En neurite utvekstanalyse og nevrotoksisitetsvurdering med humane nevrale stamcelleavledede nevroner

Summary

Den presenterte protokollen beskriver en metode for en neurite utvekstanalyse og nevrotoksisitetsvurdering av små molekylforbindelser.

Abstract

Neurite utvekstanalyse og nevrotoksisitetsvurdering er to store studier som kan utføres ved hjelp av den presenterte metoden heri. Denne protokollen gir pålitelig analyse av nevronal morfologi sammen med kvantitative målinger av modifikasjoner på neurite lengde og synaptisk protein lokalisering og overflod ved behandling med små molekylforbindelser. I tillegg til anvendelsen av den presenterte metoden i neurite utvekststudier, kan nevrotoksisitetsvurdering utføres for å vurdere, skille og rangere kommersielle kjemiske forbindelser basert på deres potensielle utviklingsnevrotoksisitetseffekt.

Selv om cellelinjer i dag er mye brukt i sammensatte screening analyser i nevrovitenskap, de ofte avvike genetisk og fenotypisk fra deres vev opprinnelse. Primærceller, derimot, opprettholde viktige markører og funksjoner observert in vivo. Derfor, på grunn av oversettelsespotensialet og fysiologisk relevans at disse cellene kan tilby neurite utvekstanalyse og nevrotoksisitetsvurdering, kan det være betydelig nytte av å bruke humane nevrale stamceller (hNPCer) som den primære humane cellemodellen.

Den presenterte metoden her kan brukes til å screene for evnen til forbindelser for å indusere neurite utvekst og nevrotoksisitet ved å dra nytte av den menneskelige nevrale stamcelleavledede nevroner, en cellemodell som representerer menneskelig biologi nøye.”

Introduction

Neurite vekst er en prosess som er grunnleggende for dannelsen av det nevronale nettverket og nerveregenerering^1,2. Etter en skade spiller neurite utvekst en nøkkelrolle i regenerering av nervesystemet. Neurite utvekst er også et viktig element i den ekstracellulære signalisering i indusere nevronale regenerative aktiviteter for å forbedre resultatene for nevrodegenerative lidelser og nevronal skade^3,,4,5,6.

Ved å opprettholde sitt differensieringspotensial i å produsere ulike nevrale slekter, kan humane nevrale stamceller (hNPCer) gi et modellsystem for studier av sentralnervesystemet (CNS) funksjon og utvikling^7,,8,9. Høyt translasjonelt potensial og fysiologisk relevans av hNPCer som en primær human cellemodell gir en betydelig fordel i neurite utvekst-relaterte narkotika oppdagelse screenings. Vedlikehold og skalering av primærcellemodellene for høygjennomstrømningsanalyser kan imidlertid være tidkrevende og^{arbeidsintensive 10,,11,,12,,13}.

I tillegg til anvendelsen av den presenterte metoden i neurite utvekststudier, er nevrotoksisitetsvurdering et annet program ved hjelp av hNPC-avledede nevroner. Det er tusenvis av kommersielle kjemiske forbindelser som enten ikke undersøkes eller med dårlig forstått nevrotoksisitetspotensial. Derfor er mer pålitelige og effektive screeningeksperimenter for å vurdere, skille mellom og rangere forbindelser basert på deres potensial til å fremkalle utviklingsnevrotoksisitet i høy etterspørsel¹⁴. Økningen i prevalens og forekomst av nevrologiske lidelser sammen med overflod av utestede forbindelser i miljøet nødvendiggjør utviklingen av mer pålitelige og effektive eksperimenter for å identifisere farlige miljøforbindelser som kan utgjøre nevrotoksisitet¹⁵.

Den presenterte metoden her kan brukes til å screene for evnen til forbindelser for å indusere neurite utvekst og nevrotoksisitet ved å dra nytte av den menneskelige nevrale stamcelleavledede nevroner, en cellemodell som representerer menneskelig biologi nøye.

Protocol

Etikkerklæring: Fosterprøver ble mottatt fra Birth Defects Research Laboratory ved University of Washington i Seattle gjennom et vevsdistribusjonsprogram støttet av National Institute of Health (NIH). Birth Defects Research Laboratory innhentet passende skriftlig informert samtykke fra foreldrene og innkjøp av vev ble overvåket av Institutional Review Board ved University of Washington. Alt arbeidet ble utført med godkjenning av Human Subject Research Office ved University of Miami8. <p …

Representative Results

Protokollen som presenteres i manuskriptet har blitt brukt i to nylig publiserte artikler22,23. Figur 3 viser bruken av hNPCs-avledede nevroner ved å undersøke effekten av HDAC-hemmere som epigenetiske forbindelser på forlengelsen av neurites som en markør for neurite utvekst og påfølgende nevrogen evne til små molekylforbindelser. Videre, i figur 4 neurotoksisitet av t…

Discussion

Denne protokollen er en av de få publiserte papirene som beskriver testen for neurite lengde ved behandling med testforbindelser. Videre beskriver vi hvordan du bruker hNPCer for en neurite utvekstanalyse og nevrotoksisitetsvurdering. Ved å benytte denne neurite utvekstanalysen og nevrotoksisitetsvurderingen på hNPCs-avledede nevroner, er det nevrogene potensialet til en kategori av epigenetiske småmolekylforbindelser, HDAC-hemmere, i induserende neurite utvekst demonstrert²². Videre, i et ann…

Materials

4-well Glass Chamber Slides	Sigma	PEZGS0816
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11001
Alexa Fluor 594	Invitrogen	R37117
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240062
Anti-β-Tubulin III	Thermo	MA1-118X
B27	Thermo	17504001
B27 – minus vitamin A	Thermo	12587010
BDNF	PeproTech	450-02
BSA	Sigma	A8531
CellTiter-Glo	Promega	G7572
CoolCell	Corning	432000	Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1℃/minute cell freezing in a -80℃ freezer
CryoStor CS10	StemCell Technologies	7930	Cryopreservation medium containing 10% DMSO
DAPI	Thermo	D1306
DMEM/F12	Gibco	11320033
DMSO	Sigma	34869-100ML
EGF	Gibco	PHG0311
FGF	Gibco	PHG6015
Formaldehyde	Thermo	FB002
GDNF	PeproTech	450-10
Glutamax	Gibco	35050061	L-alanyl-L-glutamine supplement
Goat Serum	Thermo	50062Z
Heparin	Calbiochem	375095
Laminin	Sigma	L2020-1MG
L-Ascorbic Acid	Sigma	A92902-25G
L-lysine	Sigma	L5501
MEM non-essential amino acids	Gibco	11140050
mFreSR	StemCell Technologies	5854	Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells
N2	Gibco	17502048
NaCl	Sigma	71376
Neurobasal Medium	Gibco	21103049
Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates	Thermo	164610
PBS	Thermo	10010-049
Poly‐L‐lysine	Sigma	P5899-5MG
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo	P10144
Retinoic Acid	Sigma	R2625
Sodium Azide	Sigma	S2002
StemPro Accutase	Gibco	A1110501	Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes
Synaptophysin	Thermo	MA5-14532
Tris Base	Sigma	10708976001
Triton X-100	Sigma	X100-100ML