Summary

Um ensaio de crescimento de neurita e avaliação de neurotoxicidade com neurônios derivados de células progenitoras neugenitoras humanas

Published: August 06, 2020
doi:

Summary

O protocolo apresentado descreve um método para um ensaio de crescimento de neurite e avaliação neurotoxicidade de compostos de moléculas pequenas.

Abstract

O ensaio de crescimento de neurita e a avaliação da neurotoxicidade são dois estudos importantes que podem ser realizados utilizando o método aqui apresentado. Este protocolo fornece uma análise confiável da morfologia neuronal juntamente com medições quantitativas de modificações no comprimento do neurite e localização de proteína sináptica e abundância após o tratamento com pequenos compostos de moléculas. Além da aplicação do método apresentado em estudos de crescimento de neurite, a avaliação da neurotoxicidade pode ser realizada para avaliar, distinguir e classificar compostos químicos comerciais com base em seu potencial efeito neurotoxicidade no desenvolvimento.

Embora as linhas celulares sejam hoje amplamente utilizadas em ensaios de triagem composta em neurociência, elas geralmente diferem geneticamente e fenotipicamente de sua origem tecidual. As células primárias, por outro lado, mantêm marcadores e funções importantes observados in vivo. Portanto, devido ao potencial de tradução e relevância fisiológica que essas células poderiam oferecer ensaio de crescimento neurite e avaliação da neurotoxicidade pode beneficiar consideravelmente do uso de células progenitoras neurais humanas (hNPCs) como o modelo primário de células humanas.

O método aqui apresentado pode ser utilizado para testar a capacidade dos compostos de induzir o crescimento e neurotoxicidade neurita, aproveitando-se dos neurônios derivados de células progenitoras neurais, um modelo celular que representa de perto a biologia humana.”

Introduction

O crescimento da neurita é um processo fundamental para a formação da rede neuronal e da regeneração nervosa1,2. Após uma lesão, o crescimento de neurite desempenha um papel fundamental na regeneração do sistema nervoso. O crescimento da neurita também é um elemento importante da sinalização extracelular na indução de atividades regenerativas neuronais para melhorar os desfechos para distúrbios neurodegenerativos e lesões neuronais3,,4,,5,6.

Mantendo seu potencial de diferenciação na produção de várias linhagens neurais, as células progenitoras neurais humanas (hNPCs) poderiam fornecer um sistema modelo para estudos da função e desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC)7,,8,,9. Alto potencial translacional e relevância fisiológica dos hNPCs como modelo primário de células humanas oferecem uma vantagem considerável nos exames de descoberta de drogas relacionados ao crescimento de neurite. No entanto, a manutenção e o dimensionamento dos modelos de células primárias para ensaios de alto rendimento podem ser demorados e intensivos em mão-de-obra10,11,,12,13.

Além da aplicação do método apresentado em estudos de crescimento de neurite, a avaliação da neurotoxicidade é outra aplicação utilizando os neurônios derivados do hNPC. Existem milhares de compostos químicos comerciais que não são examinados ou com potencial de neurotoxicidade mal compreendido. Portanto, experimentos de triagem mais confiáveis e eficazes para avaliar, distinguir e classificar compostos com base em seu potencial para obter neurotoxicidade do desenvolvimento está em alta demanda14. O aumento da prevalência e incidência de distúrbios neurológicos, juntamente com a abundância de compostos não testados no ambiente, requer o desenvolvimento de experimentos mais confiáveis e eficientes para identificar compostos ambientais perigosos que possam representar neurotoxicidade15.

O método aqui apresentado pode ser utilizado para testar a capacidade dos compostos de induzir o crescimento e neurotoxicidade neurita, aproveitando-se dos neurônios derivados de células progenitoras neurais humanas, um modelo celular que representa de perto a biologia humana.

Protocol

Declaração ética: Os espécimes fetais foram recebidos do Laboratório de Pesquisa de Defeitos de Nascimento da Universidade de Washington, em Seattle, por meio de um programa de distribuição de tecidos apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde (NIH). O Laboratório de Pesquisa de Defeitos de Nascimento obteve o consentimento informado por escrito adequado dos pais e a aquisição de tecidos foi monitorada pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Washington. Todo o trabalho foi realizado com aprova…

Representative Results

O protocolo apresentado no manuscrito foi utilizado com sucesso em dois artigos publicados recentemente22,23. A Figura 3 demonstra o uso de neurônios derivados de hNPCs na análise do efeito dos inibidores de HDAC como compostos epigenéticos na extensão dos neurites como um marcador para o crescimento de neurite e subsequente capacidade neurogênica de compostos de pequenas moléculas. Além disso, na <…

Discussion

Este protocolo é um dos poucos artigos publicados que descrevem o teste para o comprimento de neurite após o tratamento com compostos de teste. Além disso, descrevemos como usar hNPCs para um ensaio de crescimento de neurito e avaliação da neurotoxicidade. Utilizando este ensaio de crescimento neurite e avaliação neurotoxicidade em neurônios derivados de hNPCs, o potencial neurogênico de uma categoria de compostos epigenéticos de pequenas moléculas, inibidores de HDAC, na indução do crescimento de neurite é…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi financiada pela nimad research grant (940714) concedida à MAF.

Materials

4-well Glass Chamber Slides Sigma PEZGS0816
Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11001
Alexa Fluor 594 Invitrogen R37117
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240062
Anti-β-Tubulin III Thermo MA1-118X
B27 Thermo 17504001
B27 – minus vitamin A Thermo 12587010
BDNF PeproTech 450-02
BSA Sigma A8531
CellTiter-Glo Promega G7572
CoolCell Corning 432000 Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1℃/minute cell freezing in a -80℃ freezer
CryoStor CS10 StemCell Technologies 7930 Cryopreservation medium containing 10% DMSO
DAPI Thermo D1306
DMEM/F12 Gibco 11320033
DMSO Sigma 34869-100ML
EGF Gibco PHG0311
FGF Gibco PHG6015
Formaldehyde Thermo FB002
GDNF PeproTech 450-10
Glutamax Gibco 35050061 L-alanyl-L-glutamine supplement
Goat Serum Thermo 50062Z
Heparin Calbiochem 375095
Laminin Sigma L2020-1MG
L-Ascorbic Acid Sigma A92902-25G
L-lysine Sigma L5501
MEM non-essential amino acids Gibco 11140050
mFreSR StemCell Technologies 5854 Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells
N2 Gibco 17502048
NaCl Sigma 71376
Neurobasal Medium Gibco 21103049
Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates Thermo 164610
PBS Thermo 10010-049
Poly‐L‐lysine Sigma P5899-5MG
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo P10144
Retinoic Acid Sigma R2625
Sodium Azide Sigma S2002
StemPro Accutase Gibco A1110501 Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes
Synaptophysin Thermo MA5-14532
Tris Base Sigma 10708976001
Triton X-100 Sigma X100-100ML

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Bagheri, A., Razavipour, S. F., Wahlestedt, C., Mowla, S. J., Faghihi, M. A. A Neurite Outgrowth Assay and Neurotoxicity Assessment with Human Neural Progenitor Cell-Derived Neurons. J. Vis. Exp. (162), e60955, doi:10.3791/60955 (2020).

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