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Developmental Biology

लाइव, बरकरार ऊतक में सेल डिवीजन के विश्लेषण के लिए ड्रोसोफिला लार्वा और पुपल टेस्ट की तैयारी

doi: 10.3791/60961 Published: May 19, 2020

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य ड्रोसोफिला मेओइटिक शुक्राणुओं का उपयोग करके लाइव और फिक्स्ड सेल माइक्रोस्कोपी द्वारा अक्षुण्ण ऊतकों में सेल डिवीजन का विश्लेषण करना है। प्रोटोकॉल यह दर्शाता है कि ड्रोसोफिला लार्वा और शुरुआती पिल्ले से पूरे, बरकरार टेस्ट को कैसे अलग किया जाए, और माइक्रोस्कोपी के लिए उन्हें कैसे संसाधित और माउंट करें।

Abstract

जीवित, अक्षुण्ण ऊतकों और अंगों में विभाजित कोशिकाओं का प्रायोगिक विश्लेषण हमारी समझ के लिए आवश्यक है कि सेल डिवीजन विकास, ऊतक होमोस्टोसिस और रोग प्रक्रियाओं के साथ कैसे एकीकृत करता है। मेयोसिस से गुजर रहे ड्रोसोफिला शुक्राणुइस विश्लेषण के लिए आदर्श हैं क्योंकि (1) शुक्राणुओं से युक्त पूरे ड्रोसोफिला टेस्ट माइक्रोस्कोपी के लिए तैयार करना अपेक्षाकृत आसान है, (2) शुक्राणुओं का बड़ा आकार उन्हें उच्च रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए अच्छी तरह से अनुकूल बनाता है, और (3) शक्तिशाली ड्रोसोफिला आनुवंशिक उपकरण ों को वीवो विश्लेषण में एकीकृत किया जा सकता है। यहां, हम ड्रोसोफिला तीसरे इंस्टार लार्वा और शुरुआती पिल्ले से पूरे टेस्ट की तैयारी के लिए एक आसानी से सुलभ प्रोटोकॉल पेश करते हैं। हम वर्णन करते हैं कि तैयार पूरे टेस्ट में मेओटिक शुक्राणुओं की पहचान कैसे करें और उन्हें समय-चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा कैसे छवि दी जाए। निर्धारण और इम्यूनोस्टेनिंग पूरे टेस्टेस के लिए प्रोटोकॉल भी प्रदान किए जाते हैं। लार्वा टेस्ट के उपयोग के उपलब्ध प्रोटोकॉल पर कई फायदे हैं जो शुक्राणुओं के विश्लेषण के लिए वयस्क टेस्ट का उपयोग करते हैं। सबसे महत्वपूर्ण बात, लार्वा टेस्ट वयस्क टेस्ट की तुलना में कोशिकाओं के साथ छोटे और कम भीड़ वाले होते हैं, और यह शुक्राणुओं के उच्च संकल्प इमेजिंग की बहुत सुविधा प्रदान करता है। इन फायदों और प्रोटोकॉल के अनुप्रयोगों को प्रदर्शित करने के लिए, हम समय-चूक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा छवि वाले एक शुक्राणुमें सेल डिवीजन के दौरान स्पिंडल माइक्रोट्यूबल के संबंध में एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम के पुनर्वितरण को दिखाने वाले परिणाम प्रस्तुत करते हैं। प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंटी टैग प्रोटीन या ऑर्गेनेल मार्कर, साथ ही जीन म्यूटेशन और अन्य आनुवंशिक उपकरणों की किसी भी संख्या की अभिव्यक्ति के साथ जोड़ा जा सकता है, जिससे पूरे ऊतकों और अंगों के शारीरिक संदर्भ में सेल डिवीजन तंत्र के विश्लेषण के लिए यह दृष्टिकोण विशेष रूप से शक्तिशाली हो जाता है।

Introduction

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सेल डिवीजन अक्सर संस्कृति1में उगाया सेल लाइनों का उपयोग कर अध्ययन किया जाता है । जब तक हम अमूल्य अंतर्दृष्टि और इन अध्ययनों से मौलिक तंत्र की समझ का खजाना प्राप्त किया है2,संस्कृति में उगाया कोशिकाओं को पूरी तरह से सेल विभाजन के शरीर विज्ञान संक्षिप्त नहीं कर सकते के रूप में यह बरकरार, रहने वाले ऊतकों में होता है । उदाहरण के लिए, अक्षुण्ण ऊतकों और अंगों में, कोशिकाओं को सही जगह पर और सही समय पर विभाजित करना चाहिए ताकि संतान कोशिकाएं ऊतक के भीतर ठीक से स्थित हों, ताकि वे उचित विभेदन या कार्यात्मक कार्यक्रमों से गुजर सकें, और ताकि कोशिका प्रसार ऊतक विकास या होमोस्टोसिस3के साथ ठीक से समन्वित हो। दूसरी ओर संस्कृति में उगाई जाने वाली कोशिकाओं के लिए, सेल डिवीजन आम तौर पर संस्कृति माध्यम4में विकास कारकों द्वारा विनियमित होता है, और इस प्रकार हम इन कोशिकाओं से नहीं सीख सकते कि ऊतक वास्तुकला या विकासात्मक सिग्नलिंग जैसे वीवो पर्यावरणीय कारकों में विभाजन प्रक्रिया को कैसे प्रभावित करता है। यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि सेल डिवीजन, जैसे वाघेला और U2OS कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाने वाली कई सेल लाइनें मेटास्टैटिक ट्यूमर5से प्राप्त की गई थीं। इसलिए, इन कैंसर कोशिकाओं के बुनियादी शरीर विज्ञान के कई पहलुओं, जैसे सेल साइकिल नियामक तंत्र और गुणसूत्र स्थिरता, स्वस्थ कोशिकाओं की तुलना में बदल दिया गया है । सेल डिवीजन शरीर विज्ञान की पूरी समझ, इसलिए, शारीरिक नियामक तंत्र और ऊतक वास्तुकला को संरक्षित करने वाले वीवो वातावरण में, अपने मूल में विभाजित कोशिकाओं का अध्ययन करने की हमारी क्षमता पर निर्भर करता है।

यह समझने में प्रगति कि कोशिका विभाजन बरकरार ऊतकों के भीतर कैसे संचालित होता है और अंग वीवो या पूर्व वीवो विश्लेषण में निहित कठिनाइयों से बाधित होते हैं। सबसे पहले, बड़े अंगों या मोटी ऊतकों के भीतर सूक्ष्म विश्लेषण के लिए विभाजित कोशिकाओं तक पहुंचना मुश्किल या असंभव हो सकता है। दूसरा, यह अक्सर भविष्यवाणी करना मुश्किल होता है कि विवो में व्यक्तिगत कोशिकाएं कब विभाजित होंगी। तीसरा, पूर्व वीवो संस्कृति के दौरान ऊतक शरीर विज्ञान तेजी से खराब हो सकता है। इस प्रोटोकॉल में, हम ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर शुक्राणुओं के लाइव और निश्चित विश्लेषण के लिए आसानी से सुलभ तरीकों का वर्णन करते हैं क्योंकि वे पूरी तरह से बरकरार टेस्ट के भीतर मेओटिक सेल डिवीजनों से गुजरते हैं। ये कोशिकाएं लाइव, पूर्व वीवो विश्लेषण के लिए आदर्श हैं क्योंकि वे मानक ऑप्टिकल तरीकों जैसे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ आसानी से सुलभ हैं, वे उम्मीद के मुताबिक समय और स्थानों पर विभाजित होते हैं, और अक्षुण्ण टेस्ट पूर्व वीवो संस्कृति में लगभग 24 घंटे तक बनाए रखा जा सकता है। इसके अलावा, ड्रोसोफिला शुक्राणु बड़े दौर की कोशिकाएं (व्यास में लगभग 20-30 माइक्रोन) होती हैं जो विभाजित होने पर आकार नहीं बदलती हैं, जिससे उन्हें उच्च संकल्प के लिए आदर्श बनादिया जाता है, सेलुलर घटकों की समय-चूक इमेजिंग जैसे धुरी उपकरण और साइटोप्लाज्मिक ऑर्गेनेल्स। यद्यपि इन कोशिकाओं को माइटोसिस के विपरीत मेयोसिस से गुजरना पड़ता है, लेकिन इन दो सेल डिवीजन तंत्र6के बीच कई आवश्यक सेल डिवीजन प्रक्रियाएं बहुत समान हैं। शक्तिशाली ड्रोसोफिला आनुवंशिक उपकरणों के साथ संयुक्त,इन फायदों ने ड्रोसोफिला शुक्राणुओं को स्पिंडल गठन और विनियमन, साइटोकिनेसिस, और ऑर्गेनेल रीमॉडलिंग और विभाजन,7,8,89,10,,11सहित आवश्यक सेल डिवीजन प्रक्रियाओं के पूर्व वीवो विश्लेषण के लिए एक बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया मॉडल बनाया है।

शुक्राणुओं की कोशिकाएं होती हैं जो शुक्राणुजनन के मेयोटिक चरण में होती हैं। ड्रोसोफिलामें शुक्राणुजनन की शुरुआत जर्मलाइन स्टेम कोशिकाओं के एक समूह से होती है जो एक छोटे से क्षेत्र में स्थित होते हैं या टेस्टिस12,13के एक ध्रुव पर "हब" होते हैं। ये कोशिकाएं एक असममित माइटोसिस से विभाजित होती हैं, जिससे एक अलग शुक्राणुओं को जन्म मिलता है। इसके बाद स्पर्माटोगोनिया को 16 कोशिकाओं के समूह का उत्पादन करने के लिए चार सिंक्रोनस माइटोस से गुजरना पड़ता है जो एक ही पुटी के भीतर निकटता से जुड़े रहते हैं। इस स्तर पर, कोशिकाएं माइटोटिक से एक मेयोटिक सेल चक्र में संक्रमण करती हैं और इसे शुक्राणुओं के रूप में जाना जाता है। शुक्राणु कोशिका चक्र के विस्तारित जी-2 चरण में लगभग दो से तीन दिन बिताते हैं, जिसके दौरान वे नाटकीय रूप से बढ़ते हैं और दो मेयोटिक डिवीजनों और बाद के शुक्राणुजनन13,,14की तैयारी में साइटोलॉजिकल परिवर्तनों से गुजरते हैं। एक ही पुटी के भीतर 16 शुक्राणुओं का पूरा समूह फिर एक ही समय में पहले मेटियोटिक डिवीजन में प्रवेश करता है। इस प्रकार, कई मेओटिक शुक्राणुओं को एक साथ चित्रित किया जा सकता है क्योंकि वे सेल डिवीजन के माध्यम से आगे बढ़ते हैं। पहला मेयोटिक डिवीजन लगभग 1.5 घंटे के लिए आय करता है और इसका पालन लगभग तुरंत दूसरे मेयोटिक डिवीजन द्वारा किया जाता है, जो 64 कुल शुक्राणुओं को पैदा करता है जो परिपक्व शुक्राणुओं में अंतर करते हैं।

लाइव, बरकरार ऊतक में कोशिका विभाजन का अध्ययन करने के लिए शुक्राणुओं का उपयोग करने का एक अनूठा लाभ यह है कि शुक्राणुओं के विभिन्न चरणों के माध्यम से कोशिकाओं या अल्सर लगातार प्रगति करते हैं, और शुक्राणुओं के सभी चरणों में कोशिकाओं को आमतौर पर किसी भी टेस्टिस में पहचाना जा सकता है (चित्रा 3एदेखें)। इसलिए, पूरे टेस्ट में मेयोटिक कोशिकाओं को ढूंढना अपेक्षाकृत आसान है। हम आम तौर पर पहले पर हमारे विश्लेषण ध्यान केंद्रित के रूप में दूसरे meiosis के खिलाफ है क्योंकि इन कोशिकाओं को बहुत बड़ा और उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए उत्तरदायी हैं, लेकिन पूरी प्रक्रिया दोनों meiotic डिवीजनों शामिल सफलतापूर्वक छवि जा सकता है । यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि टेस्टिस तैयारी और संस्कृति के लिए सामान्य प्रोटोकॉल का उपयोग शुक्राणुओं की अन्य प्रक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए भी किया जा सकता है, जैसे कि पहले माइटोटिक स्टेम सेल या शुक्राणुविज्ञान ी विभाजन या शुक्राणुके रूप में होने वाले साइटोलॉजिकल परिवर्तनशुक्राणु15में परिपक्व होते हैं। शुक्राणुओं के जीनजनजनन के इनमें से कई पहलुओं को ड्रोसोफिला और मनुष्यों के बीच अत्यधिक संरक्षित किया गयाहै

ड्रोसोफिला शुक्राणुओं को ड्रोसोफिला विकास13के तीसरे इंस्टार लार्वा चरण के दौरान शुक्राणुओं के मेयोटिक चरण तक पहुंचना शुरू हो जाता है । इसलिए, तीसरे इंस्टार लार्वा के साथ शुरू होने वाले जीवनचक्र चरणों से अलग किए गए टेस्ट और प्यूप्पे और वयस्कों सहित शुक्राणुओं को विभाजित करने के विश्लेषण के लिए उपयोग किया जा सकता है। शुक्राणुजनसंख्या17,18,,19के जीवित और निश्चित विश्लेषण के लिए वयस्क पुरुष मक्खियों से टेस्ट निकालने के लिए कई उत्कृष्ट प्रोटोकॉल उपलब्ध हैं . ये प्रोटोकॉल शुक्राणुओं के देर से चरणों का अध्ययन करने के लिए बेहतर हो सकते हैं या यदि आनुवंशिक मार्कर जो केवल वयस्कों में दिखाई देते हैं, का उपयोग किया जाना चाहिए। प्रोटोकॉल लार्वा और शुरुआती पिल्ले से टेस्टिस तैयारी के बजाय केंद्रित है, क्योंकि इन चरणों में टेस्ट के कई फायदे हैं जो विशेष रूप से उच्च संकल्प, समय-चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा सेल डिवीजन विश्लेषण के लिए प्रासंगिक हैं। सबसे पहले, लार्वा और पिल्ले से टेस्ट वयस्कों की तुलना में छोटे होते हैं, और अंग के भीतर कोशिकाओं को कम भीड़ होती है। इस वजह से, शुक्राणुओं को विभाजित करना अक्सर लार्वा टेस्ट की बाहरी सतह के पास चित्रित किया जा सकता है, बिना प्रकाश बिखरने वाले ऊतककी कई परतों के माध्यम से प्रवेश किया जा सकता है। दूसरा, वयस्क टेस्ट संलग्न सहायक अंगों के संकुचन के कारण लयबद्ध रूप से चलते हैं, और ये आंदोलन व्यक्तिगत कोशिकाओं की समय-चूक इमेजिंग को चुनौती देते हैं। और तीसरा, लार्वा टेस्ट जीन म्यूटेशन का अध्ययन करते समय लाभप्रद होते हैं जो पुपल या वयस्क घातकता का कारण बनते हैं। हमारे तरीकों को माइक्रोस्कोप चरण पर टेस्ट की दीर्घकालिक संस्कृति के लिए अनुकूलित किया जाता है, जिससे कोशिका विभाजन के कई दौर ों की इमेजिंग या एक ही तैयारी में शुक्राणुओं के कई चरणों के माध्यम से व्यक्तिगत कोशिकाओं की प्रगति की अनुमति मिलती है। हम पूरे टेस्ट के निर्धारण और इम्यूनोधुंधला के लिए एक प्रोटोकॉल का भी वर्णन करते हैं। कुल मिलाकर, हमारे प्रोटोकॉल बरकरार ऊतक में सेल डिवीजन का अध्ययन करने में रुचि रखने वालों के लिए विशेष रूप से उपयोगी हैं, और अत्यधिक ट्रैक्टकरने योग्य ड्रोसोफिला आनुवंशिक उपकरणों के साथ शुक्राणुविज्ञान विश्लेषण को संयोजित करने की क्षमता इसे विशेष रूप से शक्तिशाली दृष्टिकोण बनाती है।

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Protocol

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1. विच्छेदन के लिए पशु, उपकरण और मीडिया तैयार करें

  1. वांछित जीनोटाइप की संतान प्राप्त करने के लिए पुरुष और मादा मक्खियों को पार करें। मेयोटिक शुक्राणुओं की पहचान और मंचन के लिए उपयोगी ट्रांसजेनिक मार्कर में क्रोमसोम8लेबल करने के लिए मेयोटिक स्पिंडल और आरएफपी-हिस्टोन 2ए को लेबल करने के लिए जीएफपी-ट्यूबलिन शामिल हैं। प्रति क्रॉस पांच से दस महिलाओं का उपयोग करें और 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में शीशियों में मानक फ्लाई भोजन पर क्रॉस बनाए रखें जब तक कि तीसरा इंस्टार लार्वा शीशी (4-5 दिनों) के किनारों को क्रॉल करना शुरू न कर दे। जल्दी सफेद पिल्ला एक दिन बाद बनाने शुरू हो जाएगा ।
  2. ठीक सुझावों के साथ सीधे संदंश के दो जोड़े प्राप्त करें। सुनिश्चित करें कि सुझाव तेज हैं, यहां तक कि लंबाई में, और सीधे(चित्रा 1A)। इन संदंश का उपयोग केवल विच्छेदन के लिए करें, और उपयोग में नहीं होने पर 10 μL पिपेट युक्तियों के साथ कैप करें।
  3. एक स्केलपेल उपकरण तैयार करें।
    1. एक पिन धारक में एक काले anodized स्टील कीट पिन के कुंद अंत डालें, और जगह में पिन सुरक्षित करने के लिए धारक के पेंच मोड़ । संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करना और एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे, बीच में कीट पिन को समझें और इसे 135 डिग्री(चित्रा 1B)के आंतरिक कोण बनाने के लिए मोड़ें। तेज अंत ऊतक काटने के लिए है, जबकि किनारे का उपयोग मीडिया की बूंदों के बीच टेस्ट स्थानांतरित करने के लिए किया जाता है।
    2. उपयोग में नहीं होने पर 1,000 माइक्रोन पिपेट टिप के साथ कैप करें।
  4. एक ऊतक संस्कृति हुड में काम करते हुए, श्नाइडर के मीडिया के 5 मिलीएल एलिकोट तैयार करें और उपयोग के समय तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। विच्छेदन शुरू करने के लिए तैयार होने पर, कमरे के तापमान के लिए गर्म एक 5 mL मीडिया aliquot। फिर गर्म विच्छेदन मीडिया को 10 मिलीएल सिरिंज में स्थानांतरित करें और 0.22 माइक्रोन सिरिंज फ़िल्टर संलग्न करें।

2. लार्वा और अर्ली प्यूपी से टेस्ट का विच्छेदन

  1. एक ग्लास स्लाइड के शीर्ष, मध्य और नीचे मीडिया की तीन बूंदों (50 μL प्रत्येक) को निष्कासित करने के लिए मीडिया से भरे फिल्टर सिरिंज का उपयोग करें।
  2. पांच से दस तिहाई इंस्टार लार्वा या शुरुआती पिल्ले (प्यूपीई जो अभी भी सफेद या पीले हैं) को शीर्ष बूंद में स्थानांतरित करने के लिए विच्छेदन जांच का उपयोग करें। किसी भी भोजन या मलबे को हटाने के लिए विच्छेदन जांच के साथ मीडिया में लार्वा और पिल्ले को धीरे से उत्तेजित करें।
  3. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, दो द्विपक्षीय टेस्ट की पहचान करने के लिए एक विच्छेदन जांच के साथ अपने पक्ष में एक लार्वा या पिल्ला चालू करें, जो शरीर के पीछे तीसरे हिस्से में अंडाकार आकार की पारदर्शी संरचनाओं के रूप में दिखाई देता है(चित्रा 2ए, बी)। जिन जानवरों में टेस्ट की कमी होती है, वे मादा होते हैं और उन्हें छोड़ दिया जाना चाहिए।
  4. जब एक पुरुष लार्वा या पिल्ला पाया जाता है और साफ होता है, तो इसे मीडिया की दूसरी बूंद में ले जाएं। 3 या 4 पुरुष लार्वा और/या पिल्ले को मीडिया की दूसरी बूंद में स्थानांतरित किए जाने तक दोहराएं।
  5. मीडिया की दूसरी बूंद में काम करना, अपने मध्य क्षेत्र में संदंश की एक जोड़ी के साथ एक ही पुरुष लार्वा या पिल्ला समझ, सिर्फ टेस्ट के लिए पूर्वकाल । आधे में जानवर को धीरे से फाड़ने के लिए संदंश की दूसरी जोड़ी का उपयोग करें।
  6. लार्वा या पिल्ला के पीछे के अंत को संदंश की एक जोड़ी के साथ ग्लास स्लाइड पर नीचे रखें। संदंश के ठीक बगल में शुरू करते हुए, स्केलपेल उपकरण के किनारे का उपयोग करके क्यूटिकल पर नीचे धकेलें और स्केलपेल को जानवर के कट अंत की ओर ले जाएं। यह जानवर के आंतरिक अंगों को निष्कासित करेगा, जिसमें हिम्मत, वसा शरीर और वृषण शामिल हैं।
  7. बाकी अंगों से टेस्ट के अलावा धीरे-धीरे चिढ़ाएं। वृषण स्पष्ट, अंडाकार आकार के अंग हैं जो वसा शरीर के रिबन में एम्बेडेड होते हैं(चित्रा 2C)।
  8. एक समय में एक टेस्ट को मीडिया की तीसरी बूंद में स्थानांतरित करें। इसे पूरा करने के लिए, वसा शरीर के नीचे स्केलपेल के किनारे डालें, ऊतक को मीडिया से बाहर उठाएं, और जल्दी से इसे तीसरी बूंद तक ले जाएं।
  9. वैकल्पिक रूप से, यदि ऊतक को सफलतापूर्वक उठाने के लिए अभी भी टेस्ट से जुड़ा पर्याप्त वसा शरीर नहीं है, तो धीरे-धीरे एक ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके ऊतक को स्थानांतरित करें जो विच्छेदन मीडिया के साथ पहले से गीला हो गया है।
  10. स्कैल्पेल उपकरण के तेज अंत का उपयोग धीरे-धीरे वृषण से अतिरिक्त वसा शरीर को काटने के लिए करें, किनारों के चारों ओर वसा शरीर का सिर्फ एक छोटा रिम छोड़ दें(चित्रा 2C)। यह वसा शरीर के सभी को दूर करने के लिए आवश्यक नहीं है, और ऐसा करने का प्रयास करने की संभावना हानिकारक या वृषण के टूटना में परिणाम होगा ।
  11. ग्लास स्लाइड पर सभी पुरुष लार्वा के लिए उपरोक्त चरणों को दोहराएं।
  12. या तो 3 कदम या 5 कदम के लिए आगे बढ़ें ।

3. लाइव माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग के लिए बढ़ते टेस्ट

नोट: इस बढ़ती प्रक्रिया को हाल ही में प्रकाशित प्रोटोकॉल से ड्रोसोफिला लार्वा मस्तिष्क न्यूरोब्लास्ट20की इमेजिंग के लिए अनुकूलित किया गया था । इस संदर्भ में अतिरिक्त विवरण पाया जा सकता है।

  1. 50 मिमी गैस-परगम्य संस्कृति पकवान के केंद्र पर श्नाइडर के मीडिया (लगभग 30 माइक्रोन) की एक बूंद जमा करने के लिए फ़िल्टर सिरिंज का उपयोग करें।
  2. गैस-परगम्य पकवान पर ड्रॉप करने के लिए तैयार टेस्ट स्थानांतरित करने के लिए एक पूर्व-गीला पाश्चर पिपेट का उपयोग करें। टेस्ट आम तौर पर बूंद की सतह पर तैरना होगा।
  3. स्केलपेल टूल का उपयोग धीरे-धीरे गैस-परगम्य झिल्ली पर टेस्ट को नीचे धकेलने के लिए करें। स्केलपेल के तेज बिंदु के साथ गैस-परगम्य झिल्ली को टूटना न हो इसका ध्यान रखें। सभी टेस्ट को ड्रॉप के केंद्र में धकेलें।
  4. तेल की चार बूंदों, गैस चाली झिल्ली पर लगभग 30 माइक्रोन बनाने के लिए हेलोकार्बन तेल से भरी 1 मिलीएल सिरिंज का उपयोग करें। अंतरिक्ष एक 22 मिमी ग्लास कवरस्लिप के चार कोनों के अनुरूप करने के लिए टेस्ट युक्त मीडिया की बूंदों के आसपास तेल की बूंदें ।
  5. हेलोकार्बन तेल की चार बूंदों के साथ एक 22 मिमी ग्लास कवरस्लिप के कोनों को लाइन करें और धीरे-धीरे मीडिया और तेल पर कवरस्लिप को कम करें। कवरस्लिप को व्यवस्थित करने के लिए और तेल की बूंदों के बीच फैलने के लिए टेस्ट युक्त मीडिया के लिए अनुमति दें।
  6. अतिरिक्त मीडिया निकालें ताकि कवरस्लिप को टेस्ट की सतह पर बसने की अनुमति दी जा सके। एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत वृषण देखते समय, एक नाजुक कार्य के कोने को कवरस्लिप के नीचे मीडिया में पोंछने के लिए तरल की एक छोटी राशि दूर बाती डालें । दूर पर्याप्त मीडिया बाती जब तक कांच कवरस्लिप सिर्फ सबसे बड़ा टेस्टिस की सतह के साथ संपर्क करता है । बहुत ज्यादा मीडिया को हटाना और कवरस्लिप को बहुत दूर तक कम करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह टेस्ट पर दबाव डालती है और उन्हें टूटना (चित्रा 5देखें) का कारण बनेगी।

4. मेओटिक शुक्राणुओं की लाइव इमेजिंग

नोट: स्पर्मेटोसाइट्स को लेजर स्कैनिंग या कताई डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्रित किया जा सकता है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन या ऊतक के फोटोक्षति से बचने के लिए सिस्टम में पर्याप्त गति और संवेदनशीलता होनी चाहिए।

  1. वृषण के ठीक ऊपर कांच की कवरस्लिप पर विसर्जन तेल की एक बूंद रखें। डिश पर फ्लिप करें और इसे माइक्रोस्कोप स्टेज पर रखें और माइक्रोस्कोप ऑब्जेक्टिव (40x या 60x) को तेल में तब तक ले जाएं जब तक कि यह टेस्ट के ठीक नीचे न हो जाए। एक भी टेस्टिस खोजने के लिए प्रेषित प्रकाश का उपयोग करें और इसे ध्यान में लाएं।
  2. कॉन्फोकल के साथ तेज छवियों पर कब्जा करते समय, कोशिकाओं के संगठन की जांच करने के लिए टेस्टिस को चारों ओर ले जाएं। टेस्टिस के एक छोर में कई छोटी, घनी पैक कोशिकाएं होंगी। इस छोर पर जर्मलाइन स्टेम सेल और स्पर्माटोगोनिया होता है। अंग के दूसरे छोर की ओर बढ़ते हुए, असतत समूहों या अल्सर में आयोजित उत्तरोत्तर बड़ी कोशिकाओं की पहचान करें। ये बड़ी कोशिकाएं शुक्राणुओं(चित्रा 3ए)हैं।
  3. यदि इमेजिंग जीएफपी-ट्यूबलिन, तो शुक्राणुओं की पहचान करें जो कोशिका के कॉर्टेक्स(चित्रा 3बी, सी)पर स्थित दो उज्ज्वल माइक्रोट्यूब्यूल एस्टर (यानी, सेंट्रोसोम्स) की उपस्थिति से 30-60 मिनट के भीतर मेयोसिस शुरू करेंगे।
  4. एक बार मेओटिक शुक्राणुओं के एक पुटी की पहचान की गई है, समय के साथ छवियों के जेड-स्टैक पर कब्जा करने के लिए अधिग्रहण मापदंडों की स्थापना की। आमतौर पर, जेड-आयाम में 1.5 माइक्रोन के अलावा 15-20 छवियों का अधिग्रहण एक ही पुटी के भीतर कई शुक्राणुओं की पूरी मात्रा को पकड़ने के लिए पर्याप्त है।
  5. पूर्ण जेड-ढेर प्राप्त करें हर 2 मिन अगर पूरे पहले meiotic डिवीजन है, जो के बारे में १.५ घंटे लगते है इमेजिंग । तेजी से अधिग्रहण दरों का उपयोग करना संभव है, खासकर यदि केवल मेयोसिस की एक विशिष्ट घटना का विश्लेषण किया जाना है। हालांकि, लेजर उत्तेजना के लिए नमूने के बार-बार जोखिम के कारण फोटोब्लीचिंग या फोटोक्षति का कारण न बनने का ध्यान रखें।
  6. अधिग्रहण के लंबे समय तक फोकल बहाव को रोकने के लिए एक सतत, स्वचालित फोकस नियंत्रण प्रणाली का उपयोग करें। माइक्रोस्कोप चरण पर नमूने का तापमान नियंत्रण आम तौर पर आवश्यक नहीं है, यह मानते हुए कि कमरे का तापमान लगभग 22-23 डिग्री सेल्सियस है। यदि तापमान नियंत्रण उपलब्ध है, तो माइक्रोस्कोप चरण पर 25 डिग्री सेल्सियस पर नमूना बनाए रखें।
  7. यदि मेओटिक शुक्राणुओं को नहीं पाया जाता है, तो नमूना को 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर और छवि में फिर से कई घंटों या रात भर स्टोर करें।

5. निर्धारण और इम्यूनोस्टेनिंग

  1. ऊपर चरण 2.10 से, 9-अच्छी तरह से ग्लास विच्छेदन वाले पकवान में टेस्ट स्थानांतरित करने के लिए एक ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करें जिसमें PBSTx में 8% पैराफॉर्मलडिहाइड का 0.5 मिलीएल (0.3% ट्राइटन एक्स-100 के साथ फॉस्फेट बफर खारा)। सुनिश्चित करें कि वृषण पकवान के तल पर बिछारहे हैं।
    नोट: पैराफॉर्मलडिहाइड विषाक्त है और इसे धुएं के हुड में दस्ताने के साथ संभाला जाना चाहिए।
  2. कमरे के तापमान पर 20 न्यूनतम के लिए टेस्ट फिक्स करें।
  3. टेस्ट 0.5 एमएल PBSTx युक्त एक अच्छी तरह से स्थानांतरित करें। सौम्य आंदोलन के साथ 5 मिन के लिए धोएं। ताजा PBSTx दो बार और नए कुओं में धोने के कदम दोहराएं।
  4. 0.5 एमएल PBSTx में वांछित एकाग्रता के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी पतला करें जिसमें 1.5 एमएल माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में 5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) शामिल हैं। 9-अच्छी तरह से ग्लास विच्छेदन पकवान से पतला प्राथमिक एंटीबॉडी की ट्यूब पर स्थानांतरण वृषण और कोमल कमाल या अखरोट के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  5. 9-अच्छी तरह से ग्लास विच्छेदन डिश के कुएं में 5 मिन के लिए PBSTx के 0.5 mL में टेस्ट धोलें। ताजा PBSTx दो बार और के साथ धोने के कदम दोहराएं।
  6. 5% बीएसए युक्त PBSTx के 250 μL में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी और एक 9 अच्छी तरह से कांच विच्छेदन पकवान के एक साफ कुएं में बांटना । यदि वांछित हो, तो डीएनए दाग करने के लिए DAPI जोड़ें। माध्यमिक एंटीबॉडी युक्त कुएं में टेस्ट स्थानांतरित करें, प्लास्टिक की चादर के साथ कवर करें, और कमरे के तापमान पर 4 घंटे के लिए कोमल आंदोलन के साथ अंधेरे में इनक्यूबेट करें।
  7. टेस्ट को पीबीएसटीएक्स के 0.5 एमएल से भरे साफ कुएं में स्थानांतरित करें। 5 मिन के लिए दो बार ताजा PBSTx के साथ धोएं और 30 मिन के लिए तीसरी बार।

6. बढ़ते फिक्स्ड टेस्ट

  1. पाश्चर पिपेट का उपयोग करके ग्लास माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर अंतिम धोने से टेस्ट स्थानांतरित करें। यदि आवश्यक हो, तो स्लाइड की सतह पर टेस्ट को नीचे धकेलने के लिए स्केलपेल टूल के किनारे का उपयोग करें।
  2. एक नाजुक कार्य के कोने का उपयोग करें जो वृषण से अतिरिक्त तरल को दूर करने के लिए पोंछते हैं। जितना हो सके लिक्विड निकाल ें।
  3. टेस्ट के लिए माइक्रोस्कोपी बढ़ते माध्यम की 30-50 माइक्रोन ड्रॉप लागू करें।
  4. बढ़ते माध्यम की बूंद पर 22 मिमी कवरस्लिप रखें और कवरस्लिप को व्यवस्थित करने और बढ़ते माध्यम को कवरस्लिप के नीचे फैलने की अनुमति दें। यदि आवश्यक हो तो अतिरिक्त बढ़ते माध्यम को निचोड़ने के लिए कवरस्लिप पर कोमल दबाव लागू करें और कवरस्लिप को टेस्ट की सतह पर आराम करने की अनुमति दें।
  5. कवरस्लिप के किनारों को सील करने के लिए नेल पॉलिश का उपयोग करें।

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Representative Results

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जब इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक निष्पादित किया जाता है, तो टेस्ट कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी या अन्य फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी विधियों द्वारा इमेजिंग के लिए पूरी तरह से बरकरार रहेंगे। जैसा कि चित्रा 3एमें देखा गया है, टेस्ट के सेलुलर संगठन को संरक्षित किया जाता है, और शुक्राणुटोगोनिया, शुक्राणुओं और हैप्लॉयड शुक्राणुओं सहित अन्य में टेस्टिस के एक छोर से कोशिका भेदभाव की प्रगति दिखाई देती है। जीएफपी-ट्यूबलिन शुक्राणुओं को विभाजित करने और मेयोसिस के माध्यम से कोशिकाओं की प्रगति की लाइव इमेजिंग की पहचान करने के लिए एक उपयोगी मार्कर है। जैसा कि चित्रा 3 बीमें दिखाया गया है, शुरुआती मेयोसिस के बारे में शुक्राणुओं को उनके दो प्रमुख माइक्रोट्यूब्यूल एस्टर द्वारा पहचाना जा सकता है। मेटाफेज द्वारा बड़े मेओटिक स्पिंडल को जीएफपी-ट्यूबलिन(चित्रा 3 सी)द्वारा खूबसूरती से लेबल किया जाता है।

ड्रोसोफिला शुक्राणुओं के बड़े आकार और मेयोसिस के माध्यम से उनकी सापेक्ष धीमी प्रगति उन्हें कोशिका,विभाजन8,,11,21के दौरान साइटोप्लाज्मिक ऑर्गेनेल्स जैसे सेलुलर घटकों की गतिशीलता और पुनर्गठन के विश्लेषण के लिए आदर्श बनाती है। चित्रा 4 और वीडियो 1 meiosis के पाठ्यक्रम के माध्यम से माइक्रोट्यूबबुल के संबंध में एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) के गतिशील पुनर्गठन का लाइव इमेजिंग विश्लेषण दिखाते हैं। जैसा कि ऊपर वर्णित है, मेयोसिस की शुरुआत से ठीक पहले देर से इंटरफेज के दौरान, सेल के कॉर्टेक्स में स्थित दो सेंट्रोसोम्स जीएफपी-ट्यूबलिन फ्लोरेसेंस द्वारा स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं। इस स्तर पर, ईआर लक्षित आरएफपी (आरएफपी-केडीईएल) फ्लोरेसेंस से पता चलता है कि ईआर समान रूप से साइटोप्लाज्म भर में वितरित किया जाता है। इसके बाद सेंट्रोसोम्स दो धुरी ध्रुवों को स्थापित करने के लिए परमाणु लिफाफे के विपरीत दिशाओं में पलायन करना शुरू कर देते हैं । इस समय के दौरान, ईआर तेजी से सेंट्रोसोमल माइक्रोट्यूबबुल के आसपास जमा होता है और उत्तरोत्तर बाकी साइटोप्लाज्म से साफ हो जाता है। परमाणु लिफाफा टूटने (एनईबी) परमाणु क्षेत्र के भीतर GFP-tubulin fluorescence की उपस्थिति से पता चला है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए,कि ड्रोसोफिला कोशिकाएं अर्ध-ओपन माइटोसिस या मेयोसिस द्वारा विभाजित होती हैं, जिसका अर्थ है कि परमाणु लिफाफा घटक टूट जाते हैं और तितर-बितर होते हैं और बड़े साइटोप्लाज्मिक अणु परमाणु क्षेत्र में प्रवेश करते हैं, लेकिन ईआर-व्युत्पन्न झिल्ली का एक लिफाफा पूरे सेल डिवीजन22,23, 24में स्पिंडल और क्रोमेटिड को चारों ओर से घेरे हुए है।,24 एनईबी के समय तक और मेटाफेज के माध्यम से प्रगति करते हुए, ईआर लगभग पूरी तरह से सूक्ष्म माइक्रोट्यूबबुल से जुड़ा हुआ है जो दो धुरी ध्रुव सेंट्रोसोम्स को घेरते हैं। ईआर के ये दो सूक्ष्म सूक्ष्मतुबुल जमा फिर एनाफेज के दौरान दो बेटी कोशिकाओं में विभाजित होते हैं, जो नवगठित कोशिकाओं8,,11द्वारा उचित ईआर विरासत सुनिश्चित करते हैं।

चित्रा 5 शुक्राणुओं की लाइव इमेजिंग पर टेस्टिस टूटने के प्रभाव को दर्शाता है। जैसा कि प्रोटोकॉल में वर्णित है, बढ़ते चरणों के दौरान टेस्ट की सतह पर कवरस्लिप को बहुत दूर तक कम करने के लिए बहुत सावधानी नहीं बरती जानी चाहिए, क्योंकि यह टेस्ट पर दबाव लागू करेगा और उन्हें फटने का कारण बनेगा। जैसा कि चित्रा 5 और वीडियो 2में देखा गया है, शुक्राणुओं के अल्सर तेजी से उठी टेस्टिस से बाहर बहते हैं, और कोशिकाओं का यह आंदोलन लाइव, समय-चूक इमेजिंग को बेहद मुश्किल बनाता है।

Figure 1
चित्रा 1: सफल विच्छेदन के लिए आवश्यक उपकरण। (A)विच्छेदन के लिए उपयोग किए जाने वाले संदंश सीधे होने चाहिए और तेज, अटूट सुझाव (हरे रंग के चेक मार्क द्वारा इंगित) होते हैं। तुला या टूटे हुए सुझावों (लाल एक्स अंक) के साथ संदंश का उपयोग न करें, क्योंकि वे लार्वा को लोभी और ऊतकों को अलग करने में अप्रभावी होंगे। (ख)स्केलपेल उपकरण तैयार करने के लिए, एक काले एनोड्ड स्टील कीट पिन को लगभग 135 डिग्री के आंतरिक कोण पर मोड़ें। तेज बिंदु ऊतक के माध्यम से कटौती करने के लिए एक चाकू के रूप में प्रयोग किया जाता है, और सीधे किनारे ऊतकों को स्थानांतरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: लार्वा और प्यूपल टेस्ट की पहचान। (A)नर और महिला लार्वा की छवियां। टेस्ट नर में जानवर (एरोहेड) के पीछे तीसरे हिस्से में गोलाकार या अंडाकार पारदर्शी संरचनाओं के रूप में पहचाने जाने योग्य होते हैं। महिला में एक समान संरचना की कमी पर ध्यान दें। (ख)एक प्रारंभिक पुरुष पिल्ला की छवि, दो पारदर्शी टेस्ट तीर द्वारा संकेत के साथ । (ग)विच्छेदन के बाद संलग्न वसा निकायों के साथ टेस्ट। बाईं ओर दो टेस्ट अत्यधिक वसा शरीर अभी भी संलग्न है कि दूर छंटनी की जरूरत है । दाईं ओर दो टेस्ट को उनके मोटे शरीर की ठीक से छंटनी की गई है और इमेजिंग के लिए तैयार हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: सफलतापूर्वक तैयार टेस्टिस में मेओटिक शुक्राणुओं की पहचान। (A)एक सफलतापूर्वक तैयार लाइव, बरकरार टेस्टिस की Confocal छवि GFP-tubulin व्यक्त । स्टेम सेल का हब टेस्टिस के निचले सिरे की ओर स्थित है, हालांकि इस तैयारी में यह पहचानयोग्य नहीं है। छोटे शुक्राणुओं की कई परतों को इंगित किया जाता है, और इनके बाद शुक्राणुओं के कई अल्सर होते हैं। पहले मेयोटिक डिवीजन में शुक्राणुओं का एक पुटी कोशिकाओं के बड़े आकार (व्यास में लगभग 20 - 30 माइक्रोन) और जीएफपी-ट्यूबलिन लेबल मेयोटिक स्पिंडल की उपस्थिति के आधार पर पहचाना जा सकता है। दूसरे मेयोटिक डिवीजन में शुक्राणुओं में इसी तरह स्पिंडल होते हैं, लेकिन ये कोशिकाएं लगभग आधे आकार की मेयोसिस आई कोशिकाएं हैं। पोस्ट-मेओटिक शुक्राणुभी दिखाई देते हैं, जैसा कि शुक्राणुओं को लम्बी कर रहे हैं। (ख)शुक्राणुओं कि 30 के भीतर meiosis शुरू हो जाएगा -६० मिनट उनके दो बड़े, बहुत उज्ज्वल माइक्रोट्यूबबुल एस्टर (तीर सिर द्वारा संकेत) GFP-tubulin द्वारा लेबल द्वारा पहचाना जा सकता है । प्री-मेयोटिक कोशिकाओं का पुटी धराशायी पीली रेखा से रेखांकित होता है। (ग)मेयोसिस में कोशिकाओं को उनके बड़े मेओटिक स्पिंडल द्वारा पहचाना जाता है जो आसानी से जीएफपी-ट्यूबलिन के साथ कल्पना कर ते हैं। मेयोटिक कोशिकाओं के पुटी को धराशायी पीले रेखा से रेखांकित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एक ही शुक्राणुओं में मेयोसिस की समय-चूक इमेजिंग। ईआर (आरएफपी-केडीएल) को लक्षित एक एकल शुक्राणुसह-व्यक्त जीएफपी-ट्यूबलिन और आरएफपी को मेयोसिस के पाठ्यक्रम के माध्यम से हर दो मिनट में चित्रित किया गया था। दिखाया गया है कि मेयोसिस के विशिष्ट चरणों में शुक्राणुओं की प्रतिनिधि छवियां हैं, जो देर से इंटरफेज में शुरू होती हैं और टेलोफेज के माध्यम से प्रगति करती हैं। समय मिनटों में होता है । प्रत्येक छवि प्रत्येक समय बिंदु पर अधिग्रहीत पंद्रह ऑप्टिकल स्लाइस के ढेर से एक ऑप्टिकल विमान है । यह आंकड़ा काराबाशेव और Smyth, २०१९से संशोधित किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: टूटने से पहले और बाद में एक टेस्टिस की प्रतिनिधि छवियां। बाईं ओर छवि, लेबल "बरकरार", एक GFP-tubulin व्यक्त टेस्टिस से पता चलता है बस टूटना से पहले । दाईं ओर की छवि टूटने के बाद एक ही टेस्टिस दिखाती है। शुक्राणुओं के अल्सर को उठी हुई टेस्टिस से स्ट्रीमिंग करते हुए देखा जा सकता है। तीर सिर मेओटिक शुक्राणुओं के एक पुटी का संकेत देते हैं; टेस्टिस टूटने के बाद इन शुक्राणुओं के महत्वपूर्ण आंदोलन पर ध्यान दें, जिससे इन शुक्राणुओं को समय के साथ बेहद चुनौतीपूर्ण इमेजिंग किया जा सके। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 1: एक शुक्राणुका पूर्ण मेओटिक डिवीजन। दिखाया गया है कि जीएफपी-ट्यूबलिन और आरएफपी-केडीईएल का पूरा समय चूक है जो चित्र 4में शुक्राणुओं को व्यक्त करता है । छवियों को हर दो मिनट में कब्जा कर लिया गया था, और प्लेबैक दर प्रति सेकंड तीन फ्रेम है । इस वीडियो को काराबाशेव और स्मिथ, 20198से संशोधित किया गया था। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 2: उठी टेस्टिस। टूटने से पहले और बाद में एक टेस्टिस का समय-चूक। टेस्टिस के निचले बाएं कोने के माध्यम से कोशिकाओं के अल्सर की अचानक स्ट्रीमिंग के कारण टूटना स्पष्ट होता है। छवियों को हर दो मिनट में कब्जा कर लिया गया था, और प्लेबैक दर प्रति सेकंड तीन फ्रेम है । कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

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हमने लार्वा या शुरुआती पुलपाल ड्रोसोफिला टेस्टकी तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल बताया है, जो दीर्घकालिक, शुक्राणुओं के सेल डिवीजन की लाइव इमेजिंग के लिए अनुकूलित है। यह अक्षुण्ण ऊतक के शारीरिक संदर्भ में कोशिका विभाजन के विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली विधि है। इस विधि की शक्ति को तब और विस्तारित किया जाता है जब ड्रोसोफिला आनुवंशिक उपकरणों के साथ संयुक्त होता है, जैसे विशिष्ट जीन उत्परिवर्तन, ऊतक-विशिष्ट आरएनएआई-मध्यस्थता दमन, और फ्लोरोसेंटी लेबल प्रोटीन और ऑर्गेनेल मार्कर। इसके अलावा, लार्वा और प्यूपल टेस्ट का छोटा आकार, और ग्लास कवरस्लिप के बहुत करीब कोशिकाओं को विभाजित करने की छवि बनाने की क्षमता, सुपर-रिज़ॉल्यूशन दृष्टिकोण सहित उच्च रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए विधि को आदर्श बनाती है। इस प्रयोगात्मक प्रणाली की बहुमुखी प्रतिभा सेल डिवीजन के दौरान ईआर के गतिशील पुनर्गठन का वर्णन प्रतिनिधि परिणामों द्वारा प्रदर्शित किया जाता है। इन कोशिकाओं के बड़े आकार और मेयोसिस के माध्यम से अपेक्षाकृत धीमी गति से पारगमन के कारण कोशिका विभाजन के दौरान ऑर्गेनेल गतिशीलता के ऐसे विश्लेषण के लिए ड्रोसोफिला शुक्राणु विशेष रूप से उपयोगी होते हैं। इसके अलावा, एक ही कोशिकाओं को यह समझने के लिए पोस्ट-meiotically छवि दी जा सकती है कि ऑर्गेनेल गतिशीलता या सेल डिवीजन तंत्र में परिवर्तन शुक्राणुओं की बाद की घटनाओं को कैसे प्रभावित करते हैं। इस प्रकार, ऊतक विकास और कोशिका भेदभाव के व्यापक संदर्भ में सेल डिवीजन के शरीर विज्ञान को समझने के लिए इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के साथ महान क्षमता है, परिणाम जो संस्कृति में उगाई जाने वाली कोशिकाओं का अध्ययन करते समय अप्राप्य होते हैं।

प्रोटोकॉल में कई तत्व शामिल हैं जो लगभग 24 घंटे तक टेस्ट की दीर्घकालिक पूर्व वीवो संस्कृति की सुविधा प्रदान करते हैं। सबसे पहले, श्नाइडर के मीडिया, जो ड्रोसोफिला ऊतक संस्कृति कोशिकाओं के रखरखाव के लिए विकसित किया गया था, में आसानी से उपलब्ध ऊर्जा स्रोत शामिल हैं और वायुमंडलीय हवा में शारीरिक पीएच बनाए रखने के लिए अनुकूलित किया जाता है। दूसरा, बढ़ते वृषण के लिए उपयोग की जाने वाली गैस-पारगम्य झिल्ली तेजी से गैस विनिमय के लिए अनुमति देती है। दीर्घकालिक संस्कृति का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि यदि नमूना तैयार करने के तुरंत बाद विकास या मेयोसिस के वांछित चरण में कोशिकाओं को नहीं पाया जाता है, तो नमूने को बाद के समय में संग्रहीत और चित्रित किया जा सकता है। हमने सत्यापित किया है कि रात भर 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में बनाए गए टेस्ट, कुल 16-24 घंटों के लिए, व्यवहार्य हैं और सक्रिय रूप से मेयोसिस से गुजरने वाली कोशिकाओं की नियमित उपस्थिति के आधार पर स्वस्थ दिखाई देते हैं और शुक्राणु भेदभाव के बाद के चरणों के माध्यम से प्रगति करते हैं। हालांकि, 2-3 घंटे से अधिक समय तक टेस्ट की मात्रा डालने पर सावधानी बरती जानी चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि ऊतक शरीर विज्ञान पर प्रतिकूल प्रभाव न पड़े। सबसे महत्वपूर्ण बात, कोशिकाओं के पैदा होने और शुक्राणु elongate परिपक्व के रूप में टेस्ट संस्कृति में वृद्धि जारी है । यह टेस्ट के कारण इस बात तक विस्तार कर सकता है कि वे झिल्ली और कवरस्लिप के बीच प्रतिबंधात्मक स्थान के कारण फट जाते हैं, नीचे वर्णित कारणों के लिए लाइव इमेजिंग के लिए अनुपयुक्त टेस्ट प्रदान करते हैं। इसके अलावा, यदि दीर्घकालिक संस्कृतियों को नियमित रूप से प्रयोगों में नियोजित किया जाना है, तो यह परीक्षण करने की सलाह दी जाती है कि क्या प्रयोगशाला-विशिष्ट विस्तारित संस्कृति स्थितियों के परिणामस्वरूप लंबे समय तक मेयोटिक अवधि या पिछड़ गुणसूत्रों या साइटोकिनेसिस विफलता की आवृत्तियों में वृद्धि होती है।

लंबे समय से पाठ्यक्रमों में व्यक्तिगत कोशिकाओं की छवि बनाने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि तैयार टेस्ट माइक्रोस्कोप चरण पर होने के बाद कोशिकाएं काफी आगे न बढ़ें। इस प्रकार, प्रोटोकॉल को निष्पादित करते समय यह आवश्यक है कि टेस्ट बरकरार और अक्षतिग्रस्त रहते हैं, क्योंकि कोशिकाएं क्षतिग्रस्त टेस्ट से बाहर फैल जाती हैं और परिणामस्वरूप अंग के भीतर की सभी कोशिकाएं आगे बढ़ती हैं (चित्रा 5 और वीडियो 2देखें)। यह अभी भी क्षतिग्रस्त टेस्ट में शुक्राणुओं की छवि के लिए संभव हो सकता है अगर कोशिकाओं को अंततः बसने और चलती बंद करो, हालांकि समय यह meiosis के चरणों है कि एक का विश्लेषण करना चाहता है पहले से ही हुआ हो सकता है होता है । इसके अलावा, सेल डिवीजन प्रक्रिया पर ऊतक क्षति के प्रभाव को छूट नहीं दी जा सकती है। लार्वा से वृषण को हटाने के बाद वसा निकायों को साफ करते समय टेस्ट को नुकसान हो सकता है। इसलिए प्रोटोकॉल के इस कदम के दौरान अंगों पर भेदी या टगिंग से बचने के लिए बहुत सावधानी बरती जानी चाहिए । वास्तव में, अक्सर बहुत अधिक वसा वाले शरीर को हटाना आवश्यक नहीं होता है, जब तक कि वे टेस्टिस के दृश्य को अस्पष्ट नहीं करते हैं। अधिक सामान्यतः, टेस्टिस क्षति लाइव इमेजिंग (चरण 3.6) के लिए बढ़ती प्रक्रिया के दौरान कवरस्लिप के प्लेसमेंट के बाद बहुत अधिक संस्कृति माध्यम को हटाने का परिणाम है। जैसे ही मध्यम हटादिया जाता है, कवरस्लिप कम हो जाती है और वृषण पर दबाव डालती है, और अतिरिक्त दबाव वृषण टूटना का कारण बनेगा। इस प्रकार, जबकि कवरस्लिप के लिए शुक्राणुओं की इष्टतम इमेजिंग की सुविधा के लिए टेस्ट के जितना संभव हो उतना करीब होना महत्वपूर्ण है, बहुत अधिक माध्यम को हटाने और कवरस्लिप को बहुत दूर तक कम करने से बचने के लिए कुछ अभ्यास आवश्यक है। यह बताना भी मददगार है कि कुछ अनुप्रयोगों के लिए, जैसे दवाओं या अन्य छोटे अणुओं के लिए शुक्राणुओं का तीव्र एक्सपोजर, टेस्ट को बाधित करना और विश्लेषण के लिए शुक्राणुओं के अल्सर को तितर-बितर करना लाभप्रद हो सकता है। फैलावित शुक्राणुओं के सिस्ट18,25की तैयारी और संस्कृति के लिए कई उत्कृष्ट प्रोटोकॉल उपलब्ध हैं .

सेल डिवीजन विश्लेषण के लिए शुक्राणुओं का उपयोग करते समय एक महत्वपूर्ण विचार यह है कि ये कोशिकाएं माइटोटिक डिवीजनों के विपरीत मेयोटिक निष्पादित करती हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि सेल डिवीजन यांत्रिकी के कई आवश्यक पहलू, जैसे धुरी वास्तुकला और साइटोकिनेसिस, पुरुष मेयोसिस और माइटोसिस6के बीच समान हैं। इस प्रकार, शुक्राणुओं के अध्ययन से एकत्र की गई मशीनी अंतर्दृष्टि मोटे तौर पर पशु सेल डिवीजन7के सामान्य तंत्र पर लागू हो सकती है। हालांकि, मशीनी प्रश्नों को संबोधित किए जाने के आधार पर, क्रोमोसोमल गतिशीलता और सेल चक्र विनियमन जैसी प्रक्रियाओं में शुक्राणुओं और माइटोटिक कोशिकाओं के बीच महत्वपूर्ण अंतर26पर विचार करने की आवश्यकता हो सकती है। इसके साथ ही ड्रोसोफिला स्पर्मेटोसाइट्स एक ही टिश्यू और जर्मलाइन वंश के भीतर माइटोटिक और मेयोटिक कोशिकाओं की तुलना करने का अनूठा अवसर पेश करते हैं। उदाहरण के लिए, एक ही टेस्टिस तैयारी का उपयोग माइटोसिस से गुजरने वाले जर्मलाइन स्टेम कोशिकाओं या शुक्राणुओं का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है और मेयोसिस से गुजररहे शुक्राणु। हम आम तौर पर लाइव टेस्टिस तैयारी में जर्मलाइन स्टेम सेल या शुक्राणुओं की छवि का प्रयास नहीं करते हैं क्योंकि इन डिवीजनों के समय की भविष्यवाणी करना मुश्किल है। हालांकि, हमने अपने प्रयोगों में इन डिवीजनों पर आकस्मिक रूप से कब्जा कर लिया है, यह प्रदर्शित करते हुए कि सामान्य प्रोटोकॉल को टेस्ट के भीतर माइटोटिक कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए भी लागू किया जा सकता है।

प्रस्तुत की गई पद्धति शुक्राणुओं की लाइव इमेजिंग के लिए टेस्टिस तैयारी पर केंद्रित है, क्योंकि यह सेलुलर और आणविक गतिशीलता के वास्तविक समय के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। हम बरकरार टेस्ट के निर्धारण और इम्यूनोस्टेनिंग के लिए एक विधि भी प्रदान करते हैं, क्योंकि यदि आवश्यक फ्लोरोसेंटी लेबल वाली अभिव्यक्ति निर्माण उपलब्ध नहीं हैं या प्रोटीन अतिअभिव्यक्ति के भ्रामक प्रभावों से बचने के लिए यह दृष्टिकोण बेहतर हो सकता है। हालांकि एक महत्वपूर्ण विचार यह है कि निर्धारण हमेशा ईमानदारी से देशी ऊतक और सेलुलर वास्तुकला की रक्षा नहीं करता है। उदाहरण के लिए, हमने और अन्य लोगों ने पाया है कि निर्धारण के परिणामस्वरूप अक्सर ईआर11,,27का विखंडन या व्यवधान होता है। इनमें से कुछ समस्याओं को विभिन्न फिक्सेटिव या ऊतक तैयारकरने के तरीकों का उपयोग करके समाप्त किया जा सकता है, और इसलिए किसी विशेष सेल घटक या प्रोटीन संगठन के संरक्षण के लिए इष्टतम निर्धारण प्रोटोकॉल की पहचान करने के लिए कुछ समस्या निवारण आवश्यक हो सकता है। सौभाग्य से, ड्रोसोफिला शुक्राणुनिर्धारण के लिए कई अतिरिक्त प्रोटोकॉल भी18,,28,,29उपलब्ध हैं।

निष्कर्ष में, हमने शुक्राणुओं के लाइव और फिक्स्ड सेल विश्लेषण के लिए ड्रोसोफिला टेस्ट की तैयारी के लिए बहुमुखी तरीकों का वर्णन किया है। इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण की विशिष्ट शक्तियों में अक्षुण्ण ऊतकमें सेल डिवीजन का विश्लेषण, बड़ी कोशिकाओं की उच्च संकल्प इमेजिंग और ड्रोसोफिला आनुवंशिक उपकरणों के साथ एकीकरण शामिल है। कार्यप्रणाली को नियोजित करने वाले प्रयोगों में हमारी समझ में महत्वपूर्ण योगदान करने की क्षमता है कि सेल डिवीजन ऊतक विकास और होमोस्तासिस के जटिल तंत्र के साथ कैसे एकीकृत करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को रक्षा विभाग स्टार्ट-अप फंडद्वारा जेटी एस को समर्थन दिया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5" Dissecting Probe Fisher 08-965-A
5.75" Glass Pasteur Pipet Fisher 13-678-20A
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher BP9703-100
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Straight forcepts with fine tips
Frosted Microscope Slides Fisher 12-544-2 Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface
Halocarbon oil 700 Sigma H8898-100 mL
Lumox Dish 50 Sarstedt SAR946077410 Gas-permeable tissue culture dish
Microscope Cover Glass Fisher 12-541-B 22 mm x 22 mm, #1.5 glass coverslip
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-15 Insect pins used to make scalpel tool
Nickel Plated Pin Holder Fine Science Tools 26018-17
Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade Electron Microsocopy Sciences 15714
Plan Beveled Edge Microscope Slides Fisher 12-549-5 Slides used for dissections
PYREX Spot Plates Fisher 13-748B 9-well glass dissecting dish
Schneider's Drosophila medium Fisher 21720-024
Syringe Filter, 0.22 µm EMD Millipore SLGS033SB
Triton X-100 Fisher BP151-500
Vectashield Vector Labs H-1000 Microscopy mounting medium

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References

  1. Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, (1), San Diego, Calif. 2-16 (2006).
  2. Ong, J. Y., Torres, J. Z. Dissecting the mechanisms of cell division. The Journal of Biological Chemistry. 294, (30), 11382-11390 (2019).
  3. Levine, E. M. Cell cycling through development. Development. 131, (10), 2241-2246 (2004).
  4. Gross, S. M., Rotwein, P. Unraveling Growth Factor Signaling and Cell Cycle Progression in Individual Fibroblasts. The Journal of Biological Chemistry. 291, (28), 14628-14638 (2016).
  5. Mittelman, D., Wilson, J. H. The fractured genome of HeLa cells. Genome Biology. 14, (4), 111 (2013).
  6. Bury, L., Coelho, P. A., Glover, D. M. From Meiosis to Mitosis: The Astonishing Flexibility of Cell Division Mechanisms in Early Mammalian Development. Current Topics in Developmental Biology. 120, 125-171 (2016).
  7. Giansanti, M. G., Fuller, M. T. What Drosophila spermatocytes tell us about the mechanisms underlying cytokinesis. Cytoskeleton. 69, (11), Hoboken, N.J. 869-881 (2012).
  8. Karabasheva, D., Smyth, J. T. A novel, dynein-independent mechanism focuses the endoplasmic reticulum around spindle poles in dividing Drosophila spermatocytes. Scientific Reports. 9, (1), 12456 (2019).
  9. Polevoy, G., et al. Dual roles for the Drosophila PI 4-kinase four wheel drive in localizing Rab11 during cytokinesis. Journal of Cell Biology. 187, (6), 847-858 (2009).
  10. Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes. PLoS Biology. 2, (1), 8 (2004).
  11. Smyth, J. T., Schoborg, T. A., Bergman, Z. J., Riggs, B., Rusan, N. M. Proper symmetric and asymmetric endoplasmic reticulum partitioning requires astral microtubules. Open Biology. 5, (8), (2015).
  12. Demarco, R. S., Eikenes, ÅH., Haglund, K., Jones, D. L. Investigating spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Methods. 68, (1), San Diego, Calif. 218-227 (2014).
  13. Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. Cold Spring Harbor Press. 71-147 (1993).
  14. Dunleavy, E. M., et al. The Cell Cycle Timing of Centromeric Chromatin Assembly in Drosophila Meiosis Is Distinct from Mitosis Yet Requires CAL1 and CENP-C. PLOS Biology. 10, (12), 1001460 (2012).
  15. Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2, (3), 197-212 (2012).
  16. Ramm, S. A., Scharer, L., Ehmcke, J., Wistuba, J. Sperm competition and the evolution of spermatogenesis. Molecular Human Reproduction. 20, (12), 1169-1179 (2014).
  17. Savoian, M. S. Microscopy Methods for Analysis of Spindle Dynamics in Meiotic Drosophila Spermatocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 265-276 (2017).
  18. Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological analysis of spermatogenesis: live and fixed preparations of Drosophila testes. Journal of Visualized Experiments. (83), e51058 (2014).
  19. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).
  20. Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live imaging of Drosophila larval neuroblasts. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
  21. Belloni, G., et al. Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis. Journal of Cell Science. 125, (22), 5441-5452 (2012).
  22. Harel, A., et al. Persistence of major nuclear envelope antigens in an envelope-like structure during mitosis in Drosophila melanogaster embryos. Journal of Cell Science. 94, (3), 463-470 (1989).
  23. Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components. Mol Biol Cell. 19, (9), 3652-3666 (2008).
  24. Tates, A. D. Cytodifferentiation during spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An electron microscope study. (1971).
  25. Gartner, S. M., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment. Journal of Visualized Experiments. (91), 51868 (2014).
  26. Ohkura, H. Meiosis: an overview of key differences from mitosis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7, (5), (2015).
  27. Friedman, J. R., Webster, B. M., Mastronarde, D. N., Verhey, K. J., Voeltz, G. K. ER sliding dynamics and ER-mitochondrial contacts occur on acetylated microtubules. Journal of Cell Biology. 190, (3), 363-375 (2010).
  28. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Methanol-acetone fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, (10), 1270-1272 (2011).
  29. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (1), 102-104 (2012).
लाइव, बरकरार ऊतक में सेल डिवीजन के विश्लेषण के लिए <em>ड्रोसोफिला</em> लार्वा और पुपल टेस्ट की तैयारी
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Karabasheva, D., Smyth, J. T. Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue. J. Vis. Exp. (159), e60961, doi:10.3791/60961 (2020).More

Karabasheva, D., Smyth, J. T. Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue. J. Vis. Exp. (159), e60961, doi:10.3791/60961 (2020).

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