Summary
يصف هذا البروتوكول في مقايسة في الجسم الحي من البلعوم تستخدم لتقييم وقياس قدرة الشباب والمسنين Drosophila الهيموسيات الميلانوغاستر على البكتيريا البلعمية.
Abstract
البلعوم هو وظيفة أساسية من الاستجابة المناعية الفطرية. يتم تنفيذ هذه العملية من قبل الهيموسيات البلعومية التي تتمثل وظيفتها الأساسية في التعرف على مجموعة واسعة من الجسيمات وتدمير مسببات الأمراض الميكروبية. مع تقدم الكائنات الحية في العمر ، تبدأ هذه العملية في الانخفاض ، ومع ذلك لا يعرف سوى القليل عن الآليات الأساسية أو الأساس الوراثي للمناعة. هنا ، يتم استخدام حقنة مقرها في فحص البلعوم الحوي لتقييم التغيرات ذات الصلة بالعمر في جوانب مختلفة من البلعوم ، مثل الربط ، والابتلاع ، وتدهور الجسيمات الداخلية ، من خلال تحديد كمي الأحداث البلعوية في الهيموسيات في Drosophila الكبار Drosophila melanogaster أصبح نموذجًا مثاليًا للتحقيق في التغيرات المرتبطة بالعمر في وظيفة المناعة الفطرية لأسباب عديدة. لأحد، يتم حفظ العديد من المكونات الوراثية ووظائف الاستجابة المناعية الفطرية، بما في ذلك البلعميات، تطوريا بين دروسوفيليا والثدييات. وبسبب ذلك، من المرجح أن تكون النتائج التي يتم الحصول عليها من استخدام هذا البروتوكول ذات صلة على نطاق واسع بفهم التغيرات المرتبطة بالعمر في وظائف المناعة في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية. بالإضافة إلى ذلك، نلاحظ أن هذه الطريقة توفر تقديرات كمية من قدرة البلعومات الهيموسية، والتي يمكن أن تكون مفيدة لمجموعة متنوعة من المواضيع البحثية، ويجب أن لا تقتصر على دراسات الشيخوخة.
Introduction
نظام المناعة الفطرية، الذي يتكون من الحواجز الفيزيائية والكيميائية للعدوى، فضلا عن المكونات الخلوية، هو التطوري المحفوظة عبر الكائنات متعددة الخلايا1،2. كما خط الدفاع الأول، الجهاز المناعي الفطرية تلعب دورا حاسما في مكافحة مسببات الأمراض الغازية في جميع الحيوانات1،2،3. تتضمن مكونات الاستجابة المناعية الفطرية مجموعة واسعة من أنواع الخلايا التي تصنف على أساس أنها تفتقر إلى التحديد والذاكرة المناعية2،3،4. في البشر، وتشمل هذه الأنواع الخلية monocytes البلعوية و الضامة، العدلات، وخلايا القاتل الطبيعي السام للخلايا4،5. في حين أن وجود نظام المناعة الوظيفي أمر ضروري للبقاء على قيد الحياة المضيف، فمن الواضح أن وظيفة الخلايا المناعية تنخفض مع التقدم في السن، وهي ظاهرة تعرف باسم المناعة5،6. يمكن أن تساعد القدرة على تقييم التغيرات المرتبطة بالعمر في الاستجابة المناعية ، بما في ذلك الجوانب المختلفة لعملية البلعمة ، في فهمنا للمناعة. الإجراء الذي يصفه هنا يوفر نهجا فعالا وقابلا للتكرار لتقييم وقياس الأحداث البلعمية بواسطة الهيموسيات في Drosophila الميلانوغاستر.
Drosophila هو نموذج مثالي لدراسة الاستجابة المناعية لأسباب عديدة. فمن ناحية، هناك مجموعة واسعة من الأدوات الجينية المتاحة التي تجعل من الممكن بسهولة التلاعب التعبير الجيني بطريقة تعتمد على الأنسجة7. وتشمل هذه الأدوات مجموعة من المسوخ، ومخزونات تدخل الجيش الملكي النيبالي، ومخزونات GAL4/UAS، ولوحة Drosophila المرجعية الجينية التي تحتوي على 205 خطوط مختلفة من نوعها يتم فهرسة تسلسل الجينوم بأكملها8. دورة الحياة القصيرة للدروصوفيا والعدد الكبير من الأفراد المنتجة تسمح للباحثين لاختبار عدة أفراد في بيئة خاضعة للرقابة، في فترة قصيرة من الزمن. وهذا يحسن إلى حد كبير القدرة على تحديد الاختلافات الدقيقة في الاستجابات المناعية للعدوى بين الأنماط الجينية، بين الجنسين أو عبر الأعمار. الأهم من ذلك، يتم حفظ العديد من المكونات الوراثية ووظائف الاستجابة المناعية الفطرية، بما في ذلك البلعميات، تطوريا بين دروسوفيليا والثدييات1،2.
في Drosophila ، تتم عملية البلعوم الذي يلي العدوى بواسطة الهيموسيات البلعائية تسمى البلازما ، والتي تعادل الضامة الثديية9. Hemocytes ضرورية لل التعرف على مجموعة واسعة من الجسيمات وتطهير مسببات الأمراض الميكروبية9،10،11،12،13. هذه الخلايا تعبر عن مجموعة متنوعة من المستقبلات التي يجب أن تميز النفس عن غير الذات، والشروع في الأحداث إشارة اللازمة لتنفيذ عملية البلعومات10،11،12،13،14،15. مرة واحدة في الجسيمات ملزمة، ويبدأ في أن تكون داخلية من خلال إعادة تنظيم الهيكل الكيسي actin وإعادة عرض غشاء البلازما لتوسيع حول الجسيمات، وتشكيل كوب البلعومات11،12،13،14. خلال هذه العملية، مجموعة أخرى من الإشارات تخبر الخلية إلى استيعاب الجسيمات أكثر عن طريق إغلاق كوب البلعوم، وتشكيل غشاء ملزمة phagosome11،12،13،14،15. ثم يخضع الفطووم لعملية نضوج، مع ربطه ببروتينات مختلفة، وصهره مع الليسومات، وتشكيل الفطوسومات الحمضية11،12،13،14،15. عند هذه النقطة، يمكن أن تكون الجسيمات بكفاءة تحلل والقضاء11،,12،,13،,14،,15. وقد كشفت الدراسات Drosophila أن الذباب الأكبر سنا (4 أسابيع من العمر) لديها انخفاض القدرة على إزالة العدوى مقارنة مع الذباب الأصغر سنا (1-1- العمر) ، على الأرجح يرجع ذلك ، على الأقل جزئيا ، إلى انخفاض في بعض جوانب البلعمة16،17.
تستخدم الطريقة الموصوفة هنا جسيمات إشريكية القولونية المنفصلة التي تحمل علامات الفلورسنت، وتحمل أحدهما الفلوروفور القياسي والأخرى حساسة للغلاف الحراري، لتقييم جانبين مختلفين من البلعمرة: الغمر الأولي للجسيمات، وتدهور الجسيمات في الفوماضات. في هذا الفحص ، يمكن ملاحظة الفلورو-الجسيمات عندما تكون الجسيمات مقيدة ومغمرة بالهيموسيات ، في حين أن الجسيمات الحساسة درجة الحموضة فلورية فقط في ظروف درجة الحموضة المنخفضة للphagosome. ويمكن بعد ذلك أن يلاحظ أحداث الفلورسنت في الهيموسيات التي تُحل على طول السفينة الظهرية. نحن نركز على الهيموسيت المترجمة إلى السفينة الظهرية، والتي توفر معلما التشريحية لتحديد موقع الهيموسيات التي من المعروف أنها تساهم في إزالة البكتيريا، وعزلها باستمرار. ومع ذلك، الهيموسيات في أجزاء أخرى من الجسم والهيموليكف هي أيضا مهمة لإزالة. على الرغم من أننا لم تدرس هذه الخلية السكان, يمكن أن يكون الإجراء العام لدينا تنطبق على المقايسات البلعوية من هذه الخلايا كذلك. ميزة واحدة من نهجنا هو أننا يمكن قياس الأحداث البلعمية داخل هافورسيات الفردية، مما يسمح لنا للكشف عن الاختلاف الدقيق في العمليات البلعوية. دراسات أخرى تصور الأحداث الفلورية من خلالبشرة 18،19 لا تأخذ في الاعتبار الاختلافات في أعداد الهيموسيات الحالية ، والتي من المهم بشكل خاص أن تنظر في حالتنا حيث من المتوقع أن تتغير تعدادات الهيموسيات الكلية مع سن17.
Protocol
1. جمع وعمر دروسوفيليا
- لتوليد نفس الذباب F1 الذين تتراوح أعمارهم بين لاختبار البلعوم، إضافة 5-10 الإناث العذراء و 5 الذكور من الأنماط الجينية المناسبة إلى قارورة تحتوي على الغذاء ذبابة طازجة. نحن نستخدم جبة الذرة أجار أجار الغذائية القائمة20، ولكن الطريقة يجب أن تعمل بغض النظر عن نوع النظام الغذائي الذباب تربى على. لهذه التجربة استخدمنا هيميزي (He)-GAL4؛ UAS-GFP يطير لتسمية الهيموسيات وراثيا.
ملاحظة: يمكن استخدام المزيد من الذباب، ولكن بعض خطوط D. الميلانوغاستر قد لا تتزاوج أو تتكاثر بشكل جيد عندما تكون مكتظة، وقد يكون للاكتظاظ آثار سلبية على تطور اليرقات21 والبلعمية. - الحفاظ على الذباب في ظل الظروف التجريبية المطلوبة. لهذه التجربة، والحفاظ على HE-GAL4؛ UAS-GFP الذباب في 24 درجة مئوية. السماح للذباب الكبار بالتزاوج لمدة أسبوع، ثم إزالة البالغين. ثم يتم جمع ذباب F1 من هذه القنينات بعد التخبط للاستخدام التجريبي.
- جمع الذباب العذراء على مدار الأسبوع، أو حتى يتم جمع العدد المطلوب من الذباب. العذارى غير مطلوبة; ومع ذلك، قد التزاوج تؤثر على الاستجابة المناعية. إذا كان للذباب F1 أن يتم اختبارها والعذارى، منفصلة الذكور والإناث في غضون 8 ساعات من eclosion والحفاظ على في قارورة منفصلة لمنع التزاوج. جمع ما يكفي من الذباب للسماح بتقييم البلعوم في ما لا يقل عن 10 الذباب في النمط الجيني / العلاج / الجنس في العمر.
- إذا شيخوخة الذباب إلى أسبوع واحد، وجمع ما لا يقل عن 50 الذباب المجموع، أو 20 الذباب لكل حالة العلاج لكل جسيم، إما جزيئات الفلورو أو الجسيمات الحساسة من حىH، ليتم حقنها. وهذا يضمن ما لا يقل عن 10 ذباب إلى اختبار في وقت التجربة.
- إذا كان الشيخوخة الذباب لأكثر من 3 أسابيع، وجمع ما لا يقل عن 100-150 الذباب المجموع، أو 50-75 الذباب لكل حالة العلاج لضمان وجود ما يكفي من الذباب المتاحة لقياس البلعوم. عندما الشيخوخة الذباب في المختبر، ونحن عادة استخدام أقفاص الحشرات التي حافظت على 24 درجة مئوية في 12:12 L:D الظروف ، وتغيير الطعام كل يومين. إذا كانت قنينات تستخدم بدلا من أقفاص، تلميح الذباب في قارورة جديدة كل 3-5 أيام، اعتمادا على حالة الطعام في القارورة. وسيتوقف عدد الذباب اللازم على كيفية تحليل البلعوم في وقت متأخر من العمر، ومعدلات البقاء على قيد الحياة حسب العمر لهذا النمط الجيني في حالة بيئية معينة.
- إذا كان سيتم تقييم الذباب الصغير والذان، فخطط وفقًا لذلك بحيث يتم حقن الذباب الذي يبلغ من العمر أسبوعًا واحدًا والبالغ من العمر في نفس اليوم. وهذا سوف يقلل من الاختلافات في تركيز الجسيمات بين التجارب وسوف يضمن أن تأثير العمر على القياس البلعوم لا يخلط مع تأثير اليوم الذي تم فيه إجراء الفحص.
- منزل الذباب التي تم جمعها في 24 درجة مئوية حتى تكون 5-7 أيام من العمر، أو الحفاظ على الذباب إلى العمر المطلوب.
2. إعداد الجزيئات المسمى الفلورسنت
- إعادة تشكيل الحرارة التي تقتل E. القولونية جسيمات فلورية أو جسيمات القولونية الحساسة درجة الحرارة E. coli إلى تركيز مخزون 20 ملغم / مل أو 1 ملغ / مل، على التوالي. تتوفر بكتيريا أخرى للاستخدام قد تكون أكثر ملاءمة لتجارب معينة، ولكنها تشير إلى تعليمات الشركة المصنعة لتركيزات المخزون المناسبة.
- بالنسبة لجسيمات الفلور، أضف 990 ميكرولتر من 1x PBS (الرقم الH 7.4) أو العازلة المفضلة و10 ميكرولتر من 2 mM (20٪) ازايد الصوديوم. دوامة لخلط.
ملاحظة: أزيد الصوديوم هو مادة حافظة يمكن حذفها؛ ومع ذلك، لا تستمر الجسيمات التي تم إعدادها بدون أزيد الصوديوم طالما. يجب استخدام جزيئات الفلورو في غضون 24 ساعة ويجب استخدام الجسيمات الحساسة من الدرجة الH في غضون 7 أيام. - بالنسبة للجسيمات الحساسة من الرقم الـ (PH)، أضف 1980 ميكرولتر من 1x PBS (pH 7.4) أو العازلة المفضلة و20 ميكرولتر من 2 mM (20٪) ازايد الصوديوم. دوامة لخلط.
- جعل متعددة ذات استخدام واحد 20 ميكرولتر aliquots في 1.5 مل microcentrifuge الأنابيب. تخزين جزيئات الفلورو في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة، والجسيمات الحساسة درجة حرارة 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر، محمية من الضوء.
- بالنسبة لجسيمات الفلور، أضف 990 ميكرولتر من 1x PBS (الرقم الH 7.4) أو العازلة المفضلة و10 ميكرولتر من 2 mM (20٪) ازايد الصوديوم. دوامة لخلط.
- في يوم الحقن ، قم بإزالة أزيد الصوديوم من الجسيمات قبل الاستخدام. للقيام بذلك، الطرد المركزي الجسيمات لمدة 5 دقائق في 15،000 س ز في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة الجسيمات supernatant وغسل مرتين عن طريق إعادة تعليق في 50 ميكرولتر من 1X PBS أو العازلة المفضلة، والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 15،000 س ز.
- بعد الغسيل الثاني، قم بإزالة الجسيمات الفائقة والذرية في 100 ميكرولتر من PBS 1x أو المخزن المؤقت المفضل. حافظ على الحل في الأنبوب وخفّض التعرض للضوء طوال التجربة. مرة واحدة يتم إزالة أزيد الصوديوم، واستخدام جزيئات الفلورو داخل 24 ساعة، واستخدام الجسيمات الحساسة من مادة ح H المستخدمة في غضون 5-7 أيام.
ملاحظة: في تجاربنا السابقة، وجدنا أن هذا التركيز من الجسيمات يوفر أعداداً قابلة للعد من الأحداث البلعمية وأن عدد الجسيمات المتاحة للزنايات من قبل الهيموسيات لم يكن يحدمن 17. ومع ذلك، قد يرغب مستخدمو هذا البروتوكول في مقارنة النتائج باستخدام تركيزات أخرى لضمان وجود عدد كاف من الجسيمات المتاحة للزنابع بواسطة الهيموسيات في ظروف تجاربهم.- إذا تم حذف أزيد الصوديوم، تم تخفيف الجسيمات 1:5 في نفس المخزن المؤقت تم إعداد الجسيمات مع، للحقن.
- إضافة قطرة (~ 10 ميكرولتر) من تلوين المواد الغذائية الخضراء إلى الجسيمات. وهذا يجعل من السهل التأكد من حقن الذباب.
3. حقن الذباب
- تحضير إبر زجاجية للحقن.
- سحب الإبر الزجاج باستخدام سحب ماصة. تعيين سخان سحب ماصة إلى 55 درجة مئوية واللولبي إلى 45. استخدم الإبر المتوفرة فقط مع الحقن ، حيث أنه ليس من المضمون أن الإبر الأخرى ستعمل بنفس الدقة.
- ملء حقنة معقم 1 مل مع الزيوت المعدنية، وإرفاق 30 قياس تحت الجلد (G) إبرة، المقدمة مع نانو حاقن.
- Backfill إبرة شعرية سحبت عن طريق إدراج إبرة 30 G في نهاية حادة من إبرة الزجاج المسحوبة وملء مع النفط المعدني. إزالة ببطء إبرة 30 G, ضمان عدم وجود فقاعات الهواء في جميع أنحاء الإبرة, لأن هذا يمكن أن يسبب أحجام الحقن غير دقيقة. لن يعمل المحاقن بشكل صحيح دون ردم الإبرة.
- باستخدام ملقط، وقطع قبالة غيض من إبرة لإنشاء فتحة للسماح طرد من الحل.
- تجميع نانو حاقن.
ملاحظة: يمكن استخدام الحقن الأخرى. الطريقة الموضحة أدناه تنطبق على نانو حاقن. بالنسبة إلى الحقن الأخرى، راجع دليل المستخدم للحصول على التعليمات.- تعيين حاقن إلى وحدة التخزين المطلوب (بين 46 nL و 69 nL).
- إزالة كوليه ووضع ختم O-حلقة، وفواصل بيضاء مع المسافة البادئة التي تواجه ما يصل لتلقي الطرف الخلفي من الإبرة، وأكبر O-حلقة على المكبس المعدنية، في هذا الترتيب. أعد ربط الكول دون تشديده.
- أدخل المكبس المعدني في الطرف الحاد من إبرة الزجاج المملوءة بالزيت. دفع بلطف الإبرة إلى أسفل، وإدراجه في أكبر O-حلقة. تشديد كوليت حتى آمنة.
ملاحظة: إذا كان المكبس المعدني لا تمتد الماضي collet، اضغط مع الاستمرار 'فارغة' حتى المكبس مرئيا. وهذا يجعل من الأسهل لضمان يتم إدراج المكبس في الإبرة. - اضغط مع الاستمرار على "EMPTY" حتى يصدر صوت حاقن. هذا يقذف معظم الزيوت المعدنية من الإبرة، وترك كمية صغيرة من النفط لتكون بمثابة حاجز بين السائلين، وكذلك يزيل فقاعات الهواء.
- املأ الإبرة بجسيمات الفلورو أو بالجسيمات الحساسة من الرقم الـ (ح) بإدخال طرف الإبرة الزجاجية في أنبوب الطرد الدقيق الذي يحتوي على الجسيمات المعدة.
- اضغط مع الاستمرار على 'FILL' حتى يصدر صوت حاقن.
- الحقن
- نقل الذباب التي يتم حقنها في قارورة فارغة. شل حركة الذباب عن طريق وضع القارورة في الجليد. كما يمكن استخدام ثاني أكسيد الكربون2 لشل حركة الذباب. ومع ذلك، لاحظ أنه عند استخدام الجسيمات الحساسة درجة الحموضة، يمكن لمستويات CO2 المرتفعة أن تحمض بشكل مصطنع أي مخازن يتم استخدامها ويمكن أن ترفع الفلورية الخلفية.
- حقن الذباب في لوحة الصدر من الصدر (الشكل 1A). الحقن هو ناجح إذا ينظر إلى الصبغة الخضراء الخوض في الذبابة (الشكل 1B). إذا لم تتحول الذبابة إلى اللون الأخضر، فتأكد من عدم انسداد الإبرة.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، يمكن حقن الذباب في البطن، ولكن الحفاظ على موقع الحقن ثابتًا عبر جميع التجارب. - مكان حقن الذباب في قارورة الغذاء الجديد، مشيرا إلى الوقت الذي تم حقن الذبابة الأولى والأخيرة. لتقليل الخطأ التجريبي بسبب مقدار الوقت الذي يستغرقه إكمال الحقن، قم بتكملة الحقن في الوقت المناسب. مع الممارسة، وينبغي أن يستغرق أكثر من 10 دقيقة لحقن مجموعة واحدة من الذباب. وضع القارورة على جانبها حتى كل من الذباب قد تعافى، لمنع الذباب من أن تصبح عالقة في الغذاء.
- السماح للذباب للتعافي لمدة 60-90 دقيقة، اعتمادا على الظروف التجريبية. هنا، تم استخدام وقت استرداد 60 دقيقة. لاحظ أن هذا المدى الزمني للتعافي كان الأمثل لعد الأحداث البلعائية في الظروف التجريبية في دراسة القرن وآخرون17. ومع ذلك ، في ظل بعض الظروف ، قد يكون هذا طويلاً جدًا للكشف عن الاختلافات الدقيقة في البلعمة بين مجموعات العلاج. قد يكون من المفيد إجراء تجارب الدورة الزمنية كما كان يتم سابقا17 لتحديد وقت الاسترداد التي سوف تكشف عن أقصى الاختلافات بين السيطرة والنتائج التجريبية. مهما كان وقت التعافي الذي يتم اختياره، حافظ على هذا متناسق عبر جميع العلاجات التجريبية.
- إذا حقن مع جزيئات الفلورو والجسيمات الحساسة من مادة حُكم حَسّ في نفس اليوم، استخدم إبرة جديدة لكل حل. لا يحقن الذباب الفردية مع كل من الجسيمات إذا كانت على حد سواء أحمر الفلوريس، لأن النتيجة لن تفرق بين الجانبين من البلعمة، الجسيمات ملزمة / الابتلاع مقابل إدراج الجسيمات في البلوم.
4. تشريح السفينة الظهرية
- بعد أن تعافى الذباب لمدة 60-90 دقيقة، نقل جميع الذباب الحي إلى قارورة فارغة وشل الحركة على الجليد.
- نقل ذبابة واحدة في وقت واحد على لوحة تشريح الاستومر سيليكون.
ملاحظة: إعداد لوحات التشريح على الأقل 1-أسبوع قبل الاستخدام، إذا كان علاج في درجة حرارة الغرفة. للقيام بذلك، وإعداد الداستومر وسكبه في طبق بيتري 33 ملم × 10 ملم، وملء الطبق في منتصف الطريق تقريبا. اضغط بلطف على الطبق على سطح مستو لتقليل فقاعات الهواء. دع اللوحات تجلس في درجة حرارة الغرفة، دون إزعاج، لمدة أسبوع على الأقل.- تحت مجهر ستيريو تشريح، وتوجيه الجانب البطني ذبابة لأعلى.
- باستخدام دبابيس الحشرات ، قم بتركيب الذبابة على الطبق عن طريق إدخال دبوس واحد من خلال الصدر ودبوس آخر من خلال الطرف الخلفي الأكثر من البطن ، بالقرب من الأعضاء التناسلية (الشكل 2A). قد يكون من المفيد قطع دبابيس في النصف قبل تثبيت العينة حتى لا عرقلة تشريح. كرر مع ما يصل إلى 10 الذباب لكل لوحة تشريح.
ملاحظة: اختياري: إزالة الأجنحة والساقين قبل تثبيت يطير إلى لوحة. وهذا سيساعد على منع تشكيل فقاعة حول الطاير عند إضافة الوسائط. - مرة واحدة وقد تم تثبيت جميع الذباب إلى لوحة، إضافة وسائل الإعلام تشريح كافية لتغطية الذباب (~ 1 مل) باستخدام أنبوب نقل.
- باستخدام ملقط أو مقص بشرة، وإزالة الرأس.
- باستخدام مقص بشرة، وجعل اثنين من الشقوق الأفقية: واحد مباشرة فوق دبوس الخلفي في البطن، وآخر في الطرف الأمامي من البطن، حيث يلتقي الصدر والبطن (الشكل 2B، C). في الشكل 2، تم ترك الرأس سليمًا لتوضيح الاتجاه.
- جعل شق عمودي، وربط اثنين من الشقوق الأفقية (التخفيضات الثلاثة تشبه الحرف الأول). هذا سوف تفتح تجويف البطن (الشكل 2D).
- باستخدام ملقط، وإزالة الأعضاء الداخلية والأنسجة، وتجنب السفينة الظهرية. إذا لم يتم إزعاجها ، يمكن رؤية الوعاء الظهري الشفاف في كثير من الأحيان ينبض بالقرب من الطرف الأمامي للبطن. يمكن استخدام دبابيس إضافية لتثبيت نهايات القطع المفتوحة حديثا من بشرة (الشكل 2E، F).
- باستخدام مقص بشرة، وإزالة الصدر. بدلا من ذلك، يمكن إزالة الصدر قبل تركيب البشرة التشريحية والأوعية الظهرية على شريحة المجهر.
- كرر مع الذباب المتبقي. تشريح الذباب في الوقت المناسب ، للحد من الاختلافات المحتملة في معدل البلعوم. بمجرد أن يتم تشريح جميع الذباب ، اترك البشرة مع السفينة الظهرية المرفقة المثبتة على اللوحة. سيتم تنفيذ كل الخطوة 5 في لوحة التشريح. وهذا سيمنع الإضرار أو تجاهل البشرة بين الخطوات.
5. التثبيت وتلطيخ
- إصلاح تشريح البشرة مع الأوعية الظهرية المرفقة في 4٪ شبهformaldehyde (PFA).
- باستخدام أنبوب نقل قابل للتصرف جديدة لكل خطوة، والتخلص من وسائل الإعلام تشريح، واستبدالها مع 1 مل من 4٪ PFA. في جميع أنحاء التثبيت وتلطيخ، والحفاظ على تشريح محمية من الضوء قدر الإمكان.
- احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة مع هزاز في 20 دورة في الدقيقة. لا تسمح للتشريح بالجلوس في التثبيت لأكثر من 20 دقيقة ، لأن هذا يمكن أن يبدأ في تلف الأنسجة.
- غسل بشرة 2x في 1X PBS + 0.1٪ توين (PBST).
- إزالة المثبت واستبدالها ب 1 مل من 1X PBST.
- غسل في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة مع هزاز.
- كرر 1x.
ملاحظة: تشريح، يمكن تخزين الأنسجة الثابتة في 4 درجة مئوية، لمدة تصل إلى 3 أيام، محمية من الضوء، بعد غسل الأولى عن طريق استبدال غسل مع PBST الطازجة. لا تخزن الأنسجة الثابتة إذا سيتم استخدام الأجسام المضادة. يجب استخدام الأجسام المضادة مع الأنسجة الطازجة للحصول على أفضل النتائج.
- اختياري: تلطيخ الأجسام المضادة. يمكن استخدام الأجسام المضادة لتصور واضح للسفينة الظهرية بوضوح (الشكل 3) ، أو للكشف عن علامات محددة للهيموليت. وهذا يمكن أن يضمن الخلايا فقط على طول السفينة الظهرية تحسب أو لوضع علامة على غشاء من الهيموسيات.
- إزالة غسل الثانية، إضافة الأجسام المضادة الأولية في التخفيف المناسب. احتضان بين عشية وضحاها في 4 °C، مع هزاز.
- إزالة الأجسام المضادة الأولية، وغسل مرتين مع PBST لمدة 15 دقيقة مع هزاز.
- إضافة الأجسام المضادة الثانوية الفلورية. نوصي بـ جسم مضاد أخضر فلوري حتى لا يحجب الجسيمات الفلورية. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة، مع هزاز.
- إزالة الأجسام المضادة الثانوية، وغسل مرتين لمدة 15 دقيقة لكل من مع PBST.
- وصمة عار مع DAPI.
- إزالة غسل النهائي واستبدالها مع 1 مل من DAPI المخفف في PBST (1:1000).
- وصمة عار لمدة 20 دقيقة مع هزاز في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة DAPI، وغسل 2x (كرر الخطوة 5.2).
- استبدال الغسل النهائي مع 1X PBST الطازجة.
ملاحظة: يمكن تخزين الذباب في 4 درجة مئوية، لمدة تصل إلى 3 أيام، محمية من الضوء، بعد غسل الأولى عن طريق استبدال غسل مع PBST الطازجة.
6. تركيب البشرة على شرائح المجهر والتصوير
- إعداد بشرة تشريح.
- تحت منظار المجسم المُجلّح، قطع بشرة زائدة يمكن أن تتداخل مع التصوير.
- باستخدام ملقط، نقل البشرة مع السفينة الظهرية المرفقة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل تحتوي على 70٪ الجلسرين. وضع البشرة في الجلسرين سوف تساعد على إزالة PBST ويسمح لصورة أوضح أثناء التصوير.
- جبل البشرة على الشريحة المجهر.
- إضافة بضع قطرات من 70٪ الجلسرين إلى شريحة المجهر.
- باستخدام ملقط، وإزالة البشرة من أنبوب الجلسرين ووضع في الجلسرين على الشريحة.
- تحت المجهر ستيريو تشريح، واستخدام ملقط لتوجيه الجانب البطني البشرة حتى، وضمان السفينة الظهرية مرئية. سوف يكون الصباغ أغمق من بشرة الوجه إلى أسفل.
- إضافة قطرة إضافية من الجلسرين, إذا لزم الأمر. وهذا يساعد على منع فقاعات الهواء ويسمح لصورة أوضح.
- ضع غطاءً برفق فوق بشرة وأصيل حواف مع طلاء الأظافر. السماح لتجف لمدة 10-15 دقيقة قبل المضي قدما. صورة الذباب على الفور أو تخزينها في مربع عازلة للضوء في 4 درجة مئوية.
- صورة السفينة الظهرية.
- باستخدام المجهر الفلوري، استخدم نظام التداخل الهيكلي لتوليد أقسام بصرية للسفينة الظهرية. ويمكن استخدام المجهر confocal بدلا من ذلك والتي قد توفر دقة إضافية. الحصول على صور Z-المكدس من السفينة الظهرية باستخدام الهدف 20x والبرمجيات المفضلة للتصوير. إضافة شريط مقياس 10 ملم، وتسمية بشكل صحيح وحفظ الصور كملفات tiff(الشكل 4)أو التنسيق المطلوب.
ملاحظة: يمكن أن يختلف عدد الصور Z-المكدس التي تم الحصول عليها بين التشريح ويعتمد على مدى تشريح السفينة الظهرية، وعلى حجم الخطوة المطلوبة بين الصور. هنا، تم تعيين حجم الخطوة إلى 0.49 ملم. يمكن أن يتراوح هذا العدد في أي مكان من 3 إلى 40 صورة لكل كومة في تجربتنا.
- باستخدام المجهر الفلوري، استخدم نظام التداخل الهيكلي لتوليد أقسام بصرية للسفينة الظهرية. ويمكن استخدام المجهر confocal بدلا من ذلك والتي قد توفر دقة إضافية. الحصول على صور Z-المكدس من السفينة الظهرية باستخدام الهدف 20x والبرمجيات المفضلة للتصوير. إضافة شريط مقياس 10 ملم، وتسمية بشكل صحيح وحفظ الصور كملفات tiff(الشكل 4)أو التنسيق المطلوب.
7. تحليل الصور
- كمّي الأحداث الفلورية باستخدام ImageJ.
- فتح الصور وتكديس لهم: صورة à Stacks à Images to Stack.
- عد فقط إشارات الفلورسنت ~ 1 مم الحجم داخل قطر 10 مم تركزت على نواة DAPI إيجابية من خلال النقر على كل حدث من ما لا يقل عن 10 خلايا لكل ذبابة، من ما لا يقل عن 10 الذباب لكل نوع الجسيمات حقن: الإضافات à تحليل à خلية العداد إشعار (الشكل 5A). تقوم أداة إشعار عداد الخلايا بتعيين لون مختلف لكل خلية متعقبة، مع نقطة ملونة تتوافق مع كل حدث فلوري تم النقر عليه داخل تلك الخلية.
- لإدراج موضع العداد والمكدس المقترن بكل نقطة، اضغط على 'm' أو حدد قياس ضمن علامة التبويب تحليل، أو لعرض عدد الأحداث التي تم عدها في كل خلية في جدول النتائج، اضغط على "alt +y"(الشكل 5B).
- نقل عدد الخلايا إلى جدول بيانات لاستخدامه في التحليل الإحصائي.
- إجراء تحليل إحصائي.
- تحليل الاختلافات في أحداث البلعوم باستخدام إما ANOVA ذات التأثيرات الثابتة أو نموذج مختلط متداخل ANOVA. يمكن استخدام نماذج مختلطة لاختبار الآثار الثابتة الرئيسية للعمر والنمط الجيني وتأثير عشوائي من الأفراد متداخلة داخل كل نوع جيني17.
ملاحظة: ينبغي أن يكون المحققون صارمين في اختبار افتراضات أي إجراء إحصائي يستخدم لتحليل البيانات.
- تحليل الاختلافات في أحداث البلعوم باستخدام إما ANOVA ذات التأثيرات الثابتة أو نموذج مختلط متداخل ANOVA. يمكن استخدام نماذج مختلطة لاختبار الآثار الثابتة الرئيسية للعمر والنمط الجيني وتأثير عشوائي من الأفراد متداخلة داخل كل نوع جيني17.
Representative Results
لتوضيح طرق الحقن الموصوفة ، يظهر الشكل 1A موقع الحقن على Drosophila melanogaster ، وكذلك كيف تسمح صبغة الطعام بتأكيد بصري على أن الذبابة تم حقنها (الشكل 1B). إضافة صبغة الطعام يساعد أيضا في التعرف على إبرة انسداد. يمكن إجراء الحقن في البطن، ولكن الحفاظ على موقع الحقن متسقة عبر التجارب. سيساعد هذا على تقليل الاختلافات المحتملة بين كل تجربة.
لتصور الجسيمات المسمى الفلورسنت داخل hemocytes المقيم على طول السفينة الظهرية، قمنا بتشريح السفينة الظهرية وتعلق بشرة البطن. الرسم 2A-F يحدد طرق التشريح.
لتقييم قدرة الشباب والذان على تنفيذ البلعوم على العمر، يتم تصور الخلايا الدموية على طول الوعاء الظهري باستخدام مجهر فلوري. لضمان أن يتم عد الخلايا فقط على طول السفينة الظهرية، الأجسام المضادة أو الجينات الموسومة GFP لعلامات معينة من خلايا الدم أو الكولاجين محددة القلب، مثل Hemese وهيموليكتين، أو بيريكاردين (الشكل 3)، على التوالي، يمكن استخدامها22،23،24. الفلورسنت المسمى E. الجسيمات القولونية هي 1 ملم في الطول، في حين أن الهيموسيات هي 10 ملم في قطر17. فقط تلك الأحداث الفلورسنت الموجودة داخل قطر 10 مم التي تركز على نواة DAPI إيجابية يتم عدها (الشكل 4). لقياس الأحداث الفلورية ، يتم استخدام برنامج ImageJ (الشكل 5).
الشكل 1: موقع الحقن والتحقق البصري. (أ) الجانب الجانبي من الصدر مثقوب بإبرة من الشعر الشعري المسحوب. (B) يتم التحقق بصريا من الحقن عن طريق إضافة صبغة الغذاء الأخضر إلى حل الجسيمات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تشريح السفينة الظهرية. (A) يتم وضع دبابيس في الصدر والبطن الخلفي (السهام السوداء). (B-C) يتم إجراء شقين أفقيين (السهام الخضراء) في الطرف الخلفي من البطن (B) ، والنهاية الأمامية (C). (د)يتم إجراء شق عمودي (السهم الأخضر) أسفل منتصف البطن، وربط التخفيضات الأفقية اثنين. (E) دبابيس اختيارية (*) تستخدم في وضع مفتوح في تجويف البطن ، مما يعرض الأنسجة الداخلية. (F) تتم إزالة الأنسجة الداخلية (المحاصيل والأمعاء والرحم والمبايض والأجسام الدهنية) ، مما يعرض الوعاء الظهري. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: عرض فينترال لوعاء ظهري تشريحي من أنثى عمرها 5 أسابيع حقنت بالجسيمات الحساسة من مادة حُكْرَسَرَسَرَسَسِس، ملطخة بالأجسام المضادة الموجهة ضد بيريكاردين (A). خط أبيض منقط الخطوط العريضة الجانب الجانبي من السفينة الظهرية، مع السهم يشير نحو المنطقة الأمامية. (B) صورة موسعة من (A):مجموعات من الهيموسيات (السهم الأزرق) التي كانت البكتيريا المهينة بنشاط ، داخل الغرفة الأبهري الأولى للسفينة الظهرية. (C) صورة مكبرة من (A) تحدد المصفوفة خارج الخلية (ECM) مثل البروتين الكولاجين ، بيريكاردين (السهم الأخضر) ، الذي يحمل السفينة الظهرية في مكان24. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تشريح الأوعية الظهرية والهيموسيات المرتبطة بها من ذبابة أنثى حقنها مع الجسيمات الحساسة الرقم الH، أو جزيئات الفلورو. (A) الأوعية الظهرية والهيموسيات المرتبطة بها مع الجسيمات القولونية ذات العلامات الحساسة ذات العلامات الـ (الأحمر) ذات العلامات الهستيرية (E) (أحمر) ، أو (E) جسيمات الإشريكية القولونية (الحمراء) ، معزولة عن ذبابة عمرها أسبوع واحد ، بعد تعافيها لمدة 60 دقيقة (B ، F) مكبرة من (A) و (E)(مربع أبيض ) ، على التوالي ، تظهر اثنين من الهيمواج الفردية مع أحداث يمكن عدها. (C) الأوعية الظهرية والهيموسيات المرتبطة بها مع الجزيئات E. coli ذات العلامات الحساسة ذات العلامات الـHH المُتلعومة (الحمراء)، أو (G)الفلورو المسمى E. جسيمات القولونية (الحمراء)، معزولة عن ذبابة عمرها 5 أسابيع، بعد تعافيها لمدة 60 دقيقة (D،H)مكبرة من (C)و (G) (مربع أبيض)، على التوالي، تظهر اثنين من الهيماتولي الفردية مع أحداث يمكن عدها. خط أبيض منقط الخطوط العريضة الجانب الجانبي من السفينة الظهرية، مع السهم يشير نحو المنطقة الأمامية. نوى ملونة مع DAPI (الأزرق). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: قياس الأحداث البلعائية في نطاق خلايا الدم 10 مم باستخدام عداد الخلايا في ImageJ. (A) بعد فتح صورة (صور) في ImageJ، يمكن استخدام أداة "إشعار عداد الخلية" لتتبع الأحداث البلعمية في الخلية. (B)ستقوم هذه الأداة بتعيين لون مختلف لكل خلية يتم اختيارها ليتم عدها، مع مطابقة كل نقطة لحدث الفلورسنت داخل تلك الخلية. الضغط على 'alt+y' سيعرض جدولاً يعرض عدد الأحداث التي تم حسابها لكل خلية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
البروتوكول الموصوف هنا هو وسيلة موثوقة لتحديد الجوانب المختلفة للزنابية، في ظل ظروف تجريبية خاضعة للرقابة. نلاحظ أننا قد اختبرت فقط هذا الإجراء مع الغرام الجزيئات البكتيرية السلبية والنتائج قد تختلف إذا تم استخدام الغرام الجزيئات البكتيرية إيجابية. في الواقع، سيكون من المثير للاهتمام مقارنة الاستجابات البلعوية لكل من البكتيريا السلبية والغرام إيجابية غرام في ظروف تجريبية مختلفة. استخدام نانو حاقن يسمح لمراقبة دقيقة على أحجام الحقن، وضمان حقن كل ذبابة مع نفس حجم الجسيمات. أحد القيود على البروتوكول يأتي من عدم الاتساق في تحضيرات الجسيمات. سوف تتراكم الجسيمات بمجرد تجميدها، لذلك يمكن أن تؤثر الاختلافات الصغيرة في أحجام التخفيف، أو عدم وجود دوامة، على تركيز الجسيمات بين التجارب. لتقليل الاختلافات المحتملة في تركيزات الجسيمات بين الأعمار ، من المفيد حقن الذباب القديم لمدة 1 و 5 أسابيع في نفس اليوم ، باستخدام نفس إبرة وحل الجسيمات. عيب آخر محتمل هو أنه أثناء التشريح، يمكن بسهولة أن تتلف السفينة الظهرية و /أو بشرة إذا لم يتم التعامل مع الدبابيس بشكل صحيح. لتجنب تعطيل السفينة الظهرية، تقليل عدد الدبابيس المستخدمة في التشريح. ميزة لهذا الأسلوب تشريح هو أن جميع التثبيت, غسل وتلطيخ الخطوات يمكن أن يؤديها في لوحة تشريح. لأن بشرة يتم تثبيتها إلى أسفل، وهذا يمنع البشرة من فقدان بين الخطوات.
بالمقارنة مع الأساليب القائمة18،19،25،26،27،28،29، البروتوكول الموصوف له مزاياه وحدوده. من خلال تشريح السفينة الظهرية ، ونحن قادرون على تصور وقياس عدد الهيموسيات الفردية في هذا الموقع. وهذا يجعل من الممكن الكشف عن الاختلافات الدقيقة في النشاط البلعمي بين المجموعات التجريبية. طرق أخرى تصور الجزيئات المسمى fluorescently بجمع hemocytes باستخدام النزف / كشط المقايسة19,25,26,27, أو من خلال بشرة بطنية سليمة18,19,28,29; ومع ذلك، لا يمكن تقييم الهيموسيات الفردية عند تصورها من خلال بشرة الظهر. ميزة هذا البروتوكول، بالمقارنة مع طريقة التسييل / كشط هو أن طريقتنا يسمح لنا لتقييم فقط تلك الهيموسيات المرتبطة بالأوعية الظهرية، ولا حساب ل الخلايا المتداولة أو تلك على طول جدار الجسم، والتي قد تكون مختلفة وظيفيا. تشريح السفينة الظهرية يزيل أيضا الحاجة إلى تضمين جولة ثانية من الحقن مع quencher fluorescence، مثل Trypan الأزرق19،26. وذلك لأن أي جزيئات غير ملزمة أو غارقة في خلية سيتم غسلها أثناء خطوات الغسيل. وعلى العكس من ذلك، قد يكون من الأسهل تنفيذ طرق بديلة لأنها لا تتطلب تشريح. في حين أن تشريح السفينة الظهرية من السهل تعلمها ، فإن هذه الخطوة تضيف مستوى من التعقيد قد لا يكون ممكنًا في بعض التصاميم التجريبية.
على الرغم من أن الاستخدام الموصوف لهذا في فحص البلعوم في الجسم الحي هو تقييم وقياس الأحداث البلعومية بين مختلف الأعمار ، فإن هذا البروتوكول قابل للتكيف للغاية ويمكن استخدامه لتحليل جوانب مختلفة من البلعوم بين النمط الجيني أو الجنس أو نوع الأنسجة. مع البلعوم يجري أهمية مركزية بالنسبة لمعظم الحيوانات متعددة الخلايا، فهم كيف تنخفض هذه العملية مع التقدم في السن يمكن أن يؤدي إلى علاجات علاجية أفضل للسكان الشيخوخة. يوفر هذا النهج إمكانات طويلة الأجل لتوضيح جوانب التغيرات المرتبطة بالعمر في الاستجابة المناعية ، مع التركيز بشكل خاص على البلعميات.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح من المعاهد الوطنية للصحة R03 AG061484-02 وكلية UMBC للعلوم الطبيعية والرياضية بيكتون ديكنسون كلية البحوث.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.10 mm Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Here: pins are cut in half, and the sharp end is used |
| 1 mL sterile syringes | Becton Dickinson | 309602 | Filled with mineral oil to load needle |
| 15% Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | for dissection media |
| 16 % Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | EM-grade, 4% working, diluted in 1X PBS |
| 1x Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
| 3 mL Trasnfer Pipet | Falcon | 357524 | |
| 3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | 1.14mm O.D X 3.5" length X 0.53" I.D |
| 35x10 mm Petri dishes | Becton Dickinson | 351008 | Used as dissection plate, filled half way with Sylgard |
| 6x penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | for dissection media |
| 70% Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Analog Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
| Biological point forceps, Dumont No. 5 | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Life Technologies | D1306 | Diluted 1:1000 in 1x PBST |
| Drosophila strain | w[*]; P{w[+mC]=He-GAL4.Z}85, P{w[+mC]=UAS-GFP.nls}8 | ||
| E. coli (K-12 strain) BioParticles™, Alexa Fluor™ 594 conjugate | Life Technologies | E23370 | |
| Glass slides | Premiere | D17026102 | |
| Live cell imaging solution | Life Technologies | A14291DJ | preferred buffer for particle preparation and dilutions |
| Mineral oil | Mpbio | 194836 | |
| Nanoject II automatic nanoliter injector | Drummond | 3-000-204 | |
| Narrow Polystyrene Super Bulk Drosophila Vials | Genesee | 32-116SB | Size: 25 X 95 mm |
| Nutating Mixer | Fisher Scientific | 88-861-043 | Speed used: 20 rpm |
| pHrodo™ Red E. coli BioParticles™ Conjugate for Phagocytosis | Life Technologies | P35361 | |
| Schneider's Drosophila cell culture media (1x) | Gibco | 21720-024 | Dissection media, combine: Schneiders, FBS, and pen/strep; filter sterilize |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | 2mM (or 20%) working |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Prepare according to provided protocol |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | For PBS + 0.1% tween |
| Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 812368 | Heater: 55? Solenoid: 45 |
| Zeiss AxioImager.Z1 fluorescent microscope | Zeiss | Here: Apotome structural interference system with Zeiss Zen imaging software |
References
- Abhyankar, V., Kaduskar, B., Kamat, S. S., Deobagkar, D., Ratnaparkhi, G. S. Drosophila DNA/RNA methyltransferase contributes to robust host defense in ageing animals by regulating sphingolipid metabolism. The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 22 (2018).
- DeVeale, B., Brummel, T., Seroude, L. Immunity and aging: the enemy within. Aging Cell. 3 (4), 195-208 (2004).
- Gomez, C. R., Nomellini, V., Faunce, D. E., Kovacs, E. J.
- Panda, A., et al. Human innate immunosenescence: causes and consequences for immunity in old age. Trends in Immunology. 30 (7), 325-333 (2009).
- Aw, D., Silva, A. B., Palmer, D. B. Immunosenescence: emerging challenges for an ageing population. Immunology. 120 (4), 435-446 (2007).
- Min, K. -J., Tatar, M. Unraveling the molecular mechanism of immunosenescence in Drosophila. International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), 2472 (2018).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
- Banerjee, U., Girard, J. R., Goins, L. M., Spratford, C. M. Drosophila as a genetic model for hematopoiesis. Genetics. 211 (2), 367-417 (2019).
- Rämet, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. B. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416 (6881), 644-648 (2002).
- Garschall, K., Flatt, T. The interplay between immunity and aging in Drosophila. F1000Research. 7, (2018).
- Brennan, C. A., Anderson, K. V. Drosophila: The genetics of innate immune recognition and response. Annual Review of Immunology. 22 (1), 457-483 (2004).
- Rosales, C., Uribe-Querol, E. Phagocytosis: a fundamental process in immunity. BioMed Research International. 9042851, Research article (2017).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (10), 781-795 (2008).
- Stuart, L., et al. A systems biology analysis of the Drosophila phagosome. Nature. 445 (7123), 95-101 (2007).
- Mackenzie, D. K., Bussière, L. F., Tinsley, M. C. Senescence of the cellular immune response in Drosophila melanogaster. Experimental Gerontology. 46 (11), 853-859 (2011).
- Horn, L., Leips, J., Starz-Gaiano, M. Phagocytic ability declines with age in adult Drosophila hemocytes. Aging Cell. 13 (4), 719-728 (2014).
- Elrod-Erickson, M., Mishra, S., Schneider, D. Interactions between the cellular and humoral immune responses in Drosophila. Current Biology. 10 (13), 781-784 (2000).
- Garg, A., Wu, L. P. Drosophila Rab14 mediates phagocytosis in the immune response to Staphylococcus aureus. Cellular Microbiology. 16 (2), 296-310 (2014).
- Bloomington Drosophila Stock Center: Indiana University Bloomington. , Available from: https://bdsc.indiana.edu/innformation/recipes/molassesfood.html (2019).
- Fellous, S., Lazzaro, B. P. Larval food quality affects adult (but not larval) immune gene expression independent of effects on general condition. Molecular Ecology. 19 (7), 1462-1468 (2010).
- Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2622-2627 (2003).
- Goto, A., et al. A Drosophila haemocyte-specific protein, hemolectin, similar to human von Willebrand factor. Biochemical Journal. 359, Pt 1 99-108 (2001).
- Cevik, D., Acker, M., Michalski, C., Jacobs, J. R. Pericardin, a Drosophila collagen, facilitates accumulation of hemocytes at the heart. Developmental Biology. 454 (1), 52-65 (2019).
- Ghosh, S., Mandal, S., Mandal, L. Detecting proliferation of adult hemocytes in Drosophila by BrdU incorporation and PH3 expression in response to bacterial infection. Wellcome Open Research. 3, (2018).
- Hao, Y., Yu, S., Luo, F., Jin, L. H. Jumu is required for circulating hemocyte differentiation and phagocytosis in Drosophila. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 95 (2018).
- Petraki, S., Alexander, B., Brückner, K. Assaying blood cell populations of the Drosophila melanogaster larva. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
- Gyoergy, A., et al. Tools allowing independent visualization and genetic manipulation of Drosophila melanogaster macrophages and surrounding Tissues. G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (3), 845-857 (2018).
- Bosch, P. S., et al. Blood cells of adult Drosophila do not expand, but control survival after bacterial infection by induction of Drosocin around their reservoir at the respiratory epithelia. BioRxiv. 578864, (2019).
