Summary
Den presenterte protokollen beskriver en metode for en neurite utvekstanalyse og nevrotoksisitetsvurdering av små molekylforbindelser.
Abstract
Neurite utvekstanalyse og nevrotoksisitetsvurdering er to store studier som kan utføres ved hjelp av den presenterte metoden heri. Denne protokollen gir pålitelig analyse av nevronal morfologi sammen med kvantitative målinger av modifikasjoner på neurite lengde og synaptisk protein lokalisering og overflod ved behandling med små molekylforbindelser. I tillegg til anvendelsen av den presenterte metoden i neurite utvekststudier, kan nevrotoksisitetsvurdering utføres for å vurdere, skille og rangere kommersielle kjemiske forbindelser basert på deres potensielle utviklingsnevrotoksisitetseffekt.
Selv om cellelinjer i dag er mye brukt i sammensatte screening analyser i nevrovitenskap, de ofte avvike genetisk og fenotypisk fra deres vev opprinnelse. Primærceller, derimot, opprettholde viktige markører og funksjoner observert in vivo. Derfor, på grunn av oversettelsespotensialet og fysiologisk relevans at disse cellene kan tilby neurite utvekstanalyse og nevrotoksisitetsvurdering, kan det være betydelig nytte av å bruke humane nevrale stamceller (hNPCer) som den primære humane cellemodellen.
Den presenterte metoden her kan brukes til å screene for evnen til forbindelser for å indusere neurite utvekst og nevrotoksisitet ved å dra nytte av den menneskelige nevrale stamcelleavledede nevroner, en cellemodell som representerer menneskelig biologi nøye."
Introduction
Neurite vekst er en prosess som er grunnleggende for dannelsen av det nevronale nettverket og nerveregenerering1,2. Etter en skade spiller neurite utvekst en nøkkelrolle i regenerering av nervesystemet. Neurite utvekst er også et viktig element i den ekstracellulære signalisering i indusere nevronale regenerative aktiviteter for å forbedre resultatene for nevrodegenerative lidelser og nevronal skade3,,4,5,6.
Ved å opprettholde sitt differensieringspotensial i å produsere ulike nevrale slekter, kan humane nevrale stamceller (hNPCer) gi et modellsystem for studier av sentralnervesystemet (CNS) funksjon og utvikling7,,8,9. Høyt translasjonelt potensial og fysiologisk relevans av hNPCer som en primær human cellemodell gir en betydelig fordel i neurite utvekst-relaterte narkotika oppdagelse screenings. Vedlikehold og skalering av primærcellemodellene for høygjennomstrømningsanalyser kan imidlertid være tidkrevende ogarbeidsintensive 10,,11,,12,,13.
I tillegg til anvendelsen av den presenterte metoden i neurite utvekststudier, er nevrotoksisitetsvurdering et annet program ved hjelp av hNPC-avledede nevroner. Det er tusenvis av kommersielle kjemiske forbindelser som enten ikke undersøkes eller med dårlig forstått nevrotoksisitetspotensial. Derfor er mer pålitelige og effektive screeningeksperimenter for å vurdere, skille mellom og rangere forbindelser basert på deres potensial til å fremkalle utviklingsnevrotoksisitet i høy etterspørsel14. Økningen i prevalens og forekomst av nevrologiske lidelser sammen med overflod av utestede forbindelser i miljøet nødvendiggjør utviklingen av mer pålitelige og effektive eksperimenter for å identifisere farlige miljøforbindelser som kan utgjøre nevrotoksisitet15.
Den presenterte metoden her kan brukes til å screene for evnen til forbindelser for å indusere neurite utvekst og nevrotoksisitet ved å dra nytte av den menneskelige nevrale stamcelleavledede nevroner, en cellemodell som representerer menneskelig biologi nøye.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikkerklæring: Fosterprøver ble mottatt fra Birth Defects Research Laboratory ved University of Washington i Seattle gjennom et vevsdistribusjonsprogram støttet av National Institute of Health (NIH). Birth Defects Research Laboratory innhentet passende skriftlig informert samtykke fra foreldrene og innkjøp av vev ble overvåket av Institutional Review Board ved University of Washington. Alt arbeidet ble utført med godkjenning av Human Subject Research Office ved University of Miami8.
1. Isolasjon og kultur av humane nevrale stamceller (hNPCer)
- Plasser hjernevevet i en 100 mm petriskål og fjern forsiktig meningene ved hjelp av tang.
- Overfør hjernevevet til et konisk rør på 50 ml og vask det to ganger med 20 ml PBS ved å invertere røret forsiktig.
- Inkuber hjernevevet i et nytt konisk rør på 50 ml ved å senke vevet i celledissosiasjonsløsningen (se tabell over materialer)og DNase I (10 U/ml) i 10 min ved 37 °C.
- Tilsett 5 ml nevronal cellekulturmedium (se Tabell over materialer) til hjernevevet som inneholder rør og dissosierer neurosfærene mekanisk ved å triturating 20 til 30 ganger gjennom en 1000 μL pipetspiss for å lage en enkeltcelles suspensjon.
- Filtrer cellefjæringen gjennom en 70 μm cellesil for å fjerne celleklynger.
- Frø encellesuspensjonen i en ventilert T-25 kolbe utstyrt med 5-10 ml nevronal cellekulturmedium supplert med komponenter som er beskrevet i tabell 1.
- Steriliser heparinoppløsningen ved filtrering gjennom et 0,2 μm filter. B-27 supplement uten vitamin A er et serumfritt supplement for dyrking av nevrale stamfar og stamceller, uten å indusere differensiering.
MERK: Humane nevrale stamceller (hNPCer) er isolert fra humane fosterhjerne samlet inn fra abortert foster. Etter 7–10 dager i kulturen danner nevrale stamceller (NSCer) frittflytende neurospherekolonier, mens andre celletyper forblir i suspensjon som enkeltceller eller festes til bunnen av kolben. De isolerte hNPCene kan dyrkes som neurospheres i suspensjon i flere måneder8,,16,,17.
- Steriliser heparinoppløsningen ved filtrering gjennom et 0,2 μm filter. B-27 supplement uten vitamin A er et serumfritt supplement for dyrking av nevrale stamfar og stamceller, uten å indusere differensiering.
| Beløpet | Komponent |
| 100 μL | Egf (20 ng/ml) |
| 100 μL | FGF (10 ng/ml) |
| 2 ml | B-27, Minus vitamin A (50X) |
| 1 ml | L-alanyl-L-glutamin (100X) (se tabell over materialer) |
| 4 μL | Heparin (2 μg/ml) |
| 96,8 ml | Nevronal cellekultur medium (se tabell over materialer) |
Tabell 1. Komponenter som kreves for å lage 100 ml kulturmedier
2. Passaging hNPCs
- Samle media som inneholder flytende kuler, store og små neurospheres, og overføre dem til en 50 ml konisk rør.
MERK: Av ukjente årsaker er tidspunktet for splitting av neurospheres variabel fra 7 dager til 30 dager. Men generelt må neurospheres passeres når de når en diameter større enn 700-900 μm. Dette er når midten av neurosphere begynner å mørkere, som anses som et tegn på en høy hastighet på celledød18. - Spinn neurospheres ned ved sentrifugering på 300-400 x g i 3 min.
- Aspirer forsiktig supernatanten og senk deretter kulene i 500 μL av avrimet celledissosiasjonsreagens (se Tabell over materialer).
- Lag aliquoter av celleredsosiasjonsreagens ved å tilsette 500 μL per 1,5 ml mikrorør og oppbevar ved -20 °C. For å unngå å miste enzymaktivitet, tin celledissosiasjonsreagensen ved å holde på RT eller varm i 5 min i et 37 °C vann/perlebad.
- Avhengig av tettheten og størrelsen på kulene, inkuber de nedsenkede kulene ved 37 °C i 5-15 min.
- Tilsett 5-10 ml forvarmede kulturmedier til neurosfærene som inneholder 50 ml konisk rør og sentrifuge ved 300-400 x g i 5 min for å sedimentere neurosfærene.
- Aspirer supernatanten og forsiktig pipetten opp og ned, ved hjelp av en 1000 μL pipette, i 2 ml kulturmedier til alle neurospheres er i en enkelt celle suspensjon.
MERK: Dissosiasjonen vil bli synlig for det blotte øye. Før dissosiasjon er neurospheres i form av kuler. Etter nedsenking i dissosiasjon reagens og ved pipetting opp og ned, vil de bli enkeltceller.- Tell cellene og plate enkeltcellene, 2 til 3 millioner celler per T-25 kolbe i 10 ml kulturmedier.
- Mate cellene hver tredje dag ved å erstatte halvparten av kulturmediet.
- Slå deg til rorose ved å lene kolben slik at den er på nederste hjørne. Hold kolben i posisjon i ca 1-2 min til neurospheres sediment. Deretter aspirerer halvparten av mediet forsiktig ved å sette inn den serologiske pipetten i mediet over de avgjorte neurospheres. Dissosierte celler kan aggregere for å danne kuler etter 2 til 3 dager i kultur19.
3. Frysing av hNPCs
- Forbered cellefrysingsmediet ved å legge DMSO til kulturmediet til en endelig konsentrasjon på 10 % (v/v) eller bruk kommersielt tilgjengelig kryopreservationmedium for sensitive celletyper (se Tabell over materialer).
- Sorter ut store sfærer ved å overføre media til et 50 ml konisk rør og la kulene slå seg ned ved tyngdekraften. Fjern og overfør deretter de store neurospheres til et nytt 50 ml konisk rør for passaging ved hjelp av en 200 eller 1000 μL pipetspiss.
MERK: Neurospheres med en diameter større enn 900 μm anses store og de med en diameter mindre enn 500 μm anses små. - Spinn de resterende neurospheres ned ved sentrifugering på 300-400 x g i 3 min. Fjern forsiktig supernatanten.
- Resuspend opptil 100 kuler i 1 ml kryopreservation reagens og overføre den til et kryorør.
- Oppbevar overnatting ved -80 °C i en cellefrysingsbeholder (se Materialtabell)og flytt det til flytende nitrogen neste dag for langtidslagring.
MERK: Det er å foretrekke å fryse små og mellomstore neurospheres (lavere enn 900 μm i diameter) og unngå frysing av store neurospheres (større enn 900 μm i diameter) eller enkeltceller. For å redusere celleskader under tining av prøven, hold cellene tette ved å så de tine neurospheres i en liten T25 kolbe.
4. Differensiering og behandling av hNPCer
MERK: For å indusere differensiering, blir neurospheres disaggregated i enkeltceller, telles og deretter seeded på belagte plater i 5 dager. Deretter behandles differensierte celler i 24 timer med testforbindelser før immunostaining og fluorescens kvantifisering.
- Belegg
- Tilsett 200 μL poly-L-lysin (PLL) per brønn med 4-brønnglass kammersklier (140 μL per brønn med 8-brønns kammersklier).
- Inkuber i 1 timer ved romtemperatur (RT).
- Vask 3x med PBS.
- La det tørke ved RT (i ca 30 min).
- Tilsett 150 μL laminin (50 μg/ml) per brønn med 4-brønns glasskammersklier (120 μL per brønn med 8-brønns kammersklier).
- Inkuber i 2 timer ved 37 °C.
- Vask 3x med PBS.
MERK: Belagte kammersklier kan oppbevares ved 4 °C i 1 måned.
- Plating cellene
- Telle og plate 80.000 enkeltcelleksøyosfærer (neurospheres i en enkelt celle suspensjon) per brønn av 4-brønn kammer lysbilder (70.000 celler per brønn av 8-brønns kammer lysbilde).
- Tilsett 500 μL differensieringsmedier per brønn med 4-brønns kammersklie (250 μL-medier per brønn med 8-brønns kammersklier).
- For å gjøre differensieringsmediet først, legg til følgende komponenter i tabell 2 til en steril engangsbeholder for å lage nevrale induserende medier (NIM).
- Tilsett følgende ingredienser i tabell 3 til 48,5 ml NIM laget i forrige trinn for å gjøre differensieringsmediet.
- Inkuber i 5 dager ved 37 °C.
- Etter 5 dager, behandle cellene for 24 timer ved å erstatte halvparten av mediet i hver brønn med friske medier blandet med ønsket konsentrasjon av testforbindelser, inkludert passende kontroller.
| Beløpet | Komponent |
| 49 ml | DMEM/F-12 (andre) |
| 0,5 ml | N2-tillegg (100X) |
| 0,5 ml | MEM ikke-essensielle aminosyrer (100X) |
| 2 μL | Heparin (2 μg/ml) (Stock Conc. er 50 mg/ml) |
Tabell 2. Komponenter som kreves for å lage 50 ml NIM
| Beløpet | Komponent |
| 1 ml | B-27 (50X) |
| 500 μL | Antimykotisk antibiotika (100x) |
| 5 μL | Retinsyre (0,1 μM) |
| 50 μL | GDNF (10 μg/ml) |
| 50 μL | BDNF (10 μg/ml) |
| 5 μL | Askorbinsyre (0,2 μg/ml) (Stock Conc. er 2 mg/ml) MERK: Anbefales å bli ferske. |
| 48,5 ml | Nim |
Tabell 3. Komponenter som kreves for å lage 50 ml differensieringsmedier
5. Immunocytokmi (ICC)
MERK: Cellene er festet med 4% formaldehyd. Permeabilisering og blokkering utføres deretter for å forbedre penetrasjon og forhindre uspesifikk binding av antistoffer. Celler blir deretter inkubert med primære antistoffer over natten. Deretter inkuberes celler med fluorescerende merkede sekundære antistoffer. Til slutt, etter å ha brukt DAPI til å farge kjernen, er kammerlysbilder montert.
- Fiksering
- Aspirer forsiktig mediet i hver brønn.
- Tilsett 500 μL av 4% formaldehyd per brønn av 4-brønns kammersklier (250 μL per brønn med 8-brønns kammersklier).
- Inkuber i 15 min ved RT.
- Vask forsiktig 2x med 500 μL PBS.
MERK: Etter fiksering, ved å la 1 ml PBS i hver brønn, kan kulturlysbilder lagres ved 4 °C i opptil 3 måneder.
- Cellepermeabilisering og blokkering
- Tilsett følgende komponenter i tabell 4 i en steril engangsbeholder for å lage antistoffbufferen (Ab).
- Bland følgende ingredienser i tabell 5 med Ab-bufferen i forrige trinn for å gjøre cellen permeabilisering og blokkeringsløsning.
- Tilsett 500 μL per brønn med 4-brønns kammersklier og inkuber i 1 timer ved RT.
MERK: Ab buffer kan lagres ved 4 °C.
| Beløpet | Komponent |
| 1,75 g | NaCl (150 mM) |
| 1,2 g | TrisBase (50 mM) |
| 2 g (2) | BSA 1 % |
| 3,6 g | L-lysin (100 mM) |
| 8 g (8) | Natriumazitid (4 %) |
| 200 ml | Destillert vann. MERK: Oppløs først de nødvendige komponentene i 150 ml vann, og juster deretter til 200 ml. |
Tabell 4. Komponenter som kreves for å lage 200 ml antistoffbuffer
| Beløpet | Komponent |
| 600 μL | 20% Geit serum |
| 6 μL | 0,2% Triton-X100 |
| 2394 μL | Antistoffbuffer. MERK: Oppløs først de nødvendige komponentene i 2 ml Ab-buffer, og juster deretter til pH 7.4. Legg deretter til mer Ab-buffer for å justere til det endelige volumet på 3 ml og filtersterilisere. |
Tabell 5. Komponenter som kreves for å lage 3 ml cellepermetribilisering og blokkeringsløsning
- Flekker
- Vask 2x med 500 μL PBS.
- Tilsett det fortynnede primære antistoffet, anti-β-tubulin III (1:200), og inkuber over natten ved 4 °C (200 μL per brønn med 4-brønns kammersklier). Fortynn det primære antistoffet i PBS.
- Vask 2x med PBS.
- Tilsett fortynnet, i PBS, fluorescerende merket sekundært antistoff, Alexa Fluor 488 (1:500), og inkuber i 2 timer ved RT på et sted beskyttet mot lys (250 μL per brønn av 4-brønns kammerlysbilder)
- Vask 2x med PBS.
- Tilsett fortynnet, i PBS, DAPI (300 nM konsentrasjon) og inkuber i 5 min ved RT på et sted beskyttet mot lys (300 μL per brønn av 4-brønns kammersklier).
- Vask 3x med PBS.
- Monter kammerlysbildene ved hjelp av følgende instruksjoner.
- Ta fra hverandre kammeret lysbilde ved å bryte breakaway faner og fjerne pakningen og basen.
- Legg til en dråpe monteringsløsning (se Tabell over materialer) per brønn med 4-brønns kammerlysbilder. Bruk deretter et deksellysbilde til å dekke hele lysbildet.
- Bruk en pinsett og i en vinkel, plasser den ene siden av dekselet slip mot lysbildet mens du tar kontakt med ytterkanten av væskedråpen.
- Tipp forsiktig dekkslippen på monteringsløsningen når den senkes på plass. Unngå etableringen av bobler. Ta en pipettetupp og trykk den ned på dekkslippen. Boblene vil bevege seg til siden.
MERK: Bobledannelse er uunngåelig til tider. Hvis det skjer, bilde rundt dem så lenge det er noen. - Følg produsentens anvisninger for herdingstid. Unngå å bruke ikke-skurende monteringsløsninger på grunn av problemer med håndtering under bildebehandling. Ellers er det nødvendig å bruke et passende dekksmasse på kanter for å hindre at dekkslippen glir under avbildning.
- For å forsegle dekkslippen, bruk neglelakk og lag en liten linje på kanten av dekkslippen. La neglelakken tørke i ca 2 min.
6. Bildeoppkjøp, neurite utvekst og fluorescens intensitet kvantifisering
MERK: Etter farging, bruk et konfusisk mikroskop med et 20x-mål og en bildestørrelse på 1024 x 1024 piksler for å skaffe bildene av de behandlede cellene. Ta bilde minst fra to felt per biologisk replikering per tilstand. Bruk deretter Fiji bildeanalyseprogramvare (ImageJ 1.51u) for kvantifisering av neurite lengden. Kort, måle lengden på den lengste neurite for hver nevron og etter gjennomsnitt verdiene per behandling, bruk studentens t test for uavhengige grupper for å sammenligne midler mellom eksperimentelle grupper og kontrollgruppe.
MERK: Flere kommersielle (Imaris, Volocity, Amira) og åpen kildekode (ImajeJ, CellProfiler, Vaa3D, BioImageXD, Icy, KNIME) bildebehandlingsprogrammer er tilgjengelige. Blant disse programmene har ImageJ blitt det foretrukne verktøyet for biologisk bildeanalyse20,21. ImageJ-portalen på https://imagej.net/Introduction er en nyttig informasjonskilde som gir en grundig beskrivelse av ImageJs grunnleggende og innebygde funksjoner, inkludert bildebehandling, kolokalsering, dekonvolution, registrering, segmentering, sporing og visualisering.
- Måling av nevronal utvekst med Fiji bildeanalyse programvare
- Som illustrert i figur 1,åpne bildet enten ved å dra og slippe det på Fiji programvare eller ved å velge Fil | Åpne.
- Velg Analyser | Verktøy | ROI manager, og høyreklikk deretter på 5th ikonet i verktøylinjen Rett og bytt til frihåndslinje. Eventuelt dobbeltklikk på samme ikon for å endre linjebredden til 10, og deretter spore den lengste neurite, begynner nær cellekroppen og strekker seg til spissen av neurite.
- Trykk Ctrl + T & deretter F for å legge til målingen i ROI Manager og markere det målte nevronen. Velg alle tallene i avkastningen ,klikk på Mål, velg alle beregnede lengder og kopier / lim inn i et regneark.
- Måling av fluorescensintensitet av merkede celler med Fiji bildeanalyseprogramvare
- Som illustrert i Figur 2, etter at du har åpnet bildet, klikker du på 4th-ikonet på verktøylinjen Freehand valg. Tegn formen på cellen.
- Velg Analyser | Angi målinger og velg for følgende verdier: Område, Integrert tetthet, Gjennomsnittlig grå verdi | Analysere | Mål (en popup-boks med en bunke verdier åpnes).
- Velg et område ved siden av cellen som bakgrunn (størrelse er ikke viktig), og velg deretter Analyser | Mål. Velg alle målte data og kopier/lim inn i et regneark.
MERK: Integrert tetthet (IntDen) er elementet som brukes til å bestemme fluorescerende intensiteter. I denne studien måles fluorescerende intensitet av målmolekylet for først å analysere distribusjonen i cellen og deretter kvantifisere overfloden av målmolekylet under ulike behandlinger. Følgelig vil effektiviteten av behandlinger måles og sammenlignes med kontroll.
7. Vurdering av nevrotoksisitet
MERK: Cytotoksisitet av testforbindelser evalueres i 384-brønnplater (se tabell over materialer) ved hjelp av en selvlysende celle levedyktighetsanalyse (se Tabell over materialer). HNPCene er utarbeidet etter samme metode, unntatt små modifikasjoner, beskrevet i delen "Differensiering og behandling av hNPCer". Deretter måles et selvlysende signal generert av selvlysende celletrykkasasjonsanalyse ved hjelp av en mikroplateleser. Det selvlysende signalet er proporsjonalt med den cellulære ATP-konsentrasjonen som i seg selv er direkte proporsjonal med antall levedyktige celler som finnes i hver brønn.
- Belegg
- Tilsett 30 μL poly-L-lysin (PLL) per brønn på 384-brønnplate.
- Inkuber i 1 timer ved RT.
- Vask 2x med PBS.
- La det tørke ved RT (i ca 30 min).
- Tilsett 30 μL laminin (50 μg/ml) per brønn på 384-brønnplate.
- Inkuber i 2 timer ved 37 °C.
- Vask 2x med PBS.
MERK: Belagte 384-brønnplater kan oppbevares ved 4 °C i 1 måned.
- Plating cellene
- Telle og plate 20.000 enkeltcellekøyosfærer per brønn på 384-brønnplate i 25 μL differensieringsmedier.
- Inkuber i 5 dager ved 37 °C.
- Etter 5 dager, behandle cellene i 24 timer ved testforbindelser tilberedt ved 6x den endelige ønskede konsentrasjonen i 5 μL volum (for å gjøre det endelige volumet på 30 μL per brønn).
- Analyse av celle levedyktighet
- Tilsett 30 μL selvlysende cellens levedyktighetsanalyse reagens per brønn på 384-brønnplate.
MERK: Legg til et volum av selvlysende celleavstivhetsanalysereans som tilsvarer volumet som finnes i hver brønn. Tin den selvlysende cellefiserbarhetsanalysereagensen og likevekt til RT før bruk. - Rist på en plateshaker i 2 minutter (for å blande og indusere cellelys).
- Spinn blandingen ned ved sentrifugering ved 300-400 x g i 30 s.
- Inkuber 384-brønnplaten i 10 min ved RT på et sted som er beskyttet mot lys (for å stabilisere det selvlysende signalet).
- Ta opp luminescens med en mikroplateleser.
MERK: Bruk egnede kontroller for levedyktighetsanalysen, inkludert Velcade (med en endelig konsentrasjon på 10 μM) som positiv og HBSS som inneholder DMSO (med endelig konsentrasjon på 0,1 % eller 0,2 %) som negativ kontroll.
- Tilsett 30 μL selvlysende cellens levedyktighetsanalyse reagens per brønn på 384-brønnplate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen som presenteres i manuskriptet har blitt brukt i to nylig publiserte artikler22,23. Figur 3 viser bruken av hNPCs-avledede nevroner ved å undersøke effekten av HDAC-hemmere som epigenetiske forbindelser på forlengelsen av neurites som en markør for neurite utvekst og påfølgende nevrogen evne til små molekylforbindelser.
Videre, i figur 4 neurotoksisitet av testede forbindelser (HDAC-hemmere) vurderes også ved samtidig å differensiere hNPCs i 384-brønnplater, som viser potensialet til den presenterte cellemodellen (hNPCs) for neurotoksisitet vurdering og evnen til å skalere opp for å teste nevrotoksisitet for et høyere antall forbindelser.
I et annet papir av Sartor et al. (Figur 5), måling av nevronal celle fluorescens intensitet for å kvantifisere overflod av H4K5ac, som en histone, etter behandling av nevroner differensiert fra hNPCs med epigenetiske modifikator forbindelser er vellykket demonstrert23. I tillegg, som illustrert i figur 6, i et upublisert arbeid, har protokollen blitt brukt til å visualisere et presynaptisk protein, synaptophysin, for å se etter den mulige synaptogene effekten av små molekylforbindelser.
Figur 1: Trinnvis arbeidsflyt som illustrerer en tilnærming for måling av nevronal utvekst med Fijis bildeanalyseprogramvare. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Trinnvis arbeidsflyt som illustrerer en tilnærming for å kvantifisere nevronale celler fluorescensintensitet med Fiji bildeanalyseprogramvare. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Neurite utvekstanalyse med små molekylepigenetiske forbindelser.
(A) Representative fluorescerende bilder (20x forstørrelse) for behandling av hNPCs-avledede nevroner med hydroksamiske-baserte HDAC-hemmere. Menneskelige nevrale stamceller er differensiert i 5 dager; deretter behandlet i 24 timer med 0,1% DMSO (som kontroll), og Trichostatin A, JNJ26481585, SB939 og PCI24781 (som testforbindelser). Deretter utføres immunstaining med nevronal-spesifikke β-tubulin III antistoff (grønn) for å visualisere nevronale prosesser og kvantifisere neurite lengder og DAPI (blå) for å visualisere cellekjerner. (B) Statistisk analyse av neurite lengde i ulike grupper. Som avbildet, alle testforbindelser kan indusere neurite utvekst. Kvantitativ analyse av neurite lengde er gjort ved hjelp av ImageJ programvare. Feilfelt representerer SEM; p < 0,001, **** p < 0,0001. Dette tallet er endret fra Bagheri et al.22. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Neurotoksisitetsvurdering ved bruk av selvlysende cellelyserasitetsanalyse.
hNPCer seedes og differensieres til nevroner i 384-brønnplaten i henhold til samme metode som brukes til neurite utvekstanalyse. Deretter måles effekten av testforbindelser på levedyktigheten til celler etter 24 timers eksponering. Som vist er det ingen signifikant toksisitet ved behandlinger. Enveis ANOVA brukes til dataanalyse og en p-verdi < 0,05 anses som statistisk signifikant. Dette tallet er endret fra Bagheri et al.22. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: RGFP966 øker H4K5ac i nevroner differensiert fra humane nevrale stamceller.
(A) Representativ immunofluorescensfarging av β tubulin, DAPI og H4K5ac etter behandling med DMSO, RGFP966 eller RGFP966 + JQ1 i hNPCs-avledede nevroner. (B) Kvantifisering av fluorescensintensiteten av H4K5ac etter behandling med DMSO, RGFP966 eller RGFP966 + JQ1. Feilfelt representerer SEM; p < 0.0001. Dette tallet er endret fra Sartor et al.23. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Representativ immunofluorescensfarging av Synaptophysin (rød) for å visualisere synaptiske terminaler, β tubulin (grønn) for å visualisere nevronale prosesser og DAPI (blå) for å visualisere cellekjerner etter behandling med DMSO (som kontroll) og SB939 (som testsammensatthet) i hNPCs-avledede nevroner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen er en av de få publiserte papirene som beskriver testen for neurite lengde ved behandling med testforbindelser. Videre beskriver vi hvordan du bruker hNPCer for en neurite utvekstanalyse og nevrotoksisitetsvurdering. Ved å benytte denne neurite utvekstanalysen og nevrotoksisitetsvurderingen på hNPCs-avledede nevroner, er det nevrogene potensialet til en kategori av epigenetiske småmolekylforbindelser, HDAC-hemmere, i induserende neurite utvekst demonstrert22. Videre, i et annet papir presentert av Sartor et al., brukes denne protokollen til å kvantifisere fluorescensintensiteten til H4K5ac, et histoneprotein, ved behandling med flere epigenetiske modifikatorforbindelser23.
Kognitiv funksjon er avhengig av riktige ledninger og funksjonelle tilkoblinger innen nevronale kretser. Detaljert og konsekvent kvantifisering av ulike aspekter ved nevronal morfologi som en fenotypisk screening tilnærming er avgjørende for å oppnå pålitelig innsikt i de underliggende veier som fører til hjernesykdommer som spenner fra nevroutvikling til psykiatriske lidelser. Fenotypisk screening regnes som en spesielt effektiv tilnærming i å utforske småmolekylforbindelser som antatte legemiddelkandidater for å modulere en cellulær fenotype. I denne tilnærmingen, i stedet for å avhøre bare et enkelt mål, undersøkes alle komponenter og veier i cellen24.
Nevronal morfologi inkludert form, struktur og tilkobling anses å være viktige funksjoner i nevronal funksjon. Genetiske perturbasjoner som endrer morfologien til nevroner eller synaptisk proteinlokalisering og nivå, kan spesielt bidra til analyse av sykdomsfremkallende mutasjoner. Derfor er pålitelige metoder nødvendig for å vurdere virkningen av perturbagens på nevronal morfologi25.
HNPCene er isolert fra den embryonale pattedyrhjernen, som senere dyrkes in vitro i nærvær av mitogener. Disse cellene består av neurospheres som er karakterisert som flytende cellulære aggregater består av nevrale stamceller og radiale glialceller. HNPC gir et ønskelig modellsystem for nervesystemet funksjon og utvikling ved å opprettholde sin differensiering potensial i å produsere ulike nevrale linjer7,8,9. Neurite tall, intensitet, lengde, og bredde sammen med synaptiske egenskaper inkludert pre- og post-synaptic proteiner modifikasjoner er blant neurite og synaptiske endringer som kan måles pålitelig og effektivt ved hjelp av den presenterte metoden heri.
På grunn av en økning i forekomsten av nevrologiske lidelser som oppmerksomhetsunderskudd hyperaktivitetsforstyrrelse og autisme, er nevrotoksisitetspotensialet til miljøkjemikalier på barn fortsatt en offentlig bekymring15,26. Derfor undersøkes også brukervennligheten til hNPCs-avledede nevroner for pålitelig og effektiv nevrotoksisitetsvurdering. Som vist i figur 4kan hNPCer tilpasses og skaleres opp for nevrotoksisitetsvurdering i 384-brønnplater.
Neurotoksisitet vurdering som et program for den introduserte cellemodellen er mulig ved enten å differensiere neurospheres i nevroner før plating i 384-brønnplater eller differensiere cellene mens neurospheres er belagt i 384-brønn plater som enkeltceller. I sistnevnte tilnærming er det nødvendig med høy presisjons pipetteringsferdigheter for å plating det nøyaktige antallet neurospheres som er disaggregated i enkeltceller og også for følgende behandlingsprosedyrer med differensieringsfremkallende medium. Tatt i betraktning pipettering ferdigheter som kreves, differensiering før plating anbefales for å oppnå mer reproduserbare resultater. Videre kan bulkcellesortering etter fluorescensaktivert cellesortering (FACS) også potensielt brukes til å nøyaktig skille det nødvendige antall celler som omgår behovet for høypresisjons pipetteringsferdigheter.
Det anbefales å starte neurite utvekstanalysen ved nevrotoksisitetsvurdering for å unngå gjentatte neurite utvekstanalyser med ulike doser av samme forbindelse for å nå for giftfri konsentrasjon. Derfor, kombinere en nevrotoksisitet vurdering ved å utnytte selvlysende celle levedyktighet analyse mot en dose-respons kurve av test forbindelser vil resultere i å finne riktig dosering med minimal innsats. Den selvlysende celle levedyktighet analysen er en svært følsom metode for å bestemme antall levedyktige celler i en cellekultur. Metoden fungerer på kvantitet av ATP tilstede i kultur som en indikator på cellulær metabolisme. Add, mix, og måle formatet på analysen gir en enkel og rask tilnærming for å se etter celle levedyktighet og cytotoksisitet av testforbindelser.
Det er noen begrensninger i den presenterte protokollen som følger. På grunn av tilgjengelighet og iboende variasjon er bruken av fysiologisk relevante primærceller begrenset25. hNPCer har en langsom spredningshastighet, noe som kan begrense utnyttelsen. Manuell storskala analyse av fluorescerende bilder av nevroner er tidkrevende og utsatt for eksperimentererbias. hNPCer kan betraktes som unge nevrale celler, ikke representerer aldersrelaterte epigenetiske modifikasjoner som akkumuleres i celler gjennom en persons liv. Ettersom nevrodegenerative lidelser forekommer hos eldre individer, kan hNPCer mangle tilstrekkelig fysiologisk relevans for å være en passende modell for sene innfelte forhold.
Selv om dyremodeller og cellelinjer har vært verdifulle i å tyde molekylære mekanismer underliggende sykdommer, har de vist begrensninger i å oversette funn til humane terapeutiske27,28,29,30. Humaninduserte pluripotente stamceller (hiPSCer) og humane embryonale stamceller (hESCer) sammen med hNPCer anses som bedre in vitro cellemodeller, rekapitulerende menneskelig fysiologi. Derfor kan hiPSCs- og hESCs- avledede nevroner også potensielt brukes som to alternative cellekilder for neurite utvekstanalyse og nevrotoksisitetsvurdering, ved hjelp av protokollen som presenteres her1,,31.
Til slutt gir høyt translasjonelt potensial og fysiologisk relevans av hNPCer som primær human cellemodell en verdifull regress i neurite utvekstrelaterte narkotikaoppdagelsesscreeninger og nevrotoksisitetsvurdering som oppveier begrensningene nevnt tidligere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere indikerer ingen potensielle interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av NIMAD forskningsstipend (940714) tildelt MAF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-well Glass Chamber Slides | Sigma | PEZGS0816 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | R37117 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| Anti-β-Tubulin III | Thermo | MA1-118X | |
| B27 | Thermo | 17504001 | |
| B27 - minus vitamin A | Thermo | 12587010 | |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | |
| BSA | Sigma | A8531 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7572 | |
| CoolCell | Corning | 432000 | Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1°C/minute cell freezing in a -80°C freezer |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium containing 10% DMSO |
| DAPI | Thermo | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | 34869-100ML | |
| EGF | Gibco | PHG0311 | |
| FGF | Gibco | PHG6015 | |
| Formaldehyde | Thermo | FB002 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine supplement |
| Goat Serum | Thermo | 50062Z | |
| Heparin | Calbiochem | 375095 | |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-25G | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| mFreSR | StemCell Technologies | 5854 | Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates | Thermo | 164610 | |
| PBS | Thermo | 10010-049 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P5899-5MG | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo | P10144 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes |
| Synaptophysin | Thermo | MA5-14532 | |
| Tris Base | Sigma | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML |
References
- Sherman, S. P., Bang, A. G. High-throughput screen for compounds that modulate neurite growth of human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), (2018).
- Al-Ali, H., Beckerman, S. R., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. In vitro models of axon regeneration. Experimental Neurology. 287, 423-434 (2017).
- Kudo, T., et al. Induction of neurite outgrowth in PC12 cells treated with temperature-controlled repeated thermal stimulation. PloS One. 10 (4), 0124024 (2015).
- Higgins, S., Lee, J. S., Ha, L., Lim, J. Y. Inducing neurite outgrowth by mechanical cell stretch. BioResearch Open Access. 2 (3), 212-216 (2013).
- Muramatsu, R., Ueno, M., Yamashita, T. Intrinsic regenerative mechanisms of central nervous system neurons. Bioscience Trends. 3 (5), (2009).
- Read, D. E., Herbert, K. R., Gorman, A. M. Heat shock enhances NGF-induced neurite elongation which is not mediated by Hsp25 in PC12 cells. Brain Research. 1221, 14-23 (2008).
- Finan, G. M., et al. Bioactive Compound Screen for Pharmacological Enhancers of Apolipoprotein E in Primary Human Astrocytes. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1526-1538 (2016).
- Magistri, M., et al. A comparative transcriptomic analysis of astrocytes differentiation from human neural progenitor cells. European Journal of Neuroscience. 44 (10), 2858-2870 (2016).
- Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Research. 993 (1-2), 18-29 (2003).
- Grandjean, P., Landrigan, P. J. Neurobehavioural effects of developmental toxicity. The Lancet Neurology. 13 (3), 330-338 (2014).
- Finkbeiner, S., Frumkin, M., Kassner, P. D. Cell-based screening: extracting meaning from complex data. Neuron. 86 (1), 160-174 (2015).
- An, W. F., Tolliday, N. Cell-based assays for high-throughput screening. Molecular Biotechnology. 45 (2), 180-186 (2010).
- Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507 (2011).
- Ryan, K. R., et al. Neurite outgrowth in human induced pluripotent stem cell-derived neurons as a high-throughput screen for developmental neurotoxicity or neurotoxicity. Neurotoxicology. 53, 271-281 (2016).
- Magistri, M., Velmeshev, D., Makhmutova, M., Faghihi, M. A. Transcriptomics profiling of Alzheimer's disease reveal neurovascular defects, altered amyloid-β homeostasis, and deregulated expression of long noncoding RNAs. Journal of Alzheimer's Disease. 48 (3), 647-665 (2015).
- Darbinyan, A., Kaminski, R., White, M. K., Darbinian, N., Khalili, K. Isolation and propagation of primary human and rodent embryonic neural progenitor cells and cortical neurons. Neuronal Cell Culture. , 45-54 (2013).
- Gil-Perotín, S., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone: a review of the neurosphere assay. The Anatomical Record. 296 (9), 1435-1452 (2013).
- Ebert, A. D., McMillan, E. L., Svendsen, C. N. Isolating, expanding, and infecting human and rodent fetal neural progenitor cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 6 (1), 2 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676 (2012).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43 (1), 25-30 (2007).
- Bagheri, A., et al. HDAC Inhibitors Induce BDNF Expression and Promote Neurite Outgrowth in Human Neural Progenitor Cells-Derived Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1109 (2019).
- Sartor, G. C., et al. Enhancement of BDNF expression and memory by HDAC inhibition requires BET bromodomain reader proteins. Journal of Neuroscience. 39 (4), 612-626 (2019).
- Conde, C., Cáceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319 (2009).
- Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. Journal of Neuroscience Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
- Grandjean, P., Landrigan, P. J. Developmental neurotoxicity of industrial chemicals. The Lancet. 368 (9553), 2167-2178 (2006).
- Dragunow, M. The adult human brain in preclinical drug development. Nature reviews Drug Discovery. 7 (8), 659 (2008).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
- Pan, C., Kumar, C., Bohl, S., Klingmueller, U., Mann, M. Comparative proteomic phenotyping of cell lines and primary cells to assess preservation of cell type-specific functions. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (3), 443-450 (2009).
- Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. Journal of Proteome Research. 5 (4), 862-878 (2006).
- Yeo, Y., et al. Human Embryonic Stem Cell-Derived Neural Lineages as In Vitro Models for Screening the Neuroprotective Properties of Lignosus rhinocerus (Cooke) Ryvarden. BioMed Research International. 2019, (2019).
