переменная под названием "folderName". Рядом с ним находится филпат. Здесь ввемите путь к папке выходных данных, выбранной на последнем этапе, без окончательногослэша (Дополнительный файл 1: Скриншот 6).
- В левом верхнем углу окна редактирования скриптов должна быть зеленая стрелка с пометкой Run App. Нажмите на эту стрелку. Загрузка данных может занять некоторое время, а приложение всплывающее.
- Первоначально будут видны три графика, один для обозначения минимально допустимого порога ядерной области, один для обозначения минимального допустимого порога интенсивности ядерного среднего, и один для обозначения максимально допустимого минимального диаметра ферета для кардиомиоцитов. Используйте ползунки, чтобы установить эти пороги(Дополнительный файл 1: Скриншот 7).
ПРИМЕЧАНИЕ: На каждом из этих графиков должен присутствовать большой, широкий пик, соответствующий действительным ядрам или кардиомиоцитам, окруженный широкими хвостами, представляющими мусор или ошибочные сегментированные кардиомиоциты. Используйте пороги, чтобы отрезать один хвост каждого из пиков. - Прокрутите вниз. Нажмите кнопку Применить выбранные пороги (внизу дополнительного файла 1: Скриншот 7).
- Нажмите кнопку Участок Интенсивность распределения. Это позволит сделать участок распределения ядерной интенсивности как всей выборки, так и отдельных подсюжетов для каждой переменной группировки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, если в обычное выражение в диалоге Фиджи были введены переменные группирования, сюжеты, указывающие на распределение интенсивности по строкам и по столбцам, появятся здесь(Дополнительный файл 1: Скриншот 8). Если условия освещения и окрашивания были постоянными в разных частях образца, все эти участки должны ясно показать два пика интенсивности, тусклый, выше для диплоидных ядер и ярче, короче для тетраплоидных ядер. - Внутрислойная вариация приведет к тому, что эта модель не будет видна на участке всего образца и будет большое разнообразие в расположении диплоидных и тетраплоидных пиков по ряду, столбецу или другой переменной группировки. В последнем случае прокрутите вниз, проверьте чекбокс Normalize Отдельно по группе, чтобы учесть этоизменение (Дополнительный файл 1: Скриншот 9).
- Нажмите кнопку Рассчитайте Ploidy (Дополнительный файл 1: Скриншот 9). Нажмите на кнопку Участок Предполагаемый Ploidy Распределение. Графики будут отображаться в пустых окнах справа. На нормализованном графике всего образца двухпиковая модель должна быть видна, если она не была раньше.
- Выберите пороговые значения для изоляции пиков диплоидной и тетраплоидной от друг друга и выбросов с помощьюползунков (Дополнительный файл 1: Скриншот 9). Прокрутите вниз. Нажмите кнопку Рассчитайте Ploidy и Nucleation (Дополнительный файл 1: Скриншот 10).
- Нажмите кнопку Участок и сохранить в результаты Folder. Участок, сохраненный в выбранной папке результатов, также появится в этоминтерактивном окне (Дополнительный файл 1: Скриншот 10).
Representative Results
Кардиомиоциты были изолированы в соответствии с протоколом, описанным выше. Используя этот метод, мы обычно получаем равномерно сингулярных кардиомиоцитов, которые являются относительно чистыми без загрязнения не-кардиомиоцитных клеток(рисунок 1А). Кардиомиоциты легко идентифицируются под яркой полевой микроскопией из-за их характерных размеров и бирифринга. Этот метод прост в реализации и обеспечивает последовательные результаты различных изоляций с сопоставимыми урожайности и качеством кардиомиоцитов(рисунок 1B). Изолированные кардиомиоциты могут храниться при 4 градусах Цельсия в течение нескольких недель перед дальнейшим использованием.
Кардиомиоциты, которые были изолированы в соответствии с вышеуказанным протоколом, могут быть использованы для различных приложений ниже по течению, таких как измерение размера кардиомиоцитов, кардиомиоцитов плоидии и иммуноцитохимии. В качестве репрезентативного результата, мы показываем, что кардиомиоциты изолированы в соответствии с этим протоколом могут быть окрашены с помощью антител и фторхром-конъюгированных азидов для нажмите химии для обнаружения локализации конкретных белков или для обнаружения репликации ДНК кардиомиоцитов, соответственно. Например, мы окрашенных кардиомиоцитов с антителами α-актинин, чтобы показать характерные z-линии окрашивания картины саркомеров(рисунок 2А). В отдельном эксперименте мы ввели тимидин аналоговый 5-этинил-2'-дезиуридин (ЭдУ) мышам, прежде чем изолировать фиксированные кардиомиоциты. После изоляции кардиомиоцитов, мы окрашенных для включены EdU сиспользованием стандартных протоколов 13, и смогли обнаружить кардиомиоциты, которые прошли фазу S либо в мононуклеированных, бинуклеированных и трехнуклеированных кардиомиоцитов (Рисунок 2B).
Для дальнейшего расширения полезности метода изоляции, мы разработали трубопровод, который позволяет количественно кардиомиоцитов ploidy на основе комплексного окрашивания ДНК. Чтобы измерить ploidy статус клеток или ядер, нам нужно сегментировать ядра и кардиомиоциты. На рисунке 3 показано представление стратегии, которую мы использовали для идентификации отдельных ядер. Во-первых, исходное изображение ДНК окрашенныхизображений (рисунок 3A) пороговых на основе интенсивности (Рисунок 3B). Здесь мы использовали DAPI для окрашивания ДНК, но любой другой ядерный краситель, который показывает линейную корреляцию с содержанием ДНК, будет работать. Программа позволяет выбрать любой из методов пороговой интенсивности Фиджи, но в этом примере был использован метод Оцу. Исключаются ядерные маски, которые касаются края изображения или меньше указанного минимального порога площади пикселей. Затем эллипсы подходят к ядерным маскам, сегментуя отдельные ядра. На рисунке 3C показаны эти эллипсы, наложенные на исходное изображение. Далее, отверстия заполняются в масках, и пиксели изображения затем разделены на территории, на основе которых эллипсы они являются наиболее проксимальными(рисунок 3D). Границы этих территорий затем используются для прорисовки линий через ядерные кластеры, заканчивая процесс ядерной сегментации(рисунок 3E).
Следующим шагом является выявление кардиомиоцитов. Для кардиомиоцитов изображения, которые получены на основе флуоресцентно окрашенныхклеток (рисунок4А ), процесс очень похож на то, что для ядер. Изображение пороговое на основе значения интенсивности, рассчитанного выбранным методом порогового значения, в данном случае методом треугольника. Выявленные кардиомиоцитные маски, которые касаются границ изображения или ниже определенного размера, исключаются и отверстия заполняются в масках, чтобы обеспечить правильно сегментированные кардиомиоциты(рисунок 4B). Поскольку кардиомиоциты имеют более нерегулярную форму, чем ядра, не делается никаких попыток сегментировать кардиомиоцитные кластеры. Вместо этого эти кластеры исключаются на основе их высокого минимального диаметра Ферета во время шага анализа. Сегментация от ярких полевых изображений происходит несколько иначе. Во-первых, исходное яркое изображениеполя (рисунок 4C) обрабатывается фильтром края Sobel. Этот фильтр вычисляет абсолютное значение градиента каждого пикселя в изображении. Пиксели в регионах с быстрыми изменениями получают высокие значения, а пиксели в гладких областях изображения получают низкие значения. Это изображение с краевой фильтрацией затем пороговое по интенсивности, используя метод Треугольника, в результате чего в масках кардиомиоцитов(рисунок 4D). Эти очень нерегулярные маски затем сглаживаются и связаны друг с другом через морфологическое закрытие с помощью круга с радиусом 2 пикселя, который заполняет все белые области изображения, где круг не может поместиться без перекрытия черной области(рисунок 4E). Наконец, отверстия в масках заполняются, области, касаясь границы, исключаются, а мелкие частицы удаляются, заканчивая процесс сегментации кардиомиоцитов(рисунок 4F).
Используя изложенную стратегию сегментации, мы можем определить состояние нуклеации отдельных кардиомиоцитов. Используя этот подход, мы определили состояние нуклеации кардиомиоцитов, изолированных от сердца вывереных мышей CD-1 в ранних постнатальных точках времени. Сердца новорожденных мышей (первый день жизни) показали, что большинство кардиомиоцитов на тот момент являются мононуклеированными(рисунок 5: неонатальный). Эта высокая частота мононуклеированных кардиомиоцитов значительно ниже у несовершеннолетних мышей (2 недели), где мононуклеированные кардиомиоциты составляют около 25% от общей популяции кардиомиоцитов(рисунок 5: несовершеннолетних). Наконец, мы можем измерить ploidy статус отдельных ядер в кардиомиоцитов, и определить, являются ли они диплоидной или тетраплоидной. Эти результаты показывают более высокую частоту тетраплоидных ядер у мышей-подростков(рисунок 6).
Рисунок 1: Эффективность изоляции кардиомиоцитов после фиксации. (A)Представительное изображение изолированных кардиомиоцитов, окрашенных DAPI, чтобы показать ядра. (DAPI (синий), Брайтфилд (серый)) (B)Урожайность кардиомиоцитов, изолированных от различных мышей в возрасте 3 месяцев. Масштаб баров 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Иммуноцитохимия изолированных кардиомиоцитов. (A)Представительное изображение кардиомиоцитов, окрашенных α-актинина (α-актинин (красный) и DAPI (синий)). (B) Кардиомиоциты, окрашенные для включенных EdU (красный) и DAPI (синий). Показаны репрезентативные кардиомиоциты мононуклеа (слева), бинуклеированные (средние) и тринуклеированные (справа) и ЭдУ положительные. Масштаб баров 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Стратегия ядерной сегментации. (A)Исходное изображение канала DAPI. (B)Пороговое изображение (в этом примере использовался метод Оцу). (C)Маски, которые были идентифицированы по пороговым изображениям, наложенным на исходное запятнанное изображение DAPI. (D)Вороной tessellation на основе ядерных масок. (E)Заключительные сегментированные ядра, с разделенными кластерами выделены. Масштаб баров 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Стратегия сегментации кардиомиоцитов. (A)Оригинальный флуоресцентный тропонин I окрашенных кардиомиоцитов изображения. (B)Треугольник-пороговое изображение, после заполнения отверстий и исключения мелких объектов и тех, касаясь границы. (C) Оригинальное яркое поле кардиомиоцитов изображение (D) Край-фильтрованных и треугольник-порог кардиомиоцитов изображение ( E ) Край-фильтрованное изображение после морфологического закрытия с радиусом от двухпикселей( F ) То же изображение после заполнения отверстий и за исключением мелких объектов и тех, касаясь границы.E Масштаб баров 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Классификация кардиомиоцитов на основе количества ядер. Неонатальные сердца (1 день) содержат больше мононуклеированных кардиомиоцитов, чем ювенильный сердца (14 дней). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Распределение содержания ДНК кардиомиоцитов на ядро. У новорожденных (слева) 13,5% мононуклеатных ядер СМ являются тетраплоидными, а 11,9% ядер бинуклеатных СМ тетраплоидными. У несовершеннолетних (справа) 33,9% мононуклеатных ядер СМ являются тетраплоидными, а 31,2% ядер с бинуклеированными СМ тетраплоидными. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительный файл 1: Скриншоты программного обеспечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы загрузить).
Дополнительный файл 2: AnalyzeNucleation.py. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы загрузить).
Дополнительный файл 3: AnalyzeMultinucleatedServer.R. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы загрузить).
Discussion
Поскольку кардиомиоциты не могут поддерживаться в культуре, важно изолировать первичные кардиомиоциты, чтобы иметь возможность изучать их архитектуру и функции11. Таким образом, методы изоляции кардиомиоцитов широко используются в сердечной области. Если цель состоит в том, чтобы определить функциональные аспекты кардиомиоцитов, важно изолировать жизнеспособные кардиомиоциты. Эти живые кардиомиоциты также могут быть использованы для выполнения иммуностимуляторов на изолированных кардиомиоцитов. Тем не менее, оптимизация техники изоляции живых кардиомиоцитов является технически сложной задачей, и даже лучшие методы, как правило, дают только 60-65% живых стержней формы кардиомиоцитов, а остальные кардиомиоциты все balled и умираетили мертвых 11,12. Здесь мы разработали методику, которая позволит исследователям сначала исправить сердце, а затем эффективно изолировать кардиомиоциты. Этот новый протокол позволяет гораздо более высокие урожаи стержнеобразных кардиомиоцитов по сравнению с ранее опубликованными протоколами. Кроме того, мы разработали платформу анализа изображений для классификации кардиомиоцитов автоматически на основе нуклеации и плоидии. С помощью этих новых методологий, группы могут пятно кардиомиоцитов для различных белков, и изучение кардиомиоцитов плоидии и нуклеации статус суррогатов для регенеративного потенциала сердца.
Описанный здесь протокол относительно прост и может выполняться без какого-либо современного оборудования. Количество коллагеназы и инкубации время для пищеварения может варьироваться в зависимости от партии коллагеназы, и компания, предоставляющая его. Мы использовали коллагеназы типа 2, так как это наиболее широко используется для переваривания сердца для получения живых кардиомиоцитов. Основываясь на наших наблюдениях, мы определили, что ночная инкубация с коллагеназой типа 2 60 мг/мл является оптимальной практически для всех мышей, независимо от уровня фиброза. У нас никогда не было проблемы переварения, так как внутриклеточные белки фиксируются и не так доступны, как внеклеточный коллаген. Однако, если сердце не переваривается должным образом, более энергичные тритурации могут быть необходимы, что вызывает фрагментацию клеток из-за стресса снятия свия. Таким образом, очень важно, чтобы убедиться, что сердце переваривается должным образом, прежде чем перейти к тритурации. Твердость сердца может быть проверена путем сжатия с типсами для оценки степени пищеварения. После инкубации с коллагеназой, сердца должны быть менее жесткими и легко разорвать на части. Другие виды коллагеназы также могут быть использованы. В предыдущем докладе использовалась комбинация коллагеназы B и D14.
Кроме того, мы считаем, что этот протокол может быть использован для оценки общего числа кардиомиоцитов в сердце15. Однако, если цель состоит в том, чтобы получить и количественно все кардиомиоциты из сердца, важно инкубировать сердца в течение длительных периодов времени в растворе коллагеназы (например, 3-7 дней), где раствор коллагеназы должен пополняться один раз в день. Это позволит свести к минимуму несоответствия в эффективности изоляции, устраняя влияние степени тритурации на урожайность кардиомиоцитов.
Использование содержания ДНК для измерения плоидии не является новым, и был использован в цитометрии потока на протяжении десятилетий. Недавно было показано, что микроскопия может аналогичным образом использоваться для оценки содержания ДНК на ядро16. Здесь мы реализовали эту стратегию для измерения плоидии ядер кардиомиоцитов, как суррогат для вновь образованных кардиомиоцитов. Догма в области сердечной регенерации заключается в том, что только мононуклеированные, диплоидные кардиомиоциты могут проходить цитокинез и давать новые кардиомиоциты. Так как это очень сложно измерить новое образование кардиомиоцитов в виво, изолируя кардиомиоциты, которые преследовали после введения аналога нуклеотида ДНК и определения уровня мононуклеированных, диплоидных кардиомиоцитов был использован в качестве приближения способности сердца генерировать новыекардиомиоциты 17. Здесь мы предоставляем макрос для ImageJ, который позволяет легко количественно кардиомиоцитов ploidy. Как минимум, для получения точной оценки местоположения пика G1 необходимо измерить 500 ядер. Если принять меры для обеспечения того, чтобы окрашивание и визуализация условия согласуются в каждом хорошо изображенной пластины, только 500 ядер по всей выборке должны быть изображены, в противном случае, там должно быть 500 ядер на изображениегруппы 18,19. Ограничения измерения нуклеации и плоидии на основе изображений включают трудности с разграничением ядер от клеток-адептов от фактических ядер кардиомиоцитов при использовании двумерных изображений. Такие адепт-клетки могут привести к завышению количества многоядерных клеток и снижению точности измерений популяции тетраплоидного кардиомиоцита. Одной из возможных стратегий для решения этой проблемы было бы использовать кардиомиоцитов ядерного маркера PCM16,20. Тем не менее, у нас возникли трудности, чтобы получить надежное окрашивание PCM1 на правильно закрепленных клеток или тканей.
Другим потенциальным ограничением является то, что некоторые изображения ядерных пятен могут иметь значительное фоновое цитоплазмическое окрашивание, предотвращая надлежащее пороговое значение с использованием фиджийских методов, построенных без обширной предварительной обработки. Кроме того, нерегулярный вклад этой фоновой флуоресценции в ploidy оценки снижает их точность. Кроме того, если клетки не остаются в растворе окрашивания ДНК в течение достаточного времени, флуоресцентный краситель не будет связываться с насыщением в ядрах и предположение о линейной взаимосвязи между ядерной интегрированной интенсивностью и содержанием ДНК больше не будет точным.
Следует отметить, что программное обеспечение не может сегментировать кардиомиоцитные кластеры и вместо этого удаляет их из анализа. Поэтому крайне важно семени кардиомиоцитов при относительно низкой плотности (например, 1000 клеток/см2). Кроме того, программное обеспечение не может различать два кардиомиоцитов выстроились из конца в конец и длинные, сингулярные кардиомиоциты. Такого рода кластеры могут ошибочно раздувать многоядерные оценки.
Хотя описанный метод не позволяет получить жизнеспособные кардиомиоциты и, таким образом, не может быть использован для измерения динамических клеточных процессов, если цель состоит в том, чтобы выполнить иммуностимунизацию, мы считаем, что описанный метод превосходит существующие протоколы с более высокими урожаями кардиомиоцитов и лучшим качеством с точки зрения морфологии и локализации белка. Наконец, описанный метод может быть использован для изоляции кардиомиоцитов из клиническихобразцов 14,21. Мы считаем, что описанная методология может помочь различным исследователям получить высококачественные кардиомиоциты и измерить нуклеацию и плоидию в качестве суррогатов для формирования новых кардиомиоцитов.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
JHvB поддерживается гранты от NIH, регенеративной медицины Миннесота, и отдельные биомедицинские исследования премии от Хартвелл фонда.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 wells plate for imaging | Corning | 3340 | We use these plates as they are suitable for imaging, although glass bottom plates would be better for confocal imaging |
| Alpha actinin | Novus Biologicals | NBP1-32462 | This antibody is used as a marker of cardiomyocyte sarcomeres |
| Blunt scissors | Fine Scissor Tools | 14072-10 | We prefer blunt scissors as the possibility of tearing heart tissue is lower when exposing the heart |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population |
| CD-1 mice | Charles river | 22 | Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population |
| Collagenase 2 | Worthington | LS004177 | For the purpose of this protocol, the batch to batch differences are minimal and don't affect overall yield and quality of the isolation |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 203165-10G | For edu staining |
| Cy5 Picolyl Azide | Click Chemistry Tools | 1177-25 | Azide used for edu staining |
| Cytation3 | BioTek | - | Used for automated imaging for DNA analysis |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | DAPI used for DNA staining. Stocks were dissolved in distilled water. |
| donkey anti-mouse IgG-Alexa568 | Life Technologies | A10037 | Secondary antibody used to detect alpha actinin staining within cardiomyocytes |
| Forceps | ROBOZ | RS-5137 | We use these curved, blunt forceps, although straight forceps could also be used |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144212 | To set pH of Tris-HCl buffer to pH 8.5 |
| ImageJ | imagej.net/Fiji/Downloads | - | Used for analyzing images |
| L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 255564-100G | For edu staining |
| Needle for infusion | TERUMO | SV*23BLK | We use winged infusion sets throughout the protocol as it is easy to manipulate the position of the needle with these sets during injection |
| Nikon A1R HD25 | Nikon | - | Used to take confocal images of alpha actinin staining |
| Nylon mesh 200 micron | Elko filtering | 03-200/54 | Mesh used for filtering regular cardiomyocytes (not hypertrophied) |
| Nylon mesh 400 micron | Elko filtering | 06-400/38 | Mesh used for filtering hypertrophied adult cardiomyocytes |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | Corning | 21-040-CV | This can also be prepared in the lab. Although sterility is important in this experiment, we think it is sufficient to prepare PBS and filtering it |
| Potassium chloride, Granular | Mallinckrodt | 6858 | Granular potassium chloride was preffered by us as it forms less aggregates when stored in room temperature |
| R | r-project.org | - | Used for data analysis of the measurements obtained from images |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | Used to buffer EdU staining reaction |
References
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135 (10), e146 (2017).
- Heidenreich, P. A., et al. Forecasting the future of cardiovascular disease in the United States: a policy statement from the American Heart Association. Circulation. 123 (8), 933-944 (2011).
- Eschenhagen, T., et al. Cardiomyocyte Regeneration: A Consensus Statement. Circulation. 136 (7), 680-686 (2017).
- Tzahor, E., Poss, K. D. Cardiac regeneration strategies: Staying young at heart. Science. 356 (6342), 1035-1039 (2017).
- Bergmann, O., et al. Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart. Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).
- Richardson, G. D. Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
- Ang, K. L., et al. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 298 (6), C1603-C1609 (2010).
- Bergmann, O., et al. Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover. Experimental Cell Research. 317 (2), 188-194 (2011).
- O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Shaklee, J., et al. Development of a Click-Chemistry Reagent Compatible with Mass Cytometry. Scientific Reports. 8 (1), 6657 (2018).
- Mollova, M., et al. Cardiomyocyte proliferation contributes to heart growth in young humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1446-1451 (2013).
- Naqvi, N., et al. A proliferative burst during preadolescence establishes the final cardiomyocyte number. Cell. 157 (4), 795-807 (2014).
- Roukos, V., Pegoraro, G., Voss, T. C., Misteli, T. Cell cycle staging of individual cells by fluorescence microscopy. Nature Protocols. 10 (2), 334-348 (2015).
- Patterson, M., et al. Frequency of mononuclear diploid cardiomyocytes underlies natural variation in heart regeneration. Nature Genetics. 49 (9), 1346-1353 (2017).
- Gomes, C. J., Harman, M. W., Centuori, S. M., Wolgemuth, C. W., Martinez, J. D. Measuring DNA content in live cells by fluorescence microscopy. Cell Division. 13, 6 (2018).
- Woo, L. A., et al. High-content phenotypic assay for proliferation of human iPSC-derived cardiomyocytes identifies L-type calcium channels as targets. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 127, 204-214 (2018).
- Morikawa, Y., Heallen, T., Leach, J., Xiao, Y., Martin, J. F. Dystrophin-glycoprotein complex sequesters Yap to inhibit cardiomyocyte proliferation. Nature. 547 (7662), 227-231 (2017).
- Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
