Beredning av Drosophila Larval och Pupal Testes för analys av celldelning i levande, intakt vävnad

Summary

Målet med detta protokoll är att analysera celldelning i intakt vävnad genom levande och fast cellmikroskopi med drosophila meiotic spermatocyter. Protokollet visar hur man isolerar hela, intakta testiringar från Drosophila larver och tidiga puppor, och hur man bearbetar och monterar dem för mikroskopi.

Abstract

Experimentell analys av celler som delar sig i levande, intakta vävnader och organ är avgörande för vår förståelse av hur celldelning integreras med utveckling, vävnadhomeostas och sjukdomsprocesser. Drosophila spermatocyter som genomgår meios är idealiska för denna analys eftersom (1) hela Drosophila testier som innehåller spermatocyter är relativt lätt att förbereda för mikroskopi, (2) spermatocyternas stora storlek gör dem väl lämpade för högupplöst avbildning, och (3) kraftfulla Drosophila genetiska verktyg kan integreras med in vivo analys. Här presenterar vi ett lättillgängligt protokoll för beredning av hela testi, från Drosophila tredje instar larver och tidiga puppor. Vi beskriver hur man identifierar meiotiska spermatocyter i förberedda hela testiklarna och hur man bild dem lever genom time-lapse mikroskopi. Protokoll för fixering och immunfläckande hela testikel tillhandahålls också. Användningen av larvtestes har flera fördelar jämfört med tillgängliga protokoll som använder vuxna testiklar för spermatocyteanalys. Viktigast av allt, larv testiklar är mindre och mindre trångt med celler än vuxna testiklar, och detta underlättar kraftigt högupplöst bildbehandling av spermatocyter. För att visa dessa fördelar och tillämpningarna av protokollen presenterar vi resultat som visar omfördelningen av endoplasmatiska reticulum med avseende på spindelmikrotgranskar under celldelning i en enda spermatocyte avbildad av time-lapse confocal mikroskopi. Protokollen kan kombineras med uttryck för valfritt antal fluorescerande taggade proteiner eller organellmarkörer, samt genmutationer och andra genetiska verktyg, vilket gör detta tillvägagångssätt särskilt kraftfullt för analys av celldelningsmekanismer i det fysiologiska sammanhanget av hela vävnader och organ.

Introduction

Celldelning studeras ofta med hjälp av cellinjer som odlas i kultur¹. Även om vi har fått en mängd ovärderlig insikt och förståelse för grundläggande mekanismer från dessa studier^2,celler som odlas i kultur kan inte helt rekapitulera fysiologi celldelning som det förekommer i intakt, levande vävnad. Till exempel, i intakta vävnader och organ, celler måste dela på rätt plats och vid rätt tidpunkt så att avkomma celler är korrekt belägna i vävnaden, så att de kan genomgå lämplig differentiering eller funktionella program, och så att cellproliferation är ordentligt samordnad med vävnadstillväxt eller homeostas³. För celler som odlas i kultur å andra sidan regleras celldelning i allmänhet av tillväxtfaktorer i odlingsmediet⁴, och därför kan vi inte lära oss av dessa celler hur in vivo miljöfaktorer såsom vävnadsarkitektur eller utvecklingssignalering påverkar delningsprocessen. Det är också viktigt att notera att många av de cellinjer som används för att studera celldelning, såsom HeLa och U2OS celler, härstammar från ögonbevarande tumörer⁵. Därför har många aspekter av dessa cancercellers grundläggande fysiologi, såsom regleringsmekanismer för cellcykler och kromosomal stabilitet, sannolikt ändrats jämfört med friska celler. Fullständig förståelse av celldelning fysiologi, därför beror på vår förmåga att studera dela celler i sina inhemska, in vivo miljöer som bevarar fysiologiska regleringsmekanismer och vävnad arkitektur.

Framsteg när det gäller att förstå hur celldelningen fungerar inom intakta vävnader och organ hämmas av svårigheter som är inneboende i in vivo- eller ex vivo-analys. För det första kan det vara svårt eller omöjligt att komma åt dela celler för mikroskopisk analys inom stora organ eller tjocka vävnader. För det andra är det ofta svårt att förutsäga när enskilda celler kommer att dela in vivo. För det tredje kan vävnad fysiologi snabbt försämras under ex vivo kultur. I detta protokoll beskriver vi lättillgängliga metoder för levande och fast analys av Drosophila melanogaster spermatocyter som de genomgår meiotic cell divisioner inom helt intakta testiklarna. Dessa celler är idealiska för levande, ex vivo analys eftersom de är lättillgängliga med standard optiska metoder såsom konfokalmikroskopi, de delar på förutsägbara tider och platser, och intakta testiklar kan upprätthållas i ex vivo kultur i upp till ca 24 h. Dessutom är Drosophila spermatocyter stora runda celler (cirka 20–30 μm i diameter) som inte ändrar form när de delar sig, vilket gör dem idealiska för hög upplösning, time-lapse-avbildning av cellulära komponenter som spindelapparaten och cytoplasmatiska organeller. Även om dessa celler genomgår meios i motsats till mitos, många av de väsentliga celldelningsprocesser är mycket lika mellan dessa två celldelningsmekanismer⁶. Dessa fördelar, i kombination med kraftfulla Drosophila genetiska verktyg, har gjort Drosophila spermatocyter en omfattande modell för ex vivo analys av viktiga celldelning processer inklusive spindel bildning och reglering, cytokinesi, och organell remodeling och partitionering^7,8,,9,10,11.

Spermatocyter är celler som är i det meiotiska stadiet av spermatogenes. I Drosophilabörjar spermatogenesen med en grupp stamceller som finns i en liten region eller “nav” vid en pol i^{testikot 12,13}. Dessa celler delar sig av en asymmetrisk mitos, vilket ger upphov till ett enda differentierat spermatogonium. Spermatogonia genomgår sedan fyra synkrona mitoser att producera en grupp av 16 celler som förblir nära associerade inom en enda cysta. I detta skede, cellerna övergången från en mitotisk till en meiotisk cell cykel och kallas spermatocyter. Spermatocyter tillbringar ungefär två till tre dagar i ett utökat G2-steg i cellcykeln, under vilken de växer dramatiskt och genomgår cytologiska förändringar som förberedelse för de två meiotiska divisionerna och efterföljande spermiogenesis^13,14. Hela gruppen av 16 spermatocyter inom en enda cysta går sedan in i den första meiotiska divisionen samtidigt. Således kan flera meiotiska spermatocyter avbildas samtidigt som de fortsätter genom celldelning. Den första meiotiska divisionen fortsätter för ca 1,5 h och följs nästan omedelbart av den andra meiotiska divisionen, vilket ger 64 totala spermatider som går på att skilja sig till mogna spermatozoa.

En unik fördel med att använda spermatocyter för att studera celldelning i levande, intakt vävnad är att grupper eller cystor av celler ständigt utvecklas genom de olika stadierna av spermatogenes, och celler i alla stadier av spermatogenes kan vanligtvis identifieras i en viss testis (se figur 3A). Därför är det relativt lätt att hitta meiotiska celler i hela testikor. Vi fokuserar i allmänhet våra analyser på den första i motsats till andra meios eftersom dessa celler är mycket större och mer mottagliga för högupplöst bildbehandling, men hela processen omfattar både meiotiska divisioner kan framgångsrikt avbildas. Det bör också noteras att det allmänna protokollet för testis beredning och kultur kan användas för att analysera andra processer av spermatogenes också, såsom tidigare mitotiska stamceller eller spermatoggonala divisioner eller cytologiska förändringar som uppstår som spermatider mogna till spermatozoa¹⁵. Många av dessa aspekter av spermatogenes är mycket bevarade mellan Drosophila och människor¹⁶.

Drosophila spermatocyter börjar nå den meiotiska fasen av spermatogenes under den tredje instar larvstadiet av Drosophila utveckling¹³. Därför kan testiklar som isolerats från livscykelstadier som börjar med tredje instarlarver och inklusive puppor och vuxna användas för analys av att dela spermatocyter. Flera utmärkta protokoll finns tillgängliga för extraktion av testiklar från vuxna manliga flugor för levande och fast analys av spermatogenes^17,18,19. Dessa protokoll kan vara att föredra för att studera sena stadier av spermatogenes eller om genetiska markörer som endast är synliga hos vuxna måste användas. Protokollet fokuserar istället på testis beredning från larver och tidiga puppor, eftersom testiella i dessa stadier har flera fördelar som är särskilt relevanta för celldelning analys av hög upplösning, time-lapse mikroskopi. Först är testidon från larver och poppar mindre än de från vuxna, och cellerna i organet är mindre trånga. På grund av detta kan dela spermatocyter ofta avbildas nära den yttre ytan av larvtestes, utan att behöva tränga igenom flera lager av ljusspridning vävnad. För det andra, vuxna testiklar flytta rytmiskt på grund av sammandragningar av bifogade tillbehör organ, och dessa rörelser gör time-lapse imaging av enskilda celler utmanande. Och tredje, larv testiklar är fördelaktiga när man studerar genmutationer som orsakar pupal eller vuxen dödlighet. Våra metoder är optimerade för långsiktig odling av testikel på mikroskopstadiet, vilket möjliggör avbildning av flera omgångar av celldelning eller progression av enskilda celler genom flera stadier av spermatogenes i samma preparat. Vi beskriver också ett protokoll för fixering och immunstainning av hela testikel. Sammantaget är våra protokoll särskilt användbara för dem som är intresserade av att studera celldelning i intakt vävnad, och förmågan att kombinera spermatocyte analys med mycket tractable Drosophila genetiska verktyg gör detta till en särskilt kraftfull strategi.

Protocol

1. Förbered djur, verktyg och media för dissekering Korsa manliga och kvinnliga flugor för att få avkomma av önskad genotyp. Användbara transgena markörer för identifiering och iscensättning av meiotiska spermatocyter inkluderar GFP-tubulin för att märka den meiotiska spindeln och RFP-histon 2A för att märka kromosomer8. Använd fem till tio honor per kors och håll kors på standardflugamat i injektionsflaska i en 25 °C-inkubator tills tredje instarlarver börjar krypa upp…

Representative Results

När detta protokoll har utförts kommer testiella att förbli helt intakta för avbildning genom konfokalmikroskopi eller andra fluorescensmikroskopimetoder. Som framgår av figur 3Abevaras testiklarnas cellulära organisation, och utvecklingen av celldifferentiering från ena änden av testiklarna till den andra, inklusive spermatogonia, spermatocyter och haploida spermatider är synlig. GFP-tubulin är en användbar markör för att identifiera dela spermatocyter och för levande bildbeha…

Discussion

Vi har beskrivit ett protokoll för beredning av larv eller tidiga pupal Drosophila testiklar, optimerad för långsiktiga, levande bildbehandling av spermatocyte cell division. Detta är en kraftfull metod för analys av celldelning i det fysiologiska sammanhanget intakt vävnad. Kraften i denna metod utökas ytterligare i kombination med Drosophila genetiska verktyg, såsom specifika genmutationer, vävnadsspecifika RNAi-medierad dämpning och fluorescerande märkta protein- och organellmarkörer. Des…

Materials

5" Dissecting Probe	Fisher	08-965-A
5.75" Glass Pasteur Pipet	Fisher	13-678-20A
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher	BP9703-100
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Straight forcepts with fine tips
Frosted Microscope Slides	Fisher	12-544-2	Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface
Halocarbon oil 700	Sigma	H8898-100 mL
Lumox Dish 50	Sarstedt	SAR946077410	Gas-permeable tissue culture dish
Microscope Cover Glass	Fisher	12-541-B	22×22 mm, #1.5 glass coverslip
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-15	Insect pins used to make scalpel tool
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26018-17
Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade	Electron Microsocopy Sciences	15714
Plan Beveled Edge Microscope Slides	Fisher	12-549-5	Slides used for dissections
PYREX Spot Plates	Fisher	13-748B	9-well glass dissecting dish
Schneider's Drosophila medium	Fisher	21720-024
Syringe Filter, 0.22 µm	EMD Millipore	SLGS033SB
Triton X-100	Fisher	BP151-500
Vectashield	Vector Labs	H-1000	Microscopy mounting medium