Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Använda en kemisk biopsi för graft kvalitetsbedömning

Published: June 17, 2020 doi: 10.3791/60946
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 2, 3, 3, 2,4, 3, 1
1Department of Pharmacodynamics and Molecular Pharmacology, Faculty of Pharmacy, Nicolaus Copernicus University in Torun, Collegium Medicum in Bydgoszcz, 2Multi Organ Transplant Program, Department of Surgery, Toronto General Hospital, University Health Network, 3Department of Transplantology and General Surgery, Collegium Medicum in Bydgoszcz, Antoni Jurasz University Hospital No. 1 in Bydgoszcz, Nicolaus Copernicus University in Torun, Bydgoszcz, Poland, 4Department of Medicine, Toronto General Hospital
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Protokollet presenterar utnyttjande av den kemiska biopsi strategi följt av omfattande metabolomic och lipidomic analys för kvalitetsbedömning av njure ympkvistar tilldelas för transplantation.

Abstract

Njurtransplantation är en livräddande behandling för ett stort antal personer med slutstadiet njurfunktionsstörning över hela världen. Förfarandet är förknippat med en ökad överlevnad och högre kvalitet på patientens liv jämfört med konventionell dialys. Beklagligt, transplantationsologi lider av en brist på tillförlitliga metoder för organkvalitet bedömning. Standard diagnostiska tekniker är begränsade till makroskopiska utseende inspektion eller invasiv vävnad biopsi, som inte ger omfattande information om transplantatet. Det föreslagna protokollet syftar till att införa solid fas mikroextraktion (SPME) som en idealisk analysmetod för omfattande metabolomik och lipidomic analys av alla lågmolekylära föreningar som finns i njurar som tilldelats för transplantation. Den lilla storleken på SPME-sonden möjliggör prestanda hos en kemisk biopsi, vilket möjliggör utvinning av metaboliter direkt från organet utan vävnadsuppsamling. Den minsta invasivitet av metoden tillåter utförande av flera analyser över tiden: direkt efter organ skörd, under dess bevarande, och omedelbart efter revascularization på mottagarens kropp. Det är en hypotes om att kombinationen av denna nya provtagningsmetod med en högupplöst masspektrometer kommer att möjliggöra diskriminering av en uppsättning karakteristiska föreningar som skulle kunna fungera som biologiska markörer för graft kvalitet och indikatorer för eventuell utveckling av organ dysfunktion.

Introduction

Enligt United States' Organ Procurement and Transplantation Network, fanns det 94 756 patienter som väntade på njurtransplantationer i USA under 2019; medan det i Europa 2018 var den siffran 10 791. Var tionde minut läggs någon till den nationella väntelistan för transplantationer i USA, och det uppskattas att 20 personer dör varje dag i väntan på en transplantation1,2. Njurtransplantation är en livräddande behandling för ett stort antal människor som lider med slutstadiet njurfunktionsstörning över hela världen. Förfarandet är associerat med ökad överlevnad och högre livskvalitet vid jämförelse med konventionell dialys.

Transplantation står dock inför många allvarliga problem, såsom organbrist eller brist på effektiva verktyg för organkvalitetsbedömning. Standardprotokollen är begränsade till makroskopisk utseendeinspektion eller invasiv vävnadsbiopsi, som inte ger omfattande information angående ympkvistens kvalitet. Medan en visuell bedömning möjliggör identifiering av tumörer synliga för ögat, anatomiska avvikelser, eller omfattande skador på ympkvistar, detta tillvägagångssätt är mycket subjektiva, varierande i sin effektivitet enligt erfarenheterna av observatörerna. Biopsi, å andra sidan, kan ge värdefull information om befintliga njursjukdomar, och anses därmed vara en metod för objektiva och bestyrk värde i fastställandet av transplantat resultat. Men, biopsiförfarandet är inte fri från brister; det finns risk för potentiella komplikationer såsom blödning och ytterligare 4-5 timmars provberedning krävs, vilket avsevärt förlänger den kalla ischemisk tid. Därför, särskilt i Europa, är användningen av direkt vävnadsanalys begränsad till utökade kriterier givare (ECD) och givare efter cirkulationsdöd (DCD)3,4.

Metabolomik och lipidomics har nyligen erkänts som lovande metoder för att uppnå en bättre förståelse av förändringarna i biokemiska vägar som förekommer under orgel bevarande. Metabolomisk och lipidomisk profilering möjliggör övervakning av omedelbara svar av systemet på plötsliga miljöförändringar relaterade till avlägsnande av organ med efterföljande konsekvenser: ischemi, oxidativ stress, eller inflammatoriska svar5,6,7,8. Njuren är ett organ som till stor del är associerat med metaboliska processer, således mätningar av metaboliter och lipider koncentrationer kan tillåta identifiering av potentiella organ kvalitet biomarkörer och möjliggöra bättre förutsägelser av transplantat resultatet.

Med tanke på ovanstående komplikationer och begränsningar i samband med nuvarande organkvalitet bedömningsmetoder, en mindre invasiv diagnostisk lösning behövs för snabb och komplex organkvalitet bedömning. Solid phase microextraction (SPME) uppfyller dessa krav som en minimalt invasiv analysmetod som möjliggör täckning av ett brett spektrum av metaboliter och lipider. Tekniken baseras på insättning av en tunn (~200 μm), biokompatibel, titan-nickellegeringssond täckt med en selektiv extraktionsfas i det undersökta organet under en kort tid. Det bör betonas att SPME förhindrar proteinutvinning, och möjliggör därmed metabolismhämning redan i det skede av provinsamlingen, vilket är en betydande fördel jämfört med alternativa metoder. Dessutom möjliggör miniatyriseringen av enheten för utförande av repetitiva och samtidiga analyser av få strukturer av organet9,10,11.

Protocol

Alla djur fick human vård i enlighet med ''Principles of Laboratory Animal Care'' formulerad av National Society for Medical Research och ''Guide for the Care of Laboratory Animals'' som ges ut av National Institute of Health, Ontario, Kanada. Djurvårdskommittén vid Toronto General Research Institute godkände alla studier. Forskningen involverade försökspersoner på människor godkändes av bioetiska kommittén vid Collegium Medicum i Bydgoszcz Nicolaus Copernicus University i Torun.

OBS: Erhåll godkännande från lämpliga etiska styrelser. Kom ihåg att alltid använda säkerhetshandskar. Rör inte extraktionsfasen av SPME-sonder. Användning av avaktiverade glasflaskor rekommenderas för lipidomiska analyser.

1. Förberedelse av sonder

  1. Preparera titan-nickellegeringssonder (40 mm längd; 0,2 mm diameter) belagd med 7 mm mix-mode sorbent. Antalet sonder beror på vilka tidpunkter som är riktade under hela proceduren och antalet replikat (3 rekommenderas per tidspunkt).
    OBS: Längden och typen av extraktionsfas får justeras utifrån studiesättet, metaboliternas polaritet, och provmatrisen.
  2. Bered en rengöringsblandning som består av 2:1 kloroform:metanol (v/v). Pipet 1.0 mL av lösningen till varje 2.0 mL glasflaska och placera en sond, tidigare genomborrad genom locket, i varje injektionsflaska.
    OBS: Rengör alla sonder före användning för att avlägsna förorenande partiklar.
  3. Sätt injektionsflaskan på agitatorn och ställ in agitationshastigheten på 1 200 varv/min. Efter 45 min, stoppa enheten och skölj beläggningarna med LC-MS-kvalitet vatten.
  4. Eftersom beläggningar måste genomgå ett förkonditioneringssteg för att aktivera dem, bered en förkonditioneringsblandning som består av 1:1 metanol:vatten (v/v). Pipet 1.0 mL av lösningen till varje 2.0 mL glasflaska och placera en sond, tidigare genomborrad genom locket, i varje injektionsflaska.
  5. Sätt injektionsflaskan på vortexagitatorn och ställ in agitationshastigheten på 1 200 varv/min.
  6. Efter 60 min, stoppa agitatorn och skölj beläggningarna med LC-MS-kvalitet vatten.
  7. Sterilisera prober enligt standard- kirurgiska utrustningsteriliseringsprotokollet.

2. Utvinning

  1. Öppna den sterila förpackningen direkt före provtagning för att säkerställa en steril miljö.
  2. Sätt in två sonder direkt i njurbarken i 10 min vid varje tidpunkt. Hela beläggningens längd måste täckas av vävnadsmatrisen; ingen specifik vinkel krävs, men ca. 90 grader används vanligtvis.
    OBS: Hela medicinska förfarandet följer standardprotokoll i givna institution. Ingen ändring avseende SPME-provtagning övervägs. Förfarandet omfattar de sex följande provtagningstillfällena:
    a) före njurresektion, in vivo från donator;
    b)-e) efter 1 h, 3 h, 5 h, 7 h njurperfusion, ex vivo i orgelkammare;
    f) efter reperfusion, in vivo från mottagare.
  3. Dra tillbaka sonderna genom att dra ut den från vävnaden och skölj sedan beläggningar med LC-MS-kvalitet vatten för att rensa eventuellt kvarvarande blod från beläggningsytan. Skölj bort från operationsstället, och omedelbart efter avlägsnande av sonderna.

3. Transport och lagring

  1. Placera prober i separata injektionsflaska och stäng dem.
  2. Placera injektionsflaska i en frigolitlåda fylld med torris eller i flytande kväve för transport.
  3. Förvara proverna i en frys (-80 °C), eller omedelbart påbörja desorptionssteget.

4. Desorption

  1. Förbered desorptionslösningar som består av 80:20 acetonitril:vatten (v/v) för metabolomisk analys, och 1:1 isopropanol:metanol (v/v) för lipidomisk analys.
  2. Pipet 100 μL av lösningen till insatser som placeras i 2,0 mL märkta injektionsflaska och placera en sond, tidigare genomborrad genom locket, i varje injektionsflaska.
  3. Sätt injektionsflaskan på virvelagitatorn och ställ in agitationshastigheten på 1 200 varv/min för 120 min.
  4. Ta bort sonder från injektionsflaskan. Erhållna extrakt är nu redo för instrumental analys.

5. LC-MS-analys

  1. Placera injektionsflaska som innehåller extrakt i LC-MS-systemets autosampler.
    OBS: Vätskekromatografi (RP, HILIC) tillsammans med hög upplösning masspektrometri och en orbitrap massanalysator användes för denna studie. För metabolomiska analysparametrar går du till steg 5.2. För lipidomic analys parametrar, gå till steg 5.6.
  2. Använd en pentafluorofenyl (PFP) kolumn (2,1 mm x 100 mm, 3 μm) för omvänd fasskiljning.
    1. Ställ in flödeshastigheten till 300 μL/min, och autosampler och kolumntemperaturer till 4 °C respektive 25 °C.
    2. Förbered mobila faser enligt följande proportioner: mobil fas A: vatten:myrsyra (99.9:0.1, v/v), och mobil fas B: acetonitril:myrsyra (99.9:0.1, v/v). Ställ in mobilfasflödet enligt följande parametrar: starta mobilt fasflöde (0-3 min): 100% A följt av en linjär gradient till 10% A (3-25 min), som slutar med isokratiskt flöde på 10% A tills 34 min, följt av 6 min kolonn re-jämviktstid.
  3. För HILIC-separation, använd en HILIC-kolonn (2,0 mm x 100 mm, 3 μm, 200A). Ställ in flödeshastigheten till 400 μL/min.
    1. Förbered mobila faser enligt följande proportioner: mobil fas A: acetonitril:ammoniumacetatbuffert (9:1, v/v, effektiv saltkoncentration 20 mM), mobil fas B: acetonitril:ammoniumacetatbuffert (1:1, v/v, effektiv saltkoncentration 20 mM).
    2. Ställ in mobilfasflödet enligt följande parametrar: starta mobilt fasflöde (0-3 min) vid 100% A, håll i 3,0 min och sedan ramp till 100% B inom 5 min. Håll med 100% B tills 12 min, följt av 8 min kolonn åter jämviktstid.
  4. Ställ in skanningsområdet till 85-1000 m/z. Ställ HESI jon källa parametrar i positivt joniseringsläge till: spray spänning 1,500 V, kapillär temperatur 300 °C, mant gas 40 a.u., AUX gasflödeshastighet 15 a.u., sondvärmare temperatur 300 °C, S-Lens RF-nivå 55%.
  5. Kör QC-prover som består av 10 μL av varje analyserat prov (regelbundet, var 10-12 prover) för att övervaka instrumentprestanda.
  6. För omvänd fasskiljning, använd en C18-kolonn (2,1 mm x 75 mm, 3,5 μm).
    1. Ställ in flödeshastigheten till 200 μL/min, och autosampler och kolumntemperaturer till 4 °C och 55 °C, respektive. Förbered mobila faser enligt följande proportioner: mobil fas A: H2O:MeOH (60:40, v/v), 10 mM ammoniumacetat och 1 mM ättiksyra; mobil fas B: IPA:MeOH (90:10, v/v), 10 mM ammoniumacetat och 1 mM ättiksyra.
    2. Ställ in mobilfasflödet enligt följande parametrar: 0-1 min (20% B), 1-1,5 min (20-50% B), 1,5-7,5 min (50-70% B), 7,5-13 min (70-95% B), 13-17 min (95% B), 17-17.1 min (95-20% B), 17.1-23 min (20%).
  7. För HILIC-separation, använd en HILIC-kolonn (100 x 2,1 mm, 3 μm).
    1. Ställ in flödeshastigheten till 400 μL/min, och autosampler och kolumntemperaturer till 4 °C och 40 °C, respektive.
    2. Förbered mobila faser enligt följande proportioner: mobil fas A: ACN; mobil fas B: 5 mM ammoniumacetat i vatten. Ställ in mobilfasflödet enligt följande parametrar: 0-2 min (96% B), 2-15 min (96-80% B), 15-15,1 min (80-96% B), 15,1-21 min (96% B).
  8. Ställ HESI jon källa parametrar i positivt joniseringsläge att spraya spänning 3.500 V, kapillärtemperatur 275 °C, mantgas 20 a.u., AUX gasflödeshastighet 10 a.u., sondvärmare temperatur 300 °C, S-Lens RF-nivå 55%.
  9. Kör QC-prover som består av 10 μL av varje analyserat prov (var 10-12 prov) för att övervaka instrumentprestanda.
  10. Utför datainsamling i programvara som är kompatibel med instrumentet.

6. Dataanalys

  1. Utför databearbetning, förmodade identifiering och statistisk analys med användning av programvara som är avsedd för oriktade metabolomik och lipidomics analys.
    OBS: Principal komponenter analys (PCA) och box-whisker tomter kan erhållas för att visualisera datastruktur.

Representative Results

Provinsamling utfördes enligt den SPME-metod som beskrivs ovan, med hjälp av sonder belagda med en 7 mm mixed-mode extraktionsfas. Provtagning genomfördes direkt från transplantatvävnaden (in vivo före transplantation), ex vivo i njurkammare efter 1 h, 3 h, 5 h och 7 h perfusion och in vivo efter revaskularisering i mottagaren. Oriktade metabolomic och lipidomic analyser genomfördes med användning av flytande kromatografi (RP, HILIC) tillsammans med hög upplösning masspektrometri, med massa analyzer som i positiva jonisering läge. För att bedöma datakvalitet och uppnå allmänna insikter avseende resultaten, utsattes data för principalkomponentanalys (PCA). Som framgår av figur 1, bildade QC-prov ett tätt kluster, vilket bekräftade kvaliteten på analyserna. De studerade grupperna uppvisar relativt god separation, vilket möjliggör visualisering av skillnader i metaboliska och lipidomiska profiler före och efter transplantation, samt under organperfusion (Figur 2). SPME-provtagningstillstånd metabolisk profilering av orgeln över tid. Box-whisker tomter av utvalda metaboliter tjänar till att exemplifiera förändringar i metaboliten nivåer under hela experimentet (Figur 3). Det breda spektrat av extraherade funktioner som separeras på både RP- och HILIC-kolumner visas i figur 4.

Figure 1
Figur 1: Huvudkomponentanalys som visar klustring av kvalitetskontrollprover för metabolomisk reversed-fas (A), HILIC (B) och lipidomic reversed-phase (C), HILIC (D) analyser. Kvalitetskontrollen är nödvändig i oriktad analys för att övervaka eventuella förändringar som framkallas av instrumentell instabilitet. Tätt kluster av QC-prover säkerställer att alla förändringar som observerats är av biologiskt ursprung. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Huvudkomponentanalys som visar metabolomiska (A) och lipidomiska (B) skillnader mellan särskilda provtagningspunkter. Oriktade profilering av njure med SPME-LC-HRMS gör det möjligt att observera biokemiska skillnader i organ vid efterföljande steg av deras bevarande. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Box-whisker-observationsområden av utvalda föreningar som visar förändringar i metaboliter (A, B) och lipider (C, D) under peritransväxtperioden. Efter urval och identifiering av diskriminerande föreningar box-whisker tomter gör det möjligt att övervaka förändringar i nivåer av dessa föreningar vid efterföljande steg i protokollet och jämföra metaboliter nivåer i organ som utsätts för olika bevarande protokoll eller skördas från olika givare t.ex. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Jonkarta (m/z kontra retentionstid) över funktioner som erhålls genom LC-MS-analys med (A) reversed-phase och (B) HILIC-separation. Observationsområdet gör det möjligt att uppskatta det totala antalet funktioner som erhållits med det föreslagna protokollet (från extraktion till upptäckt) och bedöma analyttäckning baserat på polariteten. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Discussion

Utvärdering av organkvalitet är fortfarande en stor utmaning för läkare, som måste fatta snabba välgrundade beslut om huruvida ett visst organ är lönsamt för transplantation eller om det måste kasseras. Flera faktorer, såsom givare ålder, varaktighet ischemi, och infektioner och inflammatoriska processer, kan påverka den långsiktiga transplantat resultatet. Medan olika metoder har utvecklats hittills för att diagnostisera njure allograft funktion, förblir histopatologisk inspektion guldmyntfoten i denfrågan 3,4,12. Även om biopsi förfarandet kan ge betydande information om redan existerande givare sjukdom och Vaskulär förändringar, är det inte fri från brister. Provtagningsfel som är associerade med interobservervariation och provtagning av otillräcklig glomeruli för omfattande information avseende organfunktion förblir typiska farhågor i detta avseende. Dessutom medför preparat för exemplar vissa frågor såsom en ofullständig bedömning av transplantatet vid frysta avsnitt, och förlängning av förfarandet tid för paraffin snittning. Den ökade risken för blödning, som kan verka akut som mikroskopisk eller grov hematuri, är dock den stora livshotande komplikationen som är associerad med biopsiförfarandet. Av denna anledning är antalet tillåtna biopsier strikt begränsad i transplantation förfaranden, en faktor som hämmar avskiljning av dynamiska förändringar och tidsserieanalyser via denna metod12,13,14. Nyttan av en histologisk analys måste vägas mot de risker som är förknippade med metoden. Värdet av histologiska fynd är obestridligt, men de förklarar inte de molekylära mekanismerna i avvikelserna.

Metabolomik och lipidomics är de yngsta domänerna av "-omics" vetenskaplig familj. Den kompletta uppsättningen av lågmolekylära (<1200 Da) mänskliga metaboliter och lipider anslutna inom ett metaboliskt nätverk definieras som en mänsklig metabolom. Genomet förblir relativt konstant under hela sin livstid, med små ändringar som orsakas av mutationer som förekommer sällan. Metabolomet är produkten av genuttryck, som är mycket känslig för förändringar i alla biologiska processer samt miljöfaktorer. Den dynamiska karaktären hos metaboliter och lipider gör dem perfekta indikatorer på nuvarande organ skick7,8,15,16. Den SPME-metod som föreslås i ovannämnda protokoll möjliggör detektering av förändringar som sker i organet under dess bevarande, med början från organborttagning från donatorns kropp tills revaskularisation hos mottagaren. Sondens lilla diameter (~200 μm) ger minimal invasivitet och möjliggör flera provtagningar från samma organ utan att orsaka någon skada på vävnaden. Genomförande av studier med njure, som det mest transplanterade organet, möjliggör en bättre förståelse och ytterligare karakterisering av de metaboliska vägar som ansvarar för att minska ympkvistarnas kvalitet och funktion. Möjligheten att övervaka modifieringar över tiden är säkert en viktig fördel med tekniken jämfört med konventionella invasiva metoder såsom biopsi. Den för närvarande presenterade analysen identifierade förändrade koncentrationer av olika grupper av lipider och metaboliter, särskilt av essentiella aminosyror, puriner, purinnukleosider och glycerofosfolipider. Dessa resultat överensstämmer med tidigare vävnadsanalysrapporter5,6,17,18,19,20. Hittills har majoriteten av vetenskapliga rapporter utnyttja metabolomik eller lipidomics att förklara processer inducera komplikationer efter transplantation eller ischemi / reperfusion skada (IRI) fenomen har begränsats till analys av biofluider21,22,23.

Varje klinisk tillämpning kräver optimering av provtagningsprotokollet för att säkerställa att analysmetodens prestanda uppfyller förväntade kriterier. I detta avseende är fördelen med att utnyttja SPME möjligheten att justera förutsättningar för olika experimentella konstruktioner. Mångfalden av tillgängliga extraktionsfaser ger ett brett spektrum av extraherade metaboliter med diversifierade polariteter. Samtidigt kan detta anses vara en begränsning av metoden på grund av att varje sorbent ger selektivitet mot specifika egenskaper och inte extraherar alla föreningar som finns i provmatrisen. Det bör noteras att SPME beläggningar extrahera endast via fria molekyler, och helt enkelt inte interagerar med en bunden fraktion av analyten. Beläggningarnas biokompatibilitet inför inte toxicitet för vävnaden samtidigt som man håller fast utvinningen av stora molekyler som proteiner; som en konsekvens hämmas de enzymatiska processerna redan i provsamlingsskedet och förekomsten av artefakter minimeras, vilket är en stor fördel jämfört med alternativa provtagningsmetoder. Beläggningens längd påverkar effektiviteten vid extraktion (dvs. beläggningens längd betecknar ytan och utsugningsfasvolymen); alltså ger längre beläggningar högre återvinningar. Å andra sidan möjliggör kortare beläggningar högre rumslig upplösning. För tillförlitliga resultat är det avgörande att dränka sonden till exakt samma djup av njurbarken. Insättning för djup orsakar risk för att komma in i njuren medulla. Tiden för extraktionen står också i proportion till extraktionseffektiviteten. Därför är val av optimal utvinningstid ett av de mest kritiska stegen i SPME-metodutveckling. Tidsmätningens noggrannhet ger högsta repeterbarhet. I biologiska tillämpningar som den som diskuteras finns det alltid en kompromiss mellan känsligheten och repeterbarheten hos det analytiska protokollet och begränsningarna i det medicinska förfarandet. Medan jämviktsextraktion ger högsta känslighet, av säkerhetsskäl, används pre-jämviktsförhållanden ofta i sådana tillämpningar, eftersom extraktionstiden inte bör påverka den totala varaktigheten av operationen. Effektiviteten av desorption bestäms av processens tid och desorptionslösningsmedlets sammansättning, som bör vara kompatibel med den mobila fas som används för kromatografisk separation9,10,11.

Ett av de stora kraven för diagnostisk instrumentering som används för intrakirurgiska bedömningar är tid för analys. Man försöker med nuvarande försök att utveckla ett snabbt verktyg för in vivo SPME-utsug som kopplas direkt till en masspektrometer via moi- (microfluidic open interface)24 eller belagda bladspray (CBS)25. Sådana tillvägagångssätt skulle möjliggöra utlämnande av analysresultat i verklig eller nära realtid. Användningen av sådana metoder för analyser före intervention av metaboliska och lipidomic profiler skulle kunna förbättra beslutsprocessen under transplantation förfaranden, möjliggör bästa möjliga personlig strategi och snabb respons vid organsvikt.

Som en sammanfattning, det är en hypotes om att det föreslagna protokollet kommer att möjliggöra uppnåendet av full metaboliska och lipidomic profiler av njure ympkvistar, vilket i sin tur skulle ge en omfattande bedömning av organ kvalitet och karakterisering av de processer som ansvarar för ischemi-reperfusion skada. Projektets nyhet omfattar utnyttjande av solid-phase microextraction (SPME), som erbjuder låg invasiv provtagning av levande system, i kombination med en av de mest innovativa teknikerna som finns för metabolomik och lipidomics-analys (t.ex. Orbitrap-masspektrometern med hög upplösning). SPME kombinerar provsamling, extraktion och släckning av metaboliter i ett steg, vilket gör det därför till ett perfekt verktyg för snabb analys. Det förväntas att detta protokoll kommer att bidra till att svara på frågor som rör vad pre-transplant villkor av njure är ansvariga för fördröjd organfunktion eller dess dysfunktioner efter transplantation, samt till hur transplantatet bevarande protokollet påverkar biokemi av organet. Sådan kunskap skulle inte bara ha betydande inverkan på förebyggandet av eventuella komplikationer relaterade till transplantation, men kan bidra till att förbättra nuvarande graft bevarande protokoll, minimera förlust av livskraftig transplantation vävnad samt förlust av liv. Den föreslagna lösningen kommer att öppna dörren för ytterligare undersökningar på detta område, inklusive validering av specifika potentiella biomarkörer och förbättring av terapeutiska resultat inom transplantationsologi.

Disclosures

Författarna vill erkänna MilliporeSigma (Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland) för att tillhandahålla SPME-enheter och Thermo Fisher Scientific för tillgång till Q-Exactive Focus Orbitrap masspektrometer.

Acknowledgments

Studien fick stöd av anslag Opus UMO-2017/27/B/NZ5/01013 från National Science Centre. Författarna vill erkänna MilliporeSigma, ett företag av Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland för att tillhandahålla SPME-enheter. Life science-verksamheten i Merck fungerar som MilliporeSigma i USA och Kanada. Dessutom vill författarna tacka Thermo Fisher Scientific för tillgång till Q-Exactive Focus orbitrap masspektrometer. Författarna vill tacka Dr Aleksandra Woderska-Jasińska och personalen vid institutionen för transplantationsologi och allmän kirurgi i Bydgoszcz för deras vänliga hjälp i projektet. BB vill tacka prof. Janusz Pawliszyn för möjligheten att provinsamling på Toronto General Hospital under sin vistelse på University of Waterloo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Merck 5330010050 Mobile phase additive
Acetonitrile Alchem 696-34967-4X2.5L HPLC solvent
Ammonium acetate Merck 5330040050 Mobile phase additive
BENCHMIXER XL MULTI-TUBE VORTEXER Benchmark Scientific BV1010 Vortex mixer
Caps Perlan Technologies 5183-2076 Blue scrw tp, pre-slit PTFE/Si spta, 100PK
Chloroform Merck 1024441000
Discovery HS F5 Supelguard Cartridge, 3 μm, L × I.D. 2 cm × 2.1 mm Merck 567570-U HPLC guard column
Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm Merck 567502-U HPLC column
Formic acid Alchem 497-94318-50ML Mobile phase additive
Glass vials Perlan Technologies 5182-0714
HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm Shim-Pol PHX-00D-4449-B0 HPLC column
HILIC SecurityGuard Cartridge, 3 μm, 4 x 2.0 mm Shim-Pol PHX-AJ0-8328 HPLC guard column
Isopropanol Alchem 231-AL03262500 HPLC solvent
Methanol Alchem 696-34966-4X2.5L HPLC solvent
Nano-pure water Merck 1037281002 HPLC solvent
Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS Thermo Scientific Q Exactive Focus Mass Spectrometer
SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm Merck 1506570001 HPLC column
SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm Merck 1504360001 HPLC guard column
SPME LC fiber probes, mixed mode Supelco prototype fibers
UltiMate 3000 HPLC systems Thermo Scientific UltiMate 3000 HPLC system
Vial inserts (deactivated) Perlan Technologies 5181-8872
XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm Waters 186005644 HPLC column
XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge 3.5μm, 2.1x5mm Waters 186007811 HPLC guard column

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. U.S. Department of Health & Human Services. Organ Procurement and Transplantation Network. , Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov (2019).
  2. Branger, P., Undine, S. Annual Report 2018/Eurotransplant International Foundation. , Eurotransplant Foundation. Leiden. (2018).
  3. Dare, A. J., Pettigrew, G. J., Saeb-Parsy, K. Preoperative assessment of the deceased-donor kidney: From macroscopic appearance to molecular biomarkers. Transplantation. 97, 797-807 (2014).
  4. Mueller, T. F., Solez, K., Mas, V. Assessment of kidney organ quality and prediction of outcome at time of transplantation. Seminars in Immunopathology. 33, 185-199 (2011).
  5. Xu, J., et al. Lipidomics comparing DCD and DBD liver allografts uncovers lysophospholipids elevated in recipients undergoing early allograft dysfunction. Scientific Reports. 5, 1-10 (2015).
  6. Rao, S., et al. Early lipid changes in acute kidney injury using SWATH lipidomics coupled with MALDI tissue imaging. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 310, 1136-1147 (2016).
  7. Wishart, D. S. Metabolomics: The principles and potential applications to transplantation. American Journal of Transplantation. 5, 2814-2820 (2005).
  8. Kim, S. J., Kim, S. H., Kim, J. H., Hwang, S., Yoo, H. J. Understanding metabolomics in biomedical research. Endocrinology and Metabolism. 31, 7-16 (2016).
  9. Bojko, B., et al. Solid phase microextraction fills the gap in tissue sampling protocols. Analytica Chimica Acta. 803, 75-81 (2013).
  10. Filipiak, W., Bojko, B. SPME in clinical, pharmaceutical, and biotechnological research - How far are we from daily practice. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. , 115-213 (2019).
  11. Bojko, B., et al. Low invasive in vivo tissue sampling for monitoring biomarkers and drugs during surgery. Laboratory Investigation. 94, 586-594 (2014).
  12. Ahmad, I. Biopsy of the transplanted kidney. Seminars in Interventional Radiology. 21, 275-281 (2004).
  13. Plattner, B. W., et al. Complications and adequacy of transplant kidney biopsies: A comparison of techniques. Journal of Vascular Access. 19, 291-296 (2018).
  14. Tapia-Canelas, C., et al. Complications associated with renal graft biopsy in transplant patients. Nefrologia. 34, 115-119 (2014).
  15. Afshinnia, F., et al. Lipidomics and Biomarker Discovery in Kidney Disease. Seminars in Nephrology. 38, 127-141 (2018).
  16. Zhao, Y. Y., Vaziri, N. D., Lin, R. C. Lipidomics: New insight into kidney disease. Advances in Clinical Chemistry. 68, 153-175 (2015).
  17. Kaminski, J., et al. Oxygen Consumption by Warm Ischemia-Injured Porcine Kidneys in Hypothermic Static and Machine Preservation. Journal of Surgical Research. 242, 78-86 (2019).
  18. Wijermars, L. G. M., et al. Defective postreperfusion metabolic recovery directly associates with incident delayed graft function. Kidney International. 90, 181-191 (2016).
  19. Huang, H., et al. Proteo-metabolomics reveals compensation between ischemic and non-injured contralateral kidneys after reperfusion. Scientific Reports. 8, 1-12 (2018).
  20. Solati, Z., Edel, A. L., Shang, Y., Karmin, O., Ravandi, A. Oxidized phosphatidylcholines are produced in renal ischemia reperfusion injury. PLoS One. 13, 1-24 (2018).
  21. Wishart, D. S. Metabolomics in monitoring kidney transplants. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 15, 637-642 (2006).
  22. Abbiss, H., Maker, G. L., Trengove, R. D. Metabolomics approaches for the diagnosis and understanding of kidney diseases. Metabolites. 9, (2019).
  23. Zhang, Z. H., et al. Metabolomics insights into chronic kidney disease and modulatory effect of rhubarb against tubulointerstitial fibrosis. Scientific Reports. 5, 1-17 (2015).
  24. Looby, N. T., et al. Solid phase microextraction coupled to mass spectrometry: Via a microfluidic open interface for rapid therapeutic drug monitoring. Analyst. 144, 3721-3728 (2019).
  25. Gómez-Ríos, G. A., Tascon, M., Pawliszyn, J. Coated blade spray: Shifting the paradigm of direct sample introduction to MS. Bioanalysis. 10, 257-271 (2018).

Tags

Medicin transplantation njure kemisk biopsi metabolom lipidomic fast fas mikroextraktion (SPME) vätskekromatografi i kombination med masspektrometri (LC-MS)

Erratum

Formal Correction: Erratum: Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment
Posted by JoVE Editors on 08/28/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment. One of the affiliations was updated.

The third affiliation was updated from:

Department of Transplantation and General Surgery, University Hospital, University of Nicolaus Copernicus Torun"

to:

Department of Transplantology and General Surgery, Collegium Medicum in Bydgoszcz, Antoni Jurasz University Hospital No. 1 in Bydgoszcz, Nicolaus Copernicus University in Torun, Bydgoszcz, Poland

Använda en kemisk biopsi för graft kvalitetsbedömning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stryjak, I., Warmuzińska, N.,… More

Stryjak, I., Warmuzińska, N., Łuczykowski, K., Hamar, M., Urbanellis, P., Wojtal, E., Masztalerz, M., Selzner, M., Włodarczyk, Z., Bojko, B. Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment. J. Vis. Exp. (160), e60946, doi:10.3791/60946 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter