Summary

Un saggio di escrescenza Neurite e una valutazione della neurotossicità con neuroni derivati dalla cellula del progenitore neurale umano

Published: August 06, 2020
doi:

Summary

Il protocollo presentato descrive un metodo per un saggio di escrescenza neurite e la valutazione della neurotossicità di piccoli composti molecolari.

Abstract

Neurite analisi di escrescenza e la valutazione della neurotossicità sono due studi principali che possono essere eseguiti utilizzando il metodo presentato qui. Questo protocollo fornisce un’analisi affidabile della morfologia neuronale insieme alle misurazioni quantitative delle modifiche sulla lunghezza dei neuriti e sulla localizzazione delle proteine sinaptiche e sull’abbondanza al trattamento con piccoli composti molecolari. Oltre all’applicazione del metodo presentato negli studi sulla neurite outgrowth, la valutazione della neurotossicità può essere eseguita per valutare, distinguere e classificare i composti chimici commerciali in base al loro potenziale effetto di neurotossicità dello sviluppo.

Anche se le linee cellulari sono oggi ampiamente utilizzate nei saggi di screening composto nelle neuroscienze, spesso differiscono geneticamente e fenotipicamente dalla loro origine tissutale. Le cellule primarie, d’altra parte, mantengono importanti marcatori e funzioni osservate in vivo. Pertanto, a causa del potenziale di traduzione e rilevanza fisiologica che queste cellule potrebbero offrire analisi di crescita neurite e la valutazione della neurotossicità possono notevolmente beneficiare dell’utilizzo di cellule progenitrici neurali umane (hNPC) come modello cellulare umano primario.

Il metodo presentato qui può essere utilizzato per lo screening per la capacità dei composti di indurre la crescita di neurite e neurotossicità sfruttando i neuroni derivati dalla cellula progenitore neurale umano, un modello cellulare che rappresenta da vicino la biologia umana.”

Introduction

La crescita di Neurite è un processo fondamentale per la formazione della rete neuronale e la rigenerazione del nervo1,2. A seguito di un infortunio, la crescita dei neuriti svolge un ruolo chiave nella rigenerazione del sistema nervoso. L’escrescenza di Neurite è anche un elemento importante della segnalazione extracellulare nell’indurre attività rigenerative neuronali per migliorare i risultati per disturbi neurodegenerativi e lesioni neuronali3,4,5,6.

Mantenendo il loro potenziale di differenziazione nella produzione di vari lignaggi neurali, le cellule progenitrici neurali umane (hNMC) potrebbero fornire un sistema modello per gli studi sulla funzione del sistema nervoso centrale (CNS) e sullo sviluppo7,8,9. L’elevato potenziale traslazionale e la rilevanza fisiologica degli hNMC come modello primario di cellule umane offrono un notevole vantaggio negli screening di scoperti di farmaci legati alla crescita neurite. Tuttavia, la manutenzione e il ridimensionamento dei modelli cellulari primari per i test ad alto consumo potrebbero richiedere molto tempo e molta mano doperante10,11,12,13.

Oltre all’applicazione del metodo presentato negli studi sulla neurite outgrowth, la valutazione della neurotossicità è un’altra applicazione che utilizza i neuroni derivati dall’hNPC. Ci sono migliaia di composti chimici commerciali che non vengono esaminati o con un potenziale di neurotossicità poco compreso. Pertanto, esperimenti di screening più affidabili ed efficaci per valutare, distinguere e classificare i composti in base al loro potenziale di provocare neurotossicità dello sviluppo è molto richiesto14. L’aumento della prevalenza e dell’incidenza di disturbi neurologici insieme all’abbondanza di composti non testati nell’ambiente richiede lo sviluppo di esperimenti più affidabili ed efficienti per identificare composti ambientali pericolosi che possono rappresentare la neurotossicità15.

Il metodo presentato qui può essere utilizzato per lo screening per la capacità dei composti di indurre neurite ecrescita e neurotossicità sfruttando i neuroni derivati dalla cellula progenitore neurale umano, un modello cellulare che rappresenta da vicino la biologia umana.

Protocol

Dichiarazione etica: Gli esemplari fetali sono stati ricevuti dal Birth Defects Research Laboratory dell’Università di Washington a Seattle attraverso un programma di distribuzione dei tessuti sostenuto dal National Institute of Health (NIH). Il Birth Defects Research Laboratory ha ottenuto un adeguato consenso informato scritto dai genitori e l’approvvigionamento dei tessuti è stato monitorato dall’Institutional Review Board dell’Università di Washington. Tutto il lavoro è stato svolto con l’approvazione dell’Uffici…

Representative Results

Il protocollo presentato nel manoscritto è stato utilizzato con successo in due articoli pubblicati di recente22,23. La figura 3 mostra l’uso di neuroni derivati da hNPC nell’esaminare l’effetto degli inibitori HDAC come composti epigenetici sull’estensione dei neuriti come marcatore per la escrescenza dei neuriti e la successiva capacità neurogenica dei composti molecolari di piccole dimensioni. Inoltre…

Discussion

Questo protocollo è uno dei pochi articoli pubblicati che descrivono il test per la lunghezza della neurite al trattamento con composti di prova. Inoltre, descriviamo come utilizzare gli hNPC per un saggio di escrescenza di neurite e una valutazione della neurotossicità. Utilizzando questa valutazione di analisi e neurotossicità della neurite e della neurotossicità sui neuroni derivati dagli hNFC, il potenziale neurogenico di una categoria di composti epigenetici di piccole molecole, inibitori HDAC, nell’indurre la c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questa ricerca è stata finanziata dalla borsa di ricerca NIMAD (940714) assegnata al MAF.

Materials

4-well Glass Chamber Slides Sigma PEZGS0816
Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11001
Alexa Fluor 594 Invitrogen R37117
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240062
Anti-β-Tubulin III Thermo MA1-118X
B27 Thermo 17504001
B27 – minus vitamin A Thermo 12587010
BDNF PeproTech 450-02
BSA Sigma A8531
CellTiter-Glo Promega G7572
CoolCell Corning 432000 Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1℃/minute cell freezing in a -80℃ freezer
CryoStor CS10 StemCell Technologies 7930 Cryopreservation medium containing 10% DMSO
DAPI Thermo D1306
DMEM/F12 Gibco 11320033
DMSO Sigma 34869-100ML
EGF Gibco PHG0311
FGF Gibco PHG6015
Formaldehyde Thermo FB002
GDNF PeproTech 450-10
Glutamax Gibco 35050061 L-alanyl-L-glutamine supplement
Goat Serum Thermo 50062Z
Heparin Calbiochem 375095
Laminin Sigma L2020-1MG
L-Ascorbic Acid Sigma A92902-25G
L-lysine Sigma L5501
MEM non-essential amino acids Gibco 11140050
mFreSR StemCell Technologies 5854 Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells
N2 Gibco 17502048
NaCl Sigma 71376
Neurobasal Medium Gibco 21103049
Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates Thermo 164610
PBS Thermo 10010-049
Poly‐L‐lysine Sigma P5899-5MG
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo P10144
Retinoic Acid Sigma R2625
Sodium Azide Sigma S2002
StemPro Accutase Gibco A1110501 Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes
Synaptophysin Thermo MA5-14532
Tris Base Sigma 10708976001
Triton X-100 Sigma X100-100ML

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Bagheri, A., Razavipour, S. F., Wahlestedt, C., Mowla, S. J., Faghihi, M. A. A Neurite Outgrowth Assay and Neurotoxicity Assessment with Human Neural Progenitor Cell-Derived Neurons. J. Vis. Exp. (162), e60955, doi:10.3791/60955 (2020).

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