Preparación de pruebas de larvas y pupales de Drosophila para el análisis de la división celular en vivo, tejido intacto
Summary
El objetivo de este protocolo es analizar la división celular en tejido intacto mediante microscopía celular viva y fija utilizando esperamorcitos meióticos Drosophila. El protocolo demuestra cómo aislar testículos enteros e intactos de larvas de Drosophila y pusias tempranas, y cómo procesarlos y montarlos para microscopía.
Abstract
El análisis experimental de las células que se dividen en tejidos y órganos vivos y intactos es esencial para nuestra comprensión de cómo la división celular se integra con el desarrollo, la homeostasis tisular y los procesos de la enfermedad. Los espermatocitos drosofílicos sometidos a meiosis son ideales para este análisis porque (1) los testículos enteros de Drosophila que contienen espermatocitos son relativamente fáciles de preparar para la microscopía, (2) el gran tamaño de los espermatocitos los hace muy adecuados para imágenes de alta resolución, y (3) potentes herramientas genéticas de Drosophila se pueden integrar con el análisis in vivo. Aquí, presentamos un protocolo de fácil acceso para la preparación de testículos enteros de larvas drosophila tercera instar y pupupas tempranas. Describimos cómo identificar esperamorcitos meióticos en testículos enteros preparados y cómo imaginarlos vivir por microscopía de lapso de tiempo. También se proporcionan protocolos para la fijación e inmunostainización de testículos enteros. El uso de testículos larvales tiene varias ventajas sobre los protocolos disponibles que utilizan testículos adultos para el análisis de espermatocitos. Lo más importante es que los testículos larvales son más pequeños y menos llenos de células que los testículos adultos, y esto facilita en gran medida la toma de imágenes de alta resolución de los espermatocitos. Para demostrar estas ventajas y las aplicaciones de los protocolos, presentamos resultados que muestran la redistribución del retículo endoplasmático con respecto a los microtúbulos del husillo durante la división celular en un solo espertacito que se muestra mediante microscopía confocal de lapso de tiempo. Los protocolos se pueden combinar con la expresión de cualquier número de proteínas etiquetadas fluorescentes u marcadores de orgánulos, así como mutaciones genéticas y otras herramientas genéticas, haciendo que este enfoque sea especialmente potente para el análisis de los mecanismos de división celular en el contexto fisiológico de tejidos y órganos enteros.
Introduction
La división celular se estudia a menudo utilizando líneas celulares cultivadas en el cultivo1. Si bien hemos obtenido una gran cantidad de información y comprensión inestimables de los mecanismos fundamentales de estos estudios2, las células cultivadas en el cultivo no pueden recapitular completamente la fisiología de la división celular como ocurre en el tejido vivo intacto. Por ejemplo, en los tejidos y órganos intactos, las células deben dividirse en el lugar correcto y en el momento adecuado para que las células de la progenie estén adecuadamente situadas dentro del tejido, de modo que puedan someterse a una adecuada diferenciación o programas funcionales, y para que la proliferación celular esté adecuadamente coordinada con el crecimiento tisular o la homeostasis3. En el caso de las células cultivadas en cultivo, por otro lado, la división celular está generalmente regulada por factores de crecimiento en el medio de cultivo4,y por lo tanto no podemos aprender de estas células cómo factores ambientales in vivo como la arquitectura de tejidos o la señalización del desarrollo influyen en el proceso de división. También es importante tener en cuenta que muchas de las líneas celulares utilizadas para estudiar la división celular, como las células HeLa y U2OS, se derivaron de tumores metastásicos5. Por lo tanto, muchos aspectos de la fisiología básica de estas células cancerosas, como los mecanismos reguladores del ciclo celular y la estabilidad cromosómica, probablemente han sido alterados en comparación con las células sanas. La comprensión completa de la fisiología de la división celular, por lo tanto, depende de nuestra capacidad para estudiar células divisorias en sus entornos nativos in vivo que preservan los mecanismos reguladores fisiológicos y la arquitectura de los tejidos.
Los avances en la comprensión de cómo funciona la división celular dentro de los tejidos y órganos intactos se ven obstaculizados por dificultades inherentes al análisis in vivo o ex vivo. En primer lugar, puede ser difícil o imposible acceder a las células divisorias para el análisis microscópico dentro de órganos grandes o tejidos gruesos. En segundo lugar, a menudo es difícil predecir cuándo las células individuales se dividirán in vivo. En tercer lugar, la fisiología tisular puede deteriorarse rápidamente durante el cultivo ex vivo. En este protocolo, describimos métodos fácilmente accesibles para el análisis en vivo y fijo de los espermatocitos Drosophila melanogaster a medida que se someten a divisiones celulares meióticas dentro de testículos totalmente intactos. Estas células son ideales para el análisis vivo y ex vivo porque son fácilmente accesibles con métodos ópticos estándar como la microscopía confocal, se dividen en momentos y ubicaciones predecibles, y los testículos intactos se pueden mantener en cultivo ex vivo durante aproximadamente 24 horas. Además, los espermatocitos Drosophila son células redondas grandes (aproximadamente de 20 a 30 m de diámetro) que no cambian de forma cuando se dividen, por lo que son ideales para imágenes de alta resolución y lapso de tiempo de componentes celulares como el aparato del husillo y los orgánulos citoplasma. Aunque estas células sufren meiosis en comparación con la mitosis, muchos de los procesos esenciales de división celular son muy similares entre estos dos mecanismos de división celular6. Estas ventajas, combinadas con potentes herramientas genéticas Drosophila, han hecho de los espermatocitos Drosophila un modelo ampliamente utilizado para el análisis ex vivo de procesos esenciales de división celular incluyendo la formación y regulación de husillos, la citokinesis, y la remodelación y partición de orgánulos7,,8,9,,10,11.
Los espermacitos son células que se encuentran en la etapa meiótica de la espermatogénesis. En Drosophila,la espermatogénesis comienza con un grupo de células madre germinales que se encuentran en una pequeña región o “hub” en un polo del testículo12,,13. Estas células se dividen por una mitosis asimétrica, dando lugar a un solo espermatogonio diferenciado. Luego, la espermatogonia se somete a cuatro mitosis síncronas para producir un grupo de 16 células que permanecen estrechamente asociadas dentro de un solo quiste. En esta etapa, las células pasan de un ciclo celular mitético a un ciclo celular meiótico y se conocen como espermatocitos. Los espermacitos pasan alrededor de dos a tres días en una etapa G2 extendida del ciclo celular, durante la cual crecen dramáticamente y experimentan cambios citológicos en la preparación para las dos divisiones meióticas y posterior espermiogénesis13,,14. Todo el grupo de 16 espermatocitos dentro de un solo quiste entonces entra en la primera división meiótica al mismo tiempo. Por lo tanto, varios esperamorcitos meióticos se pueden crear imágenes simultáneamente a medida que avanzan a través de la división celular. La primera división meiótica continúa durante aproximadamente 1,5 h y es seguida casi inmediatamente por la segunda división meiótica, produciendo 64 espermatozoides totales que pasan a diferenciarse en espermatozoides maduros.
Una ventaja única de usar espermacitos para estudiar la división celular en vivo, tejido intacto es que los grupos o quistes de las células progresan constantemente a través de las diferentes etapas de la espermatogénesis, y las células en todas las etapas de la espermatogénesis generalmente se pueden identificar en cualquier testículo dado (ver Figura 3A). Por lo tanto, es relativamente fácil encontrar células meióticas en testículos enteros. Por lo general, centramos nuestros análisis en la primera en lugar de la segunda meiosis porque estas células son mucho más grandes y más susceptibles a las imágenes de alta resolución, pero todo el proceso que abarca ambas divisiones meióticas se puede tomar imágenes con éxito. También debe tenerse en cuenta que el protocolo general para la preparación y el cultivo de testículos se puede utilizar para analizar otros procesos de espermatogénesis, así, como la célula madre mitotica anterior o divisiones espermatogoniales o los cambios citológicos que se producen a medida que los espermatozoides maduran en espermatozoides15. Muchos de estos aspectos de la espermatogénesis están muy conservados entre Drosophila y los seres humanos16.
Los espermatocitos drosófilos comienzan a alcanzar la fase meiótica de la espermatogénesis durante la tercera etapa larval instar del desarrollo de Drosophila 13. Por lo tanto, los testículos aislados de las etapas del ciclo de vida a partir de larvas de tercera estrella e incluyendo pupas y adultos se pueden utilizar para el análisis de la división de espermacitos. Varios protocolos excelentes están disponibles para la extracción de testículos de moscas macho adultas para análisis vivos y fijos de espermatogénesis17,18,19. Estos protocolos pueden ser preferibles para estudiar etapas tardías de la espermatogénesis o si se deben utilizar marcadores genéticos que solo son visibles en adultos. El protocolo se centra en cambio en la preparación de testículos a partir de larvas y pupae tempranas, porque los testículos en estas etapas tienen varias ventajas que son específicamente pertinentes para el análisis de la división celular por microscopía de lapso de tiempo de alta resolución. En primer lugar, los testículos de larvas y pusias son más pequeños que los de adultos, y las células dentro del órgano están menos llenas. Debido a esto, los espermismocitos divisorios a menudo se pueden tomar imágenes cerca de la superficie externa de los testículos larvales, sin tener que penetrar a través de múltiples capas de tejido de dispersión de luz. En segundo lugar, los testículos adultos se mueven rítmicamente debido a las contracciones de los órganos accesorios conectados, y estos movimientos hacen que la toma de imágenes de lapso de tiempo de células individuales sea un desafío. Y en tercer lugar, los testículos larvales son ventajosos cuando se estudian mutaciones genéticas que causan letalidad pupal o adulta. Nuestros métodos están optimizados para el cultivo a largo plazo de testículos en la etapa del microscopio, lo que permite la toma de imágenes de múltiples rondas de división celular o la progresión de células individuales a través de múltiples etapas de espermatogénesis en la misma preparación. También describimos un protocolo para la fijación y la inmunomanchación de testículos enteros. En general, nuestros protocolos son particularmente útiles para aquellos interesados en estudiar la división celular en tejido intacto, y la capacidad de combinar el análisis de espermatocitos con herramientas genéticas Drosophila altamente manejables hace de este un enfoque especialmente poderoso.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos descrito un protocolo para la preparación de testículos de Drosophila pupálida larvales o tempranas, optimizado para imágenes en vivo a largo plazo de la división celular de los espermatozoides. Este es un método poderoso para el análisis de la división celular en el contexto fisiológico del tejido intacto. El poder de este método se expande aún más cuando se combina con herramientas genéticas drosofílicas, como mutaciones genéticas específicas, supresión mediada por ARN específi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por fondos iniciales del Departamento de Defensa para J.T.S.
Materials
| 5" Dissecting Probe | Fisher | 08-965-A | |
| 5.75" Glass Pasteur Pipet | Fisher | 13-678-20A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Straight forcepts with fine tips |
| Frosted Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100 mL | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | SAR946077410 | Gas-permeable tissue culture dish |
| Microscope Cover Glass | Fisher | 12-541-B | 22×22 mm, #1.5 glass coverslip |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-15 | Insect pins used to make scalpel tool |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade | Electron Microsocopy Sciences | 15714 | |
| Plan Beveled Edge Microscope Slides | Fisher | 12-549-5 | Slides used for dissections |
| PYREX Spot Plates | Fisher | 13-748B | 9-well glass dissecting dish |
| Schneider's Drosophila medium | Fisher | 21720-024 | |
| Syringe Filter, 0.22 µm | EMD Millipore | SLGS033SB | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Microscopy mounting medium |
References
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38 (1), 2-16 (2006).
- Ong, J. Y., Torres, J. Z. Dissecting the mechanisms of cell division. The Journal of Biological Chemistry. 294 (30), 11382-11390 (2019).
- Levine, E. M. Cell cycling through development. Development. 131 (10), 2241-2246 (2004).
- Gross, S. M., Rotwein, P. Unraveling Growth Factor Signaling and Cell Cycle Progression in Individual Fibroblasts. The Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14628-14638 (2016).
- Mittelman, D., Wilson, J. H. The fractured genome of HeLa cells. Genome Biology. 14 (4), 111 (2013).
- Bury, L., Coelho, P. A., Glover, D. M. From Meiosis to Mitosis: The Astonishing Flexibility of Cell Division Mechanisms in Early Mammalian Development. Current Topics in Developmental Biology. 120, 125-171 (2016).
- Giansanti, M. G., Fuller, M. T. What Drosophila spermatocytes tell us about the mechanisms underlying cytokinesis. Cytoskeleton. 69 (11), 869-881 (2012).
- Karabasheva, D., Smyth, J. T. A novel, dynein-independent mechanism focuses the endoplasmic reticulum around spindle poles in dividing Drosophila spermatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 12456 (2019).
- Polevoy, G., et al. Dual roles for the Drosophila PI 4-kinase four wheel drive in localizing Rab11 during cytokinesis. Journal of Cell Biology. 187 (6), 847-858 (2009).
- Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes. PLoS Biology. 2 (1), 8 (2004).
- Smyth, J. T., Schoborg, T. A., Bergman, Z. J., Riggs, B., Rusan, N. M. Proper symmetric and asymmetric endoplasmic reticulum partitioning requires astral microtubules. Open Biology. 5 (8), (2015).
- Demarco, R. S., Eikenes, &. #. 1. 9. 7. ;. H., Haglund, K., Jones, D. L. Investigating spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), 218-227 (2014).
- Fuller, M. T., Bate, M., Martinez-Arias, A. . The Development of Drosophila melanogaster. , 71-147 (1993).
- Dunleavy, E. M., et al. The Cell Cycle Timing of Centromeric Chromatin Assembly in Drosophila Meiosis Is Distinct from Mitosis Yet Requires CAL1 and CENP-C. PLOS Biology. 10 (12), 1001460 (2012).
- Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2 (3), 197-212 (2012).
- Ramm, S. A., Scharer, L., Ehmcke, J., Wistuba, J. Sperm competition and the evolution of spermatogenesis. Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1169-1179 (2014).
- Savoian, M. S. Microscopy Methods for Analysis of Spindle Dynamics in Meiotic Drosophila Spermatocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 265-276 (2017).
- Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological analysis of spermatogenesis: live and fixed preparations of Drosophila testes. Journal of Visualized Experiments. (83), e51058 (2014).
- Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).
- Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live imaging of Drosophila larval neuroblasts. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
- Belloni, G., et al. Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis. Journal of Cell Science. 125 (22), 5441-5452 (2012).
- Harel, A., et al. Persistence of major nuclear envelope antigens in an envelope-like structure during mitosis in Drosophila melanogaster embryos. Journal of Cell Science. 94 (3), 463-470 (1989).
- Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components. Mol Biol Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).
- Tates, A. D. . Cytodifferentiation during spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An electron microscope study. , (1971).
- Gartner, S. M., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment. Journal of Visualized Experiments. (91), 51868 (2014).
- Ohkura, H. Meiosis: an overview of key differences from mitosis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7 (5), (2015).
- Friedman, J. R., Webster, B. M., Mastronarde, D. N., Verhey, K. J., Voeltz, G. K. ER sliding dynamics and ER-mitochondrial contacts occur on acetylated microtubules. Journal of Cell Biology. 190 (3), 363-375 (2010).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Methanol-acetone fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1270-1272 (2011).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 102-104 (2012).
