Summary
O protocolo apresentado descreve um método para um ensaio de crescimento de neurite e avaliação neurotoxicidade de compostos de moléculas pequenas.
Abstract
O ensaio de crescimento de neurita e a avaliação da neurotoxicidade são dois estudos importantes que podem ser realizados utilizando o método aqui apresentado. Este protocolo fornece uma análise confiável da morfologia neuronal juntamente com medições quantitativas de modificações no comprimento do neurite e localização de proteína sináptica e abundância após o tratamento com pequenos compostos de moléculas. Além da aplicação do método apresentado em estudos de crescimento de neurite, a avaliação da neurotoxicidade pode ser realizada para avaliar, distinguir e classificar compostos químicos comerciais com base em seu potencial efeito neurotoxicidade no desenvolvimento.
Embora as linhas celulares sejam hoje amplamente utilizadas em ensaios de triagem composta em neurociência, elas geralmente diferem geneticamente e fenotipicamente de sua origem tecidual. As células primárias, por outro lado, mantêm marcadores e funções importantes observados in vivo. Portanto, devido ao potencial de tradução e relevância fisiológica que essas células poderiam oferecer ensaio de crescimento neurite e avaliação da neurotoxicidade pode beneficiar consideravelmente do uso de células progenitoras neurais humanas (hNPCs) como o modelo primário de células humanas.
O método aqui apresentado pode ser utilizado para testar a capacidade dos compostos de induzir o crescimento e neurotoxicidade neurita, aproveitando-se dos neurônios derivados de células progenitoras neurais, um modelo celular que representa de perto a biologia humana."
Introduction
O crescimento da neurita é um processo fundamental para a formação da rede neuronal e da regeneração nervosa1,2. Após uma lesão, o crescimento de neurite desempenha um papel fundamental na regeneração do sistema nervoso. O crescimento da neurita também é um elemento importante da sinalização extracelular na indução de atividades regenerativas neuronais para melhorar os desfechos para distúrbios neurodegenerativos e lesões neuronais3,,4,,5,6.
Mantendo seu potencial de diferenciação na produção de várias linhagens neurais, as células progenitoras neurais humanas (hNPCs) poderiam fornecer um sistema modelo para estudos da função e desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC)7,,8,,9. Alto potencial translacional e relevância fisiológica dos hNPCs como modelo primário de células humanas oferecem uma vantagem considerável nos exames de descoberta de drogas relacionados ao crescimento de neurite. No entanto, a manutenção e o dimensionamento dos modelos de células primárias para ensaios de alto rendimento podem ser demorados e intensivos em mão-de-obra10,11,,12,13.
Além da aplicação do método apresentado em estudos de crescimento de neurite, a avaliação da neurotoxicidade é outra aplicação utilizando os neurônios derivados do hNPC. Existem milhares de compostos químicos comerciais que não são examinados ou com potencial de neurotoxicidade mal compreendido. Portanto, experimentos de triagem mais confiáveis e eficazes para avaliar, distinguir e classificar compostos com base em seu potencial para obter neurotoxicidade do desenvolvimento está em alta demanda14. O aumento da prevalência e incidência de distúrbios neurológicos, juntamente com a abundância de compostos não testados no ambiente, requer o desenvolvimento de experimentos mais confiáveis e eficientes para identificar compostos ambientais perigosos que possam representar neurotoxicidade15.
O método aqui apresentado pode ser utilizado para testar a capacidade dos compostos de induzir o crescimento e neurotoxicidade neurita, aproveitando-se dos neurônios derivados de células progenitoras neurais humanas, um modelo celular que representa de perto a biologia humana.
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Protocol
Declaração ética: Os espécimes fetais foram recebidos do Laboratório de Pesquisa de Defeitos de Nascimento da Universidade de Washington, em Seattle, por meio de um programa de distribuição de tecidos apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde (NIH). O Laboratório de Pesquisa de Defeitos de Nascimento obteve o consentimento informado por escrito adequado dos pais e a aquisição de tecidos foi monitorada pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Washington. Todo o trabalho foi realizado com aprovação do Escritório de Pesquisa de Sujeitos Humanos da Universidade de Miami8.
1. Isolamento e cultura de células progenitoras neurais humanas (hNPCs)
- Coloque o tecido cerebral em uma placa de Petri de 100 mm e remova cuidadosamente as meninges usando fórceps.
- Transfira o tecido cerebral para um tubo cônico de 50 mL e lave-o duas vezes com 20 mL de PBS invertendo suavemente o tubo.
- Incubar o tecido cerebral em um novo tubo cônico de 50 mL submergindo o tecido na solução de dissociação celular (ver Tabela de Materiais) e DNase I (10 U/mL) por 10 min a 37 °C.
- Adicione 5 mL de meio de cultura celular neuronal (ver Tabela de Materiais) ao tecido cerebral contendo tubo e dissociar mecanicamente as neurosferas triturando 20 a 30 vezes através de uma ponta de tubulação de 1000 μL para fazer uma suspensão unicelular.
- Filtre a suspensão da célula através de um coador de células de 70 μm para remover aglomerados celulares.
- Semente a suspensão unicelular em um frasco T-25 ventilado fornecido com 5-10 mL de cultura celular neuronal complementada com componentes detalhados na Tabela 1.
- Esterilize a solução de heparina através de um filtro de 0,2 μm. O suplemento B-27 sem Vitamina A é um suplemento livre de soro para o cultivo de progenitores neurais e células-tronco, sem induzir diferenciação.
NOTA: As células progenitoras neurais humanas (hNPCs) são isoladas do cérebro fetal humano coletado do feto abortado. Após 7-10 dias na cultura, as células-tronco neurais (NSCs) formam colônias neuroferas flutuantes livres, enquanto outros tipos de células permanecem em suspensão como células únicas ou anexadas ao fundo do frasco. Os hNPCs isolados podem ser cultivados como neurosferas em suspensão por váriosmeses 8,,16,17.
- Esterilize a solução de heparina através de um filtro de 0,2 μm. O suplemento B-27 sem Vitamina A é um suplemento livre de soro para o cultivo de progenitores neurais e células-tronco, sem induzir diferenciação.
| Quantidade | Componente |
| 100 μL | EGF (20 ng/mL) |
| 100 μL | FGF (10 ng/mL) |
| 2 mL | B-27, Menos vitamina A (50X) |
| 1 mL | L-alanyl-L-glutamina (100X) (ver tabela de materiais) |
| 4 μL | Heparina (2 μg/mL) |
| 96,8 mL | Meio de cultura celular neuronal (ver tabela de materiais) |
Mesa 1. Componentes necessários para fazer 100 mL de mídia cultural
2. Passaging the hNPCs
- Colete os meios que contêm as esferas flutuantes, neuroesferas grandes e pequenas, e transfira-as para um tubo cônico de 50 mL.
NOTA: Devido a razões desconhecidas, o tempo para a divisão das neurosferas é variável de 7 dias até 30 dias. No entanto, geralmente, as neurosferas precisam ser passagemdas quando atingem um diâmetro superior a 700-900 μm. É quando o centro da neurosfera começa a escurecer, o que é considerado como um sinal de alta taxa de morte celular18. - Gire as neurosferas por centrifugação a 300-400 x g por 3 min.
- Aspire cuidadosamente o supernasciante e, em seguida, submergir as esferas em 500 μL de reagente de dissociação celular descongelada (ver Tabela de Materiais).
- Faça alíquotas de reagente de dissociação celular adicionando 500 μL por microtubos de 1,5 mL e armazene a -20 °C. Para evitar perder a atividade enzimática, descongele o reagente de dissociação celular segurando no RT ou quente por 5 minutos em um banho de água/contas de 37 °C.
- Dependendo da densidade e tamanho das esferas, incubar as esferas submersas a 37 °C por 5-15 min.
- Adicione 5-10 mL de mídia de cultura pré-aquecida às neuroesferas contendo tubo cônico de 50 mL e centrífuga a 300-400 x g por 5 min para sedimentar as neurosferas.
- Aspire a supernasce e delicadamente pipeta para cima e para baixo, usando uma pipeta de 1000 μL, em 2 mL de mídia cultural até que todas as neurosferas estejam em uma única suspensão celular.
NOTA: A dissociação se tornará visível a olho nu. Antes da dissociação, as neurosferas são na forma de esferas. Depois de submergir em reagente de dissociação e por pipetar para cima e para baixo, eles se tornarão células únicas.- Conte as células e as chapas das células únicas, 2 a 3 milhões de células por frasco T-25 em 10 mL de mídia cultural.
- Alimente as células a cada 3 dias substituindo metade da mídia cultural.
- Resolver neuroesferas inclinando o frasco para que ele esteja em seu canto inferior. Segure o frasco na posição por cerca de 1-2 min até que as neurosferas sedimentem. Em seguida, aspire metade da mídia suavemente inserindo a pipeta sorológica na mídia acima das neuroesferas estabelecidas. Células dissociadas podem se agregar para formar esferas após 2 a 3 dias na cultura19.
3. Congelamento dos hNPCs
- Prepare o meio de congelamento celular adicionando DMSO aos meios de cultura a uma concentração final de 10% (v/v) ou use meio de criopreservação disponível comercialmente para tipos de células sensíveis (ver Tabela de Materiais).
- Classifique grandes esferas transferindo a mídia para um tubo cônico de 50 mL e deixando as esferas se estabelecerem pela gravidade. Em seguida, remova e transfira as grandes neuroesferas em um novo tubo cônico de 50 mL para a passagem usando uma ponta de tubulação de 200 ou 1000 μL.
NOTA: Neuroesferas com diâmetro superior a 900 μm são consideradas grandes e as com diâmetro menor que 500 μm são consideradas pequenas. - Gire as neuroferas restantes por centrifugação a 300-400 x g por 3 min. Remova cuidadosamente o supernasce.
- Resuspend até 100 esferas em 1 mL de reagente criopreservação e transferi-lo para um criotube.
- Armazene durante a noite a -80 °C em um recipiente de congelamento celular (ver Tabela de Materiais) e mova-o para nitrogênio líquido no dia seguinte para armazenamento a longo prazo.
NOTA: É preferível congelar neuroferas de pequeno a médio porte (com menos de 900 μm de diâmetro) e evitar o congelamento de neuroesferas de grande porte (maiores que 900 μm de diâmetro) ou células únicas. A fim de reduzir os danos celulares durante o descongelamento da amostra, mantenha as células densas semeando as neuroesferas descongeladas em um pequeno frasco T25.
4. Diferenciação e tratamento de hNPCs
NOTA: Para induzir a diferenciação, as neurosferas são desagregadas em células únicas, contadas e semeadas em placas revestidas por 5 dias. Em seguida, as células diferenciadas são tratadas por 24 h com compostos de teste antes da imunossão e quantificação da fluorescência.
- Revestimento
- Adicione 200 μL de poli-L-lysine (PLL) por poço de lâminas de câmara de vidro de 4 poços (140 μL por poço de lâminas de câmara de 8 poços).
- Incubar por 1h à temperatura ambiente (RT).
- Lave 3x com PBS.
- Deixe secar no RT (por cerca de 30 min).
- Adicione 150 μL de laminina (50 μg/mL) por poço de lâminas de câmara de vidro de 4 poços (120 μL por poço de lâminas de câmara de 8 poços).
- Incubar por 2 h a 37 °C.
- Lave 3x com PBS.
NOTA: Os slides da câmara revestida podem ser armazenados a 4 °C durante 1 mês.
- Emplacando as células
- Contagem e placa 80.000 neuroesferas de células únicas (neuroesferas em uma única suspensão celular) por poço de lâminas de câmara de 4 poços (70.000 células por poço de 8 poços de deslizamento de câmara).
- Adicione 500 μL de mídia de diferenciação por poço de slide de câmara de 4 poços (250 μL de mídia por poço de slides de câmara de 8 poços).
- Para tornar a mídia de diferenciação primeiro, adicione os seguintes componentes na Tabela 2 a um recipiente estéril e descartável para fazer a mídia de indução neural (NIM).
- Adicione os seguintes ingredientes na Tabela 3 a 48,5 mL de NIM feito na etapa anterior para fazer a mídia de diferenciação.
- Incubar por 5 dias a 37 °C.
- Após 5 dias, trate as células por 24 h, substituindo metade da mídia em cada poço por mídia fresca misturada com a concentração desejada de compostos de teste, incluindo controles apropriados.
| Quantidade | Componente |
| 49 mL | DMEM/F-12 |
| 0,5 mL | Suplemento N2 (100X) |
| 0,5 mL | Aminoácidos não essenciais MEM (100X) |
| 2 μL | Heparina (2 μg/mL) (Stock Conc. is 50 mg/mL) |
Tabela 2. Componentes necessários para fazer 50 mL de NIM
| Quantidade | Componente |
| 1 mL | B-27 (50X) |
| 500 μL | Antibiótico-antimíctico (100X) |
| 5 μL | Ácido retinóico (0,1 μM) |
| 50 μL | GDNF (10 μg/mL) |
| 50 μL | BDNF (10 μg/mL) |
| 5 μL | Ácido ascórbico (0,2 μg/mL) (Stock Conc. is 2 mg/mL) NOTA: Recomendado para ser fresco. |
| 48,5 mL | Nim |
Mesa 3. Componentes necessários para fazer 50 mL de mídia de diferenciação
5. Imunocytoquímica (ICC)
NOTA: As células são fixadas com 4% de formaldeído. A permeabilização e o bloqueio são então realizados para melhorar a penetração e prevenir a ligação inespecífica de anticorpos. As células são então incubadas com anticorpos primários durante a noite. Posteriormente, as células são incubadas com anticorpos secundários fluorescentes rotulados. Finalmente, depois de usar o DAPI para manchar o núcleo, os slides da câmara são montados.
- Fixação
- Aspire suavemente a mídia em cada poço.
- Adicione 500 μL de 4% de formaldeído por poço de lâminas de câmara de 4 poços (250 μL por poço de lâminas de câmara de 8 poços).
- Incubar por 15 min na RT.
- Lave suavemente 2x com 500 μL de PBS.
NOTA: Após a fixação, deixando 1 mL de PBS em cada poço, os slides de cultura podem ser armazenados a 4 °C por até 3 meses.
- Permeabilização e bloqueio celular
- Adicione os seguintes componentes na Tabela 4 a um recipiente estéril e descartável para fazer o tampão de anticorpos (Ab).
- Misture os seguintes ingredientes na Tabela 5 com o tampão Ab feito na etapa anterior para fazer a solução de permeabilização e bloqueio da célula.
- Adicione 500 μL por poço de lâminas de câmara de 4 poços e incubar por 1h no RT.
NOTA: O tampão ab pode ser armazenado a 4 °C.
| Quantidade | Componente |
| 1,75 g | NaCl (150 mM) |
| 1,2 g | TrisBase (50 mM) |
| 2 g | BSA 1% |
| 3,6 g | L-lysine (100 mM) |
| 8 g | Azida de Sódio (4%) |
| 200 mL | Água destilada. NOTA: Inicialmente dissolva os componentes necessários em 150 mL de água e, em seguida, ajuste para 200 mL. |
Mesa 4. Componentes necessários para fazer 200 mL de tampão de anticorpos
| Quantidade | Componente |
| 600 μL | Soro de cabra de 20% |
| 6 μL | 0,2% Triton-X100 |
| 2394 μL | Tampão de anticorpos. NOTA: Inicialmente dissolva os componentes necessários em 2 mL de tampão Ab e, em seguida, ajuste para pH 7.4. Em seguida, adicione mais tampão Ab para ajustar ao volume final de 3 mL e o filtro esterilizar. |
Mesa 5. Componentes necessários para fazer 3 mL de solução de permeabilização e bloqueio de células
- Mancha
- Lave 2x com 500 μL de PBS.
- Adicione o anticorpo primário diluído, anti-β-tubulin III (1:200) e incubar durante a noite a 4 °C (200 μL por poço de lâminas de câmara de 4 poços). Diluir o anticorpo primário na PBS.
- Lave 2x com PBS.
- Adicione o diluído, em PBS, anticorpo secundário fluorescentemente rotulado, Alexa Fluor 488 (1:500), e incubar por 2h no RT em um lugar protegido de luz (250 μL por poço de lâminas de câmara de 4 poços)
- Lave 2x com PBS.
- Adicione o diluído, em PBS, DAPI (concentração de 300 nM) e incubar por 5 min em RT em um lugar protegido de luz (300 μL por poço de lâminas de câmara de 4 poços).
- Lave 3x com PBS.
- Monte os slides da câmara usando as seguintes instruções.
- Desmonte o slide da câmara quebrando as abas de fuga e removendo a junta e a base.
- Adicione uma gota da solução de montagem (ver Tabela de Materiais) por poço de slides de câmara de 4 poços. Em seguida, use um slide de cobertura para cobrir todo o slide.
- Usando uma pinça e em um ângulo, coloque um lado da tampa escorregando contra o slide enquanto faz contato com a borda externa da gota líquida.
- Coloque cuidadosamente a tampa na solução de montagem ao colocá-la no lugar. Evite a criação de bolhas. Pegue uma ponta de pipeta e pressione-a no deslizamento da tampa. As bolhas se movem para o lado.
NOTA: A formação de bolhas é inevitável às vezes. Se ocorrer, imagem ao seu redor, desde que haja alguns. - Siga as instruções do fabricante para o tempo de cura. Evite usar soluções de montagem sem estação devido à dificuldade de manuseio durante a imagem. Caso contrário, o uso de um selante de deslizamento de cobertura apropriado nas bordas é necessário para evitar que a mancha de cobertura deslize durante a imagem.
- Para selar a mancha, use esmalte e faça uma pequena linha na borda do deslizamento da tampa. Deixe o esmalte secar por cerca de 2 minutos.
6. Aquisição de imagem, crescimento de neurite e quantificação da intensidade da fluorescência
NOTA: Após a coloração, use um microscópio confocal com um objetivo de 20x e um tamanho de imagem de 1024 x 1024 pixels para adquirir as imagens das células tratadas. Tirar a imagem pelo menos de dois campos por réplica biológica por condição. Em seguida, use o software de análise de imagem Fiji (ImageJ 1.51u) para quantificação do comprimento do neurite. Brevemente, meça o comprimento do neurite mais longo para cada neurônio e, após a média dos valores por tratamento, use o teste t do aluno para grupos independentes para comparar os meios entre grupos experimentais e grupo controle.
NOTA: Vários programas comerciais (Imaris, Volocity, Amira) e open source (ImajeJ, CellProfiler, Vaa3D, BioImageXD, Icy, KNIME) estão disponíveis. Entre esses programas, o ImageJ tornou-se a ferramenta de escolha para análise biológica de imagens20,21. O portal ImageJ em https://imagej.net/Introduction é uma fonte útil de informações que fornecem uma descrição completa das funções básicas e incorporadas do ImageJ, incluindo processamento de imagem, colocalização, desconvolução, registro, segmentação, rastreamento e visualização.
- Medindo o crescimento neuronal com o software de análise de imagem fiji
- Como ilustrado na Figura 1,abra a imagem arrastando-a e soltando-a no software Fiji ou selecionando File | Aberto.
- Selecionar analisar | Ferramentas | Gerenciador de ROIe, em seguida, clique com o botão direito do mouse no ícone 5na barra de ferramentas Reta e mude para linha à mão livre. Opcionalmente, clique duas vezes no mesmo ícone para alterar a largura da linha para 10 e, em seguida, traçar o neurite mais longo, começando perto do corpo celular e estendendo-se até a ponta do neurite.
- Pressione Ctrl + T & depois F para adicionar a medição ao Gerenciador de ROI e destacar o neurônio medido. Selecione todos os números no ROI,clique em Medir,selecione todos os comprimentos calculados e copie/cole em uma planilha.
- Medindo a intensidade da fluorescência de células rotuladas com o software de análise de imagem fiji
- Conforme ilustrado na Figura 2, após abrir a imagem, clique no ícone 4na barra de ferramentas seleções à mão livre. Desenhe a forma da célula.
- Selecionar analisar | Definir medidas e selecionar para os seguintes valores: Área, Densidade Integrada, Valor cinza médio | Analisar | Medida (uma caixa pop-up com uma pilha de valores abertos).
- Selecione uma região ao lado da célula como plano de fundo (tamanho não é importante) e, em seguida, selecione Analisar | Medida. Selecione todos os dados medidos e copie/cole em uma planilha.
NOTA: Densidade Integrada (IntDen) é o item utilizado para determinar as intensidades fluorescentes. Neste estudo, a intensidade fluorescente da molécula-alvo é medida para analisar inicialmente sua distribuição na célula e, posteriormente, quantificar a abundância da molécula-alvo sob vários tratamentos. Consequentemente, a eficácia dos tratamentos será medida e comparada com o controle.
7. Avaliação da neurotoxicidade
NOTA: A citotoxicidade dos compostos de ensaio é avaliada em placas de 384 poços (ver Tabela de Materiais) utilizando um ensaio de viabilidade celular luminescente (ver Tabela de Materiais). Os hNPCs são preparados seguindo o mesmo método, exceto pequenas modificações, descritas na seção "Diferenciação e Tratamento de hNPCs". Posteriormente, um sinal luminescente gerado pelo ensaio de viabilidade celular luminescente é medido utilizando um leitor de microplaca. O sinal luminescente é proporcional à concentração de ATP celular que em si é diretamente proporcional ao número de células viáveis presentes em cada poço.
- Revestimento
- Adicione 30 μL de poli-L-lysine (PLL) por poço de placa de 384 poços.
- Incubar por 1 h na RT.
- Lave 2x com PBS.
- Deixe secar no RT (por cerca de 30 min).
- Adicione 30 μL de laminina (50 μg/mL) por poço de placa de 384 poços.
- Incubar por 2 h a 37 °C.
- Lave 2x com PBS.
NOTA: As placas revestidas de 384 poços podem ser armazenadas a 4 °C durante 1 mês.
- Emplacando as células
- Contagem e placa 20.000 neurosferas de células únicas por poço de placa de 384 poços em 25 μL de mídia de diferenciação.
- Incubar por 5 dias a 37 °C.
- Após 5 dias, trate as células por 24 h por compostos de teste preparados em 6x a concentração final desejada em volume de 5 μL (para fazer o volume final de 30 μL por poço).
- Ensaio de viabilidade celular
- Adicione 30 μL de reagente de ensaio de viabilidade celular luminescente por poço de placa de 384 poços.
NOTA: Adicione um volume de reagente de ensaio de viabilidade celular luminescente igual ao volume presente em cada poço. Descongele o reagente de ensaio de viabilidade celular luminescente e equilibre-se ao RT antes de usar. - Agite em um agitador de pratos por 2 minutos (para misturar e induzir a lise celular).
- Gire a mistura para baixo por centrifugação a 300-400 x g para 30 s.
- Incubar a placa de 384 poços por 10 min no RT em um lugar protegido da luz (para estabilizar o sinal luminescente).
- Regisso recorde luminescência com um leitor de microplaca.
NOTA: Utilize controles apropriados para o ensaio de viabilidade, incluindo Velcade (em uma concentração final de 10 μM) como positivo e HBSS contendo DMSO (com concentração final de 0,1% ou 0,2%) como controle negativo.
- Adicione 30 μL de reagente de ensaio de viabilidade celular luminescente por poço de placa de 384 poços.
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Representative Results
O protocolo apresentado no manuscrito foi utilizado com sucesso em dois artigos publicados recentemente22,23. A Figura 3 demonstra o uso de neurônios derivados de hNPCs na análise do efeito dos inibidores de HDAC como compostos epigenéticos na extensão dos neurites como um marcador para o crescimento de neurite e subsequente capacidade neurogênica de compostos de pequenas moléculas.
Além disso, na Figura 4, a neurotoxicidade dos compostos testados (inibidores de HDAC) também é avaliada por diferenciar simultaneamente os hNPCs em placas de 384 poços, mostrando o potencial do modelo celular apresentado (hNPCs) para avaliação neurotoxicidade e a capacidade de escalar para testar a neurotoxicidade para um maior número de compostos.
Em outro artigo de Sartor et al. (Figura 5),a medição da intensidade de fluorescência celular neuronal para quantificar a abundância de H4K5ac, como marca histona, após tratar os neurônios diferenciados dos hNPCs com compostos modificadores epigenéticos é demonstrado com sucesso23. Além disso, como ilustrado na Figura 6, em um trabalho inédito, o protocolo tem sido usado para visualizar uma proteína pré-sináptica, a sináptise, para verificar o possível efeito sinatogênico de compostos de pequenas moléculas.
Figura 1: Fluxo de trabalho passo a passo ilustrando uma abordagem para medir o crescimento neuronal com o software de análise de imagem fiji. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fluxo de trabalho passo a passo ilustrando uma abordagem para quantificar a intensidade de fluorescência das células neuronais com o software de análise de imagem de Fiji. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Ensaio de crescimento de neurita com pequenos compostos epigenéticos de moléculas.
(A) Imagens fluorescentes representativas (ampliação de 20x) para tratamento de neurônios derivados de hNPCs com inibidores de HDAC à base de hidroxamic. As células progenitoras neurais humanas são diferenciadas por 5 dias; em seguida, tratada por 24h com DMSO de 0,1% (como controle), e Trichostatina A, JNJ26481585, SB939 e PCI24781 (como compostos de teste). Em seguida, a imunostaining é realizada com anticorpo β-tubulin III específico do neurônio (verde) para visualizar processos neuronais e quantificar comprimentos de neurite e DAPI (azul) para visualizar núcleos celulares. (B) Análise estatística do comprimento do neurite em vários grupos. Como descrito, todos os compostos de teste podem induzir o crescimento de neurite. A análise quantitativa do comprimento do neurite é feita usando o software ImageJ. As barras de erro representam o SEM; p < 0,001, **** p < 0,0001. Este valor foi modificado a partir de Bagheri et al.22. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Avaliação da neurotoxicidade utilizando ensaio de viabilidade celular luminescente.
hNPCs são semeados e diferenciados para neurônios na placa de 384 poços de acordo com o mesmo método usado para o ensaio de crescimento de neurite. A partir daí, o efeito dos compostos de teste sobre a viabilidade das células após 24 horas de exposição é medido. Como mostrado, não há toxicidade significativa nos tratamentos. A ANOVA unidirecional é utilizada para análise de dados e um valor p < 0,05 é considerado estatisticamente significativo. Este valor foi modificado a partir de Bagheri et al.22. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: RGFP966 aumenta H4K5ac em neurônios diferenciados das células progenitoras neurais humanas.
(A) Coloração representativa da imunofluorescência de β tubulin, DAPI e H4K5ac após tratamento com DMSO, RGFP966 ou RGFP966 + JQ1 em neurônios derivados de hNPCs. (B) Quantificação da intensidade de fluorescência de H4K5ac após o tratamento com DMSO, RGFP966 ou RGFP966 + JQ1. As barras de erro representam o SEM; p < 0,0001. Este número foi modificado a partir de Sartor et al.23. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Coloração representativa da imunofluorescência da Sináptica (vermelha) para visualizar terminais sinápticos, β tubulin (verde) para visualizar processos neuronais, e DAPI (azul) para visualizar núcleos celulares após o tratamento com DMSO (como controle) e SB939 (como composto de teste) em neurônios derivados de hNPCs. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo é um dos poucos artigos publicados que descrevem o teste para o comprimento de neurite após o tratamento com compostos de teste. Além disso, descrevemos como usar hNPCs para um ensaio de crescimento de neurito e avaliação da neurotoxicidade. Utilizando este ensaio de crescimento neurite e avaliação neurotoxicidade em neurônios derivados de hNPCs, o potencial neurogênico de uma categoria de compostos epigenéticos de pequenas moléculas, inibidores de HDAC, na indução do crescimento de neurite é demonstrado22. Além disso, em outro artigo apresentado por Sartor et al., este protocolo é usado para quantificar a intensidade de fluorescência de H4K5ac, uma proteína histona, após o tratamento com vários compostos modificadores epigenéticos23.
A função cognitiva conta com fiação adequada e conexões funcionais dentro de circuitos neuronais. Quantificação detalhada e consistente de vários aspectos da morfologia neuronal como uma abordagem de triagem fenotípica é essencial para obter uma visão confiável nas vias subjacentes que levam a distúrbios cerebrais que vão do neurodesenvolvimento a transtornos psiquiátricos. A triagem fenotípica é considerada uma abordagem notavelmente eficaz na exploração de compostos de pequenas moléculas como candidatos a medicamentos putativos para modular um fenótipo celular. Nesta abordagem, em vez de interrogar apenas um único alvo, todos os componentes e caminhos da célula são examinados24.
A morfologia neuronal, incluindo forma, estrutura e conectividade são consideradas características-chave da função neuronal. Perturbações genéticas que alteram a morfologia dos neurônios ou a localização e o nível de proteína sináptica poderiam, notavelmente, contribuir para a análise de mutações causadoras de doenças. Portanto, métodos confiáveis são necessários para avaliar o impacto dos perturbagens na morfologia neuronal25.
Os hNPCs são isolados do cérebro mamífero embrionário, que são posteriormente cultivados in vitro na presença de mitogênios. Essas células são compostas de neurosferas que são caracterizadas como agregados celulares flutuantes compostos por células progenitoras neurais e células gliais radiais. Os hNPCs fornecem um sistema de modelo desejável para função e desenvolvimento do sistema nervoso, mantendo seu potencial de diferenciação na produção de várias linhagens neurais7,,8,,9. O número de neurite, intensidade, comprimento e largura, juntamente com características sinápticas, incluindo modificações de proteínas pré e pós-sinápticas, estão entre as alterações neurite e sináptica que poderiam ser medidas de forma confiável e eficiente usando o método aqui apresentado.
Devido ao aumento da prevalência de distúrbios neurológicos, como transtorno do déficit de atenção com hiperatividade e autismo, o potencial neurotoxicidade de produtos químicos ambientais em crianças continua sendo uma preocupação pública15,26. Portanto, também é examinada a usabilidade dos neurônios derivados de hNPCs para uma avaliação de neurotoxicidade confiável e eficiente. Como demonstrado na Figura 4,os hNPCs poderiam ser adaptados e dimensionados para avaliação da neurotoxicidade em placas de 384 poços.
A avaliação da neurotoxicidade como aplicação para o modelo celular introduzido é viável diferenciando as neurosferas em neurônios antes de emplacar em placas de 384 poços ou diferenciando as células enquanto as neurosferas são banhadas em placas de 384 poços como células únicas. Nesta última abordagem, são necessárias habilidades de pipetação de alta precisão para emplacar o número exato de neuroesferas que são desagregadas em células únicas e também para os seguintes procedimentos de tratamento com meio indutor de diferenciação. Considerando as habilidades de pipetação necessárias, recomenda-se diferenciação antes do revestimento para alcançar resultados mais reprodutíveis. Além disso, a classificação de células a granel por fluorescência ativada de triagem celular (FACS) também poderia ser potencialmente usada para separar com precisão o número necessário de células contornando a necessidade de habilidades de tubulação de alta precisão.
É aconselhável iniciar o ensaio de crescimento de neurita por avaliação neurotoxicic para evitar ensaios repetidos de crescimento de neurite com várias doses do mesmo composto para alcançar a concentração nãotóxica. Portanto, a combinação de uma avaliação da neurotoxicidade utilizando o ensaio de viabilidade celular luminescente contra uma curva dose-resposta dos compostos de teste resultará em encontrar a dosagem certa com o mínimo esforço. O ensaio de viabilidade celular luminescente é um método altamente sensível para determinar o número de células viáveis em uma cultura celular. O método funciona na quantitação da ATP presente na cultura como um indicador do metabolismo celular. O formato de adquirção, mixagem e medida do ensaio fornece uma abordagem simples e rápida para verificar a viabilidade celular e a citotoxicidade dos compostos de teste.
Existem algumas limitações ao protocolo apresentado da seguinte forma. Devido à disponibilidade e variabilidade inerente, o uso de células primárias fisiologicamente relevantes é limitado25. os hNPCs têm uma taxa de proliferação lenta, o que poderia limitar sua utilização. A análise manual em larga escala de imagens fluorescentes de neurônios é demorada e suscetível ao viés experimentador. HNPCs poderiam ser considerados como células neurais jovens, não representando modificações epigenéticas relacionadas à idade acumuladas em células ao longo da vida de uma pessoa. Como os distúrbios neurodegenerativos ocorrem em indivíduos mais velhos, os HNPCs podem não ter relevância fisiológica adequada para ser um modelo apropriado para condições de início tardio.
Embora modelos animais e linhas celulares tenham sido valiosos na decifração de mecanismos moleculares subjacentes às doenças, eles têm mostrado limitações na tradução dos achados em terapêutica humana27,,28,,29,30. Células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSCs) e células-tronco embrionárias humanas (hESCs) ao lado de hNPCs são consideradas como melhores modelos de células in vitro, recapitulando a fisiologia humana. Portanto, os neurônios derivados de hiPSCs e hESCs também podem ser potencialmente utilizados como duas fontes de células alternativas para ensaio de crescimento de neurito e avaliação neurotoxicidade, utilizando o protocolo aqui apresentado1,,31.
Em conclusão, o alto potencial translacional e a relevância fisiológica dos HNPCs como modelo celular humano primário fornecem um recurso valioso em exames de descoberta de drogas relacionados ao crescimento de neurite e avaliação da neurotoxicidade superando as limitações mencionadas anteriormente.
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Disclosures
Todos os autores não indicam potenciais conflitos de interesse.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi financiada pela nimad research grant (940714) concedida à MAF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-well Glass Chamber Slides | Sigma | PEZGS0816 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | R37117 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| Anti-β-Tubulin III | Thermo | MA1-118X | |
| B27 | Thermo | 17504001 | |
| B27 - minus vitamin A | Thermo | 12587010 | |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | |
| BSA | Sigma | A8531 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7572 | |
| CoolCell | Corning | 432000 | Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1°C/minute cell freezing in a -80°C freezer |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium containing 10% DMSO |
| DAPI | Thermo | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | 34869-100ML | |
| EGF | Gibco | PHG0311 | |
| FGF | Gibco | PHG6015 | |
| Formaldehyde | Thermo | FB002 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine supplement |
| Goat Serum | Thermo | 50062Z | |
| Heparin | Calbiochem | 375095 | |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-25G | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| mFreSR | StemCell Technologies | 5854 | Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates | Thermo | 164610 | |
| PBS | Thermo | 10010-049 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P5899-5MG | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo | P10144 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes |
| Synaptophysin | Thermo | MA5-14532 | |
| Tris Base | Sigma | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML |
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