Den fremlagte protokol beskriver en metode til en neurite outgrowth assay og neurotoksicitet vurdering af små molekyle forbindelser.
Neurite outgrowth assay og neurotoksicitet vurdering er to store undersøgelser, der kan udføres ved hjælp af den præsenterede metode heri. Denne protokol giver pålidelig analyse af neuronal morfologi sammen med kvantitative målinger af modifikationer på neurite længde og synaptisk protein lokalisering og overflod ved behandling med små molekyle forbindelser. Ud over anvendelsen af den præsenterede metode i neurite udvækstundersøgelser kan der foretages en neurotoksicitetsvurdering for at vurdere, skelne og rangordne kommercielle kemiske forbindelser baseret på deres potentielle udviklingsmæssige neurotoksicitetseffekt.
Selv om cellelinjer er i dag udbredt i sammensatte screening assays i neurovidenskab, de ofte adskiller sig genetisk og fænotypisk fra deres væv oprindelse. Primære celler, på den anden side, opretholde vigtige markører og funktioner observeret in vivo. Derfor, på grund af oversættelsen potentiale og fysiologiske relevans, at disse celler kunne tilbyde neurite outgrowth assay og neurotoksicitet vurdering kan betydeligt drage fordel af at bruge humane neurale progenitor celler (hNPC’ er) som den primære menneskelige celle model.
Den præsenterede metode heri kan bruges til at screene for evne til forbindelser til at fremkalde neurite udvækst og neurotoksicitet ved at drage fordel af den menneskelige neurale stamfader celle-afledte neuroner, en celle model tæt repræsenterer den menneskelige biologi.
Neurite vækst er en proces, der er grundlæggende for dannelsen af det neuronale netværk og nerve regenerering1,2. Efter en skade, neurite udvækst spiller en central rolle i regenerering af nervesystemet. Neurite udvækst er også et vigtigt element i den ekstracellulære signalering i inducerende neuronal regenerative aktiviteter for at forbedre resultaterne for neurodegenerative lidelser og neuronal skade3,,4,5,6.
Ved at opretholde deres differentieringspotentiale i produktionen af forskellige neurale slægter, menneskelige neurale stamceller (hNPC’er) kunne give en model system for undersøgelser af centralnervesystemet (CNS) funktion og udvikling7,8,9. Høj translationel potentiale og fysiologisk relevans af hNPC’er som en primær human celle model giver en betydelig fordel i neurite udvækst-relaterede drug discovery screenings. Vedligeholdelse og skalering af primærcellemodellerne til analyser med høj kapacitet kan dog være tidskrævende og arbejdskrævende10,11,12,13.
Ud over anvendelsen af den præsenterede metode i neurite udvækstundersøgelser er neurotoksicitetsvurdering en anden anvendelse ved hjælp af hNPC-afledte neuroner. Der er tusindvis af kommercielle kemiske forbindelser, der enten ikke undersøges eller med dårligt forstået neurotoksicitet potentiale. Derfor, mere pålidelige og effektive screening eksperimenter til at vurdere, skelne, og rang forbindelser baseret på deres potentiale til at fremkalde udviklingsmæssige neurotoksicitet er i høj efterspørgsel14. Stigningen i prævalens og forekomst af neurologiske lidelser sammen med den overflod af uprøvede forbindelser i miljøet nødvendiggør udvikling af mere troværdige og effektive eksperimenter til at identificere farlige miljøforbindelser, der kan udgøre neurotoksicitet15.
Den præsenterede metode heri kan udnyttes til at screene for evne til forbindelser til at fremkalde neurite udvækst og neurotoksicitet ved at drage fordel af den menneskelige neurale stamfader celle-afledte neuroner, en celle model tæt repræsenterer den menneskelige biologi.
Denne protokol er en af de få offentliggjorte papirer, der beskriver testen for neurite længde ved behandling med testforbindelser. Desuden beskriver vi, hvordan man bruger hNPC’er til en neurite outgrowth assay og neurotoxicity vurdering. Ved at udnytte denne neurite outgrowth assay og neurotoxicity vurdering på hNPCs-afledte neuroner, det neurogene potentiale af en kategori af epigenetiske små-molekyle forbindelser, HDAC hæmmere, i inducerende neurite udvækst er påvist22. Endvidere, i et …
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev finansieret af NIMAD forskningstilskud (940714) tildelt MAF.
4-well Glass Chamber Slides | Sigma | PEZGS0816 | |
Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | |
Alexa Fluor 594 | Invitrogen | R37117 | |
Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | |
Anti-β-Tubulin III | Thermo | MA1-118X | |
B27 | Thermo | 17504001 | |
B27 – minus vitamin A | Thermo | 12587010 | |
BDNF | PeproTech | 450-02 | |
BSA | Sigma | A8531 | |
CellTiter-Glo | Promega | G7572 | |
CoolCell | Corning | 432000 | Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1℃/minute cell freezing in a -80℃ freezer |
CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium containing 10% DMSO |
DAPI | Thermo | D1306 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
DMSO | Sigma | 34869-100ML | |
EGF | Gibco | PHG0311 | |
FGF | Gibco | PHG6015 | |
Formaldehyde | Thermo | FB002 | |
GDNF | PeproTech | 450-10 | |
Glutamax | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine supplement |
Goat Serum | Thermo | 50062Z | |
Heparin | Calbiochem | 375095 | |
Laminin | Sigma | L2020-1MG | |
L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-25G | |
L-lysine | Sigma | L5501 | |
MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
mFreSR | StemCell Technologies | 5854 | Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
N2 | Gibco | 17502048 | |
NaCl | Sigma | 71376 | |
Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates | Thermo | 164610 | |
PBS | Thermo | 10010-049 | |
Poly‐L‐lysine | Sigma | P5899-5MG | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo | P10144 | |
Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes |
Synaptophysin | Thermo | MA5-14532 | |
Tris Base | Sigma | 10708976001 | |
Triton X-100 | Sigma | X100-100ML |