Utarbeidelse av Drosophila Larval og Pupal Testiklene for analyse av celledivisjon i Live, intakt vev

Summary

Målet med denne protokollen er å analysere celledeling i intakt vev ved levende og fast cellemikroskopi ved hjelp av Drosophila meiotic spermatocytes. Protokollen demonstrerer hvordan man isolerer hele, intakte testikler fra Drosophila larver og tidlig pupae, og hvordan du behandler og monterer dem for mikroskopi.

Abstract

Eksperimentell analyse av celler som deler seg i levende, intaktvev og organer er avgjørende for vår forståelse av hvordan celledeling integreres med utvikling, vev homeostase og sykdomsprosesser. Drosophila spermatocytes som gjennomgår meiose er ideelle for denne analysen fordi (1) hele Drosophila testiklene som inneholder spermatocytter er relativt lett å forberede seg på mikroskopi, (2) spermatocytes store størrelse gjør dem godt egnet for høyoppløselig bildebehandling, og (3) kraftige Drosophila genetiske verktøy kan integreres med in vivo analyse. Her presenterer vi en lett tilgjengelig protokoll for fremstilling av hele testikler fra Drosophila tredje instar larver og tidlig pupper. Vi beskriver hvordan du identifiserer meiotic spermatocytes i forberedt hele testiklene og hvordan å bilde dem leve av time-lapse mikroskopi. Protokoller for fiksering og immunfarging av hele testiklene er også gitt. Bruken av larval testiklene har flere fordeler fremfor tilgjengelige protokoller som bruker voksne testiklene for spermatocytter analyse. Viktigst, larval testiklene er mindre og mindre overfylt med celler enn voksne testiklene, og dette forenkler i stor grad høyoppløselig avbildning av spermatocytter. For å demonstrere disse fordelene og anvendelsene av protokollene presenterer vi resultater som viser omfordelingen av endoplasmatisk reticulum med hensyn til spindelmikrotubuli under celledeling i en enkelt spermatocyte avbildet av tidsforløp konfokal mikroskopi. Protokollene kan kombineres med uttrykk for en rekke fluorescerende merkede proteiner eller organelle markører, samt genmutasjoner og andre genetiske verktøy, noe som gjør denne tilnærmingen spesielt kraftig for analyse av celledelingmekanismer i den fysiologiske konteksten av hele vev og organer.

Introduction

Celledeling studeres ofte ved hjelp av cellelinjer dyrket i kultur¹. Mens vi har fått et vell av uvurderlig innsikt og forståelse av grunnleggende mekanismer fra disse studiene², celler dyrket i kultur kan ikke fullt ut rekapitulere fysiologien til celledeling som det oppstår i intakt, levende vev. For eksempel, i intakt vev og organer, celler må dele på rett sted og til rett tid slik at avkom celler er riktig plassert i vevet, slik at de kan gjennomgå passende differensiering eller funksjonelle programmer, og slik at cellespredning er riktig koordinert med vevvekst eller homeostase³. For celler dyrket i kultur derimot, er celledeling generelt regulert av vekstfaktorer i kulturmediet⁴, og dermed kan vi ikke lære av disse cellene hvordan vivo miljøfaktorer som vevarkitektur eller utviklingssignaler påvirker divisjonsprosessen. Det er også viktig å merke seg at mange av cellelinjene som brukes til å studere celledeling, som HeLa og U2OS-celler, ble avledet fra metastatiske svulster⁵. Derfor har mange aspekter ved den grunnleggende fysiologien til disse kreftcellene, som cellesyklusregulatoriske mekanismer og kromosomstabilitet, sannsynligvis blitt endret sammenlignet med friske celler. Fullstendig forståelse av celledelingsfysiologi avhenger derfor av vår evne til å studere skilleceller i sitt opprinnelige, in vivo-miljøer som bevarer fysiologiske regulatoriske mekanismer og vevsarkitektur.

Fremskritt i å forstå hvordan celledeling opererer innenfor intakt vev og organer er hemmet av vanskeligheter som er iboende for in vivo eller ex vivo analyse. For det første kan det være vanskelig eller umulig å få tilgang til skilleceller for mikroskopisk analyse i store organer eller tykt vev. For det andre er det ofte vanskelig å forutsi når individuelle celler vil dele seg in vivo. For det tredje kan vevsfysiologi raskt forverres under ex vivo-kulturen. I denne protokollen beskriver vi lett tilgjengelige metoder for levende og fast analyse av Drosophila melanogaster spermatocytes som de gjennomgår meiotiske celledivisjoner innenfor helt intakte testikler. Disse cellene er ideelle for live, ex vivo analyse fordi de er lett tilgjengelig med standard optiske metoder som konfokal mikroskopi, de deler seg på forutsigbare tider og steder, og intakte testiklene kan opprettholdes i ex vivo kultur for opptil ca 24 timer. I tillegg er Drosophila spermatocytes store runde celler (ca. 20–30 μm i diameter) som ikke endrer form når de deler seg, noe som gjør dem ideelle for høy oppløsning, tidsforløpsavbildning av cellulære komponenter som spindelapparatet og cytoplasmatiske organeller. Selv om disse cellene gjennomgår meiose i motsetning til mitose, er mange av de essensielle celledelingsprosessene svært like mellom disse to celledelingsmekanismene⁶. Disse fordelene, kombinert med kraftige Drosophila genetiske verktøy, har gjort Drosophila spermatocytes en mye brukt modell for ex vivo analyse av essensielle celledeling prosesser inkludert spindel dannelse og regulering, cytokinese, og organelle remodeling og partisjonering^7,8,9,10,11.

Spermatocytter er celler som er på det meiotiske stadiet av spermatogenese. I Drosophilabegynner spermatogenese med en gruppe kimline stamceller som ligger i en liten region eller “hub” på en pol av testis^12,13. Disse cellene deler seg ved en asymmetrisk mitose, noe som gir opphav til et enkelt differensiert spermatogonium. Spermatogonia gjennomgår deretter fire synkrone mitoseer for å produsere en gruppe på 16 celler som forblir nært forbundet i en enkelt cyste. På dette stadiet, cellene overgang fra en mitotisk til en meiotisk celle syklus og er referert til som spermatocytes. Spermatocytter tilbringer omtrent to til tre dager i et utvidet G2-stadium av cellesyklusen, der de vokser dramatisk og gjennomgår cytologiske endringer i forberedelse til de to meiotiske divisjonene og påfølgende spermiogenese^13,14. Hele gruppen av 16 spermatocytter i en enkelt cyste går deretter inn i den første meiotiske divisjonen samtidig. Dermed kan flere meiotiske spermatocytter avbildes samtidig som de fortsetter gjennom celledeling. Den første meiotiske divisjonen fortsetter for ca 1,5 timer og følges nesten umiddelbart av den andre meiotiske divisjonen, noe som gir 64 totale spermatider som fortsetter å differensiere til modne spermatozoa.

En unik fordel ved å bruke spermatocytter til å studere celledeling i levende, intakt vev er at grupper eller cyster av celler stadig utvikler seg gjennom de forskjellige stadiene av spermatogenese, og celler i alle stadier av spermatogenese kan vanligvis identifiseres i en gitt testis (se figur 3A). Derfor er det relativt enkelt å finne meiotiske celler i hele testiklene. Vi fokuserer generelt våre analyser på den første i motsetning til andre meiose fordi disse cellene er mye større og mer mottagelige for høyoppløselig bildebehandling, men hele prosessen som omfatter begge meiotiske divisjoner kan bli avbildet. Det bør også bemerkes at den generelle protokollen for testis forberedelse og kultur kan brukes til å analysere andre prosesser av spermatogenese også, for eksempel den tidligere mitotiske stamcelle eller spermatogonial divisjoner eller cytologiske endringer som oppstår som spermatids modnes i spermatozoa¹⁵. Mange av disse aspektene av spermatogenese er svært bevart mellom Drosophila og mennesker¹⁶.

Drosophila spermatocytes begynner å nå den meiotiske fasen av spermatogenese under den tredje instar larval stadium av Drosophila utvikling¹³. Derfor kan testiklene isolert fra livssyklusstadier som begynner med tredje instar larver og inkludert pupper og voksne brukes til analyse av å dele spermatocytter. Flere gode protokoller er tilgjengelige for utvinning av testiklene fra voksne mannlige fluer for levende og fast analyse av spermatogenese^17,18,19. Disse protokollene kan være å foretrekke for å studere sene stadier av spermatogenese eller hvis genetiske markører som bare er synlige hos voksne, må brukes. Protokollen fokuserer i stedet på testis forberedelse fra larver og tidlig pupae, fordi testiklene på disse stadiene har flere fordeler som er spesielt relevant for celledelinganalyse ved høy oppløsning, tidsforløpmikroskopi. For det første er testiklene fra larver og pupper mindre enn de fra voksne, og cellene i orgelet er mindre overfylte. På grunn av dette kan deling av spermatocytter ofte avbildes nær den ytre overflaten av larvetestikler, uten å måtte trenge gjennom flere lag med lysspredningsvev. For det andre beveger voksne testikler seg rytmisk på grunn av sammentrekninger av de vedlagte tilbehørsorganene, og disse bevegelsene gjør tidsforløpsavbildning av individuelle celler utfordrende. Og for det tredje er larvaltestiklere fordelaktige når de studerer genmutasjoner som forårsaker pupal eller voksen dødelighet. Våre metoder er optimalisert for langsiktig kultur av testikler på mikroskopstadiet, noe som gjør det mulig å bilde av flere runder med celledeling eller utviklingen av individuelle celler gjennom flere stadier av spermatogenese i samme preparat. Vi beskriver også en protokoll for fiksering og immunfarging av hele testikler. Samlet sett er våre protokoller spesielt nyttige for de som er interessert i å studere celledeling i intakt vev, og evnen til å kombinere spermatocytteranalyse med svært tractable Drosophila genetiske verktøy gjør dette til en spesielt kraftig tilnærming.

Protocol

1. Klargjør dyr, verktøy og medier for disseksjon Cross mannlige og kvinnelige fluer for å få avkom av ønsket genotype. Nyttige transgene markører for identifisering og iscenesettelse av meiotiske spermatocytter inkluderer GFP-tubulin for å merke meiotisk spindel og RFP-histone 2A for å merke krosomer8. Bruk fem til ti hunner per kors og vedlikehold kors på standard flymat i hetteglass i en 25 °C inkubator til tredje instar larver begynner å krype opp på sidene av hetteglasse…

Representative Results

Når denne protokollen utføres, vil testiklene forbli helt intakte for avbildning av konfokal mikroskopi eller andre fluorescensmikroskopimetoder. Som sett i figur 3A, er den cellulære organiseringen av testiklene bevart, og utviklingen av celledifferensiering fra den ene enden av testis til den andre, inkludert spermatogoni, spermatocytter og haploid spermatids er synlig. GFP-tubulin er en nyttig markør for å identifisere skille spermatocytter og for levende avbildning av utviklingen av…

Discussion

Vi har beskrevet en protokoll for fremstilling av larval eller tidlig pupal Drosophila testiklene, optimalisert for langsiktig, levende avbildning av spermatocyte celledeling. Dette er en kraftig metode for analyse av celledeling i den fysiologiske konteksten av intakt vev. Kraften i denne metoden utvides ytterligere når den kombineres med drosofilgenetiske verktøy, for eksempel spesifikke genmutasjoner, vevsspesifikk RNAi-mediert undertrykkelse og fluorescerende merkede protein- og organellemarkører…

Materials

5" Dissecting Probe	Fisher	08-965-A
5.75" Glass Pasteur Pipet	Fisher	13-678-20A
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher	BP9703-100
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Straight forcepts with fine tips
Frosted Microscope Slides	Fisher	12-544-2	Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface
Halocarbon oil 700	Sigma	H8898-100 mL
Lumox Dish 50	Sarstedt	SAR946077410	Gas-permeable tissue culture dish
Microscope Cover Glass	Fisher	12-541-B	22×22 mm, #1.5 glass coverslip
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-15	Insect pins used to make scalpel tool
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26018-17
Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade	Electron Microsocopy Sciences	15714
Plan Beveled Edge Microscope Slides	Fisher	12-549-5	Slides used for dissections
PYREX Spot Plates	Fisher	13-748B	9-well glass dissecting dish
Schneider's Drosophila medium	Fisher	21720-024
Syringe Filter, 0.22 µm	EMD Millipore	SLGS033SB
Triton X-100	Fisher	BP151-500
Vectashield	Vector Labs	H-1000	Microscopy mounting medium