Vorbereitung von Drosophila Larval und Pupal Hoden für die Analyse der Zellteilung in Leben, intaktes Gewebe

Summary

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Zellteilung im intakten Gewebe durch lebende und feste Zellmikroskopie mit Drosophila meiotischen Spermatozyten zu analysieren. Das Protokoll zeigt, wie ganze, intakte Hoden von Drosophila-Larven und frühen Pupas isoliert und wie man sie für die Mikroskopie verarbeitet und montiert.

Abstract

Die experimentelle Analyse von Zellen, die sich in lebenden, intakten Geweben und Organen teilen, ist für unser Verständnis der Integration von Zellteilung in Entwicklung, Gewebehomöostase und Krankheitsprozesse von wesentlicher Bedeutung. Drosophila Drosophila-Spermatozyten, die sich einer Meiose unterziehen, sind ideal für diese Analyse, da (1) ganze Drosophila-Hoden, die Spermatozyten enthalten, relativ einfach auf die Mikroskopie vorbereitet werden können, (2) die größe der Spermatozyten macht sie gut für hochauflösende Bildgebung geeignet, und (3) leistungsstarke Drosophila-Genwerkzeuge können in die In-vivo-Analyse integriert werden. Hier präsentieren wir ein leicht zugängliches Protokoll zur Herstellung ganzer Hoden aus Drosophila dritten Instar Larven und frühen Pupae. Wir beschreiben, wie man meiotische Spermatozyten in vorbereiteten ganzen Hoden identifiziert und wie man sie live durch Zeitraffermikroskopie abbilden kann. Protokolle zur Fixierung und Immunfärbung ganzer Hoden werden ebenfalls zur Verfügung gestellt. Die Verwendung von Larvenhoden hat mehrere Vorteile gegenüber verfügbaren Protokollen, die erwachsene Hoden für die Spermatozytenanalyse verwenden. Am wichtigsten ist, Larvenhogen sind kleiner und weniger mit Zellen als erwachsene Hoden überfüllt, und dies erleichtert stark hochauflösende Bildgebung von Spermatozyten. Um diese Vorteile und die Anwendung der Protokolle zu demonstrieren, präsentieren wir Ergebnisse, die die Umverteilung des endoplasmatischen Retikulums in Bezug auf Spindelmikrotubuli während der Zellteilung in einem einzigen Spermatozyten zeigen, das durch zeitraffende konfokale Mikroskopie dargestellt wird. Die Protokolle können mit der Expression einer beliebigen Anzahl von fluoreszierend markierten Proteinen oder Organellenmarkern sowie Genmutationen und anderen genetischen Werkzeugen kombiniert werden, was diesen Ansatz besonders leistungsfähig für die Analyse von Zellteilungsmechanismen im physiologischen Kontext ganzer Gewebe und Organe macht.

Introduction

Die Zellteilung wird häufig mit Zelllinien untersucht, die in Kultur¹gewachsen sind. Während wir aus diesen Studien eine Fülle von unschätzbaren Erkenntnissen und Verständnis grundlegender Mechanismen gewonnen haben², können Zellen, die in der Kultur angebaut werden, die Physiologie der Zellteilung nicht vollständig rekapitulieren, wie sie in intaktem, lebendem Gewebe vorkommt. Zum Beispiel müssen sich die Zellen in intakten Geweben und Organen an der richtigen Stelle und zur richtigen Zeit teilen, damit sich die Vorläuferzellen richtig im Gewebe befinden, so dass sie sich einer angemessenen Differenzierung oder funktionellen Programmen unterziehen können, und damit die Zellproliferation richtig mit dem Gewebewachstum oder der Homöostase³koordiniert wird. Bei Zellen, die in der Kultur angebaut werden, wird die Zellteilung im Allgemeinen durch Wachstumsfaktoren im Kulturmedium⁴reguliert, und daher können wir aus diesen Zellen nicht lernen, wie in vivo Umweltfaktoren wie Gewebearchitektur oder Entwicklungssignalisierung den Teilungsprozess beeinflussen. Es ist auch wichtig zu beachten, dass viele der Zelllinien, die zur Untersuchung der Zellteilung verwendet wurden, wie HeLa- und U2OS-Zellen, von metastasierenden Tumoren abgeleitet wurden⁵. Daher wurden viele Aspekte der grundlegenden Physiologie dieser Krebszellen, wie die Regulierungsmechanismen des Zellzyklus und die Chromosomenstabilität, wahrscheinlich im Vergleich zu gesunden Zellen verändert. Ein vollständiges Verständnis der Physiologie der Zellteilung hängt daher von unserer Fähigkeit ab, teilende Zellen in ihren nativen In-vivo-Umgebungen zu untersuchen, die physiologische Regulierungsmechanismen und Gewebearchitektur erhalten.

Fortschritte beim Verständnis der Funktionsweise der Zellteilung in intakten Geweben und Organen werden durch Schwierigkeiten behindert, die der In-vivo- oder Ex-vivo-Analyse innewohnen. Erstens kann es schwierig oder unmöglich sein, auf Trennzellen für mikroskopische Analysen in großen Organen oder dicken Geweben zuzugreifen. Zweitens ist es oft schwierig vorherzusagen, wann sich einzelne Zellen in vivo teilen. Drittens kann sich die Gewebephysiologie während der Ex-vivo-Kultur rapide verschlechtern. In diesem Protokoll beschreiben wir leicht zugängliche Methoden für die lebende und feste Analyse von Drosophila melanogaster Spermatozyten, während sie meiotische Zellteilungen innerhalb vollständig intakter Hoden durchlaufen. Diese Zellen sind ideal für livee Ex-vivo-Analysen, da sie mit optischen Standardmethoden wie konfokaler Mikroskopie leicht zugänglich sind, sie teilen sich zu vorhersagbaren Zeiten und Orten und intakte Hoden können in ex vivo-Kultur bis zu etwa 24 h aufrechterhalten werden. Darüber hinaus sind Drosophila-Spermatozyten große runde Zellen (ca. 20–30 m Durchmesser), die ihre Form nicht ändern, wenn sie sich teilen, was sie ideal für die hochauflösende Zeitraffer-Bildgebung von zellulären Komponenten wie dem Spindelapparat und zytoplasmatischen Organellen macht. Obwohl diese Zellen im Gegensatz zur Mitose einer Meiose unterzogen werden, sind viele der wesentlichen Zellteilungsprozesse zwischen diesen beiden Zellteilungsmechanismen sehr ähnlich⁶. Diese Vorteile, kombiniert mit leistungsstarken Drosophila genetischen Werkzeugen, haben Drosophila Spermatozyten zu einem ausgiebig verwendeten Modell für die Ex-vivo-Analyse von wesentlichen Zellteilungsprozessen einschließlich Spindelbildung und -regulierung, Zytokinese und Organelle-Umbau und Partitionierung^7,8,9,10,11.

Spermatozyten sind Zellen, die sich im meiotischen Stadium der Spermatogenese befinden. In Drosophilabeginnt die Spermatogenese mit einer Gruppe von Keimbahnstammzellen, die sich in einer kleinen Region befinden oder an einem Pol des^Hoden12,13” “Hub” sind. Diese Zellen teilen sich durch eine asymmetrische Mitose, wodurch ein einziges differenziertes Spermatogonium entstand. Spermatogonie unterzieht sich dann vier synchronen Milben, um eine Gruppe von 16 Zellen zu produzieren, die eng innerhalb einer einzigen Zyste verbunden bleiben. In diesem Stadium, die Zellen Übergang von einem mitotischen zu einem meiotischen Zellzyklus und werden als Spermatozyten bezeichnet. Spermatozyten verbringen etwa zwei bis drei Tage in einer verlängerten G2-Phase des Zellzyklus, in der sie dramatisch wachsen und zytologische Veränderungen in Vorbereitung auf die beiden meiotischen Teilungen und die anschließende Spermiogenese^13,14durchlaufen. Die gesamte Gruppe von 16 Spermatozyten innerhalb einer einzigen Zyste tritt dann gleichzeitig in die erste meiotische Teilung ein. So können mehrere meiotische Spermatozyten gleichzeitig abgebildet werden, während sie durch die Zellteilung verlaufen. Die erste meiotische Teilung dauert ca. 1,5 h und wird fast sofort von der zweiten meiotischen Division gefolgt, die insgesamt 64 Spermatoide ergibt, die sich in reife Spermatozoen differenzieren.

Ein einzigartiger Vorteil der Verwendung von Spermatozyten zur Untersuchung der Zellteilung im lebenden, intakten Gewebe besteht darin, dass Gruppen oder Zysten von Zellen ständig durch die verschiedenen Stadien der Spermatogenese fortschreiten und Zellen in allen Stadien der Spermatogenese in der Regel in jedem gegebenen Hoden identifiziert werden können (siehe Abbildung 3A). Daher ist es relativ einfach, meiotische Zellen in ganzen Hoden zu finden. Wir konzentrieren unsere Analysen in der Regel auf die erste statt auf die zweite Meiose, da diese Zellen viel größer und für hochauflösende Bildgebung zugänglicher sind, aber der gesamte Prozess, der beide meiotischen Divisionen umfasst, kann erfolgreich abgebildet werden. Es sollte auch angemerkt werden, dass das allgemeine Protokoll für Hodenvorbereitung und Kultur verwendet werden kann, um andere Prozesse der Spermatogenese zu analysieren, wie die früheren mitotischen Stammzellen oder Spermatogonial-Divisionen oder die zytologischen Veränderungen, die auftreten, wenn Spermatozoen zu Spermatozoen¹⁵reifen. Viele dieser Aspekte der Spermatogenese sind hoch konserviert zwischen Drosophila und Menschen¹⁶.

Drosophila Spermatozyten beginnen, die meiotische Phase der Spermatogenese während der dritten Instar Larvenstadium der Drosophila Entwicklung zu erreichen¹³. Daher können Hoden, die von Lebenszyklusstadien isoliert sind, beginnend mit dritten Instarlarven und einschließlich Pupas und Erwachsenen, für die Analyse der Teilung von Spermatozyten verwendet werden. Mehrere ausgezeichnete Protokolle sind für die Extraktion von Hoden von erwachsenen männlichen Fliegen für lebende und feste Analyse der Spermatogenese^17,18,19. Diese Protokolle können für die Untersuchung von späten Stadien der Spermatogenese vorzuziehen sein oder wenn genetische Marker verwendet werden müssen, die nur bei Erwachsenen sichtbar sind. Das Protokoll konzentriert sich stattdessen auf die Testis-Vorbereitung von Larven und frühen Pupas, da Tests in diesen Stadien mehrere Vorteile haben, die speziell für die Zellteilungsanalyse durch hochauflösende Zeitraffermikroskopie relevant sind. Erstens sind Hoden von Larven und Pupae kleiner als die von Erwachsenen, und die Zellen im Organ sind weniger überfüllt. Aus diesem Grund können die geteilten Spermatozyten oft in der Nähe der äußeren Oberfläche von Larvenhoden abgebildet werden, ohne durch mehrere Schichten von Lichtstreugewebe eindringen zu müssen. Zweitens bewegen sich erwachsene Hoden rhythmisch aufgrund von Kontraktionen der angeschlossenen Zubehörorgane, und diese Bewegungen machen die Zeitraffer-Bildgebung einzelner Zellen schwierig. Und drittens sind Larvenhoden vorteilhaft, wenn genmutationen untersucht werden, die pupal oder adulte Letalität verursachen. Unsere Methoden sind für die Langzeitkultur der Hoden auf der Mikroskopstufe optimiert, so dass mehrere Runden der Zellteilung oder das Fortschreiten einzelner Zellen durch mehrere Stadien der Spermatogenese in der gleichen Präparation geographiert werden können. Wir beschreiben auch ein Protokoll zur Fixierung und Immunfärbung ganzer Hoden. Insgesamt sind unsere Protokolle besonders nützlich für diejenigen, die an der Untersuchung der Zellteilung in intaktem Gewebe interessiert sind, und die Fähigkeit, Spermatozytenanalysen mit hochgradig retrierbaren Drosophila-Genwerkzeugen zu kombinieren, macht dies zu einem besonders leistungsfähigen Ansatz.

Protocol

1. Bereiten Sie Tiere, Werkzeuge und Medien auf die Zerlegung vor Kreuz männliche und weibliche Fliegen, um Nachkommen des gewünschten Genotyps zu erhalten. Nützliche transgene Marker zur Identifizierung und Inszenierung von meiotischen Spermatozyten sind GFP-Tubulin zur Kennzeichnung der meiotischen Spindel und RFP-Histon 2A zur Kennzeichnung von Chromsomen8. Verwenden Sie fünf bis zehn Weibchen pro Kreuz und pflegen Kreuze auf Standard-Fliegenfutter in Fläschchen in einem 25 °C I…

Representative Results

Wenn dieses Protokoll erfolgreich ausgeführt wird, bleiben die Tests für die Bildgebung durch konfokale Mikroskopie oder andere Fluoreszenzmikroskopiemethoden vollständig intakt. Wie in Abbildung 3Azu sehen, bleibt die zelluläre Organisation der Hoden erhalten, und das Fortschreiten der Zelldifferenzierung von einem Ende des Hodens zum anderen, einschließlich Spermatogonie, Spermatozyten und haploiden Spermatoiden, ist sichtbar. GFP-Tubulin ist ein nützlicher Marker zur Identifizierung…

Discussion

Wir haben ein Protokoll zur Herstellung von Larven- oder frühen Pupal-Drosophila-Hoden beschrieben, das für die langfristige, live bildende Zellteilung von Spermatozyten-Zellen optimiert ist. Dies ist eine leistungsfähige Methode zur Analyse der Zellteilung im physiologischen Kontext intakten Gewebes. Die Leistungsfähigkeit dieser Methode wird in Kombination mit den genetischen Werkzeugen von Drosophila, wie z. B. spezifischen Genmutationen, gewebespezifischer RNAi-vermittelter Unterdrückung und fl…

Materials

5" Dissecting Probe	Fisher	08-965-A
5.75" Glass Pasteur Pipet	Fisher	13-678-20A
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher	BP9703-100
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Straight forcepts with fine tips
Frosted Microscope Slides	Fisher	12-544-2	Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface
Halocarbon oil 700	Sigma	H8898-100 mL
Lumox Dish 50	Sarstedt	SAR946077410	Gas-permeable tissue culture dish
Microscope Cover Glass	Fisher	12-541-B	22×22 mm, #1.5 glass coverslip
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-15	Insect pins used to make scalpel tool
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26018-17
Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade	Electron Microsocopy Sciences	15714
Plan Beveled Edge Microscope Slides	Fisher	12-549-5	Slides used for dissections
PYREX Spot Plates	Fisher	13-748B	9-well glass dissecting dish
Schneider's Drosophila medium	Fisher	21720-024
Syringe Filter, 0.22 µm	EMD Millipore	SLGS033SB
Triton X-100	Fisher	BP151-500
Vectashield	Vector Labs	H-1000	Microscopy mounting medium