Summary
Le protocole présenté décrit une méthode pour un test d’excroissance de neurite et l’évaluation de neurotoxicité des composés de petites molécules.
Abstract
L’analyse d’excroissance de neurite et l’évaluation de neurotoxicité sont deux études principales qui peuvent être exécutées utilisant la méthode présentée ci-dessus. Ce protocole fournit une analyse fiable de la morphologie neuronale ainsi que des mesures quantitatives des modifications sur la longueur de la neurite et la localisation des protéines synaptiques et l’abondance lors du traitement avec de petits composés de molécules. En plus de l’application de la méthode présentée dans les études sur l’excroissance de la neurite, l’évaluation de la neurotoxicité peut être effectuée pour évaluer, distinguer et classer les composés chimiques commerciaux en fonction de leur effet potentiel de neurotoxicité développementale.
Même si les lignées cellulaires sont aujourd’hui largement utilisées dans les tests de dépistage composés en neurosciences, elles diffèrent souvent génétiquement et phénotypiquement de leur origine tissulaire. Les cellules primaires, d’autre part, maintiennent des marqueurs et des fonctions importants observés in vivo. Par conséquent, en raison du potentiel de traduction et de la pertinence physiologique que ces cellules pourraient offrir l’essai de néoration et l’évaluation de neurotoxicité peuvent considérablement bénéficier de l’utilisation des cellules progénitrices neuronales humaines (hNPC) comme modèle cellulaire humain primaire.
La méthode présentée ici peut être utilisée pour dépister la capacité des composés à induire l’excroissance de la neurite et la neurotoxicité en profitant des neurones humains dérivés des cellules progéniteurs, un modèle cellulaire représentant étroitement la biologie humaine.
Introduction
La croissance de la neurite est un processus fondamental pour la formation du réseau neuronal et la régénération nerveuse1,2. À la suite d’une blessure, l’excroissance de la neurite joue un rôle clé dans la régénération du système nerveux. L’excroissance de neurite est également un élément important de la signalisation extracellulaire en induisant des activités régénératrices neuronales pour améliorer les résultats pour les désordres neurodégénératifs et les dommages neuronaux3,4,5,6.
En maintenant leur potentiel de différenciation dans la production de diverses lignées neuronales, les cellules progénitrices neuronales humaines (hNPC) pourraient fournir un système modèle pour l’étude de la fonction et du développement du système nerveux central (SNC)7,8,9. Le potentiel translationnel élevé et la pertinence physiologique des HNPC en tant que modèle primaire de cellules humaines offrent un avantage considérable dans les dépistages de découverte de drogue liés à l’excroissance de neurite. Toutefois, l’entretien et l’échelle des modèles de cellules primaires pour les tests à haut débit pourraient prendre beaucoup de temps et10,11,12,13.
En plus de l’application de la méthode présentée dans les études sur l’excroissance de la neurite, l’évaluation de la neurotoxicité est une autre application utilisant les neurones dérivés du HNPC. Il y a des milliers de composés chimiques commerciaux qui ne sont pas examinés ou avec un potentiel de neurotoxicité mal compris. Par conséquent, des expériences de dépistage plus fiables et plus efficaces pour évaluer, distinguer et classer les composés en fonction de leur potentiel pour susciter une neurotoxicité développementale sont très demandées14. L’augmentation de la prévalence et de l’incidence des troubles neurologiques ainsi que l’abondance de composés non testés dans l’environnement nécessite le développement d’expériences plus fiables et efficaces pour identifier les composés environnementaux dangereux qui peuvent poser la neurotoxicité15.
La méthode présentée ici peut être utilisée pour dépister la capacité des composés à induire l’excroissance de la neurite et la neurotoxicité en profitant des neurones humains dérivés des cellules progéniteurs, un modèle cellulaire représentant étroitement la biologie humaine.
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Protocol
Énoncé d’éthique : Des échantillons fœtaux ont été reçus du Laboratoire de recherche sur les malformations congénitales de l’Université de Washington à Seattle dans le cadre d’un programme de distribution de tissus soutenu par le National Institute of Health (NIH). Le Laboratoire de recherche sur les malformations congénitales a obtenu le consentement écrit approprié des parents et l’achat de tissus a été surveillé par le Conseil d’examen institutionnel de l’Université de Washington. Tous les travaux ont été effectués avec l’approbation du Bureau de recherche sur les sujets humains de l’Université de Miami8.
1. Isolement et culture des cellules progénitrices neuronales humaines (hNPC)
- Placez le tissu cérébral dans une boîte de Pétri de 100 mm et retirez soigneusement les méninges à l’aide de forceps.
- Transférer le tissu cérébral dans un tube conique de 50 mL et le laver deux fois avec 20 ml de PBS en inversant doucement le tube.
- Incuber le tissu cérébral dans un nouveau tube conique de 50 mL en submergeant le tissu dans la solution de dissociation cellulaire (voir tableau des matériaux)et DNase I (10 U/mL) pendant 10 min à 37 °C.
- Ajouter 5 ml de milieu de culture cellulaire neuronale (voir tableau des matériaux)au tissu cérébral contenant le tube et dissocier mécaniquement les neurosphères en triturant 20 à 30 fois par une pointe de pipet de 1000 μL pour faire une suspension à une seule cellule.
- Filtrer la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 70 μm pour enlever les grappes cellulaires.
- Seed la suspension unicellulaire dans une fiole T-25 ventilée fournie avec 5-10 mL de milieu de culture cellulaire neuronale complétée par des composants détaillés dans le tableau 1.
- Stériliser la solution d’héparine par filtration à travers un filtre de 0,2 μm. Le supplément B-27 sans vitamine A est un supplément sans sérum pour la culture des progéniteurs neuronaux et des cellules souches, sans induire la différenciation.
NOTE : Les cellules progénitrices neuronales humaines (hNPC) sont isolées du cerveau foetal humain recueilli du foetus avorté. Après 7 à 10 jours de culture, les cellules souches neurales (NSC) forment des colonies de neurosphère flottante, tandis que d’autres types de cellules restent en suspension sous forme de cellules simples ou s’attachent au fond de la fiole. Les hNPC isolés peuvent être cultivés comme neurosphères en suspension pendant plusieurs mois8,16,17.
- Stériliser la solution d’héparine par filtration à travers un filtre de 0,2 μm. Le supplément B-27 sans vitamine A est un supplément sans sérum pour la culture des progéniteurs neuronaux et des cellules souches, sans induire la différenciation.
| Montant | Composant |
| 100 μL | EGF (20 ng/mL) |
| 100 μL | FGF (10 ng/mL) |
| 2 mL | B-27, moins vitamine A (50X) |
| 1 mL | L-alanyl-L-glutamine (100X) (voir tableau des matériaux) |
| 4 μL | Héparine (2 μg/mL) |
| 96,8 mL | Milieu de culture cellulaire neuronale (voir tableau des matériaux) |
Tableau 1. Composants nécessaires à la fabrication de 100 mL de supports culturels
2. Passer les hNPC
- Recueillir les supports contenant les sphères flottantes, grandes et petites neurosphères, et les transférer dans un tube conique de 50 mL.
REMARQUE : Pour des raisons inconnues, le moment de fractionnement des neurosphères varie de 7 jours à 30 jours. Cependant, généralement, les neurosphères doivent être adoptées lorsqu’elles atteignent un diamètre supérieur à 700-900 μm. C’est alors que le centre de la neurosphère commence à s’assombrir, ce qui est considéré comme un signe d’un taux élevé de mort cellulaire18. - Faites tourner les neurosphères vers le bas par centrifugation à 300-400 x g pendant 3 min.
- Apirate soigneusement le supernatant, puis submerger les sphères dans 500 μL de réactif de dissociation des cellules décongelées (voir tableau des matériaux).
- Faire des aliquots de réactif de dissociation cellulaire en ajoutant 500 μL par microtubes de 1,5 mL et stocker à -20 °C. Pour éviter de perdre l’activité enzymatique, décongeler le réactif de dissociation cellulaire en maintenant à RT ou au chaud pendant 5 min dans un bain d’eau/perle de 37 °C.
- Selon la densité et la taille des sphères, incuber les sphères submergées à 37 °C pendant 5-15 min.
- Ajouter 5 à 10 ml de supports de culture préchauffés aux neurosphères contenant un tube conique de 50 ml et une centrifugeuse à 300-400 x g pendant 5 min pour sédimenter les neurosphères.
- Remplacer le supernatant et doucement pipette de haut en bas, à l’aide d’une pipette de 1000 μL, dans 2 mL de milieux de culture jusqu’à ce que toutes les neurosphères soient dans une seule suspension cellulaire.
REMARQUE : La dissociation deviendra visible à l’œil nu. Avant la dissociation, les neurosphères sont sous forme de sphères. Après avoir immergé dans le réactif de dissociation et en faisant des pipeting de haut en bas, ils deviendront des cellules simples.- Compter les cellules et plaquer les cellules simples, 2 à 3 millions de cellules par flacon T-25 dans 10 ml de milieux de culture.
- Nourrissez les cellules tous les 3 jours en remplaçant la moitié des supports de culture.
- Installez les neurosphères en penchant la fiole de sorte qu’elle soit sur son coin inférieur. Maintenez la fiole en position pendant environ 1-2 min jusqu’à ce que les neurosphères sédimentent. Puis aspirate doucement la moitié des médias en insérant la pipette sérologique dans les médias au-dessus des neurosphères installées. Les cellules dissociées peuvent s’agréger pour former des sphères après 2 à 3 jours dans la culture19.
3. Congélation des hNPC
- Préparer le milieu de congélation cellulaire en ajoutant le DMSO au support de culture à une concentration finale de 10 % (v/v) ou utiliser un milieu de cryoconservation disponible dans le commerce pour les types de cellules sensibles(voir tableau des matériaux ).
- Trier les grandes sphères en transférant les médias dans un tube conique de 50 mL et en laissant les sphères s’installer par gravité. Retirez et transférez ensuite les grandes neurosphères dans un nouveau tube conique de 50 mL pour le passage à l’aide d’une pointe de pipet de 200 ou 1000 μL.
REMARQUE : Les neurosphères d’un diamètre supérieur à 900 μm sont considérées comme grandes et celles d’un diamètre inférieur à 500 μm sont considérées comme petites. - Faites tourner les neurosphères restantes vers le bas par centrifugation à 300-400 x g pendant 3 min. Retirez soigneusement le supernatant.
- Resuspendez jusqu’à 100 sphères dans 1 mL de réactif cryoconservation et transférez-le sur un cryotube.
- Conserver toute la nuit à -80 °C dans un contenant de congélation cellulaire (voir tableau des matériaux)et le déplacer vers l’azote liquide le lendemain pour un stockage à long terme.
REMARQUE : Il est préférable de congeler des neurosphères de petite à moyenne taille (de moins de 900 μm de diamètre) et d’éviter de congeler des neurosphères de grande taille (de plus de 900 μm de diamètre) ou des cellules individuelles. Afin de réduire les dommages cellulaires pendant le dégel de l’échantillon, gardez les cellules denses en ensemenant les neurosphères décongelées dans une petite fiole T25.
4. Différenciation et traitement des PNH
REMARQUE : Pour induire la différenciation, les neurosphères sont désagrégées en cellules individuelles, comptées puis ensemencées sur des plaques enduites pendant 5 jours. Ensuite, les cellules différenciées sont traitées pendant 24 h avec des composés d’essai avant l’immunostaining et la quantification de fluorescence.
- Revêtement
- Ajouter 200 μL de poly-L-lysine (PLL) par puits de lames de chambre en verre de 4 puits (140 μL par puits de lames de chambre de 8 puits).
- Incuber pendant 1 h à température ambiante (RT).
- Laver 3x avec PBS.
- Laissez sécher à RT (pendant environ 30 min).
- Ajouter 150 μL de laminine (50 μg/mL) par puits de lames de chambre en verre de 4 puits (120 μL par puits de lames de chambre de 8 puits).
- Incuber pendant 2 h à 37 °C.
- Laver 3x avec PBS.
REMARQUE : Les lames de chambre enduites peuvent être conservées à 4 °C pendant 1 mois.
- Placage des cellules
- Compter et plaquer 80 000 neurosphères à cellules uniques (neurosphères dans une suspension à cellule unique) par puits de lames de chambre de 4 puits (70 000 cellules par puits de lame de chambre de 8 puits).
- Ajouter 500 μL de milieu de différenciation par puits de lame de chambre de 4 puits (250 μL de milieu par puits de lames de chambre de 8 puits).
- Pour faire le média de différenciation d’abord, ajouter les composants suivants dans le tableau 2 à un stérile, récipient jetable pour faire le milieu induisant neural (NIM).
- Ajoutez les ingrédients suivants dans le tableau 3 à 48,5 mL de NIM fait dans l’étape précédente pour faire le support de différenciation.
- Incuber pendant 5 jours à 37 °C.
- Après 5 jours, traiter les cellules pendant 24 h en remplaçant la moitié des supports dans chaque puits par des supports frais mélangés à la concentration souhaitée de composés d’essai, y compris les contrôles appropriés.
| Montant | Composant |
| 49 mL | DMEM/F-12 |
| 0,5 mL | Supplément N2 (100X) |
| 0,5 mL | Mem acides aminés non essentiels (100X) |
| 2 μL | Héparine (2 μg/mL) (Stock Conc. est de 50 mg/mL) |
Tableau 2. Composants requis pour la fabrication de 50 mL de NIM
| Montant | Composant |
| 1 mL | B-27 (50X) |
| 500 μL | Antibiotique-Antimycotique (100X) |
| 5 μL | Acide rétinoïque (0,1 μM) |
| 50 μL | GDNF (10 μg/mL) |
| 50 μL | BDNF (10 μg/mL) |
| 5 μL | Acide ascorbique (0,2 μg/mL) (Stock Conc. est de 2 mg/mL) NOTE : Recommandé pour être fait frais. |
| 48,5 mL | Nim |
Tableau 3. Composants nécessaires à la fabrication de 50 mL de supports de différenciation
5. Immunocytochimie (ICC)
REMARQUE : Les cellules sont fixées avec 4 % de formaldéhyde. La perméabilisation et le blocage sont ensuite effectués pour améliorer la pénétration et prévenir la liaison non spécifique des anticorps. Les cellules sont ensuite incubées avec des anticorps primaires pendant la nuit. Par la suite, les cellules sont incubées avec des anticorps secondaires fluorescents. Enfin, après avoir utilisé DAPI pour tacher le noyau, des lames de chambre sont montées.
- Fixation
- Aspirant doucement les médias dans chaque puits.
- Ajouter 500 μL de 4 % de formaldéhyde par puits de lames de chambre de 4 puits (250 μL par puits de lames de chambre de 8 puits).
- Incuber pendant 15 min à RT.
- Laver doucement 2x avec 500 μL de PBS.
REMARQUE : Après fixation, en laissant 1 mL de PBS dans chaque puits, les diapositives de culture peuvent être stockées à 4 °C pendant jusqu’à 3 mois.
- Perméabilisation et blocage cellulaire
- Ajoutez les composants suivants dans le tableau 4 à un contenant stérile et jetable pour faire le tampon anticorps (Ab).
- Mélanger les ingrédients suivants dans le tableau 5 avec la mémoire tampon Ab faite dans l’étape précédente pour faire la perméabilisation cellulaire et la solution de blocage.
- Ajouter 500 μL par puits de lames de chambre de 4 puits et incuber pendant 1 h à RT.
REMARQUE : La mémoire tampon Ab peut être stockée à 4 °C.
| Montant | Composant |
| 1,75 g | NaCl (150 mM) |
| 1,2 g | TrisBase (50 mM) |
| 2 g | BSA 1% |
| 3,6 g | L-lysine (100 mM) |
| 8 g | Azide de sodium (4%) |
| 200 mL | Eau distillée. REMARQUE : Dissoudre d’abord les composants requis dans 150 mL d’eau, puis ajuster à 200 mL. |
Tableau 4. Composants nécessaires à la fabrication de 200 mL de tampon d’anticorps
| Montant | Composant |
| 600 μL | Sérum 20% chèvre |
| 6 μL | 0,2 % Triton-X100 |
| 2394 μL | Tampon d’anticorps. REMARQUE : Dissoudre d’abord les composants requis dans 2 mL de tampon Ab, puis ajuster au pH 7.4. Ajoutez ensuite plus de tampon Ab pour ajuster au volume final de 3 mL et filtrer la stérilisation. |
Tableau 5. Composants nécessaires à la fabrication de 3 mL de solution de perméabilisation et de blocage des cellules
- Coloration
- Laver 2x avec 500 μL de PBS.
- Ajouter l’anticorps primaire dilué, l’anti-β-tubuline III (1:200), et incuber toute la nuit à 4 °C (200 μL par puits de lames de chambre de 4 puits). Diluer l’anticorps primaire dans PBS.
- Laver 2x avec PBS.
- Ajouter l’anticorps secondaire dilué, en PBS, étiqueté fluorescent, Alexa Fluor 488 (1:500), et incuber pendant 2 h à RT dans un endroit protégé de la lumière (250 μL par puits de diapositives de chambre de 4 puits)
- Laver 2x avec PBS.
- Ajouter le dilué, en PBS, DAPI (concentration de 300 nM) et incuber pendant 5 min à RT dans un endroit protégé de la lumière (300 μL par puits de diapositives de chambre de 4 puits).
- Laver 3x avec PBS.
- Montez les diapositives de la chambre en utilisant les instructions suivantes.
- Démonter la glissière de chambre en brisant les onglets d’échappée et en enlevant le joint et la base.
- Ajoutez une goutte de la solution de montage (voir Tableau des matériaux)par puits de diapositives de chambre de 4 puits. Utilisez ensuite une diapositive de couverture pour couvrir toute la diapositive.
- À l’aide d’une pince à épiler et à un angle, placez un côté du couvercle contre la glissière tout en prenant contact avec le bord extérieur de la goutte liquide.
- Inclinez soigneusement le couvercle sur la solution de montage lorsque vous l’abaissez en place. Évitez la création de bulles. Prenez une pointe de pipette et appuyez-la sur le couvercle. Les bulles se déplaceront sur le côté.
REMARQUE : La formation de bulles est parfois inévitable. Si elle se produit, l’image autour d’eux tant qu’il ya quelques-uns. - Suivez les instructions du fabricant pour le temps de séchage. Évitez d’utiliser des solutions de montage noncurant en raison de la difficulté de manipulation pendant l’imagerie. Sinon, l’utilisation d’un joint de couvercle approprié sur les bords est nécessaire pour empêcher la couverture de glisser pendant l’imagerie.
- Pour sceller le couvercle, utilisez du vernis à ongles et faites une petite ligne sur le bord du couvercle. Laisser sécher le vernis à ongles pendant environ 2 min.
6. Acquisition d’images, excroissance de neurite et quantification de l’intensité de fluorescence
REMARQUE : Après la coloration, utilisez un microscope confocal avec un objectif de 20x et une taille d’image de 1024 x 1024 pixels pour acquérir les images des cellules traitées. Prenez l’image au moins à partir de deux champs par réplique biologique par condition. Utilisez ensuite le logiciel d’analyse d’images Fidji (ImageJ 1.51u) pour la quantification de la longueur de la neurite. En bref, mesurer la longueur de la plus longue neurite pour chaque neurone et après la moyenne des valeurs par traitement, utilisez le test t de l’élève pour les groupes indépendants pour comparer les moyens entre les groupes expérimentaux et le groupe témoin.
REMARQUE : Plusieurs programmes commerciaux (Imaris, Volocity, Amira) et open source (ImajeJ, CellProfiler, Vaa3D, BioImageXD, Icy, KNIME) sont disponibles. Parmi ces programmes, ImageJ est devenu l’outil de choix pour l’analyse d’image biologique20,21. Le portail ImageJ à https://imagej.net/Introduction est une source d’information utile fournissant une description détaillée des fonctions de base et intégrées d’ImageJ, y compris le traitement d’image, la colocalisation, la déconvolution, l’enregistrement, la segmentation, le suivi et la visualisation.
- Mesure de l’excroissance neuronale avec un logiciel d’analyse d’images fidji
- Comme illustré dans la figure 1, ouvrir l’image soit en la faisant glisser et en la laissant tomber sur le logiciel Fidji ou en sélectionnant fichier | Ouvrir.
- Sélectionnez Analyser | Outils | Gestionnaire de retour sur investissement, puis cliquez avec le bouton droit sur l’icône5 e dans la barre d’outils droite et passez à la ligne à main levée. En option, double-cliquez sur la même icône pour changer la largeur de la ligne à 10, puis tracez la plus longue neurite, commençant près du corps cellulaire et s’étendant jusqu’à l’extrémité de la neurite.
- Appuyez sur Ctrl + T & puis F pour ajouter la mesure au gestionnaire de retour sur investissement et mettre en évidence le neurone mesuré. Sélectionnez tous les numéros du roi, cliquez sur Mesurer, sélectionnez toutes les longueurs calculées et copiez/collez dans une feuille de calcul.
- Mesure de l’intensité de fluorescence des cellules étiquetées avec un logiciel d’analyse d’images fidji
- Comme illustré dans la figure 2, après l’ouverture de l’image, cliquez sur l’icône4 e dans la barre d’outils sélections freehand. Dessinez la forme de la cellule.
- Sélectionnez Analyser | Définir les mesures et sélectionner pour les valeurs suivantes : Zone, Densité intégrée, Valeur grise moyenne | Analyser | Mesure (une zone contextuele avec une pile de valeurs s’ouvre).
- Sélectionnez une région en regard de la cellule en arrière-plan (la taille n’est pas importante), puis sélectionnez Analyser | Mesure. Sélectionnez toutes les données mesurées et copiez/collez dans une feuille de calcul.
REMARQUE : La densité intégrée (IntDen) est l’élément utilisé pour déterminer les intensités fluorescentes. Dans cette étude, l’intensité fluorescente de la molécule cible est mesurée pour analyser d’abord sa distribution dans la cellule et par la suite quantifier l’abondance de la molécule cible sous divers traitements. Par conséquent, l’efficacité des traitements sera mesurée et comparée au contrôle.
7. Évaluation de la neurotoxicité
REMARQUE : La cytotoxicité des composés d’essai est évaluée dans des plaques de 384 puits (voir tableau des matériaux)à l’aide d’un test de viabilité des cellules luminescentes (voir tableau des matériaux). Les PNSP sont préparés selon la même méthode, à l’exception de légères modifications, décrites dans la section « Différenciation et traitement des PNSP ». Par la suite, un signal luminescent généré par l’essai de viabilité des cellules luminescentes est mesuré à l’aide d’un lecteur de microplaques. Le signal luminescent est proportionnel à la concentration d’ATP cellulaire qui elle-même est directement proportionnelle au nombre de cellules viables présentes dans chaque puits.
- Revêtement
- Ajouter 30 μL de poly-L-lysine (PLL) par puits de plaque de 384 puits.
- Incuber pendant 1 h chez RT.
- Laver 2x avec PBS.
- Laissez sécher à RT (pendant environ 30 min).
- Ajouter 30 μL de laminine (50 μg/mL) par puits de plaque de 384 puits.
- Incuber pendant 2 h à 37 °C.
- Laver 2x avec PBS.
REMARQUE : Les plaques enduites de 384 puits peuvent être conservées à 4 °C pendant 1 mois.
- Placage des cellules
- Compter et plaquer 20 000 neurosphères à cellules uniques par puits de plaque de 384 puits dans 25 μL de milieux de différenciation.
- Incuber pendant 5 jours à 37 °C.
- Après 5 jours, traiter les cellules pendant 24 h par des composés d’essai préparés à 6x la concentration finale désirée en volume de 5 μL (pour faire le volume final de 30 μL par puits).
- Test de viabilité cellulaire
- Ajouter 30 μL de réactif de viabilité des cellules luminescentes par puits de plaque de 384 puits.
REMARQUE : Ajoutez un volume de réactif de test de viabilité cellulaire luminescente égal au volume présent dans chaque puits. Décongeler le réactif de viabilité des cellules luminescentes et équilibrer le rt avant l’utilisation. - Agiter sur un shaker pendant 2 minutes (pour mélanger et induire la lyse cellulaire).
- Faire tourner le mélange vers le bas par centrifugation à 300-400 x g pour 30 s.
- Incuber la plaque de 384 puits pendant 10 min à RT dans un endroit protégé de la lumière (pour stabiliser le signal luminescent).
- Enregistrez la luminescence avec un lecteur de microplaques.
REMARQUE : Utilisez des contrôles appropriés pour l’analyse de viabilité, y compris velcade (à une concentration finale de 10 μM) comme positif et HBSS contenant DMSO (avec une concentration finale de 0,1% ou 0,2%) comme contrôle négatif.
- Ajouter 30 μL de réactif de viabilité des cellules luminescentes par puits de plaque de 384 puits.
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Representative Results
Le protocole présenté dans le manuscrit a été utilisé avec succès dans deux articles récemment publiés22,23. La figure 3 démontre l’utilisation de neurones dérivés des HNPC pour examiner l’effet des inhibiteurs du HDAC comme composés épigénétiques sur l’extension des neurites comme marqueur de l’excroissance des neurites et de la capacité neurogénique subséquente des composés de petites molécules.
En outre, à la figure 4, la neurotoxicité des composés testés (inhibiteurs du HDAC) est également évaluée en différenciant simultanément les HNPC dans des plaques de 384 puits, montrant le potentiel du modèle cellulaire présenté (hNPC) pour l’évaluation de la neurotoxicité et la capacité de s’étendre pour tester la neurotoxicité pour un plus grand nombre de composés.
Dans un autre article de Sartor et coll. (Figure 5), la mesure de l’intensité de fluorescence des cellules neuronales pour quantifier l’abondance de H4K5ac, comme marque d’histone, après le traitement des neurones différenciés des hNPC avec des composés modificateurs épigénétiques est démontrée avec succès23. En outre, comme illustré dans la figure 6, dans un travail non publié, le protocole a été utilisé pour visualiser une protéine présynaptique, la synaptophysine, pour vérifier l’effet synaptogène possible des composés de petites molécules.
Figure 1 : Flux de travail étape par étape illustrant une approche de mesure des excroissances neuronales avec le logiciel d’analyse d’images fidji. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Flux de travail étape par étape illustrant une approche pour quantifier l’intensité de fluorescence des cellules neuronales avec le logiciel d’analyse d’image fidji. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Test d’excroissance de neurite avec de petits composés épigénétiques à petites molécules.
(A) Images fluorescentes représentatives (grossissement 20x) pour le traitement des neurones dérivés des HNPC avec des inhibiteurs de HDAC hydroxamiques. Les cellules progénitrices neuronales humaines sont différenciées pendant 5 jours; puis traités pendant 24 h avec 0,1 % de DMSO (comme contrôle), et trichostatine A, JNJ26481585, SB939 et PCI24781 (comme composés d’essai). Ensuite, l’immunostaining est effectué avec l’anticorps β-tubuline III spécifique aux neurones (vert) pour visualiser les processus neuronaux et quantifier les longueurs de neurite et DAPI (bleu) pour visualiser les noyaux cellulaires. (B) Analyse statistique de la longueur de la neurite dans divers groupes. Comme décrit, tous les composés d’essai peuvent induire l’excroissance de neurite. L’analyse quantitative de la longueur de la neurite se fait à l’aide du logiciel ImageJ. Les barres d’erreur représentent SEM ; p < 0,001, 0,0001. Ce chiffre a été modifié à partir de Bagheri et coll.22. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Évaluation de la neurotoxicité à l’aide d’un test de viabilité des cellules luminescentes.
Les hNPC sont ensemencés et différenciés en neurones dans la plaque de 384 puits selon la même méthode utilisée pour l’essai de néurite de croissance. Par la suite, l’effet des composés d’essai sur la viabilité des cellules après 24 h d’exposition est mesuré. Comme indiqué, il n’y a pas de toxicité significative sur les traitements. Anova à sens unique est utilisé pour l’analyse des données et une valeur p < 0,05 est considérée comme statistiquement significative. Ce chiffre a été modifié à partir de Bagheri et coll.22. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : RGFP966 augmente le H4K5ac dans les neurones différenciés des cellules progénitrices neuronales humaines.
(A) Coloration d’immunofluorescence représentative de la tubuline β, du DAPI et du H4K5ac après traitement par DMSO, RGFP966 ou RGFP966 + JQ1 dans les neurones dérivés des RNPC. (B) Quantification de l’intensité de fluorescence du H4K5ac après traitement par DMSO, RGFP966 ou RGFP966 + JQ1. Les barres d’erreur représentent SEM ; p < 0,0001. Ce chiffre a été modifié à partir de Sartor et coll.23. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Coloration représentative de l’immunofluorescence de la synaptophysine (rouge) pour visualiser les terminaux synaptiques, de la tubuline (vert) pour visualiser les processus neuronaux, et du DAPI (bleu) pour visualiser les noyaux cellulaires après traitement avec DMSO (comme contrôle) et du SB939 (comme composé d’essai) dans les neurones dérivés des HNPC. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Ce protocole est l’un des rares articles publiés décrivant le test de longueur de neurite lors du traitement avec des composés d’essai. En outre, nous décrivons comment employer des hNPC pour un essai de neure de excroissance et évaluation de neurotoxicité. En utilisant cet essai d’excroissance de neure et l’évaluation de neurotoxicité sur les neurones dérivés des HNPC, le potentiel neurogénique d’une catégorie de composés épigénétiques à petites molécules, inhibiteurs du HDAC, dans l’induction de la croissance des neurites est démontré22. En outre, dans un autre article présenté par Sartor et al., ce protocole est utilisé pour quantifier l’intensité de fluorescence de H4K5ac, une protéine histone, lors du traitement avec plusieurs composés modificateurs épigénétiques23.
La fonction cognitive repose sur un câblage approprié et des connexions fonctionnelles dans les circuits neuronaux. La quantification détaillée et cohérente de divers aspects de la morphologie neuronale en tant qu’approche phénotypique de criblage est essentielle pour obtenir une perspicacité fiable dans les voies sous-jacentes menant aux désordres de cerveau s’étendant du neurodéveloppemental aux désordres psychiatriques. Le dépistage phénotypique est considéré comme une approche particulièrement efficace dans l’exploration des composés à petites molécules en tant que candidats médicamenteux putatifs pour moduler un phénotype cellulaire. Dans cette approche, au lieu d’interroger une seule cible, tous les composants et voies de la cellule sont examinés24.
La morphologie neuronale, y compris la forme, la structure et la connectivité, sont considérées comme des caractéristiques clés de la fonction neuronale. Les perturbations génétiques qui modifient la morphologie des neurones ou la localisation et le niveau des protéines synaptiques pourraient notamment contribuer à l’analyse des mutations pathogènes. Par conséquent, des méthodes fiables sont nécessaires pour évaluer l’impact des perturbations sur la morphologie neuronale25.
Les hNPC, sont isolés du cerveau embryonnaire des mammifères, qui sont ensuite cultivés in vitro en présence de mitogènes. Ces cellules sont composées de neurosphères qui sont caractérisées comme des agrégats cellulaires flottants composés de cellules progénitrices neuronales et de cellules gliales radiales. Les hNPC fournissent un système modèle souhaitable pour la fonction et le développement du système nerveux en maintenant leur potentiel de différenciation dans la production de diverses lignées neuronales7,8,9. Le nombre de neurites, l’intensité, la longueur et la largeur ainsi que les caractéristiques synaptiques, y compris les modifications pré-et post-synaptiques, sont parmi les changements neurite et synaptique qui pourraient être mesurés de manière fiable et efficace à l’aide de la méthode présentée ci-après.
En raison d’une augmentation de la prévalence des troubles neurologiques tels que le trouble déficitaire de l’attention avec hyperactivité et l’autisme, le potentiel de neurotoxicité des produits chimiques environnementaux sur les enfants reste une préoccupation publique15,26. Par conséquent, la facilité d’utilisation des neurones dérivés des HNPC pour une évaluation fiable et efficace de la neurotoxicité est également examinée. Comme l’a démontré la figure 4,les PHN pourraient être adaptés et mis à l’échelle pour l’évaluation de la neurotoxicité dans des plaques de 384 puits.
L’évaluation de la neurotoxicité en tant qu’application pour le modèle cellulaire introduit est possible soit en différenciant les neurosphères en neurones avant de le placage en plaques de 384 puits ou en différenciant les cellules tandis que les neurosphères sont plaquées dans des plaques de 384 puits ainsi que des cellules simples. Dans cette dernière approche, des compétences de pipetage de haute précision sont nécessaires pour le placage du nombre exact de neurosphères qui sont ventilées en cellules individuelles et aussi pour les procédures de traitement suivantes avec un milieu induisant la différenciation. Compte tenu des compétences de pipetage requises, la différenciation avant le placage est recommandée pour obtenir des résultats plus reproductibles. De plus, le tri des cellules en vrac par tri des cellules activées par fluorescence (FACS) pourrait également être utilisé pour séparer avec précision le nombre requis de cellules contournant le besoin de compétences de pipetage de haute précision.
Il est conseillé de commencer l’essai d’excroissance de neurite par l’évaluation de neurotoxicité pour éviter les essais répétés d’excroissance de neurite avec diverses doses du même composé pour atteindre la concentration non toxique. Par conséquent, la combinaison d’une évaluation de neurotoxicité en utilisant l’essai de viabilité de cellules luminescentes contre une courbe dose-réponse des composés d’essai aura comme conséquence trouvant le bon dosage avec l’effort minimum. L’essai de viabilité des cellules luminescentes est une méthode très sensible pour déterminer le nombre de cellules viables dans une culture cellulaire. La méthode fonctionne sur la quantitation de l’ATP présent dans la culture comme un indicateur du métabolisme cellulaire. Le format d’ajout, de mélange et de mesure de l’essai fournit une approche simple et rapide pour vérifier la viabilité cellulaire et la cytotoxicité des composés d’essai.
Il y a certaines limites au protocole présenté comme suit. En raison de la disponibilité et de la variabilité inhérente, l’utilisation de cellules primaires physiologiquement pertinentes est limitée25. les pNPC ont un taux de prolifération lent, ce qui pourrait limiter son utilisation. L’analyse manuelle à grande échelle des images fluorescentes des neurones prend beaucoup de temps et est susceptible de biais expérimentateur. Les hNPC pourraient être considérés comme de jeunes cellules neuronales, ne représentant pas les modifications épigénétiques liées à l’âge qui s’accumulent dans les cellules tout au long de la vie d’une personne. Comme les troubles neurodégénératifs se produisent chez les personnes âgées, les PHPH peuvent manquer d’une pertinence physiologique adéquate pour être un modèle approprié pour les conditions de début tardif.
Même si les modèles animaux et les lignées cellulaires ont été précieux dans le décryptage des mécanismes moléculaires sous-jacents aux maladies, ils ont montré des limites dans la traduction des résultats en thérapeutique humaine27,28,29,30. Les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSCs) et les cellules souches embryonnaires humaines (HESC) aux côtés des HNPC sont considérées comme de meilleurs modèles de cellules in vitro, récapitulant la physiologie humaine. Par conséquent, les neurones dérivés des hiPSC et des HESC peuvent également être utilisés comme deux sources cellulaires alternatives pour l’analyse d’excroissance de neurite et l’évaluation de la neurotoxicité, en utilisant le protocole présenté ci-après1,31.
En conclusion, le potentiel translationnel élevé et la pertinence physiologique des PPCM comme modèle principal de cellules humaines fournissent un recours valable dans les dépistages de découverte de médicaments liés à la neurite de croissance et l’évaluation de neurotoxicité l’emportant sur les limites mentionnées précédemment.
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Disclosures
Tous les auteurs n’indiquent aucun conflit d’intérêts potentiel.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par la subvention de recherche nimad (940714) accordée au CRG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-well Glass Chamber Slides | Sigma | PEZGS0816 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | R37117 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| Anti-β-Tubulin III | Thermo | MA1-118X | |
| B27 | Thermo | 17504001 | |
| B27 - minus vitamin A | Thermo | 12587010 | |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | |
| BSA | Sigma | A8531 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7572 | |
| CoolCell | Corning | 432000 | Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1°C/minute cell freezing in a -80°C freezer |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium containing 10% DMSO |
| DAPI | Thermo | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | 34869-100ML | |
| EGF | Gibco | PHG0311 | |
| FGF | Gibco | PHG6015 | |
| Formaldehyde | Thermo | FB002 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine supplement |
| Goat Serum | Thermo | 50062Z | |
| Heparin | Calbiochem | 375095 | |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-25G | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| mFreSR | StemCell Technologies | 5854 | Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates | Thermo | 164610 | |
| PBS | Thermo | 10010-049 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P5899-5MG | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo | P10144 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes |
| Synaptophysin | Thermo | MA5-14532 | |
| Tris Base | Sigma | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML |
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