Summary
Представленный протокол описывает метод нейритового анализа наростов и оценки нейротоксичности малых молекулярных соединений.
Abstract
Neurite анализ нарост и нейротоксичность оценки двух основных исследований, которые могут быть выполнены с использованием представленного метода здесь. Данный протокол обеспечивает надежный анализ нейрональной морфологии вместе с количественными измерениями модификаций по длине нейрита и локализации синаптического белка и изобилию при лечении небольшими молекулярными соединениями. В дополнение к применению представленного метода в исследованиях нейритового роста, оценка нейротоксичности может быть выполнена для оценки, разграничения и ранжирования коммерческих химических соединений на основе их потенциального эффекта нейротоксичности развития.
Хотя клеточные линии в настоящее время широко используются в сложных анализов скрининга в неврологии, они часто отличаются генетически и фенотипически от их происхождения тканей. Первичные клетки, с другой стороны, поддерживают важные маркеры и функции, наблюдаемые in vivo. Таким образом, из-за потенциала перевода и физиологической значимости, что эти клетки могут предложить нейрит анализ роста и нейротоксичность оценка может значительно извлечь выгоду из использования человеческих нейронных клеток-предшественников (HNPCs) в качестве основной модели клеток человека.
Представленный метод здесь может быть использован для проверки на способность соединений, чтобы вызвать нейритовой нарост и нейротоксичность, воспользовавшись человеческого нервного прародителя клеточных нейронов, клеточной модели тесно представляющих человеческой биологии ".
Introduction
Neurite роста является процессом, основополагающим для формирования нейронной сети и регенерации нервов1,2. После травмы, нейрит нарост играет ключевую роль в регенерации нервной системы. Нейрит нарост также является важным элементом внеклеточной сигнализации в индуцировании нейронных регенеративных мероприятий для повышения результатов для нейродегенеративных расстройств и нейрональных травм3,4,5,6.
Поддерживая свой потенциал дифференциации в производстве различных нейронных линий, клетки-предшественники человека (HNPCs) могли бы обеспечить модельную систему для изучения функции центральной нервной системы (ЦНС) и развития7,,8,9. Высокий переводческий потенциал и физиологическая значимость ГНПЦ в качестве основной модели клеток человека дают значительное преимущество в скринингах обнаружения лекарств, связанных с нейритом. Тем не менее, обслуживание и масштабирование основных моделей клеток для анализа высокой пропускной способности может быть трудоемким и трудоемким10,,11,,12,13.
В дополнение к применению представленного метода в исследованиях нейритового нарастания, оценка нейротоксичности является еще одним приложением с использованием нейронов, полученных из hNPC. Существуют тысячи коммерческих химических соединений, которые либо не рассматриваются или с плохо понимаемой нейротоксичности потенциал. Таким образом, более надежные и эффективные скрининговые эксперименты для оценки, разграничения и ранжирования соединений на основе их потенциала для получения развития нейротоксичности пользуется большим спросом14. Увеличение распространенности и частоты неврологических расстройств наряду с обилием непроверенных соединений в окружающей среде требует разработки более надежных и эффективных экспериментов по выявлению опасных экологических соединений, которые могут представлять нейротоксичность15.
Представленный метод здесь может быть использован для проверки на способность соединений, чтобы вызвать нейритовой нарост и нейротоксичность, воспользовавшись человеческим нейроном нервного прародителя, полученных из клетки, клеточной модели, тесно представляющей человеческую биологию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Заявление по этике: Образцы плода были получены из исследовательской лаборатории врожденных дефектов в Университете Вашингтона в Сиэтле в рамках программы распределения тканей, поддерживаемой Национальным институтом здравоохранения (NIH). Исследовательская лаборатория по врожденным дефектам получила соответствующее письменное информированное согласие родителей, а закупка тканей контролировалась Институциональным наблюдательным советом Университета Вашингтона. Вся работа была выполнена с одобрения Человеческого Субъект исследовательского бюро в Университете Майами8.
1. Изоляция и культура клеток-предшественников нейронов человека (hNPCs)
- Поместите ткани мозга в 100 мм чашку Петри и тщательно удалить очинки с помощью щипцов.
- Перенесите ткани мозга в коническую трубку размером 50 мЛ и вымойте ее дважды с помощью 20 мл PBS, аккуратно инвертируя трубку.
- Инкубировать ткани мозга в новой конической трубки 50 мЛ, погружая ткани в клеточном диссоциационном растворе (см. Таблицу материалов)и DNase I (10 U/mL) в течение 10 мин при 37 градусов по Цельсию.
- Добавьте 5 мл нейронной клеточной культуры среды (см. Таблицу Материалов)в ткани мозга, содержащую трубку, и механически разъедините нейросферы, тритурируя от 20 до 30 раз через 1000-й зл пипетный наконечник, чтобы сделать одноклеточную подвеску.
- Фильтруй клеточное суспензию через 70-м клеточный ситечко для удаления клеточных кластеров.
- Семя одноклеточной подвески в вентилируемой колбе Т-25, предоставленной 5-10 мЛ нейрональной клеточной культуры среды, дополненной компонентами, подробно описанными в таблице 1.
- Стерилизовать раствор гепарина путем фильтрации через фильтр 0,2 мкм. B-27 дополнение без витамина А является сыворотки бесплатно дополнение для выращивания нервных прародителей и стволовых клеток, без индуцирования дифференциации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки нервного прародителя человека (hNPCs) изолированы от мозга плода человека собранных от прерванного плода. После 7-10 дней в культуре, нервные стволовые клетки (NSCs) образуют свободно плавающие нейросферы колоний, в то время как другие типы клеток остаются в подвеске, как одиночные клетки или прикрепить к нижней части колбы. Изолированные hNPCs могут быть культивируемы как нейросферы в подвеске в течение несколькихмесяцев 8,,16,17.
- Стерилизовать раствор гепарина путем фильтрации через фильтр 0,2 мкм. B-27 дополнение без витамина А является сыворотки бесплатно дополнение для выращивания нервных прародителей и стволовых клеток, без индуцирования дифференциации.
| Сумма | Компонент |
| 100 мл | EGF (20 нг/мл) |
| 100 мл | FGF (10 нг/мл) |
| 2 мл | B-27, Минус витамин А (50X) |
| 1 мл | L-аланил-Л-глютамин (100X) (см. таблицу материалов) |
| 4 л | Гепарин (2 мкг/мл) |
| 96,8 мл | Нейронная клеточная культура среды (см. таблицу материалов) |
Таблица 1. Компоненты, необходимые для изготовления 100 мЛ культурных носителей
2. Прохождение HNPCs
- Соберите носители, содержащие плавающие сферы, большие и малые нейросферы, и перенесите их в коническую трубку 50 мЛ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за неизвестных причин, сроки для разделения нейросфер варьируется от 7 дней до 30 дней. Тем не менее, как правило, нейросферы должны быть проход, когда они достигают диаметра более 700-900 мкм. Это когда центр нейросферы начинает темнеть, что считается признаком высокой скорости клеточной смерти18. - Спин нейросфер вниз по центрифугу на 300-400 х г в течение 3 мин.
- Тщательно аспирировать супернатанта, а затем погрузить сферы в 500 мл размороженного диссоциации клеток реагент (см. таблицу материалов).
- Сделать aliquots диссоциации клеток реагент, добавив 500 мл на 1,5 мл микротрубок и хранить при -20 градусов по Цельсию. Чтобы избежать потери активности фермента, оттаить реагент диссоциации клеток, удерживая на RT или тепло в течение 5 минут в 37 кк воды / бисерной ванне.
- В зависимости от плотности и размера сфер, инкубировать подводные сферы при 37 градусов по Цельсию в течение 5-15 мин.
- Добавьте 5-10 мл предварительно разогретых культурных носителей в нейросферы, содержащие 50 мЛ конической трубки и центрифуги на 300-400 х г в течение 5 мин, чтобы осадить нейросферы.
- Аспирировать супернатант и мягко пипетки вверх и вниз, используя 1000 мл пипетка, в 2 мл культуры средств массовой информации, пока все нейросферы находятся в одной клеточной подвески.
ПРИМЕЧАНИЕ: Диссоциация станет видимой невооруженным глазом. Перед диссоциацией, нейросферы находятся в виде сфер. После погружения в диссоциацию реагента и пипетки вверх и вниз, они станут одиночными клетками.- Подсчитайте клетки и пластины одиночных клеток, от 2 до 3 миллионов клеток на колбу Т-25 в 10 мл культурных носителей.
- Кормите клетки каждые 3 дня, заменяя половину культурных носителей.
- Поселить нейросферы, опираясь колбу так, что она находится на нижнем углу. Держите колбу в положении около 1-2 мин до неерозного отложения. Затем aspirate половину средств массовой информации осторожно, вставив серологических пипетки в средствах массовой информации выше поселились нейросферы. Разрозненные клетки могут агрегироваться в сферы через 2-3 дня в культуре19.
3. Замораживание ГНПЦ
- Подготовьте средство замораживания клеток, добавив DMSO к средствам культуры к окончательной концентрации 10% (v/v) или используйте коммерчески доступную криоконсервационную среду для чувствительных типов клеток (см. Таблицу Материалов).
- Сортировать большие сферы путем передачи средств массовой информации в 50 mL конической трубки и позволяя сферы оседают под действием силы тяжести. Затем удалите и перенесите большие нейросферы в новую коническую трубку 50 мл для прохождения с помощью наконечника пипеса 200 или 1000 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нейросферы диаметром более 900 мкм считаются большими, а те, диаметр которых меньше 500 мкм, считаются небольшими. - Спин остальных нейросфер вниз центробежием при 300-400 х г в течение 3 мин. Тщательно удалите супернатант.
- Resuspend до 100 сфер в 1 мЛ криоконсервационного реагента и перенести его в криотрубку.
- Хранить на ночь при температуре -80 градусов в контейнере для замораживания ячейки (см. Таблицу материалов)и переместите его в жидкий азот на следующий день для длительного хранения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно заморозить малые и средние нейросферы (менее 900 мкм в диаметре) и избегать замораживания нейросфер большого размера (более 900 мкм в диаметре) или одиночных клеток. Для того, чтобы уменьшить повреждение клеток во время оттаивания образца, держать клетки плотной путем посева талых нейросфер в небольшой колбе T25.
4. Дифференциация и обработка ГНПЦ
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы вызвать дифференциацию, нейросферы дезагрегируются на одиночные клетки, подсчитываются, а затем сеют на тарелках с покрытием в течение 5 дней. Затем дифференцированные клетки обрабатываются на 24 ч с помощью тестовых соединений перед иммунотенией и количественной оценкой флуоресценции.
- Покрытие
- Добавьте 200 мл поли-L-лизина (PLL) на колодец из 4-хорошо стеклянных камерных слайдов (140 мл на колодец из 8-хорошо камерных слайдов).
- Инкубировать на 1 ч при комнатной температуре (RT).
- Вымойте 3x с PBS.
- Дайте ему высохнуть на RT (около 30 мин).
- Добавьте 150 мл ламинина (50 мкг/мл) на колодец из 4-хорошо стеклянных камерных горок (120 мл на колодец из 8-хорошо камерных слайдов).
- Инкубировать в течение 2 ч при 37 градусов по Цельсию.
- Вымойте 3x с PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Покрытые камеры слайды могут храниться при 4 градусов по Цельсию в течение 1 месяца.
- Покрытие клеток
- Граф и пластина 80000 одноклеточных нейросфер (нейросферы в одной клеточной подвеске) на колодец из 4-хорошо камерных слайдов (70 000 клеток на колодец 8-хорошо камерного слайда).
- Добавьте 500 мл дифференциации носителей на колодец 4-хорошо камерного слайда (250 мкл-носителей на колодец из 8-хорошо камерных слайдов).
- Чтобы сделать дифференциацию носителя во-первых, добавьте следующие компоненты в таблице 2 в стерильный одноразовый контейнер, чтобы сделать нейронные индуцирующие средства массовой информации (NIM).
- Добавьте следующие ингредиенты в таблице 3 до 48,5 мл NIM, сделанные в предыдущем шаге, чтобы сделать дифференциацию носителями.
- Инкубировать в течение 5 дней при 37 градусов по Цельсию.
- После 5 дней, лечить клетки в течение 24 ч, заменив половину средств массовой информации в каждой скважине со свежими средствами массовой информации смешивается с желаемой концентрации тестовых соединений, в том числе соответствующие элементы управления.
| Сумма | Компонент |
| 49 мл | DMEM/F-12 |
| 0,5 мл | N2 дополнение (100X) |
| 0,5 мл | MEM несущественные аминокислоты (100X) |
| 2 л | Гепарин (2 мкг/мл) (Сток Кон. составляет 50 мг/мл) |
Таблица 2. Компоненты, необходимые для изготовления 50 мл NIM
| Сумма | Компонент |
| 1 мл | B-27 (50X) |
| 500 мл | Антибиотико-антимикотический (100X) |
| 5 л | Ретиноевая кислота (0,1 МК) |
| 50 мл | GDNF (10 мкг/мл) |
| 50 мл | БДНФ (10 мкг/мл) |
| 5 л | Аскорбиновая кислота (0,2 мкг/мл) (Stock Conc. составляет 2 мг/мл) ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется сделать свежей. |
| 48,5 мл | Ним |
Таблица 3. Компоненты, необходимые для изготовления 50 мЛ дифференциации носителей
5. Иммуноцитохимия (МЦМ)
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки фиксируются 4% формальдегидом. Пермеябиизация и блокирование затем выполняется для улучшения проникновения и предотвращения неспецифической связывания антител. Клетки затем инкубируются первичными антителами в одночасье. Впоследствии клетки инкубируются флуоресцентно помеченными вторичными антителами. Наконец, после использования DAPI для испачкания ядра устанавливаются камерные слайды.
- Фиксации
- Аккуратно аспирировать средства массовой информации в каждом колодце.
- Добавьте 500 мл 4% формальдегида на колодец из 4-хорошо камерных слайдов (250 мл на колодец из 8-хорошо камерных слайдов).
- Инкубация в течение 15 минут на RT.
- Аккуратно промойте 2x с 500 мл PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: После фиксации, оставляя 1 mL PBS в каждом колодце, культурные слайды могут храниться при 4 градусов по Цельсию до 3 месяцев.
- Клеточная пермякализация и блокировка
- Добавьте следующие компоненты в таблице 4 в стерильный одноразовый контейнер, чтобы сделать буфер антитела (Ab).
- Смешайте следующие ингредиенты в таблице 5 с буфером Ab, сделанным на предыдущем этапе, чтобы сделать завихрожде и блокирующее решение ячейки.
- Добавьте 500 мл на колодец из 4-хорошо камерных горок и инкубировать на 1 ч на RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ab буфер может храниться при 4 градусах Цельсия.
| Сумма | Компонент |
| 1,75 г | NaCl (150 мМ) |
| 1,2 г | TrisBase (50 мМ) |
| 2 г | BSA 1% |
| 3,6 г | L-лизин (100 мМ) |
| 8 г | Азид натрия (4%) |
| 200 мл | Дистиллированная вода. ПРИМЕЧАНИЕ: Сначала растворить необходимые компоненты в 150 мл воды, а затем настроить до 200 мл. |
Таблица 4. Компоненты, необходимые для изготовления 200 мл буфера антитела
| Сумма | Компонент |
| 600 мл | 20% Козья сыворотка |
| 6 л | 0,2% Тритон-X100 |
| 2394 л | Буфер антител. ПРИМЕЧАНИЕ: Сначала растворить необходимые компоненты в 2 мЛ буфера Ab, а затем настроить на рН 7.4. Затем добавьте больше буфера Ab, чтобы приспособиться к окончательному объему 3 мл и фильтровать стерилизовать. |
Таблица 5. Компоненты, необходимые для изготовления 3 мЛ клеточного пермяки и блокирующего решения
- Окрашивания
- Вымойте 2x с 500 мл PBS.
- Добавьте разбавленное первичное антитело, анти-я-тубулин III (1:200), и инкубировать на ночь при 4 градусах (200 мл на колодец из 4-хорошо камерных слайдов). Разбавить первичное антитело в PBS.
- Вымойте 2x с PBS.
- Добавьте разбавленное, в PBS, флуоресцентно обозначенное вторичное антитело, Alexa Fluor 488 (1:500), и инкубировать на 2 ч на RT в месте защищенном от света (250 зл на колодец 4-ну камерных слайдов)
- Вымойте 2x с PBS.
- Добавьте разбавленный, в PBS, DAPI (300 nM концентрация) и инкубировать в течение 5 минут на RT в месте, защищенном от света (300 мл на колодец 4-хорошо камерных слайдов).
- Вымойте 3x с PBS.
- Смонтировать камерные горки, используя следующие инструкции.
- Разойдите камерный слайд, преодолев отколовшиеся вкладок и удалив прокладку и основание.
- Добавьте одну каплю монтажного раствора (см. Таблицу Материалов)на колодец из 4-хорошо камерных слайдов. Затем используйте слайд крышки, чтобы покрыть весь слайд.
- Используя пинцет и под углом, поместите одну сторону крышки скольжения против слайда при контакте с внешним краем жидкого падения.
- Тщательно наконечник крышки на монтажное решение при снижении его на место. Избегайте создания пузырьков. Возьмите наконечник пипетки и нажмите его на крышку скольжения. Пузыри перейдут в сторону.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образование пузыря неизбежно время от времени. Если это происходит, изображение вокруг них до тех пор, как Есть несколько. - Следуйте указаниям производителя для лечения времени. Избегайте использования неукайных монтажных решений из-за сложности обработки во время визуализации. В противном случае с помощью соответствующего уплотнитель крышки на краях требуется для предотвращения крышки от скольжения во время изображения.
- Чтобы запечатать крышку, используйте лак для ногтей и сделать небольшую линию на краю крышки скольжения. Пусть лак для ногтей сухой около 2 мин.
6. Приобретение изображений, нейритовый рост и количественная оценка интенсивности флуоресценции
ПРИМЕЧАНИЕ: После окрашивания, используйте конфокальный микроскоп с 20x целью и размером изображения 1024 х 1024 пикселей для получения изображений обработанных клеток. Возьмите изображение по крайней мере из двух полей на биологическую репликацию в состоянии. Затем используйте программное обеспечение для анализа изображений Фиджи (ImageJ 1.51u) для количественной оценки длины нейта. Короче говоря, измерьте длину самого длинного неврита для каждого нейрона и после усреднения значений за лечение, используйте тест студента для независимых групп для сравнения средств между экспериментальными группами и контрольной группой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Доступно несколько коммерческих (Imaris, Volocity, Amira) и с открытым исходным кодом (ImajeJ, CellProfiler, Vaa3D, BioImageXD, Icy, KNIME) программ обработки изображений. Среди этих программ, ImageJ стал инструментом выбора для биологического анализа изображений20,21. Портал ImageJ в https://imagej.net/Introduction является полезным источником информации, обеспечивающей тщательное описание основных и встроенных функций ImageJ, включая обработку изображений, колокализацию, деконволюцию, регистрацию, сегментацию, отслеживание и визуализацию.
- Измерение нейронных результатов с помощью программного обеспечения для анализа изображений Фиджи
- Как показано на рисунке 1, открыть изображение либо путем перетаскивания и падения его на программное обеспечение Фиджи или, выбрав файл Открыть.
- Выберите Анализ (ru) Инструменты ROI менеджер, а затем право нажмите на 5-й значок в панели инструментов прямо и переключиться наth линию от руки. Дополнительно, дважды щелкните на такой же иконке для того чтобы изменить ширину линии до 10, и после этого трассировка самый длинный neurite, начиная около тела клетки и удлиняющ к кончику neurite.
- Нажмите Ctrl и T и затем F, чтобы добавить измерения в рентабельности менеджер и выделить измеренный нейрон. Выберите все номера в рентабельности инвестиций,нажмите на меру,выберите все рассчитанные длины, и копировать / вставить в таблицу.
- Измерение интенсивности флуоресценции помеченных клеток с программным обеспечением анализа изображений Фиджи
- Как показано на рисунке 2, после открытия изображения, нажмите на 4-й значок в панелиth инструментов Freehand выбор. Нарисуйте форму клетки.
- Выберите Анализ (ru) Установить измерения и выбрать для следующих значений: Площадь, Интегрированная плотность, Среднее значение серого Анализ Измерение (всплывающее окно с стопкой значений открывается).
- Выберите область рядом с ячейкой в качестве фона (размер не важен), а затем выберите Analyze Мера. Выберите все измеренные данные и скопировать/вставить в электронную таблицу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Интегрированная плотность (IntDen) является элементом, используемым для определения флуоресцентной интенсивности. В этом исследовании флуоресцентная интенсивность молекулы-мишени измеряется для первоначального анализа ее распределения в клетке, а затем количественного обилия молекулы-мишени при различных методах лечения. Следовательно, эффективность лечения будет измеряться и сравниваться с контролем.
7. Оценка нейротоксичности
ПРИМЕЧАНИЕ: Цитотоксичность тестовых соединений оценивается в 384-ну пластин (см. Таблицу Материалов) с использованием люминесцентной клеточной жизнеспособности анализа (см. таблицу материалов). ГНПЗ готовятся по тому же методу, за исключением небольших изменений, описанных в разделе "Дифференциация и лечение ГНПЦ". Впоследствии, люминесцентный сигнал, генерируемый люминесцентным анализом жизнеспособности клеток, измеряется с использованием считывателя микропластов. Люминесцентный сигнал пропорционален концентрации клеточного АТФ, которая сама по себе прямо пропорциональна количеству жизнеспособных клеток, присутствующих в каждом колодце.
- Покрытие
- Добавьте 30 мл поли-Л-лизина (PLL) на колодец из 384-хорошо.
- Инкубировать за 1 ч на RT.
- Вымойте 2x с PBS.
- Дайте ему высохнуть на RT (около 30 мин).
- Добавьте 30 мл ламинина (50 мкг/мл) на колодец из 384-го колодца.
- Инкубировать в течение 2 ч при 37 градусов по Цельсию.
- Вымойте 2x с PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Покрытые 384-хорошо пластины могут храниться при 4 градусов по Цельсию в течение 1 месяца.
- Покрытие клеток
- Граф и пластина 20000 одноклеточных нейросфер на колодец 384-хорошо пластины в 25 МЛ дифференциации средств массовой информации.
- Инкубировать в течение 5 дней при 37 градусов по Цельсию.
- Через 5 дней, лечить клетки в течение 24 ч с помощью тестовых соединений, подготовленных в 6x окончательной желаемой концентрации в 5 МЛ тома (чтобы сделать окончательный объем 30 мл на хорошо).
- Анализ жизнеспособности клеток
- Добавьте 30 мл люминесцентных клеточных жизнеспособность анализа реагента на колодец 384-хорошо пластины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте объем люминесцентных жизнеспособность ячейки анализа реагента, равного объему, присутствующему в каждой скважине. Оттепель люминесцентных клеток жизнеспособность анализа реагента и эквилибрировать RT до использования. - Встряхните на шейкере пластины в течение 2 минут (для смешивания и индуцирования лиза клеток).
- Спин смеси вниз по центрифугу на 300-400 х г на 30 с.
- Инкубировать 384-хорошо пластины в течение 10 минут на RT в месте, защищенном от света (для стабилизации люминесцентного сигнала).
- Запись люминесценции с микроплитным считывателем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте соответствующие элементы управления для анализа жизнеспособности, включая Velcade (при окончательной концентрации 10 МКМ) в качестве положительного и HBSS, содержащих DMSO (с конечной концентрацией 0,1% или 0,2%) как отрицательный контроль.
- Добавьте 30 мл люминесцентных клеточных жизнеспособность анализа реагента на колодец 384-хорошо пластины.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол, представленный в рукописи, успешно используется в двух недавно опубликованных работах22,,23. Рисунок 3 демонстрирует использование нейронов, полученных из ННПЦ, при изучении влияния ингибиторов HDAC в качестве эпигенетических соединений на расширение невритов в качестве маркера для нейритовых наростов и последующей нейрогенной способности малых молекулярных соединений.
Кроме того, на рисунке 4 нейротоксичность проверенных соединений (ингибиторы HDAC) также оценивается путем одновременной дифференциации HNPCs в 384-хорошо пластин, показывая потенциал представленной клеточной модели (HNPCs) для оценки нейротоксичности и способность к масштабированию для тестирования нейротоксичности для большего числа соединений.
В другой работе Sartor et al. (Рисунок 5), измерение интенсивности флуоресценции нейронных клеток для количественной оценки обилия H4K5ac, как знак гистона, после лечения нейронов, дифференцированных от HNPCs с эпигенетическими соединениями модификатора успешнопродемонстрированы 23. Кроме того, как показано на рисунке 6, в неопубликованной работе, протокол был использован для визуализации пресинаптического белка, синаптофизиана, чтобы проверить на возможный синаптогенный эффект малых соединений молекул.
Рисунок 1: Пошаговый рабочий процесс, иллюстрирующий подход к измерению нейронных результатов с помощью программного обеспечения для анализа изображений Фиджи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Пошаговый рабочий процесс, иллюстрирующий подход к количественной оценке интенсивности флуоресценции нейронных клеток с помощью программного обеспечения для анализа изображений Фиджи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Анализ нарастания неурита с помощью небольших молекулярных эпигенетических соединений.
()Представитель флуоресцентные изображения (20x увеличение) для лечения HNPCs полученных нейронов с гидроксомическим основе ингибиторы HDAC. Клетки нервного прародителя человека дифференцированы в течение 5 дней; затем обработаны для 24 ч с 0,1% DMSO (как контроль), и Трихостатин A, JNJ26481585, SB939, и PCI24781 (в качестве тестовых соединений). Затем иммуносетирование выполняется с нейронально-специфическими антителами тубулин III (зеленый) для визуализации нейронных процессов и количественной оценки длины нейрита и DAPI (синий) для визуализации ядер клеток. (B) Статистический анализ длины нейта в различных группах. Как показано на рисунке, все испытательные соединения могут вызвать нейрит нарост. Количественный анализ длины нейрита проводится с помощью программного обеспечения ImageJ. Бары ошибок представляют SEM; р-л; 0,001, р-л; 0,0001. Эта цифра была изменена из Bagheri и др.22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Оценка нейротоксичности с использованием люминесцентных анализов жизнеспособности клеток.
hNPCs посеяны и дифференцированы к нейронам в 384-хорошо пластины в соответствии с тем же методом, используемым для нейрита анализа нарост. После этого измеряется влияние тестовых соединений на жизнеспособность клеток после 24 ч воздействия. Как показано, нет существенной токсичности при лечении. Для анализа данных используется одностоящий ANOVA, а значение p lt; 0,05 считается статистически значимым. Эта цифра была изменена из Bagheri и др.22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: RGFP966 увеличивает H4K5ac в нейронах, дифференцированных от клеток-предшественников человека.
()Представитель иммунофлуоресценции окрашивания тубулина, DAPI, и H4K5ac после лечения с DMSO, RGFP966, или RGFP966 й J-1 в HNPCs полученных нейронов. (B) Количественная оценка интенсивности флуоресценции H4K5ac после лечения DMSO, RGFP966, или RGFP966 и J-1. Бары ошибок представляют SEM; р Зтт; 0,0001. Эта цифра была изменена из Sartor et al.23. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: Представитель иммунофлуоресценции окрашивания Synaptophysin (красный) для визуализации синаптических терминалов, тубулин (зеленый) для визуализации нейронных процессов, и DAPI (синий) для визуализации ядер клеток после лечения с DMSO (как контроль), и SB939 (как тест соединение) в HNPCs-производных нейронов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол является одним из немногих опубликованных работ, описывающих тест на нейрит длины при лечении с тестовыми соединениями. Кроме того, мы описываем, как использовать hNPCs для нейритового анализа нароста и оценки нейротоксичности. Используя этот анализ нейритового роста и оценку нейротоксичности на нейронах, полученных из HNPCs, продемонстрирован нейрогенный потенциал категории эпигенетических маломалекулярных соединений, ингибиторов HDAC, в индуцировании неуритовых наростов22. Кроме того, в другой работе, представленной Sartor et al., этот протокол используется для количественной оценки интенсивности флуоресценции H4K5ac, белка гистона, при лечении несколькими эпигенетическими соединениями модификатора23.
Когнитивная функция опирается на надлежащую проводку и функциональные соединения в нейронных схемах. Подробная и последовательная количественная оценка различных аспектов нейрональной морфологии в качестве фенотипического скрининга подхода имеет важное значение для достижения надежного понимания в основных путей, ведущих к расстройствам мозга, начиная от нейроразвития до психических расстройств. Фенотипический скрининг считается особенно эффективным подходом при изучении малокомипиных соединений в качестве кандидатов на положенные препараты для модулирования клеточного фенотипа. При таком подходе вместо того, чтобы допрашивать только одну цель, все компоненты и пути клетки исследуются24.
Нейронная морфология, включая форму, структуру и связь, считается ключевыми особенностями нейронной функции. Генетические возмущения, которые изменяют морфологию нейронов или локализацию и уровень синаптического белка, могут, в частности, способствовать анализу болезнетворных мутаций. Поэтому, надежные методы, необходимые для оценки воздействия возмущений на нейрональнойморфологии 25.
HNPCs, изолированы от эмбрионального мозга млекопитающих, которые впоследствии культивируются в пробирке в присутствии митогенов. Эти клетки состоят из нейросфер, которые характеризуются как плавающие клеточные агрегаты, состоящие из нейронных клеток-предшественников и радиальных глиальных клеток. HNPCs обеспечивают желанную модель системы для функции и развития нервной системы, сохраняя их потенциал дифференциации в производстве различных нейронных линий7,,8,9. Число нейрита, интенсивность, длина и ширина вместе с синаптическими характеристиками, включая модификации до- и постсинаптических белков, относятся к неритным и синаптическим изменениям, которые могут быть надежно и эффективно измерены с помощью представленного метода.
В связи с увеличением распространенности неврологических расстройств, таких как синдром дефицита внимания и гиперактивности и аутизм, нейротоксичность потенциал экологических химических веществ на детей остается общественной проблемой15,26. Таким образом, также изучается удобство использования нейронов, полученных из HNPCs, для надежной и эффективной оценки нейротоксичности. Как показано на рисунке 4,HNPCs могут быть адаптированы и масштабируется для оценки нейротоксичности в 384-хорошо пластин.
Нейротоксичность оценки в качестве приложения для введенной модели клеток возможно либо дифференциации нейросфер в нейроны до покрытия в 384-хорошо пластин или дифференциации клеток в то время как нейросферы поккрыны в 384-а пластины, как отдельные клетки. В последнем подходе, высокоточные навыки пипетки необходимы для покрытия точное количество нейросфер, которые дезагрегированы в отдельные клетки, а также для следующих процедур лечения с дифференциацией индуцирующих среды. Учитывая необходимые навыки пипетки, дифференциация перед покрытием рекомендуется для достижения более воспроизводимых результатов. Кроме того, сортировка навалочных клеток путем флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS) также потенциально может быть использована для точного разделения необходимого количества клеток, обходят потребность в высокоточных навыках трубоутирования.
Рекомендуется начать нейритный анализ нароста по оценке нейротоксичности, чтобы избежать повторных анализов нарост нейритов с различными дозами того же соединения, чтобы достичь нетоксичной концентрации. Таким образом, сочетание нейротоксичности оценки, используя люминесцентные клетки жизнеспособность анализа против дозы ответа кривой тестовых соединений приведет к поиску правильной дозировки с минимальными усилиями. Люминесцентный анализ жизнеспособности клеток является очень чувствительным методом для определения количества жизнеспособных клеток в клеточной культуре. Метод работает на количестве АТФ, присутствующих в культуре как индикатор клеточного метаболизма. Добавление, смешивание и измерение формата анализа обеспечивает простой и быстрый подход к проверке жизнеспособности клеток и цитотоксичности тестовых соединений.
Представленный протокол имеет некоторые ограничения следующим образом. Из-за наличия и присущей изменчивости, использование физиологически соответствующих первичных клеток ограничено25. HNPCs имеют медленный уровень распространения, что может ограничить его использование. Ручной крупномасштабный анализ флуоресцентных изображений нейронов занимает много времени и подвержен смещению экспериментатора. hNPCs можно рассматривать как молодые нервные клетки, не представляющие возрастных эпигенетических модификаций, накапливающихся в клетках на протяжении всей жизни человека. Как нейродегенеративные расстройства происходят у пожилых людей, HNPCs может не иметь адекватного физиологического значения, чтобы быть подходящей моделью для позднего начала условиях.
Хотя животные модели и клеточные линии были ценны в расшифровке молекулярных механизмов, лежащих в основе заболеваний, они показали ограничения в переводе выводов в человеческой терапии27,28,29,30. Индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hiPSCs) и эмбриональные стволовые клетки человека (hESCs) наряду с HNPCs считаются лучшими моделями клеток in vitro, переотделяющими физиологию человека. Поэтому hiPSCs- и hESCs-производных нейронов также потенциально могут быть использованы в качестве двух альтернативных источников клеток для нейритов анализ роста и нейротоксичности оценки, используя протокол, представленный здесь1,31.
В заключение, высокий потенциал перевода и физиологическая значимость HNPCs в качестве первичной модели клеток человека обеспечивает ценное средство в нейритных нарост связанных скринингов обнаружения наркотиков и нейротоксичности оценки перевешивают ограничения, упомянутые ранее.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы указывают на отсутствие потенциальных конфликтов интересов.
Acknowledgments
Это исследование было профинансировано грантовом исследования NIMAD (940714), присужденным MAF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-well Glass Chamber Slides | Sigma | PEZGS0816 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | R37117 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| Anti-β-Tubulin III | Thermo | MA1-118X | |
| B27 | Thermo | 17504001 | |
| B27 - minus vitamin A | Thermo | 12587010 | |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | |
| BSA | Sigma | A8531 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7572 | |
| CoolCell | Corning | 432000 | Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1°C/minute cell freezing in a -80°C freezer |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium containing 10% DMSO |
| DAPI | Thermo | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | 34869-100ML | |
| EGF | Gibco | PHG0311 | |
| FGF | Gibco | PHG6015 | |
| Formaldehyde | Thermo | FB002 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine supplement |
| Goat Serum | Thermo | 50062Z | |
| Heparin | Calbiochem | 375095 | |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-25G | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| mFreSR | StemCell Technologies | 5854 | Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates | Thermo | 164610 | |
| PBS | Thermo | 10010-049 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P5899-5MG | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo | P10144 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes |
| Synaptophysin | Thermo | MA5-14532 | |
| Tris Base | Sigma | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML |
References
- Sherman, S. P., Bang, A. G. High-throughput screen for compounds that modulate neurite growth of human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), (2018).
- Al-Ali, H., Beckerman, S. R., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. In vitro models of axon regeneration. Experimental Neurology. 287, 423-434 (2017).
- Kudo, T., et al. Induction of neurite outgrowth in PC12 cells treated with temperature-controlled repeated thermal stimulation. PloS One. 10 (4), 0124024 (2015).
- Higgins, S., Lee, J. S., Ha, L., Lim, J. Y. Inducing neurite outgrowth by mechanical cell stretch. BioResearch Open Access. 2 (3), 212-216 (2013).
- Muramatsu, R., Ueno, M., Yamashita, T. Intrinsic regenerative mechanisms of central nervous system neurons. Bioscience Trends. 3 (5), (2009).
- Read, D. E., Herbert, K. R., Gorman, A. M. Heat shock enhances NGF-induced neurite elongation which is not mediated by Hsp25 in PC12 cells. Brain Research. 1221, 14-23 (2008).
- Finan, G. M., et al. Bioactive Compound Screen for Pharmacological Enhancers of Apolipoprotein E in Primary Human Astrocytes. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1526-1538 (2016).
- Magistri, M., et al. A comparative transcriptomic analysis of astrocytes differentiation from human neural progenitor cells. European Journal of Neuroscience. 44 (10), 2858-2870 (2016).
- Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Research. 993 (1-2), 18-29 (2003).
- Grandjean, P., Landrigan, P. J. Neurobehavioural effects of developmental toxicity. The Lancet Neurology. 13 (3), 330-338 (2014).
- Finkbeiner, S., Frumkin, M., Kassner, P. D. Cell-based screening: extracting meaning from complex data. Neuron. 86 (1), 160-174 (2015).
- An, W. F., Tolliday, N. Cell-based assays for high-throughput screening. Molecular Biotechnology. 45 (2), 180-186 (2010).
- Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507 (2011).
- Ryan, K. R., et al. Neurite outgrowth in human induced pluripotent stem cell-derived neurons as a high-throughput screen for developmental neurotoxicity or neurotoxicity. Neurotoxicology. 53, 271-281 (2016).
- Magistri, M., Velmeshev, D., Makhmutova, M., Faghihi, M. A. Transcriptomics profiling of Alzheimer's disease reveal neurovascular defects, altered amyloid-β homeostasis, and deregulated expression of long noncoding RNAs. Journal of Alzheimer's Disease. 48 (3), 647-665 (2015).
- Darbinyan, A., Kaminski, R., White, M. K., Darbinian, N., Khalili, K. Isolation and propagation of primary human and rodent embryonic neural progenitor cells and cortical neurons. Neuronal Cell Culture. , 45-54 (2013).
- Gil-Perotín, S., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone: a review of the neurosphere assay. The Anatomical Record. 296 (9), 1435-1452 (2013).
- Ebert, A. D., McMillan, E. L., Svendsen, C. N. Isolating, expanding, and infecting human and rodent fetal neural progenitor cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 6 (1), 2 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676 (2012).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43 (1), 25-30 (2007).
- Bagheri, A., et al. HDAC Inhibitors Induce BDNF Expression and Promote Neurite Outgrowth in Human Neural Progenitor Cells-Derived Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1109 (2019).
- Sartor, G. C., et al. Enhancement of BDNF expression and memory by HDAC inhibition requires BET bromodomain reader proteins. Journal of Neuroscience. 39 (4), 612-626 (2019).
- Conde, C., Cáceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319 (2009).
- Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. Journal of Neuroscience Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
- Grandjean, P., Landrigan, P. J. Developmental neurotoxicity of industrial chemicals. The Lancet. 368 (9553), 2167-2178 (2006).
- Dragunow, M. The adult human brain in preclinical drug development. Nature reviews Drug Discovery. 7 (8), 659 (2008).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
- Pan, C., Kumar, C., Bohl, S., Klingmueller, U., Mann, M. Comparative proteomic phenotyping of cell lines and primary cells to assess preservation of cell type-specific functions. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (3), 443-450 (2009).
- Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. Journal of Proteome Research. 5 (4), 862-878 (2006).
- Yeo, Y., et al. Human Embryonic Stem Cell-Derived Neural Lineages as In Vitro Models for Screening the Neuroprotective Properties of Lignosus rhinocerus (Cooke) Ryvarden. BioMed Research International. 2019, (2019).
