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Developmental Biology

Vorbereitung von Drosophila Larval und Pupal Hoden für die Analyse der Zellteilung in Leben, intaktes Gewebe

Published: May 19, 2020 doi: 10.3791/60961
Automatic Translation
1, 1
1Department of Anatomy, Physiology, and Genetics, F. Edward Hébert School of Medicine, Uniformed Services University of the Health Sciences

Summary

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Zellteilung im intakten Gewebe durch lebende und feste Zellmikroskopie mit Drosophila meiotischen Spermatozyten zu analysieren. Das Protokoll zeigt, wie ganze, intakte Hoden von Drosophila-Larven und frühen Pupas isoliert und wie man sie für die Mikroskopie verarbeitet und montiert.

Abstract

Die experimentelle Analyse von Zellen, die sich in lebenden, intakten Geweben und Organen teilen, ist für unser Verständnis der Integration von Zellteilung in Entwicklung, Gewebehomöostase und Krankheitsprozesse von wesentlicher Bedeutung. Drosophila Drosophila-Spermatozyten, die sich einer Meiose unterziehen, sind ideal für diese Analyse, da (1) ganze Drosophila-Hoden, die Spermatozyten enthalten, relativ einfach auf die Mikroskopie vorbereitet werden können, (2) die größe der Spermatozyten macht sie gut für hochauflösende Bildgebung geeignet, und (3) leistungsstarke Drosophila-Genwerkzeuge können in die In-vivo-Analyse integriert werden. Hier präsentieren wir ein leicht zugängliches Protokoll zur Herstellung ganzer Hoden aus Drosophila dritten Instar Larven und frühen Pupae. Wir beschreiben, wie man meiotische Spermatozyten in vorbereiteten ganzen Hoden identifiziert und wie man sie live durch Zeitraffermikroskopie abbilden kann. Protokolle zur Fixierung und Immunfärbung ganzer Hoden werden ebenfalls zur Verfügung gestellt. Die Verwendung von Larvenhoden hat mehrere Vorteile gegenüber verfügbaren Protokollen, die erwachsene Hoden für die Spermatozytenanalyse verwenden. Am wichtigsten ist, Larvenhogen sind kleiner und weniger mit Zellen als erwachsene Hoden überfüllt, und dies erleichtert stark hochauflösende Bildgebung von Spermatozyten. Um diese Vorteile und die Anwendung der Protokolle zu demonstrieren, präsentieren wir Ergebnisse, die die Umverteilung des endoplasmatischen Retikulums in Bezug auf Spindelmikrotubuli während der Zellteilung in einem einzigen Spermatozyten zeigen, das durch zeitraffende konfokale Mikroskopie dargestellt wird. Die Protokolle können mit der Expression einer beliebigen Anzahl von fluoreszierend markierten Proteinen oder Organellenmarkern sowie Genmutationen und anderen genetischen Werkzeugen kombiniert werden, was diesen Ansatz besonders leistungsfähig für die Analyse von Zellteilungsmechanismen im physiologischen Kontext ganzer Gewebe und Organe macht.

Introduction

Die Zellteilung wird häufig mit Zelllinien untersucht, die in Kultur1gewachsen sind. Während wir aus diesen Studien eine Fülle von unschätzbaren Erkenntnissen und Verständnis grundlegender Mechanismen gewonnen haben2, können Zellen, die in der Kultur angebaut werden, die Physiologie der Zellteilung nicht vollständig rekapitulieren, wie sie in intaktem, lebendem Gewebe vorkommt. Zum Beispiel müssen sich die Zellen in intakten Geweben und Organen an der richtigen Stelle und zur richtigen Zeit teilen, damit sich die Vorläuferzellen richtig im Gewebe befinden, so dass sie sich einer angemessenen Differenzierung oder funktionellen Programmen unterziehen können, und damit die Zellproliferation richtig mit dem Gewebewachstum oder der Homöostase3koordiniert wird. Bei Zellen, die in der Kultur angebaut werden, wird die Zellteilung im Allgemeinen durch Wachstumsfaktoren im Kulturmedium4reguliert, und daher können wir aus diesen Zellen nicht lernen, wie in vivo Umweltfaktoren wie Gewebearchitektur oder Entwicklungssignalisierung den Teilungsprozess beeinflussen. Es ist auch wichtig zu beachten, dass viele der Zelllinien, die zur Untersuchung der Zellteilung verwendet wurden, wie HeLa- und U2OS-Zellen, von metastasierenden Tumoren abgeleitet wurden5. Daher wurden viele Aspekte der grundlegenden Physiologie dieser Krebszellen, wie die Regulierungsmechanismen des Zellzyklus und die Chromosomenstabilität, wahrscheinlich im Vergleich zu gesunden Zellen verändert. Ein vollständiges Verständnis der Physiologie der Zellteilung hängt daher von unserer Fähigkeit ab, teilende Zellen in ihren nativen In-vivo-Umgebungen zu untersuchen, die physiologische Regulierungsmechanismen und Gewebearchitektur erhalten.

Fortschritte beim Verständnis der Funktionsweise der Zellteilung in intakten Geweben und Organen werden durch Schwierigkeiten behindert, die der In-vivo- oder Ex-vivo-Analyse innewohnen. Erstens kann es schwierig oder unmöglich sein, auf Trennzellen für mikroskopische Analysen in großen Organen oder dicken Geweben zuzugreifen. Zweitens ist es oft schwierig vorherzusagen, wann sich einzelne Zellen in vivo teilen. Drittens kann sich die Gewebephysiologie während der Ex-vivo-Kultur rapide verschlechtern. In diesem Protokoll beschreiben wir leicht zugängliche Methoden für die lebende und feste Analyse von Drosophila melanogaster Spermatozyten, während sie meiotische Zellteilungen innerhalb vollständig intakter Hoden durchlaufen. Diese Zellen sind ideal für livee Ex-vivo-Analysen, da sie mit optischen Standardmethoden wie konfokaler Mikroskopie leicht zugänglich sind, sie teilen sich zu vorhersagbaren Zeiten und Orten und intakte Hoden können in ex vivo-Kultur bis zu etwa 24 h aufrechterhalten werden. Darüber hinaus sind Drosophila-Spermatozyten große runde Zellen (ca. 20–30 m Durchmesser), die ihre Form nicht ändern, wenn sie sich teilen, was sie ideal für die hochauflösende Zeitraffer-Bildgebung von zellulären Komponenten wie dem Spindelapparat und zytoplasmatischen Organellen macht. Obwohl diese Zellen im Gegensatz zur Mitose einer Meiose unterzogen werden, sind viele der wesentlichen Zellteilungsprozesse zwischen diesen beiden Zellteilungsmechanismen sehr ähnlich6. Diese Vorteile, kombiniert mit leistungsstarken Drosophila genetischen Werkzeugen, haben Drosophila Spermatozyten zu einem ausgiebig verwendeten Modell für die Ex-vivo-Analyse von wesentlichen Zellteilungsprozessen einschließlich Spindelbildung und -regulierung, Zytokinese und Organelle-Umbau und Partitionierung7,8,9,10,11.

Spermatozyten sind Zellen, die sich im meiotischen Stadium der Spermatogenese befinden. In Drosophilabeginnt die Spermatogenese mit einer Gruppe von Keimbahnstammzellen, die sich in einer kleinen Region befinden oder an einem Pol desHoden12,13" "Hub" sind. Diese Zellen teilen sich durch eine asymmetrische Mitose, wodurch ein einziges differenziertes Spermatogonium entstand. Spermatogonie unterzieht sich dann vier synchronen Milben, um eine Gruppe von 16 Zellen zu produzieren, die eng innerhalb einer einzigen Zyste verbunden bleiben. In diesem Stadium, die Zellen Übergang von einem mitotischen zu einem meiotischen Zellzyklus und werden als Spermatozyten bezeichnet. Spermatozyten verbringen etwa zwei bis drei Tage in einer verlängerten G2-Phase des Zellzyklus, in der sie dramatisch wachsen und zytologische Veränderungen in Vorbereitung auf die beiden meiotischen Teilungen und die anschließende Spermiogenese13,14durchlaufen. Die gesamte Gruppe von 16 Spermatozyten innerhalb einer einzigen Zyste tritt dann gleichzeitig in die erste meiotische Teilung ein. So können mehrere meiotische Spermatozyten gleichzeitig abgebildet werden, während sie durch die Zellteilung verlaufen. Die erste meiotische Teilung dauert ca. 1,5 h und wird fast sofort von der zweiten meiotischen Division gefolgt, die insgesamt 64 Spermatoide ergibt, die sich in reife Spermatozoen differenzieren.

Ein einzigartiger Vorteil der Verwendung von Spermatozyten zur Untersuchung der Zellteilung im lebenden, intakten Gewebe besteht darin, dass Gruppen oder Zysten von Zellen ständig durch die verschiedenen Stadien der Spermatogenese fortschreiten und Zellen in allen Stadien der Spermatogenese in der Regel in jedem gegebenen Hoden identifiziert werden können (siehe Abbildung 3A). Daher ist es relativ einfach, meiotische Zellen in ganzen Hoden zu finden. Wir konzentrieren unsere Analysen in der Regel auf die erste statt auf die zweite Meiose, da diese Zellen viel größer und für hochauflösende Bildgebung zugänglicher sind, aber der gesamte Prozess, der beide meiotischen Divisionen umfasst, kann erfolgreich abgebildet werden. Es sollte auch angemerkt werden, dass das allgemeine Protokoll für Hodenvorbereitung und Kultur verwendet werden kann, um andere Prozesse der Spermatogenese zu analysieren, wie die früheren mitotischen Stammzellen oder Spermatogonial-Divisionen oder die zytologischen Veränderungen, die auftreten, wenn Spermatozoen zu Spermatozoen15reifen. Viele dieser Aspekte der Spermatogenese sind hoch konserviert zwischen Drosophila und Menschen16.

Drosophila Spermatozyten beginnen, die meiotische Phase der Spermatogenese während der dritten Instar Larvenstadium der Drosophila Entwicklung zu erreichen13. Daher können Hoden, die von Lebenszyklusstadien isoliert sind, beginnend mit dritten Instarlarven und einschließlich Pupas und Erwachsenen, für die Analyse der Teilung von Spermatozyten verwendet werden. Mehrere ausgezeichnete Protokolle sind für die Extraktion von Hoden von erwachsenen männlichen Fliegen für lebende und feste Analyse der Spermatogenese17,18,19. Diese Protokolle können für die Untersuchung von späten Stadien der Spermatogenese vorzuziehen sein oder wenn genetische Marker verwendet werden müssen, die nur bei Erwachsenen sichtbar sind. Das Protokoll konzentriert sich stattdessen auf die Testis-Vorbereitung von Larven und frühen Pupas, da Tests in diesen Stadien mehrere Vorteile haben, die speziell für die Zellteilungsanalyse durch hochauflösende Zeitraffermikroskopie relevant sind. Erstens sind Hoden von Larven und Pupae kleiner als die von Erwachsenen, und die Zellen im Organ sind weniger überfüllt. Aus diesem Grund können die geteilten Spermatozyten oft in der Nähe der äußeren Oberfläche von Larvenhoden abgebildet werden, ohne durch mehrere Schichten von Lichtstreugewebe eindringen zu müssen. Zweitens bewegen sich erwachsene Hoden rhythmisch aufgrund von Kontraktionen der angeschlossenen Zubehörorgane, und diese Bewegungen machen die Zeitraffer-Bildgebung einzelner Zellen schwierig. Und drittens sind Larvenhoden vorteilhaft, wenn genmutationen untersucht werden, die pupal oder adulte Letalität verursachen. Unsere Methoden sind für die Langzeitkultur der Hoden auf der Mikroskopstufe optimiert, so dass mehrere Runden der Zellteilung oder das Fortschreiten einzelner Zellen durch mehrere Stadien der Spermatogenese in der gleichen Präparation geographiert werden können. Wir beschreiben auch ein Protokoll zur Fixierung und Immunfärbung ganzer Hoden. Insgesamt sind unsere Protokolle besonders nützlich für diejenigen, die an der Untersuchung der Zellteilung in intaktem Gewebe interessiert sind, und die Fähigkeit, Spermatozytenanalysen mit hochgradig retrierbaren Drosophila-Genwerkzeugen zu kombinieren, macht dies zu einem besonders leistungsfähigen Ansatz.

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Protocol

1. Bereiten Sie Tiere, Werkzeuge und Medien auf die Zerlegung vor

  1. Kreuz männliche und weibliche Fliegen, um Nachkommen des gewünschten Genotyps zu erhalten. Nützliche transgene Marker zur Identifizierung und Inszenierung von meiotischen Spermatozyten sind GFP-Tubulin zur Kennzeichnung der meiotischen Spindel und RFP-Histon 2A zur Kennzeichnung von Chromsomen8. Verwenden Sie fünf bis zehn Weibchen pro Kreuz und pflegen Kreuze auf Standard-Fliegenfutter in Fläschchen in einem 25 °C Inkubator, bis die dritte Instar-Larven beginnen, die Seiten der Durchstechflasche hinaufzukriechen (4–5 Tage). Frühe weiße Pupae werden sich einen Tag später bilden.
  2. Erhalten Sie zwei Paare von geraden Zangen mit feinen Spitzen. Stellen Sie sicher, dass die Spitzen scharf, gleichmäßig in der Länge und gerade sind (Abbildung 1A). Verwenden Sie diese Zangen nur für Sezierungen und Kappe mit 10 L Pipettenspitzen, wenn nicht in Gebrauch.
  3. Bereiten Sie ein Skalpellwerkzeug vor.
    1. Setzen Sie das stumpfe Ende eines schwarzen eloxierten Stahlinsektenstifts in einen Stifthalter ein, und drehen Sie die Schraube des Halters, um den Stift an Ort und Stelle zu befestigen. Mit einem Zangenpaar und unter einem Sezierendes Mikroskop greifen Sie den Insektenstift in der Mitte und biegen Ihn zu einem Innenwinkel von 135° (Abbildung 1B). Das scharfe Ende ist zum Schneiden von Gewebe, während die Kante für die Übertragung von Hoden zwischen Tropfen von Medien verwendet wird.
    2. Kappe mit einer 1.000 L Pipettenspitze, wenn sie nicht verwendet wird.
  4. Arbeiten in einer Gewebekulturhaube, bereiten Sie 5 ml Aliquots von Schneiders Medien vor und lagern bei 4 °C bis zum Zeitpunkt der Anwendung. Wenn Sie bereit sind, mit den Zerlegungen zu beginnen, erwärmen Sie ein 5 ml Medium aliquot auf Raumtemperatur. Dann das erwärmte Seziermedium auf eine 10 ml Spritze übertragen und einen 0,22 m Spritzenfilter befestigen.

2. Zerlegung von Hoden von Larven und frühen Pupae

  1. Verwenden Sie die mediengefüllte Filterspritze, um drei Tropfen Medien (je 50 l) an der Ober-, Mittel- und Unterseite eines Glasschlittens zu vertreiben.
  2. Verwenden Sie eine Sezierensonde, um fünf bis zehn Drittel der Instar-Larven oder frühen Pupae (Pupae, die noch weiß oder gelb sind) in den oberen Tropfen zu übertragen. Rühren Sie die Larven und Pupas in den Medien vorsichtig mit der Sezierenderon, um Lebensmittel oder Trümmer zu entfernen.
  3. Drehen Sie unter einem Sezierendes Mikroskop eine einzelne Larve oder einen Pupa auf ihre Seite mit einer Sezierenderon, um die beiden bilateralen Hoden zu identifizieren, falls vorhanden, die als oval geformte transluzente Strukturen im hinteren Drittel des Körpers erscheinen (Abbildung 2A, B). Tiere ohne Hoden sind weiblich und sollten entsorgt werden.
  4. Wenn eine männliche Larve oder Pupa gefunden wird und sauber ist, bewegen Sie sie auf den zweiten Tropfen der Medien. Wiederholen Sie dies, bis 3 oder 4 männliche Larven und/oder Pupae auf den zweiten Tropfen Medien übertragen wurden.
  5. Arbeiten im zweiten Tropfen der Medien, greifen Sie eine einzelne männliche Larve oder Pupa mit einem Paar Zange in seiner Mitte-Region, nur vor den Hoden. Verwenden Sie das zweite Zangenpaar, um das Tier vorsichtig in die Hälfte zu reißen.
  6. Halten Sie das hintere Ende der Larve oder Pupa mit einem Zangenpaar auf der Glasrutsche nach unten. Beginnend direkt neben der Zange, drücken Sie auf die Nagelhaut mit der Kante des Skalpellwerkzeugs und bewegen Sie das Skalpell in Richtung des geschnittenen Endes des Tieres. Dadurch werden die inneren Organe des Tieres, zu denen die Darm-, Fettkörper und Hoden gehören, ausgegart sein.
  7. Die Hoden sanft von den übrigen Organen trennen. Die Hoden sind klare, oval geformte Organe, die in Fettkörperbänder eingebettet sind (Abbildung 2C).
  8. Übertragen Sie die Hoden nacheinander auf den dritten Medientropfen. Um dies zu erreichen, legen Sie die Kante des Skalpells unter den Fettkörper, heben Sie das Gewebe aus den Medien, und bewegen Sie es schnell auf den dritten Tropfen.
  9. Alternativ, wenn es nicht genug Fett Körper noch an den Hoden befestigt ist, um erfolgreich das Gewebe zu heben, übertragen Sie das Gewebe vorsichtig mit einer Glas Pasteur Pipette, die mit Seziermedien vorbenetzt wurde.
  10. Verwenden Sie das scharfe Ende des Skalpellwerkzeugs, um überschüssigen Fettkörper sanft von den Hoden zu entfernen, so dass nur ein kleiner Rand von Fettkörper um die Ränder(Abbildung 2C). Es ist nicht notwendig, den gesamten Fettkörper zu entfernen, und der Versuch, dies zu tun, wird wahrscheinlich zu einer Beschädigung oder Zerbrechen der Hoden führen.
  11. Wiederholen Sie die obigen Schritte für alle männlichen Larven auf der Glasrutsche.
  12. Fahren Sie mit Schritt 3 oder Schritt 5 fort.

3. Montagetests für Live Microscopic Imaging

HINWEIS: Dieses Montageverfahren wurde von einem kürzlich veröffentlichten Protokoll zur Bildgebung von Drosophila Larven-Gehirn-Neuroblasten20angepasst. Weitere Details finden Sie in dieser Referenz.

  1. Verwenden Sie die Filterspritze, um einen einzigen Tropfen Schneiders Medien (ca. 30 l) auf die Mitte einer 50 mm gasdurchlässigen Kulturschale zu legen.
  2. Verwenden Sie eine vorbenetzte Pasteur Pipette, um die vorbereiteten Hoden auf den Tropfen auf der gasdurchlässigen Schale zu übertragen. Die Hoden schweben in der Regel an die Oberfläche des Tropfens.
  3. Verwenden Sie das Skalpellwerkzeug, um die Hoden vorsichtig auf die gasdurchlässige Membran zu schieben. Achten Sie darauf, die gasdurchlässige Membran nicht mit der scharfen Spitze des Skalpells zu brechen. Schieben Sie alle Tests in die Mitte des Tropfens.
  4. Verwenden Sie eine 1 ml Spritze gefüllt mit Halocarbonöl, um vier Tropfen Öl, jeweils etwa 30 l, auf der gasdurchlässigen Membran herzustellen. Raum die Tropfen des Öls um den Tropfen der Medien mit den Hoden, um die vier Ecken eines 22 mm Glasabdeckungsrutsch zu entsprechen.
  5. Richten Sie die Ecken eines 22 mm Glasdeckels mit den vier Tropfen Halocarbonöl aus und senken Sie den Deckelrutsch vorsichtig auf die Medien und das Öl. Lassen Sie den Deckelschein sich absetzen und damit sich die Medien, die die Hoden enthalten, zwischen den Öltropfen ausbreiten.
  6. Entfernen Sie überschüssige Medien, damit sich der Deckelauflege auf der Oberfläche der Hoden absetzen kann. Während Sie die Hoden unter einem Sezierendes Mikroskop beobachten, legen Sie die Ecke einer heiklen Aufgabe in die Medien unter dem Deckschein ab, um eine kleine Menge Flüssigkeit abzuleiten. Wick weg genug Medien, bis die GlasabdeckungSlip nur Kontakt mit der Oberfläche der größten Hoden. Es ist wichtig, nicht zu viele Medien zu entfernen und den Deckelzuschlag zu weit zu senken, da dies Druck auf die Hoden ausübt und sie zum Bruch bringt (siehe Abbildung 5).

4. Live Imaging von meiotischen Spermatozyten

HINWEIS: Spermatozyten können mit einem Laserscanning oder einem konfokalen Mikroskop der Spinnscheibe abgebildet werden. Das System muss über eine ausreichende Geschwindigkeit und Empfindlichkeit verfügen, um Photobleichungen von fluoreszierenden Proteinen oder Photoschäden des Gewebes zu vermeiden.

  1. Legen Sie einen Tropfen Tauchöl auf den Glasdeckel direkt über den Hoden. Überdieb die Schale und legen Sie sie auf die Mikroskopbühne und bewegen Sie das Mikroskopobjektiv (40x oder 60x) in das Öl, bis es knapp unter den Hoden liegt. Verwenden Sie Durchlicht, um einen einzelnen Hoden zu finden und in den Fokus zu rücken.
  2. Bewegen Sie beim Erfassen schneller Bilder mit dem Konfokale die Hoden, um die Organisation der Zellen zu untersuchen. Ein Ende des Hodens wird viele kleine, dicht gepackte Zellen haben. Dieses Ende enthält die Keimbahn Stammzellen und Spermatogonie. Bewegen sich auf das andere Ende des Organs, identifizieren zunehmend größere Zellen in diskreten Clustern oder Zysten organisiert. Diese großen Zellen sind die Spermatozyten (Abbildung 3A).
  3. Wenn Bildgebung GFP-Tubulin, identifizieren Spermatozyten, die Meiose innerhalb von 30-60 min durch das Vorhandensein von zwei hellen Mikrotubuli-Astern (d.h. Zentrosomen) am Kortex der Zelle beginnen wird (Abbildung 3B, C).
  4. Sobald eine Zyste von meiotischen Spermatozyten identifiziert wurde, richten Sie Erfassungsparameter ein, um Z-Stacks von Bildern im Laufe der Zeit zu erfassen. Typischerweise reicht die Erfassung von 15–20 Bildern im Abstand von 1,5 m in der Z-Dimension aus, um das volle Volumen mehrerer Spermatozyten innerhalb derselben Zyste zu erfassen.
  5. Erfassen Sie alle 2 min volle Z-Stacks, wenn Sie die gesamte erste meiotische Division darstellen, die etwa 1,5 Stunden dauert. Es ist möglich, schnellere Erfassungsraten zu verwenden, insbesondere wenn nur ein bestimmtes Ereignis der Meiose analysiert werden soll. Achten Sie jedoch darauf, dass photobleaching oder photodamage nicht aufgrund der wiederholten Exposition der Probe gegenüber Laseranregung verursacht wird.
  6. Verwenden Sie eine kontinuierliche, automatische Fokusregelung, um Fokusdrift über den langen Zeitverlauf der Erfassung zu verhindern. Eine Temperaturregelung der Probe auf der Mikroskopstufe ist bei Raumtemperatur von ca. 22–23 °C in der Regel nicht erforderlich. Wenn eine Temperaturregelung verfügbar ist, halten Sie die Probe bei 25 °C auf der Mikroskopstufe.
  7. Wenn meiotische Spermatozyten nicht gefunden werden, lagern Sie die Probe mehrere Stunden oder über Nacht in einem 25 °C Inkubator und Bild wieder.

5. Fixierung und Immunostainierung

  1. Verwenden Sie ab Schritt 2.10 eine glasige Pasteurpipette, um Die Hoden in einer 9-Well-Glas-Sesektierungsschale mit 0,5 ml 8% Paraformaldehyd in PBSTx (Phosphat gepufferte Salin mit 0,3% Triton X-100) in einen Brunnen zu übertragen. Stellen Sie sicher, dass die Hoden auf dem Boden der Schale liegen.
    HINWEIS: Paraformaldehyd ist giftig und sollte mit Handschuhen in einer Dunstabzugshaube behandelt werden.
  2. Fixieren Sie die Hoden für 20 min bei Raumtemperatur.
  3. Die Hoden auf einen Brunnen mit 0,5 ml PBSTx übertragen. 5 min mit sanfter Rührung waschen. Wiederholen Sie den Waschschritt in neuen Brunnen mit frischem PBSTx zwei weitere Male.
  4. Verdünnung des Primärantikörpers auf die gewünschte Konzentration in 0,5 ml PBSTx mit 5% Rinderserumalbumin (BSA) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Die Hoden von der 9-Well-Glas-Sesektierungsschale auf das Rohr des verdünnten Primärantikörpers übertragen und über Nacht bei 4 °C mit sanftem Schaukeln oder Nusszenis inkubieren.
  5. Waschen Sie die Hoden in 0,5 ml PBSTx für 5 min in einem Brunnen einer 9-Well-Glas-Sezierenschale. Wiederholen Sie den Waschschritt mit frischem PBSTx noch zwei Mal.
  6. Sekundärantikörper in 250 l PBSTx mit 5% BSA verdünnen und in einen sauberen Brunnen einer 9-Well-Glassezierenderschale geben. Falls gewünscht, fügen Sie DAPI hinzu, um DNA zu färben. Die Hoden auf den Brunnen, der Sekundärantikörper enthält, mit Plastikfolie abdecken und im Dunkeln mit sanfter Rührung für 4 Stunden bei Raumtemperatur bebrüten.
  7. Die Hoden auf einen sauberen Brunnen mit 0,5 ml PBSTx übertragen. Zweimal 5 min mit frischem PBSTx und 30 min mit frischem PBSTx waschen.

6. Montage fester Hoden

  1. Übertragen Sie die Hoden aus der letzten Wäsche mit einer Pasteur-Pipette auf ein Glasmikroskopie-Dia. Verwenden Sie bei Bedarf die Kante des Skalpellwerkzeugs, um die Hoden auf die Oberfläche des Schlittens zu schieben.
  2. Verwenden Sie die Ecke einer heiklen Aufgabe wischen, um überschüssige Flüssigkeit aus den Hoden zu leiten. Entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich.
  3. Tragen Sie einen 30–50-L-Tropfen Mikroskopie-Montagemedium auf die Hoden auf.
  4. Legen Sie einen 22 mm Deckelschlupf auf den Tropfen des Montagemediums und lassen Sie den Deckelschlappen setzen und das Montagemedium unter dem Deckschein verteilen. Tragen Sie bei Bedarf sanften Druck auf den Deckelschlupf auf, um überschüssiges Montagemedium herauszupressen und den Deckelrutsch auf der Oberfläche der Hoden ruhen zu lassen.
  5. Verwenden Sie Nagellack, um die Kanten des Coverslip zu versiegeln.

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Representative Results

Wenn dieses Protokoll erfolgreich ausgeführt wird, bleiben die Tests für die Bildgebung durch konfokale Mikroskopie oder andere Fluoreszenzmikroskopiemethoden vollständig intakt. Wie in Abbildung 3Azu sehen, bleibt die zelluläre Organisation der Hoden erhalten, und das Fortschreiten der Zelldifferenzierung von einem Ende des Hodens zum anderen, einschließlich Spermatogonie, Spermatozyten und haploiden Spermatoiden, ist sichtbar. GFP-Tubulin ist ein nützlicher Marker zur Identifizierung von teilenden Spermatozyten und zur Live-Bildgebung des Fortschreitens der Zellen durch Meiose. Wie in Abbildung 3Bdargestellt, können Spermatozyten über die beginnende Meiose durch ihre beiden prominenten Mikrotubuli-Astern identifiziert werden. Durch Metaphase sind die großen meiotischen Spindeln durch GFP-Tubulin schön beschriftet (Abbildung 3C).

Die große Größe der Drosophila-Spermatozyten und ihre relativ langsame Progression durch Meiose machen sie ideal für die Analyse der Dynamik und Reorganisation von zellulären Komponenten wie zytoplasmatischen Organellen während der Zellteilung8,11,21. Abbildung 4 und Video 1 zeigen eine Live-Bildgebungsanalyse der dynamischen Reorganisation des endoplasmatischen Retikulums (ER) in Bezug auf Mikrotubuli im Verlauf der Meiose. Wie oben beschrieben, sind während der späten Interphase kurz vor Beginn der Meiose zwei Zentrosomen, die sich am Kortex der Zelle befinden, durch GFP-Tubulinfluoreszenz deutlich sichtbar. In diesem Stadium zeigt die ER-gezielte RFP-Fluoreszenz (RFP-KDEL), dass der ER gleichmäßig über das Zytoplasma verteilt ist. Die Zentrosomen beginnen dann, zu gegenüberliegenden Seiten der Kernhülle zu wandern, um die beiden Spindelstangen zu errichten. Während dieser Zeit sammelt sich der ER schnell um die zentrosomalen Mikrotubuli an und wird nach und nach vom Rest des Zytoplasmas befreit. Der Zusammenbruch der Nuklearen Hüllen (NEB) wird durch das Auftreten der GFP-Tubulinfluoreszenz innerhalb der Kernregion aufgedeckt. Es sollte beachtet werden, dass Drosophila-Zellen durch halboffene Mitose oder Meiose teilen, was bedeutet, dass Kernhüllekomponenten brechen und zerstreuen und große zytoplasmatische Moleküle in den kernaitischen Bereich gelangen, aber eine Hülle von ER-abgeleiteten Membranen umgibt die Spindel und Chromatiden in der gesamten Zellteilung22,23,24. Zum Zeitpunkt der NEB und des Fortschreitens der Metaphase ist der ER fast vollständig mit den Astralmikrobulen verbunden, die die beiden Spindelpolzentrosomen umgeben. Diese beiden astralen Mikrotubuli-Akkumulationen des ER teilen sich dann während der Anaphase zu den beiden Tochterzellen auf, um eine ordnungsgemäße ER-Vererbung durch die neu gebildeten Zellen8,11zu gewährleisten.

Abbildung 5 zeigt die Auswirkungen des Hodenrisses auf die Live-Bildgebung von Spermatozyten. Wie im Protokoll beschrieben, ist darauf zu achten, dass der Deckelrutsch während der Montageschritte nicht zu weit auf die Oberfläche der Hoden abgesenkt wird, da dadurch Druck auf die Hoden ausgeübt wird und sie platzen. Wie in Abbildung 5 und Video 2zu sehen, fließen Zysten von Spermatozyten schnell aus dem gebrochenen Hoden heraus, und diese Bewegung der Zellen macht die Live-Zeitraffer-Bildgebung extrem schwierig.

Figure 1
Abbildung 1: Werkzeuge, die für eine erfolgreiche Zerlegung erforderlich sind. (A) Zangen, die für die Zerlegung verwendet werden, müssen gerade sein und scharfe, ungebrochene Spitzen haben (gekennzeichnet durch grünes Häkchen). Verwenden Sie keine Zangen mit gebogenen oder gebrochenen Spitzen (rote X-Markierungen), da sie unwirksam beim Greifen von Larven und Hänseleien sein werden. (B) Um das Skalpellwerkzeug vorzubereiten, biegen Sie einen schwarz eloxierten Stahlinsektenstift auf einen Innenwinkel von ca. 135°. Der scharfe Punkt wird als Messer verwendet, um Gewebe zu schneiden, und die gerade Kante wird für das Bewegen von Geweben verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Identifizierung von Larven- und Pupalhoden. (A) Bilder von männlichen und weiblichen Larven. Die Hoden sind im Männchen als kreisförmige oder ovale transluzente Strukturen im hinteren Drittel des Tieres (Pfeilspitze) identifizierbar. Beachten Sie das Fehlen einer ähnlichen Struktur bei der Frau. (B) Bild eines frühen männlichen Pupas, mit den beiden durchscheinenden Hoden, die durch Pfeilspitzen angezeigt werden. (C) Hoden mit angehängten Fettkörpern nach der Zerlegung. Die beiden Hoden auf der linken Seite haben noch übermäßige Fettkörper, die weggetrimmt werden müssen. Die beiden Hoden auf der rechten Seite wurden ordnungsgemäß von ihren Fettkörpern getrimmt und sind bereit für die Bildgebung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Identifizierung meiotischer Spermatozyten in einem erfolgreich vorbereiteten Hoden. (A) Konfokales Bild eines erfolgreich vorbereiteten lebenden, intakten Hoden, die GFP-Tubulin exzessizieren. Die Nabe der Stammzellen befindet sich in Richtung der unteren Spitze des Hodens, obwohl sie in dieser Zubereitung nicht identifizierbar ist. Mehrere Schichten von kleinen Spermatogonien sind angezeigt, und diese werden von zahlreichen Zysten von Spermatozyten gefolgt. Eine Zyste von Spermatozyten in der ersten meiotischen Teilung ist aufgrund der großen Größe der Zellen (ca. 20 – 30 m im Durchmesser) und des Vorhandenseins von GFP-Tubulin-markierten meiotischen Spindeln identifizierbar. Spermatozyten in der zweiten meiotischen Teilung haben ebenfalls Spindeln, aber diese Zellen sind etwa halb so groß wie Meiose-I-Zellen. Post-meiotische Spermatoide sind ebenso sichtbar wie lände Spermatozoen. (B) Spermatozyten, die innerhalb von 30 – 60 min mit Deriose beginnen, können durch ihre beiden großen, sehr hellen Mikrotubuli-Aster (angezeigt durch Pfeilspitzen) identifiziert werden, die durch GFP-Tubulin beschriftet sind. Die Zyste der prämeiotischen Zellen wird durch die gestrichelte gelbe Linie abgegrenzt. (C) Zellen in Deriose sind durch ihre großen meiotischen Spindeln identifizierbar, die leicht mit GFP-Tubulin visualisiert werden können. Die Zyste der meiotischen Zellen wird durch die gestrichelte gelbe Linie abgegrenzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Zeitraffer-Bildgebung der Meiose in einem einzigen Spermatozyten. Ein einziges Spermatozyten-Co-Expressing-GFP-Tubulin und RFP, das auf den ER (RFP-KDEL) ausgerichtet ist, wurde im Laufe der Meiose alle zwei Minuten abgebildet. Gezeigt werden repräsentative Bilder der Spermatozyten in bestimmten Stadien der Meiose, beginnend in der späten Interphase und fortschreitend durch Telophase. Die Zeiten sind in minuten. Jedes Bild ist eine einzelne optische Ebene aus einem Stapel von fünfzehn optischen Slices, die zu jedem Zeitpunkt erfasst werden. Diese Zahl wurde von Karabasheva und Smyth, 20198geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Repräsentative Bilder eines Hodens vor und nach dem Bruch. Das Bild links mit der Aufschrift "Intact" zeigt einen GFP-Tubulin, der Kurz vor dem Bruch Hoden ausdrückt. Das Bild auf der rechten Seite zeigt die gleichen Hoden nach dem Bruch. Zysten von Spermatozyten können gesehen werden, die aus dem gebrochenen Hoden strömen. Die Pfeilspitzen weisen auf eine Zyste meiotischer Spermatozyten hin; Beachten Sie die signifikante Bewegung dieser Spermatozyten nach den Hodenrupturen, so dass die Bildgebung dieser Spermatozyten im Laufe der Zeit extrem anspruchsvoll. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Video 1: Vollständige meiotische Teilung eines einzelnen Spermatozyten. Gezeigt wird der vollständige Zeitraffer des GFP-Tubulins und des RFP-KDEL, der Spermatozyten in Abbildung 4ausdrückt. Die Bilder wurden alle zwei Minuten aufgenommen, und die Wiedergaberate beträgt drei Bilder pro Sekunde. Dieses Video wurde von Karabasheva und Smyth, 20198geändert. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Video 2: Ruptured Testis. Zeitraffer eines Hodens vor und nach dem Bruch. Der Bruch ist offensichtlich durch das plötzliche Strömen von Zysten von Zellen durch die untere linke Ecke des Hodens. Die Bilder wurden alle zwei Minuten aufgenommen, und die Wiedergaberate beträgt drei Bilder pro Sekunde. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

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Discussion

Wir haben ein Protokoll zur Herstellung von Larven- oder frühen Pupal-Drosophila-Hoden beschrieben, das für die langfristige, live bildende Zellteilung von Spermatozyten-Zellen optimiert ist. Dies ist eine leistungsfähige Methode zur Analyse der Zellteilung im physiologischen Kontext intakten Gewebes. Die Leistungsfähigkeit dieser Methode wird in Kombination mit den genetischen Werkzeugen von Drosophila, wie z. B. spezifischen Genmutationen, gewebespezifischer RNAi-vermittelter Unterdrückung und fluoreszierend gekennzeichneten Protein- und Organellenmarkern, weiter ausgebaut. Darüber hinaus machen die geringe Größe der Larven- und Pupalhoden und die Fähigkeit, Trennzellen sehr nah am Glasdeckel abzubilden, die Methode ideal für hochauflösende Bildgebung mit Super-Resolution-Ansätzen. Die Vielseitigkeit dieses experimentellen Systems zeigt sich in den repräsentativen Ergebnissen, die die dynamische Reorganisation des ER während der Zellteilung beschreiben. Drosophila-Spermatozyten sind besonders nützlich für eine solche Analyse der Organellendynamik während der Zellteilung aufgrund der großen Größe dieser Zellen und relativ langsamen Transit durch Meiose. Darüber hinaus können die gleichen Zellen postmeiotisch abgebildet werden, um zu verstehen, wie Veränderungen in der Organellendynamik oder Zellteilungsmechanismen nachfolgende Ereignisse der Spermatogenese beeinflussen. Somit besteht mit diesem experimentellen Ansatz ein großes Potenzial, die Physiologie der Zellteilung im größeren Kontext der Gewebeentwicklung und Zelldifferenzierung zu verstehen, Ergebnisse, die bei der Untersuchung von Zellen, die in der Kultur angebaut werden, unerreichbar sind.

Das Protokoll enthält mehrere Elemente, die eine langfristige Ex-vivo-Kultur von Hoden für bis zu etwa 24 Stunden ermöglichen. Zunächst enthalten Schneiders Medien, die für die Aufrechterhaltung von Drosophila-Gewebekulturzellen entwickelt wurden, leicht verfügbare Energiequellen und sind optimiert, um den physiologischen pH-Wert in der Luft zu erhalten. Zweitens ermöglicht die gasdurchlässige Membran, die für die Montage von Tests verwendet wird, einen schnellen Gasaustausch. Ein wichtiger Vorteil der Langzeitkultur ist, dass, wenn Zellen im gewünschten Entwicklungsstadium oder Meiose nicht unmittelbar nach der Probenvorbereitung gefunden werden, die Probe zu einem späteren Zeitpunkt gespeichert und wieder abgebildet werden kann. Wir haben überprüft, dass Hoden, die über Nacht in einem 25 °C-Inkubator gehalten werden, insgesamt 16-24 Stunden lang lebensfähig sind und gesund erscheinen, basierend auf dem routinemäßigen Vorhandensein von Zellen, die sich aktiv einer Meiose unterziehen und sich durch spätere Stadien der Spermiendifferenzierung fortschreiten. Allerdings sollten Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, wenn Hoden länger als 2-3 Stunden kultiviert werden, um sicherzustellen, dass die Gewebephysiologie nicht beeinträchtigt wird. Am wichtigsten ist, Hoden weiterhin in der Kultur wachsen, wie Zellen vermehren und reifenSperma verlängert. Dies kann dazu führen, dass sich die Hoden so weit vergrößern, dass sie aufgrund des restriktiven Abstands zwischen Membran und Deckblatt platzen, wodurch die Hoden aus den unten beschriebenen Gründen für live-Bildgebung ungeeignet sind. Darüber hinaus ist es ratsam zu testen, ob laborspezifische erweiterte Kulturbedingungen zu meiotischen Anomalien wie längeren meiotischen Dauern oder erhöhten Häufigkeiten von verzögerten Chromosomen oder Zytokineseversagen führen, wenn Langzeitkulturen routinemäßig in Experimenten eingesetzt werden sollen.

Um einzelne Zellen über lange Zeitläufe abzubilden, ist es wichtig, dass sich die Zellen nicht signifikant bewegen, sobald die vorbereiteten Hoden auf der Mikroskopstufe sind. Daher ist es bei der Ausführung des Protokolls wichtig, dass die Hoden intakt und unbeschädigt bleiben, da Zellen aus beschädigten Hoden auslaufen und sich dadurch alle Zellen innerhalb des Organs bewegen (siehe Abbildung 5 und Video 2). Es kann immer noch möglich sein, Spermatozyten in beschädigten Hoden abzubilden, wenn die Zellen sich schließlich niederlassen und aufhören, sich zu bewegen, obwohl bis zu dem Zeitpunkt, zu dem dies geschieht, die Stadien der Meiose, die man zu analysieren beabsichtigt, bereits eingetreten sein kann. Darüber hinaus können Auswirkungen von Gewebeschäden auf den Zellteilungsprozess selbst nicht herabgelassen werden. Schäden an den Hoden können auftreten, wenn Fettkörper nach entfernung der Hoden von Larven entfernt werden. Daher ist sehr darauf zu achten, dass die Organe während dieses Schritts des Protokolls nicht durchbohrt oder zerren. In der Tat ist es oft nicht notwendig, sehr viel von den Fettkörpern zu entfernen, solange sie die Visualisierung der Hoden nicht verschleiern. Häufiger ist Hodenschäden das Ergebnis der Entfernung zu viel Kulturmedium nach der Platzierung des Coverslip während des Montageverfahrens für Live-Bildgebung (Schritt 3.6). Wenn das Medium entfernt wird, fällt der Deckelschlappe tiefer und übt Druck auf die Hoden aus, und überdruckwird, dass die Hoden brechen. Während es für den Coverslip wichtig ist, so nah wie möglich an den Hoden zu sein, um eine optimale Bildgebung der Spermatozyten zu erleichtern, ist es notwendig, dass einige Praktiken notwendig sind, um zu vermeiden, dass zu viel Medium entfernt wird und der Deckelrutsch zu weit gesenkt wird. Es ist auch hilfreich, darauf hinzuweisen, dass für einige Anwendungen, wie akute Exposition von Spermatozyten bei Medikamenten oder anderen kleinen Molekülen, es vorteilhaft sein kann, die Hoden zu stören und die Zysten von Spermatozyten für die Analyse zu dispergieren. Mehrere ausgezeichnete Protokolle sind für die Vorbereitung und Kultur der dispergierten Spermatozyten18,25verfügbar.

Eine wichtige Überlegung bei der Verwendung von Spermatozyten für die Zellteilungsanalyse ist, dass diese Zellen meiotisch im Gegensatz zu mitotischen Divisionen ausführen. Wichtig ist, dass viele der wesentlichen Aspekte der Zellteilungsmechanik, wie Spindelarchitektur und Zytokinese, zwischen männlicher Meiose und Mitose6ähnlich sind. So können mechanistische Erkenntnisse aus der Untersuchung von Spermatozyten-Meiose im Großen und Ganzen auf allgemeine Mechanismen der Tierzellteilung7anwendbar sein. Je nach den angesprochenen mechanistischen Fragen müssen jedoch wichtige Unterschiede zwischen Spermatozyten und mitotischen Zellen in Prozessen wie Chromosomendynamik und Zellzyklusregulation als26betrachtet werden. Gleichzeitig bieten Drosophila-Spermatozyten die einzigartige Gelegenheit, mitotische und meiotische Zellen innerhalb derselben Gewebe- und Keimbahnlinie zu vergleichen. Zum Beispiel kann die gleiche Hodenzubereitung verwendet werden, um Keimbahnstammzellen oder Spermatogonien zu analysieren, die sich einer Mitose und Spermatozyten unterziehender Meiose. Wir versuchen in der Regel nicht, Keimbahn Stammzelle oder Spermatogonialmilben in Live-Hodenpräparaten abzubilden, weil das Timing dieser Teilungen schwer vorherzusagen ist. Allerdings haben wir diese Teilungen in unseren Experimenten zufällig erfasst und gezeigt, dass das allgemeine Protokoll auch auf die Analyse von mitotischen Zellen in Hoden angewendet werden kann.

Die vorgestellte Methodik konzentriert sich auf die Testis-Vorbereitung für die Live-Bildgebung der Spermatozyten-Meiose, da dies eine Echtzeitanalyse der zellulären und molekularen Dynamik ermöglicht. Wir bieten auch ein Verfahren zur Fixierung und Immunfärbung intakter Hoden an, da dieser Ansatz vorzuziehen sein kann, wenn erforderliche fluoreszierend gekennzeichnete Expressionskonstrukte nicht verfügbar sind oder um verwirrende Effekte der Proteinüberexpression zu vermeiden. Eine wichtige Überlegung ist jedoch, dass die Fixierung nicht immer treu natives Gewebe und zelluläre Architektur bewahrt. Zum Beispiel haben wir und andere festgestellt, dass die Fixierung häufig zu einer Fragmentierung oder Störung der ER11,27führt. Einige dieser Probleme können durch die Verwendung verschiedener Fixative oder Gewebevorbereitungsmethoden gelindert werden, und einige Fehlerbehebungkanne kann daher notwendig sein, um das optimale Fixierungsprotokoll für die Erhaltung einer bestimmten Zellkomponente oder Proteinorganisation zu identifizieren. Glücklicherweise sind eine Reihe von zusätzlichen Protokollen für Drosophila Spermatozyten Fixierung auch verfügbar18,28,29.

Abschließend haben wir vielseitige Methoden zur Herstellung von Drosophila-Hoden für die Lebende und feste Zellanalyse der Spermatozyten-Meiose beschrieben. Zu den spezifischen Stärken dieses experimentellen Ansatzes gehören die Analyse der Zellteilung im intakten Gewebe, die hochauflösende Bildgebung großer Zellen und die Integration mit den genetischen Werkzeugen von Drosophila. Experimente, die die Methodik anwenden, haben das Potenzial, wichtige Beiträge zu unserem Verständnis der Integration der Zellteilung mit komplexen Mechanismen der Gewebeentwicklung und Homöostase zu leisten.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von Start-up-Mitteln des VERTEIDIGUNGSministeriums an J.T.S. unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5" Dissecting Probe Fisher 08-965-A
5.75" Glass Pasteur Pipet Fisher 13-678-20A
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher BP9703-100
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Straight forcepts with fine tips
Frosted Microscope Slides Fisher 12-544-2 Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface
Halocarbon oil 700 Sigma H8898-100 mL
Lumox Dish 50 Sarstedt SAR946077410 Gas-permeable tissue culture dish
Microscope Cover Glass Fisher 12-541-B 22 mm x 22 mm, #1.5 glass coverslip
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-15 Insect pins used to make scalpel tool
Nickel Plated Pin Holder Fine Science Tools 26018-17
Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade Electron Microsocopy Sciences 15714
Plan Beveled Edge Microscope Slides Fisher 12-549-5 Slides used for dissections
PYREX Spot Plates Fisher 13-748B 9-well glass dissecting dish
Schneider's Drosophila medium Fisher 21720-024
Syringe Filter, 0.22 µm EMD Millipore SLGS033SB
Triton X-100 Fisher BP151-500
Vectashield Vector Labs H-1000 Microscopy mounting medium

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Entwicklungsbiologie Ausgabe 159 Drosophila Spermatozyten Hoden Mitose Meiose Zellteilung Mikrotubuli Spindel endoplasmatisches Retikulum
Vorbereitung von <em>Drosophila</em> Larval und Pupal Hoden für die Analyse der Zellteilung in Leben, intaktes Gewebe
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Karabasheva, D., Smyth, J. T.… More

Karabasheva, D., Smyth, J. T. Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue. J. Vis. Exp. (159), e60961, doi:10.3791/60961 (2020).

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