Summary
El protocolo presentado describe un método para un ensayo de crecimiento de neurito y la evaluación de la neurotoxicidad de compuestos de moléculas pequeñas.
Abstract
El ensayo de crecimiento de la neurita y la evaluación de la neurotoxicidad son dos estudios principales que se pueden realizar utilizando el método presentado en el presente documento. Este protocolo proporciona un análisis fiable de la morfología neuronal junto con mediciones cuantitativas de modificaciones en la longitud de la neurita y la localización de proteínas sinápticas y abundancia en el tratamiento con compuestos de moléculas pequeñas. Además de la aplicación del método presentado en estudios de crecimiento de neuritas, se puede realizar una evaluación de la neurotoxicidad para evaluar, distinguir y clasificar los compuestos químicos comerciales en función de su posible efecto de neurotoxicidad del desarrollo.
A pesar de que las líneas celulares se utilizan hoy en día en ensayos de cribado compuestos en neurociencia, a menudo difieren genética y fenotípicamente de su origen tisular. Las células primarias, por otro lado, mantienen marcadores y funciones importantes observados in vivo. Por lo tanto, debido al potencial de traducción y la relevancia fisiológica que estas células podrían ofrecer un ensayo de crecimiento de neurita y la evaluación de la neurotoxicidad puede beneficiarse considerablemente del uso de células progenitoras neuronales humanas (hNPC) como el modelo de células humanas primarias.
El método presentado aquí se puede utilizar para detectar la capacidad de los compuestos para inducir el crecimiento de la neurita y la neurotoxicidad aprovechando las neuronas derivadas de células progenitoras neuronales humanas, un modelo celular que representa estrechamente la biología humana."
Introduction
El crecimiento de la neurita es un proceso fundamental para la formación de la red neuronal y la regeneración nerviosa1,2. Después de una lesión, el crecimiento de la neurita juega un papel clave en la regeneración del sistema nervioso. El crecimiento de la neurita es también un elemento importante de la señalización extracelular en la inducción de actividades regenerativas neuronales para mejorar los resultados de los trastornos neurodegenerativos y lesiones neuronales3,,4,5,6.
Al mantener su potencial de diferenciación en la producción de varios linajes neuronales, las células progenitoras neuronales humanas (hNPC) podrían proporcionar un sistema modelo para los estudios de la función del sistema nervioso central (SNC) y el desarrollo7,,8,,9. El alto potencial traslacional y la relevancia fisiológica de los hNPC como modelo de células humanas primarias ofrecen una ventaja considerable en las pruebas de descubrimiento de fármacos relacionadas con el crecimiento de neuritas. Sin embargo, el mantenimiento y escalado de los modelos de células primarias para ensayos de alto rendimiento podría ser lento y laborioso10,,11,12,13.
Además de la aplicación del método presentado en estudios de crecimiento de neuritas, la evaluación de la neurotoxicidad es otra aplicación utilizando las neuronas derivadas de hNPC. Hay miles de compuestos químicos comerciales que no se examinan o con potencial de neurotoxicidad mal entendido. Por lo tanto, experimentos de cribado más fiables y eficaces para evaluar, distinguir y clasificar compuestos en función de su potencial para provocar neurotoxicidad del desarrollo está en alta demanda14. El aumento de la prevalencia y la incidencia de trastornos neurológicos junto con la abundancia de compuestos no probados en el medio ambiente requiere el desarrollo de experimentos más fiables y eficientes para identificar compuestos ambientales peligrosos que puedan suponer neurotoxicidad15.
El método presentado aquí se puede utilizar para detectar la capacidad de los compuestos para inducir el crecimiento de la neurita y la neurotoxicidad aprovechando las neuronas derivadas de células progenitoras neuronales humanas, un modelo celular que representa estrechamente la biología humana.
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Protocol
Declaración de ética: Los especímenes fetales fueron recibidos del Laboratorio de Investigación de Defectos de Nacimiento de la Universidad de Washington en Seattle a través de un programa de distribución de tejidos apoyado por el Instituto Nacional de Salud (NIH). El Laboratorio de Investigación de Defectos De Nacimiento obtuvo el consentimiento fundamentado por escrito apropiado de los padres y la adquisición de tejidos fue monitoreada por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Washington. Todo el trabajo se realizó con la aprobación de la Oficina de Investigación de Sujetos Humanos de la Universidad de Miami8.
1. Aislamiento y cultivo de células progenitoras neuronales humanas (hNPC)
- Coloque el tejido cerebral en una placa Petri de 100 mm y retire cuidadosamente las meninges usando fórceps.
- Transfiera el tejido cerebral a un tubo cónico de 50 ml y lávelo dos veces con 20 ml de PBS invirtiendo suavemente el tubo.
- Incubar el tejido cerebral en un nuevo tubo cónico de 50 ml sumergiendo el tejido en la solución de disociación celular (ver Tabla de materiales)y DNase I (10 U/ml) durante 10 min a 37oC.
- Añadir 5 ml de medio de cultivo celular neuronal (ver Tabla de materiales)al tejido cerebral que contiene tubo y disociar mecánicamente las neuroesferas mediante la trituración de 20 a 30 veces a través de una punta de pipeta de 1000 l para hacer una suspensión de una sola célula.
- Filtre la suspensión celular a través de un colador celular de 70 m para eliminar los racimos de células.
- Semilla de la suspensión monocelular en un matraz T-25 ventilado provisto de 5-10 ml de medio de cultivo celular neuronal complementado con componentes detallados en la Tabla 1.
- Esterilice la solución de heparina filtrando a través de un filtro de 0,2 m. El suplemento B-27 sin vitamina A es un suplemento libre de suero para el cultivo de progenitores neuronales y células madre, sin inducir la diferenciación.
NOTA: Las células progenitoras neuronales humanas (hNPC) están aisladas del cerebro fetal humano recogido del feto abortado. Después de 7-10 días en el cultivo, las células madre neurales (NC) forman colonias de neuroesfera flotantes, mientras que otros tipos de células permanecen en suspensión como células individuales o se unen a la parte inferior del matraz. Los hNPC aislados se pueden cultivar como neuroesferas en suspensión durante variosmeses 8,,16,,17.
- Esterilice la solución de heparina filtrando a través de un filtro de 0,2 m. El suplemento B-27 sin vitamina A es un suplemento libre de suero para el cultivo de progenitores neuronales y células madre, sin inducir la diferenciación.
| Cantidad | Componente |
| 100 l | EGF (20 ng/mL) |
| 100 l | FGF (10 ng/mL) |
| 2 mL | B-27, Menos vitamina A (50X) |
| 1 mL | L-alanil-L-glutamina (100X) (ver tabla de materiales) |
| 4 l | Heparina (2 g/ml) |
| 96,8 mL | Medio de cultivo celular neuronal (ver tabla de materiales) |
Tabla 1. Componentes necesarios para la fabricación de 100 ml de medios de cultivo
2. Pasar los hNPC
- Recoger los medios que contienen las esferas flotantes, grandes y pequeñas neuroesferas, y transferirlos a un tubo cónico de 50 ml.
NOTA: Debido a razones desconocidas, el momento para dividir las neuroesferas es variable de 7 días a 30 días. Sin embargo, generalmente, las neuroesferas necesitan ser pasajes cuando alcanzan un diámetro mayor que 700-900 m. Esto es cuando el centro de la neuroesfera comienza a oscurecer, lo que se considera como un signo de una alta tasa de muerte celular18. - Gire las neuroesferas hacia abajo por centrifugación a 300-400 x g durante 3 min.
- Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y luego sumergir las esferas en 500 l de reactivo de disociación celular descongelada (ver Tabla de Materiales).
- Haga alícuotas de reactivo de disociación celular añadiendo 500 l por microtubos de 1,5 ml y guárdelos a -20 oC. Para evitar la pérdida de actividad enzimática, descongele el reactivo de disociación celular sosteniendo en RT o caliente durante 5 minutos en un baño de agua/perla de 37oC.
- Dependiendo de la densidad y el tamaño de las esferas, incubar las esferas sumergidas a 37oC durante 5-15 min.
- Añadir 5-10 ml de medios de cultivo precalentó a las neuroesferas que contienen tubo cónico de 50 ml y centrífuga a 300-400 x g durante 5 minutos para sedimentar las neuroesferas.
- Aspirar el sobrenadante y pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo, usando una pipeta de 1000 l, en 2 ml de medios de cultivo hasta que todas las neuroesferas estén en una sola suspensión celular.
NOTA: La disociación se hará visible a simple vista. Antes de la disociación, las neuroesferas están en forma de esferas. Después de sumergirse en el reactivo de disociación y por pipetear hacia arriba y hacia abajo, se convertirán en células individuales.- Contar las células y placar las células individuales, 2 a 3 millones de células por matraz T-25 en 10 ml de medios de cultivo.
- Alimentar las células cada 3 días reemplazando la mitad de los medios de cultivo.
- Asenta las neuroesferas inclinando el matraz para que esté en su esquina inferior. Sostenga el matraz en la posición durante aproximadamente 1-2 minutos hasta que el sedimento de las neuroesferas. A continuación, aspirar la mitad de los medios suavemente insertando la pipeta serológica en los medios por encima de las neuroesferas asentadas. Las células disociadas pueden agregarse para formar esferas después de 2 a 3 días en el cultivo19.
3. Congelación de los hNPC
- Preparar el medio de congelación celular añadiendo DMSO a los medios de cultivo a una concentración final del 10% (v/v) o utilizar un medio de criopreservación disponible comercialmente para tipos de celdas sensibles (consulte Tabla de materiales).
- Ordene las esferas grandes transfiriendo los medios a un tubo cónico de 50 ml y dejando que las esferas se asienten por gravedad. A continuación, retire y transfiera las grandes neuroesferas a un nuevo tubo cónico de 50 ml para el passaging usando una punta de pipeta de 200 o 1000 l.
NOTA: Las neuroesferas con un diámetro superior a 900 m se consideran grandes y las que tienen un diámetro inferior a 500 m se consideran pequeñas. - Gire las neuroesferas restantes hacia abajo por centrifugación a 300-400 x g durante 3 min. Retire cuidadosamente el sobrenadante.
- Resuspender hasta 100 esferas en 1 ml de reactivo de criopreservación y transferirlo a un criotubo.
- Conservar durante la noche a -80 oC en un recipiente de congelación celular (ver Tabla de materiales)y trasladarlo al nitrógeno líquido al día siguiente para su almacenamiento a largo plazo.
NOTA: Es preferible congelar neuroesferas pequeñas a medianas (inferiores a 900 m de diámetro) y evitar la congelación de neuroesferas de gran tamaño (más de 900 m de diámetro) o células individuales. Con el fin de reducir el daño celular durante la descongelación de la muestra, mantenga las células densas sembrando las neuroesferas descongeladas en un pequeño matraz T25.
4. Diferenciación y tratamiento de los hNPC
NOTA: Para inducir la diferenciación, las neuroesferas se desagregan en células individuales, se cuentan y luego se siembran en placas recubiertas durante 5 días. Luego, las células diferenciadas se tratan durante 24 h con compuestos de ensayo antes de la inmunosuferencia y la cuantificación de la fluorescencia.
- Capa
- Añadir 200 l de poli-L-lisina (PLL) por pocero de los portaobjetos de cámara de vidrio de 4 pod (140 l por pocero de los portaobjetos de cámara de 8 polos).
- Incubar durante 1 h a temperatura ambiente (RT).
- Lavar 3x con PBS.
- Dejar secar a RT (durante unos 30 min).
- Añadir 150 l de laminin (50 g/ml) por pocero de los portaobjetos de cámara de vidrio de 4 podéricos (120 oL por pocero de los portaobjetos de cámara de 8 pocín).
- Incubar durante 2 h a 37oC.
- Lavar 3x con PBS.
NOTA: Los portaobjetos de cámara recubiertos se pueden almacenar a 4 oC durante 1 mes.
- Chapar las células
- Recuento y placa 80.000 neuroesferas de una sola célula (neuroesferas en una sola suspensión celular) por pozo de diapositivas de cámara de 4 pozos (70.000 células por pozo de tobogán de cámara de 8 pozos).
- Añadir 500 l de medios de diferenciación por poción de tobogán de cámara de 4 pocólo (250 oL de soportes de cámara de 8 pocódizos).
- Para hacer primero el medio de diferenciación, agregue los siguientes componentes de la Tabla 2 a un contenedor estéril y desechable para hacer el medio de inducción neuronal (NIM).
- Agregue los siguientes ingredientes en la Tabla 3 a 48,5 ml de NIM realizada en el paso anterior para hacer la diferenciación de medios.
- Incubar durante 5 días a 37oC.
- Después de 5 días, tratar las células durante 24 h reemplazando la mitad de los medios en cada pozo con medios frescos mezclados con la concentración deseada de compuestos de prueba, incluyendo controles apropiados.
| Cantidad | Componente |
| 49 mL | DMEM/F-12 |
| 0,5 mL | N2 suplemento (100X) |
| 0,5 mL | MeM aminoácidos no esenciales (100X) |
| 2 l | Heparina (2 g/ml) (Stock Conc. es de 50 mg/ml) |
Tabla 2. Componentes necesarios para fabricar 50 mL de NIM
| Cantidad | Componente |
| 1 mL | B-27 (50X) |
| 500 l | Antibiótico-antimiótico (100X) |
| 5 l | Acido retinoico (0,1 m) |
| 50 l | GDNF (10 g/ml) |
| 50 l | BDNF (10 g/ml) |
| 5 l | Acido ascórbico (0,2 g/ml) (Stock Conc. es 2 mg/ml) NOTA: Se recomienda que se haga fresco. |
| 48,5 mL | Nim |
Cuadro 3. Componentes necesarios para fabricar 50 ml de medios de diferenciación
5. Inmunocitoquímica (ICC)
NOTA: Las celdas se fijan con un 4% de formaldehído. A continuación, se realiza la permeabilización y el bloqueo para mejorar la penetración y prevenir la unión inespecífica de anticuerpos. Luego, las células se incuban con anticuerpos primarios durante la noche. Posteriormente, las células se incuban con anticuerpos secundarios con etiqueta fluorescente. Finalmente, después de usar DAPI para manchar el núcleo, se montan los portaobjetos de la cámara.
- Fijación
- Aspirar suavemente los medios de cada pozo.
- Añadir 500 l de 4% de formaldehído por pocón de toboganes de cámara de 4 pocód siguientes (250 l por pocmillo de diapositivas de cámara de 8 pocód siguientes).
- Incubar durante 15 min en RT.
- Lavar suavemente 2x con 500 s de PBS.
NOTA: Después de la fijación, dejando 1 ml de PBS en cada pozo, las diapositivas de cultivo se pueden almacenar a 4 oC durante un máximo de 3 meses.
- Permeabilización y bloqueo celular
- Agregue los siguientes componentes de la Tabla 4 a un recipiente estéril y desechable para hacer el tampón de anticuerpos (Ab).
- Mezclar los siguientes ingredientes en la Tabla 5 con el tampón Ab hecho en el paso anterior para hacer que la célula permeabilización y solución de bloqueo.
- Añadir 500 l por poción de toboganes de cámara de 4 pocóculos e incubar durante 1 h en RT.
NOTA: El búfer Ab se puede almacenar a 4 oC.
| Cantidad | Componente |
| 1,75 g | NaCl (150 mM) |
| 1,2 g | TrisBase (50 mM) |
| 2 g | BSA 1% |
| 3,6 g | L-lisina (100 mM) |
| 8 g | Azida de sodio (4%) |
| 200 mL | Agua destilada. NOTA: Disolver inicialmente los componentes requeridos en 150 ml de agua y, a continuación, ajustar a 200 ml. |
Cuadro 4. Componentes necesarios para fabricar 200 ml de tampón de anticuerpos
| Cantidad | Componente |
| 600 l | 20% Suero de cabra |
| 6 L | 0.2% Tritón-X100 |
| 2394 L | Búfer de anticuerpos. NOTA: Disolver inicialmente los componentes necesarios en 2 ml del búfer Ab y, a continuación, ajustar a pH 7.4. A continuación, agregue más búfer Ab para ajustar al volumen final de 3 ml y filtrar esterilizar. |
Cuadro 5. Componentes necesarios para hacer 3 ml de permeabilización celular y solución de bloqueo
- Tinción
- Lavar 2x con 500 l de PBS.
- Añadir el anticuerpo primario diluido, anti-tubulina III (1:200), e incubar durante la noche a 4 oC (200 oC por poc de toboganes de cámara de 4 pocicos). Diluir el anticuerpo primario en PBS.
- Lavar 2x con PBS.
- Añadir el anticuerpo secundario diluido, en PBS, con etiqueta fluorescente, Alexa Fluor 488 (1:500), e incubar durante 2 horas en RT en un lugar protegido de la luz (250 oL por pocillo de las diapositivas de cámara de 4 podillos)
- Lavar 2x con PBS.
- Añadir el diluido, en PBS, DAPI (concentración de 300 nM) e incubar durante 5 minutos a RT en un lugar protegido de la luz (300 l por pocillo de diapositivas de cámara de 4 pocillos).
- Lavar 3x con PBS.
- Monte las correderas de la cámara siguiendo las siguientes instrucciones.
- Desmonte el tobogán de la cámara rompiendo las pestañas de separación y quitando la junta y la base.
- Añada una gota de la solución de montaje (consulte Tabla de materiales)por pozo de portaobjetos de 4 pozos. A continuación, utilice una diapositiva de cubierta para cubrir toda la diapositiva.
- Usando una pinza y en un ángulo, coloque un lado del resbalón de la cubierta contra la corredera mientras hace contacto con el borde exterior de la gota de líquido.
- Coloque cuidadosamente la cubierta sobre la solución de montaje al colocarla en su lugar. Evitar la creación de burbujas. Tome una punta de pipeta y presiónelo hacia abajo en el resbalón de la cubierta. Las burbujas se moverán hacia un lado.
NOTA: La formación de burbujas es inevitable a veces. Si ocurre, imagen alrededor de ellos siempre y cuando haya algunos. - Siga las instrucciones del fabricante para el tiempo de curado. Evite el uso de soluciones de montaje sin curvas debido a la dificultad de manipulación durante la toma de imágenes. De lo contrario, se requiere el uso de un sellador de cubrelip adecuado en los bordes para evitar que el cubreobjetos se deslice durante la toma de imágenes.
- Para sellar el cubreobjetos, utilice esmalte de uñas y haga una pequeña línea en el borde del resbalón de la cubierta. Deje secar el esmalte de uñas durante unos 2 minutos.
6. Adquisición de imágenes, crecimiento de neurita y cuantificación de la intensidad de la fluorescencia
NOTA: Después de la tinción, utilice un microscopio confocal con un objetivo de 20x y un tamaño de imagen de 1024 x 1024 píxeles para adquirir las imágenes de las celdas tratadas. Tome la imagen al menos de dos campos por réplica biológica por condición. A continuación, utilice el software de análisis de imágenes de Fiji (ImageJ 1.51u) para cuantificar la longitud del neurito. Brevemente, medir la longitud de la neurita más larga para cada neurona y después de promediar los valores por tratamiento, utilizar la prueba t del estudiante para grupos independientes para comparar los medios entre los grupos experimentales y el grupo de control.
NOTA: Varios programas de procesamiento de imágenes comerciales (Imaris, Volocity, Amira) y de código abierto (ImajeJ, CellProfiler, Vaa3D, BioImageXD, Icy, KNIME) están disponibles. Entre estos programas, ImageJ se ha convertido en la herramienta de elección para el análisis de imágenes biológicas20,,21. El portal ImageJ en https://imagej.net/Introduction es una fuente útil de información que proporciona una descripción completa de las funciones básicas e integradas de ImageJ, incluyendo procesamiento de imágenes, colocación, desconvolución, registro, segmentación, seguimiento y visualización.
- Medición del crecimiento neuronal con el software de análisis de imágenes de Fiji
- Como se ilustra en la Figura 1, abra la imagen arrastrándola y soltándola sobre el software de Fiji o seleccionando Archivo . Abrir.
- Seleccione Analizar ?? Herramientas ? Administrador de ROI, y luego haga clic con el botón derecho en el icono5 en la barra de herramientas Recta y cambie a línea a mano alzada. Opcionalmente, haga doble clic en el mismo icono para cambiar el ancho de la línea a 10, y luego trace el neurito más largo, comenzando cerca del cuerpo de la celda y extendiéndose hasta la punta del neurito.
- Presione Ctrl + T y luego F para agregar la medición al Administrador de ROI y resaltar la neurona medida. Seleccione todos los números en el ROI, haga clic en Medir, seleccione todas las longitudes calculadas y copie/pegue en una hoja de cálculo.
- Medición de la intensidad de fluorescencia de las células etiquetadas con el software de análisis de imágenes de Fiji
- Como se ilustra en la Figura 2,después de abrir la imagen, haga clic en el icono 4en la barra de herramientas Selecciones a mano alzada. Dibuja la forma de la celda.
- Seleccione Analizar ?? Establezca Mediciones y seleccione los siguientes valores: Area, Densidad integrada, Valor gris medio ? Analizar ? Medir (se abre un cuadro emergente con una pila de valores).
- Seleccione una región junto a la celda como fondo (el tamaño no es importante) y, a continuación, seleccione Analizar . Medir. Seleccione todos los datos medidos y copie/pegue en una hoja de cálculo.
NOTA: Densidad integrada (IntDen) es el elemento utilizado para determinar las intensidades fluorescentes. En este estudio se mide la intensidad fluorescente de la molécula diana para analizar inicialmente su distribución en la célula y posteriormente cuantificar la abundancia de la molécula diana bajo diversos tratamientos. En consecuencia, se medirá la eficacia de los tratamientos y se comparará con el control.
7. Evaluación de neurotoxicidad
NOTA: La citotoxicidad de los compuestos de ensayo se evalúa en placas de 384 pozos (ver Tabla de materiales)utilizando un ensayo de viabilidad de celdas luminiscentes (ver Tabla de materiales). Los hNPC se preparan siguiendo el mismo método, excepto ligeras modificaciones, descritas en la sección "Diferenciación y tratamiento de los hNPC". Posteriormente, se mide una señal luminiscente generada por un ensayo de viabilidad de células luminiscentes utilizando un lector de microplacas. La señal luminiscente es proporcional a la concentración celular de ATP que a su vez es directamente proporcional al número de células viables presentes en cada pozo.
- Capa
- Añadir 30 l de poli-L-lisina (PLL) por poción de placa de 384 pocillos.
- Incubar durante 1 h en RT.
- Lavar 2x con PBS.
- Dejar secar a RT (durante unos 30 min).
- Añadir 30 l de laminin (50 g/ml) por pocero de placa de 384 pocillos.
- Incubar durante 2 h a 37oC.
- Lavar 2x con PBS.
NOTA: Las placas recubiertas de 384 pozos se pueden almacenar a 4 oC durante 1 mes.
- Chapar las células
- Recuento y placa 20.000 neuroesferas de una sola célula por poción de placa de 384 pocillos en 25 l de medios de diferenciación.
- Incubar durante 5 días a 37oC.
- Después de 5 días, tratar las células durante 24 h por compuestos de ensayo preparados a 6 veces la concentración final deseada en volumen de 5 l (para hacer el volumen final de 30 l por pozo).
- Ensayo de viabilidad celular
- Añadir 30 l de reactivo de ensayo de viabilidad de células luminiscentes por pocero de placa de 384 pocillos.
NOTA: Añada un volumen de reactivo de viabilidad de celda luminiscente igual al volumen presente en cada pozo. Descongelar el reactivo de viabilidad de la célula luminiscente y equilibrar a RT antes de su uso. - Agitar en un agitador de placa durante 2 minutos (para mezclar e inducir la lelisis celular).
- Girar la mezcla hacia abajo por centrifugación a 300-400 x g durante 30 s.
- Incubar la placa de 384 pozos durante 10 minutos en RT en un lugar protegido de la luz (para estabilizar la señal luminiscente).
- Graba luminiscencia con un lector de microplacas.
NOTA: Utilice los controles adecuados para el ensayo de viabilidad, incluyendo Velcade (a una concentración final de 10 m) como positivo y HBSS que contenga DMSO (con una concentración final de 0,1% o 0,2%) como control negativo.
- Añadir 30 l de reactivo de ensayo de viabilidad de células luminiscentes por pocero de placa de 384 pocillos.
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Representative Results
El protocolo presentado en el manuscrito se ha utilizado con éxito en dos artículos publicados recientemente22,,23. La Figura 3 demuestra el uso de neuronas derivadas de hNPCs en el examen del efecto de los inhibidores de la HDAC como compuestos epigenéticos en la extensión de las neuritas como marcador para el crecimiento de la neurita y la posterior capacidad neurogénica de compuestos de moléculas pequeñas.
Además, en la Figura 4 la neurotoxicidad de los compuestos probados (inhibidores de la HDAC) también se evalúa diferenciando simultáneamente los hNPC en placas de 384 pozos, mostrando el potencial del modelo celular presentado (hNPCs) para la evaluación de la neurotoxicidad y la capacidad de escalar para probar la neurotoxicidad para un mayor número de compuestos.
En otro artículo de Sartor et al. (Figura 5), la medición de la intensidad de fluorescencia de la célula neuronal para cuantificar la abundancia de H4K5ac, como marca de histona, después de tratar las neuronas diferenciadas de hNPCs con compuestos modificadores epigenéticos se demuestra con éxito23. Además, como se ilustra en la Figura 6,en un trabajo inédito, el protocolo se ha utilizado para visualizar una proteína presináptica, sinaptofisina, para comprobar el posible efecto sinaptogénico de los compuestos de moléculas pequeñas.
Figura 1: Flujo de trabajo paso a paso que ilustra un enfoque para medir el crecimiento neuronal con el software de análisis de imágenes de Fiji. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Flujo de trabajo paso a paso que ilustra un enfoque para cuantificar la intensidad de la fluorescencia de las células neuronales con el software de análisis de imágenes Fiji. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ensayo de crecimiento de neurita con compuestos epigenéticos de moléculas pequeñas.
(A) Imágenes fluorescentes representativas (aumento de 20x) para el tratamiento de las neuronas derivadas de hNPC con inhibidores de HDAC basados en hidroxam. Las células progenitoras neuronales humanas se diferencian durante 5 días; luego tratada durante 24 h con 0.1% DMSO (como control), y Trichostatin A, JNJ26481585, SB939, y PCI24781 (como compuestos de prueba). A continuación, la inmunostaining se realiza con anticuerpos neuronales específicos de la tubulina III (verde) para visualizar los procesos neuronales y cuantificar longitudes de neurita y DAPI (azul) para visualizar núcleos celulares. (B) Análisis estadístico de la longitud del neurito en varios grupos. Como se muestra, todos los compuestos de prueba pueden inducir el crecimiento de la neurita. El análisis cuantitativo de la longitud del neurito se realiza utilizando el software ImageJ. Las barras de error representan SEM; p < 0.001, **** p < 0.0001. Esta cifra ha sido modificada de Bagheri et al.22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Evaluación de la neurotoxicidad mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscente.
Los hNPC se siembran y diferencian a las neuronas en la placa de 384 pozos de acuerdo con el mismo método utilizado para el ensayo de crecimiento de neurita. A partir de entonces se mide el efecto de los compuestos de ensayo en la viabilidad de las células después de 24 h de exposición. Como se muestra, no hay toxicidad significativa en los tratamientos. ANOVA unidireccional se utiliza para el análisis de datos y un valor p < 0.05 se considera estadísticamente significativo. Esta cifra ha sido modificada de Bagheri et al.22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: RGFP966 aumenta H4K5ac en neuronas diferenciadas de las células progenitoras neuronales humanas.
(A) Tinción representativa de inmunofluorescencia de tubulina, DAPI y H4K5ac tras el tratamiento con DMSO, RGFP966 o RGFP966 + JQ1 en neuronas derivadas de hNPC. (B) Cuantificación de la intensidad de fluorescencia de H4K5ac tras el tratamiento con DMSO, RGFP966 o RGFP966 + JQ1. Las barras de error representan SEM; p < 0.0001. Esta cifra ha sido modificada de Sartor et al.23. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Tinción representativa de inmunofluorescencia de Sinaptophysin (rojo) para visualizar terminales sinápticos, tubulina (verde) para visualizar procesos neuronales y DAPI (azul) para visualizar núcleos celulares tras el tratamiento con DMSO (como control), y SB939 (como compuesto de prueba) en neuronas derivadas de hNPC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo es uno de los pocos artículos publicados que describen la prueba de la longitud de la neurita tras el tratamiento con compuestos de prueba. Además, describimos cómo utilizar hNPCs para un ensayo de crecimiento de neurita y una evaluación de neurotoxicidad. Mediante la utilización de este ensayo de crecimiento de neurita y la evaluación de la neurotoxicidad en las neuronas derivadas de hNPCs, se demuestra el potencial neurogénico de una categoría de compuestos epigenéticos de moléculas pequeñas, inhibidores de HDAC, en la inducción del crecimiento de la neurita22. Además, en otro documento presentado por Sartor et al., este protocolo se utiliza para cuantificar la intensidad de fluorescencia de H4K5ac, una proteína histona, tras el tratamiento con varios compuestos modificadores epigenéticos23.
La función cognitiva se basa en el cableado adecuado y las conexiones funcionales dentro de los circuitos neuronales. La cuantificación detallada y consistente de diversos aspectos de la morfología neuronal como un enfoque de cribado fenotípico es esencial para lograr una visión fiable de las vías subyacentes que conducen a trastornos cerebrales que van desde el neurodesarrollo hasta los trastornos psiquiátricos. El cribado fenotípico se considera un enfoque notablemente eficaz en la exploración de compuestos de moléculas pequeñas como candidatos a fármacos putativos para modular un fenotipo celular. En este enfoque, en lugar de interrogar a un solo objetivo, se examinan todos los componentes y vías de la célula24.
La morfología neuronal, incluida la forma, la estructura y la conectividad, se consideran características clave de la función neuronal. Las perturbaciones genéticas que alteran la morfología de las neuronas o la localización y el nivel de proteínas sinápticas podrían contribuir notablemente al análisis de mutaciones que causan enfermedades. Por lo tanto, se requieren métodos confiables para evaluar el impacto de los perturbagens en la morfología neuronal25.
Los hNPC, están aislados del cerebro de mamífero embrionario, que posteriormente se cultivan in vitro en presencia de mitógenos. Estas células se componen de neuroesferas que se caracterizan como agregados celulares flotantes compuestos de células progenitoras neuronales y células gliales radiales. Los hNPC proporcionan un sistema modelo deseable para la función del sistema nervioso y el desarrollo mediante el mantenimiento de su potencial de diferenciación en la producción de varios linajes neuronales7,,8,9. El número de neurita, la intensidad, la longitud y la anchura, junto con las características sinápticas, incluidas las modificaciones de las proteínas pre y postsinápticas, se encuentran entre los cambios de neurita y sináptica que podrían medirse de forma fiable y eficiente utilizando el método presentado en el presente documento.
Debido a un aumento en la prevalencia de trastornos neurológicos como el trastorno por déficit de atención con hiperactividad y el autismo, el potencial de neurotoxicidad de los productos químicos ambientales en los niños sigue siendo una preocupación pública15,,26. Por lo tanto, también se examina la usabilidad de las neuronas derivadas de hNPC para una evaluación de neurotoxicidad fiable y eficiente. Como se muestra en la Figura 4,los hNPC podrían adaptarse y ampliarse para la evaluación de la neurotoxicidad en placas de 384 pozos.
La evaluación de la neurotoxicidad como una aplicación para el modelo celular introducido es factible, ya sea diferenciando las neuroesferas en neuronas antes de enchapar en placas de 384 pozos o diferenciando las células mientras que las neuroesferas están chapadas en placas de 384 pozos como células individuales. En este último enfoque, se requieren habilidades de pipeteo de alta precisión para enchapar el número exacto de neuroesferas que se desagregan en células individuales y también para los siguientes procedimientos de tratamiento con medio inductor de diferenciación. Teniendo en cuenta las habilidades de pipeteo requeridas, se recomienda la diferenciación antes del chapado para lograr resultados más reproducibles. Además, la clasificación de células a granel por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) también podría utilizarse potencialmente para separar con precisión el número requerido de celdas que eluden la necesidad de habilidades de pipeteo de alta precisión.
Se recomienda iniciar el ensayo de crecimiento de neurita mediante la evaluación de neurotoxicidad para evitar ensayos repetidos de crecimiento de neurita con varias dosis del mismo compuesto para alcanzar la concentración no tóxica. Por lo tanto, la combinación de una evaluación de neurotoxicidad mediante la utilización del ensayo de viabilidad celular luminiscente contra una curva de dosis-respuesta de compuestos de prueba dará lugar a encontrar la dosis correcta con el mínimo esfuerzo. El ensayo de viabilidad de células luminiscentes es un método altamente sensible para determinar el número de células viables en un cultivo celular. El método trabaja en la cuantificación del ATP presente en el cultivo como un indicador del metabolismo celular. El formato de adición, mezcla y medida del ensayo proporciona un enfoque simple y rápido para comprobar la viabilidad celular y la citotoxicidad de los compuestos de ensayo.
Hay algunas limitaciones al protocolo presentado de la siguiente manera. Debido a la disponibilidad y la variabilidad inherente, el uso de células primarias fisiológicamente relevantes está limitado25. hNPC tienen una tasa de proliferación lenta, lo que podría limitar su utilización. El análisis manual a gran escala de imágenes fluorescentes de neuronas requiere mucho tiempo y es susceptible al sesgo de los experimentados. Los hNPC podrían considerarse como células neuronales jóvenes, no representando modificaciones epigenéticas relacionadas con la edad que se acumulan en las células a lo largo de la vida de una persona. Como los trastornos neurodegenerativos ocurren en individuos mayores, los hNPC pueden carecer de una relevancia fisiológica adecuada para ser un modelo adecuado para las condiciones de inicio tardío.
A pesar de que los modelos animales y las líneas celulares han sido valiosos para descifrar los mecanismos moleculares subyacentes a las enfermedades, han demostrado limitaciones al traducir los hallazgos en terapias humanas27,,28,,29,,30. Las células madre pluripotentes inducidas por el ser humano (hiPSC) y las células madre embrionarias humanas (hESC) junto con los hNPC se consideran mejores modelos de células in vitro, recapitulando la fisiología humana. Por lo tanto, las neuronas derivadas de hiPSCs y hESC también pueden utilizarse potencialmente como dos fuentes celulares alternativas para el ensayo de crecimiento de neuritas y la evaluación de la neurotoxicidad, utilizando el protocolo aquí presentado1,31.
En conclusión, el alto potencial traslacional y la relevancia fisiológica de los hNPC como modelo de células humanas primarias proporcionan un recurso valioso en las pruebas de detección de fármacos relacionadas con el crecimiento de neuritas y la evaluación de la neurotoxicidad, superando las limitaciones mencionadas anteriormente.
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Disclosures
Todos los autores no indican posibles conflictos de intereses.
Acknowledgments
Esta investigación fue financiada por la beca de investigación NIMAD (940714) otorgada a MAF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-well Glass Chamber Slides | Sigma | PEZGS0816 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | R37117 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| Anti-β-Tubulin III | Thermo | MA1-118X | |
| B27 | Thermo | 17504001 | |
| B27 - minus vitamin A | Thermo | 12587010 | |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | |
| BSA | Sigma | A8531 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7572 | |
| CoolCell | Corning | 432000 | Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1°C/minute cell freezing in a -80°C freezer |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium containing 10% DMSO |
| DAPI | Thermo | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | 34869-100ML | |
| EGF | Gibco | PHG0311 | |
| FGF | Gibco | PHG6015 | |
| Formaldehyde | Thermo | FB002 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine supplement |
| Goat Serum | Thermo | 50062Z | |
| Heparin | Calbiochem | 375095 | |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-25G | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| mFreSR | StemCell Technologies | 5854 | Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates | Thermo | 164610 | |
| PBS | Thermo | 10010-049 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P5899-5MG | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo | P10144 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes |
| Synaptophysin | Thermo | MA5-14532 | |
| Tris Base | Sigma | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML |
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