Summary

En neurite utvekstanalyse og nevrotoksisitetsvurdering med humane nevrale stamcelleavledede nevroner

Published: August 06, 2020
doi:

Summary

Den presenterte protokollen beskriver en metode for en neurite utvekstanalyse og nevrotoksisitetsvurdering av små molekylforbindelser.

Abstract

Neurite utvekstanalyse og nevrotoksisitetsvurdering er to store studier som kan utføres ved hjelp av den presenterte metoden heri. Denne protokollen gir pålitelig analyse av nevronal morfologi sammen med kvantitative målinger av modifikasjoner på neurite lengde og synaptisk protein lokalisering og overflod ved behandling med små molekylforbindelser. I tillegg til anvendelsen av den presenterte metoden i neurite utvekststudier, kan nevrotoksisitetsvurdering utføres for å vurdere, skille og rangere kommersielle kjemiske forbindelser basert på deres potensielle utviklingsnevrotoksisitetseffekt.

Selv om cellelinjer i dag er mye brukt i sammensatte screening analyser i nevrovitenskap, de ofte avvike genetisk og fenotypisk fra deres vev opprinnelse. Primærceller, derimot, opprettholde viktige markører og funksjoner observert in vivo. Derfor, på grunn av oversettelsespotensialet og fysiologisk relevans at disse cellene kan tilby neurite utvekstanalyse og nevrotoksisitetsvurdering, kan det være betydelig nytte av å bruke humane nevrale stamceller (hNPCer) som den primære humane cellemodellen.

Den presenterte metoden her kan brukes til å screene for evnen til forbindelser for å indusere neurite utvekst og nevrotoksisitet ved å dra nytte av den menneskelige nevrale stamcelleavledede nevroner, en cellemodell som representerer menneskelig biologi nøye.”

Introduction

Neurite vekst er en prosess som er grunnleggende for dannelsen av det nevronale nettverket og nerveregenerering1,2. Etter en skade spiller neurite utvekst en nøkkelrolle i regenerering av nervesystemet. Neurite utvekst er også et viktig element i den ekstracellulære signalisering i indusere nevronale regenerative aktiviteter for å forbedre resultatene for nevrodegenerative lidelser og nevronal skade3,,4,5,6.

Ved å opprettholde sitt differensieringspotensial i å produsere ulike nevrale slekter, kan humane nevrale stamceller (hNPCer) gi et modellsystem for studier av sentralnervesystemet (CNS) funksjon og utvikling7,,8,9. Høyt translasjonelt potensial og fysiologisk relevans av hNPCer som en primær human cellemodell gir en betydelig fordel i neurite utvekst-relaterte narkotika oppdagelse screenings. Vedlikehold og skalering av primærcellemodellene for høygjennomstrømningsanalyser kan imidlertid være tidkrevende ogarbeidsintensive 10,,11,,12,,13.

I tillegg til anvendelsen av den presenterte metoden i neurite utvekststudier, er nevrotoksisitetsvurdering et annet program ved hjelp av hNPC-avledede nevroner. Det er tusenvis av kommersielle kjemiske forbindelser som enten ikke undersøkes eller med dårlig forstått nevrotoksisitetspotensial. Derfor er mer pålitelige og effektive screeningeksperimenter for å vurdere, skille mellom og rangere forbindelser basert på deres potensial til å fremkalle utviklingsnevrotoksisitet i høy etterspørsel14. Økningen i prevalens og forekomst av nevrologiske lidelser sammen med overflod av utestede forbindelser i miljøet nødvendiggjør utviklingen av mer pålitelige og effektive eksperimenter for å identifisere farlige miljøforbindelser som kan utgjøre nevrotoksisitet15.

Den presenterte metoden her kan brukes til å screene for evnen til forbindelser for å indusere neurite utvekst og nevrotoksisitet ved å dra nytte av den menneskelige nevrale stamcelleavledede nevroner, en cellemodell som representerer menneskelig biologi nøye.

Protocol

Etikkerklæring: Fosterprøver ble mottatt fra Birth Defects Research Laboratory ved University of Washington i Seattle gjennom et vevsdistribusjonsprogram støttet av National Institute of Health (NIH). Birth Defects Research Laboratory innhentet passende skriftlig informert samtykke fra foreldrene og innkjøp av vev ble overvåket av Institutional Review Board ved University of Washington. Alt arbeidet ble utført med godkjenning av Human Subject Research Office ved University of Miami8. <p …

Representative Results

Protokollen som presenteres i manuskriptet har blitt brukt i to nylig publiserte artikler22,23. Figur 3 viser bruken av hNPCs-avledede nevroner ved å undersøke effekten av HDAC-hemmere som epigenetiske forbindelser på forlengelsen av neurites som en markør for neurite utvekst og påfølgende nevrogen evne til små molekylforbindelser. Videre, i figur 4 neurotoksisitet av t…

Discussion

Denne protokollen er en av de få publiserte papirene som beskriver testen for neurite lengde ved behandling med testforbindelser. Videre beskriver vi hvordan du bruker hNPCer for en neurite utvekstanalyse og nevrotoksisitetsvurdering. Ved å benytte denne neurite utvekstanalysen og nevrotoksisitetsvurderingen på hNPCs-avledede nevroner, er det nevrogene potensialet til en kategori av epigenetiske småmolekylforbindelser, HDAC-hemmere, i induserende neurite utvekst demonstrert22. Videre, i et ann…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne forskningen ble finansiert av NIMAD forskningsstipend (940714) tildelt MAF.

Materials

4-well Glass Chamber Slides Sigma PEZGS0816
Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11001
Alexa Fluor 594 Invitrogen R37117
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240062
Anti-β-Tubulin III Thermo MA1-118X
B27 Thermo 17504001
B27 – minus vitamin A Thermo 12587010
BDNF PeproTech 450-02
BSA Sigma A8531
CellTiter-Glo Promega G7572
CoolCell Corning 432000 Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1℃/minute cell freezing in a -80℃ freezer
CryoStor CS10 StemCell Technologies 7930 Cryopreservation medium containing 10% DMSO
DAPI Thermo D1306
DMEM/F12 Gibco 11320033
DMSO Sigma 34869-100ML
EGF Gibco PHG0311
FGF Gibco PHG6015
Formaldehyde Thermo FB002
GDNF PeproTech 450-10
Glutamax Gibco 35050061 L-alanyl-L-glutamine supplement
Goat Serum Thermo 50062Z
Heparin Calbiochem 375095
Laminin Sigma L2020-1MG
L-Ascorbic Acid Sigma A92902-25G
L-lysine Sigma L5501
MEM non-essential amino acids Gibco 11140050
mFreSR StemCell Technologies 5854 Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells
N2 Gibco 17502048
NaCl Sigma 71376
Neurobasal Medium Gibco 21103049
Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates Thermo 164610
PBS Thermo 10010-049
Poly‐L‐lysine Sigma P5899-5MG
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo P10144
Retinoic Acid Sigma R2625
Sodium Azide Sigma S2002
StemPro Accutase Gibco A1110501 Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes
Synaptophysin Thermo MA5-14532
Tris Base Sigma 10708976001
Triton X-100 Sigma X100-100ML

References

  1. Sherman, S. P., Bang, A. G. High-throughput screen for compounds that modulate neurite growth of human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), (2018).
  2. Al-Ali, H., Beckerman, S. R., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. In vitro models of axon regeneration. Experimental Neurology. 287, 423-434 (2017).
  3. Kudo, T., et al. Induction of neurite outgrowth in PC12 cells treated with temperature-controlled repeated thermal stimulation. PloS One. 10 (4), 0124024 (2015).
  4. Higgins, S., Lee, J. S., Ha, L., Lim, J. Y. Inducing neurite outgrowth by mechanical cell stretch. BioResearch Open Access. 2 (3), 212-216 (2013).
  5. Muramatsu, R., Ueno, M., Yamashita, T. Intrinsic regenerative mechanisms of central nervous system neurons. Bioscience Trends. 3 (5), (2009).
  6. Read, D. E., Herbert, K. R., Gorman, A. M. Heat shock enhances NGF-induced neurite elongation which is not mediated by Hsp25 in PC12 cells. Brain Research. 1221, 14-23 (2008).
  7. Finan, G. M., et al. Bioactive Compound Screen for Pharmacological Enhancers of Apolipoprotein E in Primary Human Astrocytes. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1526-1538 (2016).
  8. Magistri, M., et al. A comparative transcriptomic analysis of astrocytes differentiation from human neural progenitor cells. European Journal of Neuroscience. 44 (10), 2858-2870 (2016).
  9. Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Research. 993 (1-2), 18-29 (2003).
  10. Grandjean, P., Landrigan, P. J. Neurobehavioural effects of developmental toxicity. The Lancet Neurology. 13 (3), 330-338 (2014).
  11. Finkbeiner, S., Frumkin, M., Kassner, P. D. Cell-based screening: extracting meaning from complex data. Neuron. 86 (1), 160-174 (2015).
  12. An, W. F., Tolliday, N. Cell-based assays for high-throughput screening. Molecular Biotechnology. 45 (2), 180-186 (2010).
  13. Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).
  14. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507 (2011).
  15. Ryan, K. R., et al. Neurite outgrowth in human induced pluripotent stem cell-derived neurons as a high-throughput screen for developmental neurotoxicity or neurotoxicity. Neurotoxicology. 53, 271-281 (2016).
  16. Magistri, M., Velmeshev, D., Makhmutova, M., Faghihi, M. A. Transcriptomics profiling of Alzheimer’s disease reveal neurovascular defects, altered amyloid-β homeostasis, and deregulated expression of long noncoding RNAs. Journal of Alzheimer’s Disease. 48 (3), 647-665 (2015).
  17. Darbinyan, A., Kaminski, R., White, M. K., Darbinian, N., Khalili, K. Isolation and propagation of primary human and rodent embryonic neural progenitor cells and cortical neurons. Neuronal Cell Culture. , 45-54 (2013).
  18. Gil-Perotín, S., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone: a review of the neurosphere assay. The Anatomical Record. 296 (9), 1435-1452 (2013).
  19. Ebert, A. D., McMillan, E. L., Svendsen, C. N. Isolating, expanding, and infecting human and rodent fetal neural progenitor cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 6 (1), 2 (2008).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676 (2012).
  21. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43 (1), 25-30 (2007).
  22. Bagheri, A., et al. HDAC Inhibitors Induce BDNF Expression and Promote Neurite Outgrowth in Human Neural Progenitor Cells-Derived Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1109 (2019).
  23. Sartor, G. C., et al. Enhancement of BDNF expression and memory by HDAC inhibition requires BET bromodomain reader proteins. Journal of Neuroscience. 39 (4), 612-626 (2019).
  24. Conde, C., Cáceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319 (2009).
  25. Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. Journal of Neuroscience Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
  26. Grandjean, P., Landrigan, P. J. Developmental neurotoxicity of industrial chemicals. The Lancet. 368 (9553), 2167-2178 (2006).
  27. Dragunow, M. The adult human brain in preclinical drug development. Nature reviews Drug Discovery. 7 (8), 659 (2008).
  28. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
  29. Pan, C., Kumar, C., Bohl, S., Klingmueller, U., Mann, M. Comparative proteomic phenotyping of cell lines and primary cells to assess preservation of cell type-specific functions. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (3), 443-450 (2009).
  30. Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. Journal of Proteome Research. 5 (4), 862-878 (2006).
  31. Yeo, Y., et al. Human Embryonic Stem Cell-Derived Neural Lineages as In Vitro Models for Screening the Neuroprotective Properties of Lignosus rhinocerus (Cooke) Ryvarden. BioMed Research International. 2019, (2019).

Play Video

Cite This Article
Bagheri, A., Razavipour, S. F., Wahlestedt, C., Mowla, S. J., Faghihi, M. A. A Neurite Outgrowth Assay and Neurotoxicity Assessment with Human Neural Progenitor Cell-Derived Neurons. J. Vis. Exp. (162), e60955, doi:10.3791/60955 (2020).

View Video