Summary
该协议描述了一种在体内的噬菌体测定法，用于评估和量化年轻和老年果蝇黑色素血细胞对噬菌体的能力。
Abstract
噬菌体是先天免疫反应的一种基本功能。这个过程由噬菌体血细胞进行，其主要功能是识别各种颗粒并破坏微生物病原体。随着生物体的老化，这个过程开始衰退，然而对免疫敏感性的基本机制或遗传基础知之甚少。在这里，一种基于体内邻苯二甲酸酯测定的注射，通过量化成人血Drosophilamelanogaster 细胞中的噬菌体事件，用于评估邻代细胞病不同方面的年龄相关变化，如内化粒子的结合、吞没和降解。其一，先天免疫反应的许多遗传成分和功能，包括咽喉病，在果蝇和哺乳动物之间被进化保护。因此，使用这种协议获得的结果可能与了解不同生物体免疫功能的年龄相关变化有着广泛的相关性。此外，我们注意到，这种方法提供血细胞噬菌体能力的定量估计，可用于各种研究课题，无需局限于衰老研究。
Introduction
先天免疫系统，由感染的物理和化学屏障以及细胞成分组成，在多细胞生物体1、22之间被进化保护。作为第一道防线，先天免疫系统在防治所有动物11、2、32,3的病原体方面起着至关重要的作用。先天免疫反应的成分包括广泛的细胞类型，分类的基础上，他们缺乏特异性和免疫记忆22，3，4。3,4在人类中，这些细胞类型包括噬菌体单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞和细胞毒性天然杀伤细胞44、5。5虽然拥有功能性免疫系统对宿主生存至关重要，但很明显，免疫细胞的功能会随着年龄的增长而下降，这种现象被称为免疫敏感性55、6。6能够评估免疫反应的年龄相关变化，包括噬菌体过程的不同方面，有助于我们理解免疫敏感性。我们在这里描述的程序提供了一种有效和可重复的方法，以评估和量化血细胞在果蝇黑色素气仪的噬菌体事件。
果蝇是研究免疫反应的理想模型，原因有很多。首先，有一套广泛的遗传工具可用，使很容易操作基因表达在组织依赖的方式7。这些工具包括突变体的集合，RNA干扰种群，GAL4/UAS种群，以及含有205条不同近亲繁殖系的果蝇遗传参考面板，其中整个基因组序列被编目8。果蝇的短生命周期和大量个体的产生使研究人员能够在短时间内在受控环境中测试多个个体。这大大提高了识别基因型、性别之间或不同年龄之间对感染的免疫反应的细微差异的能力。重要的是，许多遗传成分和功能的先天免疫反应，包括噬菌体，在果蝇和哺乳动物11，22之间的进化保护。
在果蝇，感染后产生病菌的过程是由称为血浆细胞的噬菌体血细胞进行的，这相当于哺乳动物巨噬细胞9。细胞对识别各种粒子和清除,微生物病原体9、10、11、12、1310,11至关重要。12,139这些细胞表达各种受体，必须区分自我和非自我，并启动信号事件需要执行噬菌体过程10，11，12，13，14，15。10,11,12,13,14,15一旦粒子被结合，它开始内化通过重组细胞骨架和改造等离子膜，以围绕粒子展开，形成一个噬菌杯11，12，13，14。11,12,13,14在这个过程中，另一组信号告诉细胞通过关闭噬菌杯进一步内化粒子，形成膜结合的邻形体11，12，13，14，15。11,12,13,14,15然后，邻苯二甲酸菌经历了一个成熟过程，与不同的蛋白质结合，并与同体细胞融合，形成酸性邻苯二甲酸的11、12、13、14、15。11,12,13,14,15此时，粒子可以有效地降解和消除11，12，13，14，15。11,12,13,14,15果蝇研究表明，与幼蝇（1周大）相比，较老苍蝇（4周大）清除感染的能力降低，至少部分原因可能是16、17,17岁的咽喉炎的某些方面下降。
此处描述的方法使用两个独立的荧光标记热杀大肠杆菌颗粒，一个带有标准荧光磷和一个pH敏感，以评估噬菌体细胞学的两个不同方面：粒子的初始吞没，以及邻肠胶质颗粒的降解。在此测定中，当颗粒被细胞束缚和吞没时，荧光粒子荧光是可观察到的，而pH敏感颗粒仅在噬菌体的低pH条件下荧光。然后，可以在沿背容器局部的细胞细胞中观察到荧光事件。我们专注于定位到背血管的细胞，它提供了一个解剖学上的里程碑，以定位已知有助于细菌清除的细胞，并持续隔离它们。然而，身体其他部位和淋巴的细胞对清除也很重要。虽然我们还没有研究这种细胞群，我们的一般程序也可以适用于这些细胞的噬菌体测定。我们方法的一个优点是，我们可以量化单个血细胞中的噬菌体事件，使我们能够检测噬菌体过程中的细微变化。其他通过角质18、19,19来可视化荧光事件的研究没有考虑到目前存在的细胞数量的差异，这一点在我们的例子中尤为重要，因为总的细胞计数预计将随着17岁的变化而变化。
Protocol
1. 收集和年龄恋童癖
- 要生成用于测试邻接细胞学的同龄F1苍蝇，在含有新鲜苍蝇食物的小瓶中加入5-10只处女母和5只适当基因型的雄性苍蝇。我们使用玉米粉糖蜜agar基食物20，但这种方法应该工作，无论类型的饮食苍蝇饲养。在这个实验中，我们使用海梅斯（他）-GAL4;UAS-GFP苍蝇在基因上标记了细胞。
注：可以使用更多的苍蝇，但一些D.黑色素气仪线在过度拥挤时可能交配或繁殖良好，过度拥挤可能对幼虫发育21和咽喉产生不良影响。 - 在所需的实验条件下保持苍蝇。对于这个实验，保持他-GAL4;UAS-GFP 在 24 °C 下飞行。允许成年苍蝇交配一周，然后去除成人。然后，F1苍蝇将被从这些小瓶中收集，经过实验使用。
- 收集一周中的处女苍蝇，或直到收集所需的苍蝇数量。不需要处女;然而，交配可能会影响免疫反应。如果F1苍蝇被测试为处女，分离雄性和雌性在8小时内分离，并保持在单独的小瓶，以防止交配。收集足够的苍蝇，允许评估每一个基因型/治疗/性别每个年龄至少10只苍蝇的噬菌体。
- 如果苍蝇老化到一周，则每向粒子（无论是氟粒子或pH敏感粒子）收集至少50只苍蝇，或每只处理条件20只苍蝇。这将确保实验时至少有10只苍蝇进行测定。
- 如果老化苍蝇超过3周，收集至少100-150苍蝇，或50-75苍蝇每治疗条件，以确保有足够的苍蝇可用于测量噬菌体。当老化苍蝇在实验室，我们通常使用昆虫笼保持在24°C在12：12 L：D条件，并改变食物每隔一天。如果小瓶被使用而不是笼子，小费每3-5天飞入新的小瓶，这取决于小瓶中的食物状况。所需苍蝇的数量将取决于对年龄噬菌体分析的较晚程度，以及该基因型在特定环境条件下的年龄特定生存率。
- 如果对幼蝇和年老苍蝇进行评估，应作相应计划，以便在同一天注射1周大和龄苍蝇。这将最大限度地减少实验之间粒子浓度的变化，并确保年龄对噬菌体测量的影响不会与执行测定当天的影响相混淆。
- 在24°C处将收集的苍蝇安置起来，直到它们5-7天大，或保持苍蝇达到预期年龄。
2. 准备荧光标记颗粒
- 将热杀的大肠杆菌氟粒或对pH敏感的大肠杆菌颗粒重组为库存浓度分别为20毫克/米或1毫克/米。其他细菌可用于可能更适合某些实验，但请参阅制造商的说明，说明适当的库存浓度。
- 对于氟颗粒，添加 990 μL 的 1x PBS （pH 7.4） 或首选缓冲液和 10 μL 2 mM （20%）阿齐德钠。漩涡混合。
注：氧化钠是一种防腐剂，可以省略;然而，没有氧化钠制备的颗粒不会持续太久。氟颗粒必须在24小时内使用，pH敏感颗粒必须在7天内使用。 - 对于 pH 敏感颗粒，添加 1，980 μL 的 1x PBS （pH 7.4） 或首选缓冲液和 20 μL 2 mM （20%）阿齐德钠。漩涡混合。
- 在 1.5 mL 微离心管中制造多个一次性 20 μL 等位。将氟颗粒储存在-20°C下长达一年，在4°C下储存pH敏感颗粒长达6个月，免受光照照射。
- 对于氟颗粒，添加 990 μL 的 1x PBS （pH 7.4） 或首选缓冲液和 10 μL 2 mM （20%）阿齐德钠。漩涡混合。
- 注射当天，在使用前从颗粒中取出氧化钠。为此，在室温下，在 15，000 x g下将颗粒离心 5 分钟。
- 通过在 50 μL 的 1x PBS 或首选缓冲液中重新悬浮，然后以 15，000 x g的离心机进行 5 分钟，从而去除上清液并洗涤颗粒两次。
- 第二次洗涤后，在 1x PBS 或首选缓冲液的 100 μL 或首选缓冲液中去除上清和重新悬浮颗粒。将溶液保存在管中，并在整个实验中尽量减少光线照射。去除氧化钠后，在24小时内使用氟颗粒，并在5-7天内使用pH敏感颗粒。
注：在以前的实验中，我们发现这种粒子的浓度提供了可数的噬菌体事件，血细胞可用于噬菌体的粒子数量并不限制17。然而，该协议的用户可能希望使用其他浓度比较结果，以确保在实验条件下，血液细胞可用于噬菌体化的粒子数量充足。- 如果省略了氧化钠，稀释粒子1：5中的颗粒，颗粒制备的缓冲液，用于注射。
- 在颗粒中加入一滴（±10 μL）的绿色食品着色。这使得它更容易确保苍蝇被注射。
3. 注射苍蝇
- 准备玻璃针进行注射。
- 使用移液器拉拔器拉玻璃针。将移液器拉拔器加热器设置为 55°C，将电磁阀设置为 45。仅使用喷油器随附的针头，因为不能保证其他针头以相同的精度工作。
- 用矿物油填充 1 mL 无菌注射器，并连接 30 仪表皮下 （G） 针，该针随纳米喷油器一起提供。
- 通过将 30 G 针插入拉取玻璃针的钝端并填充矿物油，将拉扯毛细管针头回填。慢慢取出 30 G 针，确保针内没有气泡，因为这可能导致注射量不准确。不回填针头，喷油器将无法正常工作。
- 使用钳子，切断针尖以创建一个开口，允许弹出溶液。
- 组装纳米喷射器。
注：可以使用其他喷油器。下面描述的方法适用于纳米注射器。有关其他喷油器，请参阅用户手册以获得说明。- 将喷油器设置为所需音量（在 46 nL 和 69 nL 之间）。
- 拆下小夹子，按该顺序将密封 O 环、正面朝上的白色垫圈接收针的后端，将较大的 O 环放在金属柱塞上。重新连接小夹头，无需拧紧。
- 将金属柱塞插入充满油的玻璃针的钝端。轻轻向下推针，将其插入更大的 O 圈。拧紧夹头，直到安全。
注： 如果金属柱塞没有延伸到小柱上，则按住"EMPTY"，直到柱塞可见。这样可以更轻松地确保柱塞插入针中。 - 按住"EMPTY"，直到喷油器发出蜂鸣音。这将从针中排出大部分矿物油，留下少量的油作为两种液体之间的屏障，并去除气泡。
- 将玻璃针尖插入含有制备颗粒的微离心管中，将针脚与荧光颗粒或pH敏感颗粒填充。
- 按住"FILL"，直到喷油器发出蜂鸣音。
- 注射
- 将要注入空小瓶的苍蝇转移到其中。将小瓶放入冰中来固定苍蝇。CO2也可用于固定苍蝇。但是，请注意，当使用 pH 敏感颗粒时，升高的 CO2水平可以人为地使正在使用的任何缓冲液酸化，并可提升背景荧光。
- 将苍蝇注射到胸部的子宫板中（图1A）。如果看到绿色染料进入苍蝇，注射是成功的（图1B）。如果苍蝇没有变绿，请确保针头没有堵塞。
注：或者，苍蝇可以注射在腹部，但保持注射部位在所有实验一致。 - 放置注射苍蝇到一个新的食物小瓶，注意到第一次和最后一只苍蝇被注射的时间。为了尽量减少实验误差，因为完成注射所需的时间，请及时完成注射。通过练习，注射一组苍蝇的时间不应超过 10 分钟。把小瓶放在它的一边，直到所有的苍蝇都恢复过来，以防止苍蝇被困在食物里。
- 根据实验条件，允许苍蝇恢复60-90分钟。在这里，使用了 60 分钟的恢复时间。请注意，这个恢复时间范围是最佳计数在霍恩等人研究17的实验条件下的噬菌体事件。然而，在某些情况下，这可能太长，无法检测治疗组之间的邻苯二甲组之间的邻苯二甲组之间的细微差异。进行时间过程实验可能很有用，就像之前17年所做的那样，以确定恢复时间，从而揭示控制和实验结果之间的最大差异。无论选择什么恢复时间，在所有实验性治疗中保持这一致性。
- 如果在同一天注射氟颗粒和pH敏感颗粒，则对每种溶液使用新针头。如果单个苍蝇都荧红，则不要用它们注入它们，因为结果不会区分噬菌体、粒子结合/吞没与邻苯甲a中颗粒的两个方面。
4. 解剖背船
- 苍蝇恢复60-90分钟后，将所有活苍蝇转移到一个空小瓶，在冰上固定。
- 一次将一只苍蝇转移到硅弹性体解剖板上。
注：如果在室温下固化，在使用前至少1周准备解剖板。为此，准备弹性体，并将其倒入 33 毫米 x 10 毫米培养皿中，将菜填充约一半。轻轻敲击平底面的菜，以尽量减少气泡。让盘子在室温下，不受干扰，至少一个星期。- 在解剖立体显微镜下，将苍蝇腹腔侧向上定向。
- 使用昆虫针，通过胸腔插入一个针，将另一个针插入腹部最后端，靠近生殖器的针脚，将苍蝇固定在盘子上（图2A）。在固定试样之前将针脚切成两半可能很有用，以免妨碍解剖。每个解剖板最多使用 10 个苍蝇重复上述步骤。
注：可选：在固定飞到板之前，先取下翅膀和腿。这将有助于防止在添加介质时在苍蝇周围形成气泡。 - 将所有苍蝇固定到板上后，添加足够的解剖介质，使用移液管子覆盖苍蝇 （±1 mL）。
- 使用钳子或角质剪刀，取下头部。
- 使用角质剪刀，使两个水平切口：一个直接在腹部后针上方，另一个在腹部最前端，胸部和腹部相遇（图2B，C）。在图 2中，头部保持不变以明确方向。
- 做一个垂直切口，连接两个水平切口（三个切口类似于字母I）。这将打开腹腔（图2D）。
- 使用钳子，去除内脏器官和组织，避免背水带。如果不受到干扰，经常可以看到透明背血管在腹部前端附近跳动。附加引脚可用于固定开开切口的新切割端（图 2E，F）。
- 使用角质剪刀，取出胸部。或者，在将解剖的角质和背带容器安装在显微镜滑道上之前，可以取出胸部。
- 对剩余的苍蝇重复上述步骤。 及时解剖苍蝇，尽量减少噬菌体率的可能变化。一旦所有苍蝇被解剖，将带有背船的角质固定在盘子上。所有步骤 5 都将在解剖板上执行。这将防止在步骤之间损坏或意外丢弃角质。
5. 固定和染色
- 用附着的背带容器在4%甲醛（PFA）中固定解剖的角质物。
- 对每个步骤使用新的一次性转移移液器，丢弃解剖介质，代之以 1 mL 4% PFA。在整个固定和染色过程中，尽可能保持解剖保护免受光线照射。
- 在室温下孵育15分钟，在20 rpm时摇动。不要让解剖在固定性下坐超过20分钟，因为这可能会开始损坏组织。
- 在 1x PBS 中洗涤角质 2 x = 0.1% 补间 （PBST）。
- 拆下固定式，并更换为 1 mL 的 1x PBST。
- 在室温下用摇动洗涤15分钟。
- 重复 1x。
注：经过解剖的固定组织可以储存在4°C下，长达3天，在第一次洗涤后，用新鲜的PBST代替洗涤，防止光线照射。如果使用抗体，请勿储存固定组织。抗体应与新鲜组织一起使用，以获得最佳效果。
- 可选：抗体染色。抗体可用于清晰地可视化背血管（图3），或检测细胞特定标记物。这可以确保只计算背血管上的细胞或标记血细胞的膜。
- 取出第二洗液，在适当的稀释时加入原抗体。在4°C孵育过夜，摇动。
- 去除原抗体，用PBST洗涤两次，用摇动洗涤15分钟。
- 添加荧光二次抗体。我们建议使用绿色荧光抗体，使其不会遮盖荧光颗粒。在室温下孵育2小时，摇动。
- 去除继发抗体，用PBST洗涤两次，每次洗涤15分钟。
- 使用 DAPI 染色。
- 取出最终洗涤，用在 PBST （1：1000） 中稀释的 1 mL DAPI 替换。
- 在室温下摇动，染色 20 分钟。
- 删除 DAPI，并洗涤 2x（重复步骤 5.2）。
- 用新鲜的 1x PBST 替换最终洗涤。
注：苍蝇可以储存在4°C，长达3天，保护免受光，第一次洗涤后，更换洗涤与新鲜的PBST。
6. 将角质片安装到显微镜幻灯片和成像上
- 准备解剖的角质。
- 在解剖立体显微镜下，切断可能干扰成像的过量切口。
- 使用钳子，将带连接背带容器的角质体转移到含有70%甘油的1.5mL微离心管中。将角质醇放入甘油有助于去除PBST，并允许在成像过程中获得更清晰的图像。
- 将角质片安装到显微镜滑轨上。
- 在显微镜幻灯片中加入几滴70%甘油。
- 使用钳子，从甘油管中取出角质，并放置在滑道上的甘油中。
- 在解剖立体显微镜下，使用钳子将角质侧侧定向，确保背船体可见。角质层的较暗颜料面朝下。
- 如果需要，再加一滴甘油。这有助于防止气泡，并允许更清晰的图像。
- 用指甲油轻轻将盖玻片放在角质和密封边缘。在继续之前，请干燥 10-15 分钟。立即成像苍蝇或储存在 4 °C 的防光箱中。
- 成像背船。
- 使用荧光显微镜，使用结构干涉系统生成背船的光学部分。共聚焦显微镜也可以使用，这可以提供额外的精度。使用 20x 目标和首选成像软件获取背船的 Z 堆栈图像。添加 10 mm 比例条，并将图像正确标记为 tiff 文件（图 4）或所需的格式。
注： 获得的 Z 堆栈图像的数量可能因剖面而异，具体取决于背船的解剖效果以及图像之间的所需步长大小。此处，步长尺寸设置为 0.49 mm。根据我们的经验，这个数字可以范围从每个堆栈3到40个图像。
- 使用荧光显微镜，使用结构干涉系统生成背船的光学部分。共聚焦显微镜也可以使用，这可以提供额外的精度。使用 20x 目标和首选成像软件获取背船的 Z 堆栈图像。添加 10 mm 比例条，并将图像正确标记为 tiff 文件（图 4）或所需的格式。
7. 分析图像
- 使用 ImageJ 量化荧光事件。
- 打开图像并堆叠它们：图像 = 堆栈 = 要堆叠的图像。
- 仅计算直径为10毫米的10毫米大小的荧光信号，以DAPI阳性核为中心，通过点击每飞至少10个细胞中的每个事件，每注入粒子类型至少10个苍蝇：插件 + 分析 + 细胞计数器通知（图5A）。单元格计数器通知工具为每个跟踪的单元格分配不同的颜色，带有一个彩色点，对应于该单元格内单击的每个荧光事件。
- 要列出与每个点关联的计数器和堆栈位置，请按"m"或选择"分析"选项卡下的"度量"，或显示结果表中每个单元格中计数的事件数，请按"alt _y"（图 5B）。
- 将单元格计数传输到电子表格以用于统计分析。
- 执行统计分析。
- 使用固定效果 ANOVA 或混合模型嵌套 ANOVA 分析邻形事件的差异。混合模型可用于测试年龄和基因型的主要固定效应以及嵌套在每个基因型17中的个体的随机效应。
注：调查人员应严格测试用于分析数据的任何统计程序的假设。
- 使用固定效果 ANOVA 或混合模型嵌套 ANOVA 分析邻形事件的差异。混合模型可用于测试年龄和基因型的主要固定效应以及嵌套在每个基因型17中的个体的随机效应。
Representative Results
为了说明描述的注射方法，图1A显示了果蝇黑色素气剂上的注射部位，以及食物染料如何允许视觉确认苍蝇被注射（图1B）。添加食物染料也有助于识别堵塞的针头。注射可以在腹部进行，但在整个实验中保持注射部位的一致性。这将有助于最大限度地减少每个实验之间可能的变化。
为了想象沿着背船在常驻细胞体内的荧光标记颗粒，我们解剖了背血管和附着的腹角。图 2A-F概述了解剖方法。
为了评估幼蝇和老年苍蝇进行邻系细胞炎的年龄特异性能力，使用荧光显微镜可视化了背带血管上的细胞。为了确保只计算背血管上的细胞，可以分别使用22、23、24,23,24用于某些血细胞标记或心脏特定胶原蛋白的抗体或GFP标记基因，如血素和血红素或Pericardin（图3）。荧光标记的大肠杆菌颗粒长度为1毫米，而细胞直径为10毫米17。只计算那些直径在10毫米的荧光事件，以DAPI阳性核为中心（图4）。为了量化荧光事件，使用了 ImageJ 软件（图 5）。
图 1：注射现场和视觉验证。（A） 胸腔的侧侧用拉毛细管针刺穿。（B） 注射通过添加绿色食品染料到颗粒溶液中进行目视验证。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：背船解剖。（A） 针脚被放置在胸部和后腹部（黑色箭头）。（B-C）两个水平切口（绿色箭头）在腹部的后端（B） 和前端 （C） 制成。（D） 一个垂直切口（绿色箭头）向下穿过腹部中间，连接两个水平切口。（E） 可选针 （*） 用于打开腹腔，露出内部组织。（F） 内组织（作物、肠道、子宫、卵巢、脂肪体）被切除，露出背血管。请点击此处查看此图形的较大版本。
图3：一名5周大的女性注射pH敏感颗粒，沾染着针对Pericardin（A）的抗体，对被解剖背带容器的腹腔视图A。点状白线勾勒出背船的侧侧，箭头指向前区域。（B） 放大的图像 （A）： 在背船的第一主动脉室内，有积极降解细菌的血细胞（蓝色箭头）簇。（C） 放大的图像 （A） 勾勒出细胞外基质 （ECM） 胶原蛋白般蛋白质， Pericardin （绿色箭头）， 容纳背血管的地方24.请点击此处查看此图形的较大版本。
图4：被解剖的背带容器和相关细胞从雌性苍蝇注入pH敏感颗粒，或氟颗粒。（A） 背侧容器和相关细胞与吞没的pH敏感标记大肠杆菌颗粒（红色），或（E）氟标记的大肠杆菌颗粒（红色），从1周老苍蝇分离，恢复60分钟后（B，F）放大的（A）和（E）（白色盒子），分别显示两个个体的囊肿与可计数的事件。（C） 背船和相关细胞与吞没pH敏感标记的大肠杆菌颗粒（红色），或（G）氟标记的大肠杆菌颗粒（红色），从5周大苍蝇分离，恢复60分钟后（D，H）放大内嵌（C）和（G）（白盒），分别显示两个个体的囊肿与计数事件。点状白线勾勒出背船的侧侧，箭头指向前区域。沾有DAPI（蓝色）的核。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 5：使用 ImageJ 中的细胞计数器对 10 mm 血细胞中的噬菌体事件进行量化。（A） 在 ImageJ 中打开图像后，"细胞计数器通知"工具可用于跟踪每个单元格的噬菌体事件。（B） 此工具将为选择要计数的每个单元格分配不同的颜色，每个点对应于该单元格中的荧光事件。按"alt_y"将显示一个表，显示每个单元格计数的事件数。请点击此处查看此图形的较大版本。
Discussion
此处描述的协议是在受控实验条件下量化噬菌体不同方面的可靠方法。我们注意到，我们只测试了这个程序与克阴性细菌颗粒和结果可能不同，如果使用克阳性细菌颗粒。事实上，将邻形细胞反应与克阴性和克阳性细菌在不同实验条件下进行比较会很有趣。使用纳米喷射器可以精确控制喷射量，确保每只苍蝇都注入相同体积的颗粒。协议的一个限制来自粒子制剂的不一致。粒子一旦冻结就会聚集，因此稀释体积的微小变化或缺乏涡流会影响实验之间的颗粒浓度。为了尽量减少不同年龄之间颗粒浓度的可能变化，使用相同的针头和颗粒溶液在同一天注射1周和5周大苍蝇是有益的。另一个潜在的缺点是，在解剖过程中，如果针脚处理不当，背船和/或角质体很容易被损坏。为避免干扰背船，请尽量减少每次解剖使用的针脚数量。这种解剖方法的优点是，所有固定、洗涤和染色步骤都可以在解剖板上执行。由于角质被固定下来，这可以防止角质在步骤之间丢失。
与现有方法18、19、25、26、27、28、29相比，所述协议有其优点和局限性。18,19,25,26,27,28,29通过解剖背血管，我们能够在此位置可视化和量化单个细胞。这使得可以检测实验组之间的邻形活动中的细微变化。其他方法通过收集血细胞/碎片测定1919，25，26，27，或通过完整的心室角,25,26,271818，19，28，29收集荧光标记粒子;,19,28,29然而，当通过背角质层可视化时，不能评估单个细胞。与出血/刮伤方法相比，该协议的优点是，我们的方法允许我们只评估与背血管相关的血细胞，并解释循环细胞或沿体壁的细胞，这在功能上可能不同。解剖背底容器也消除了包括第二轮注射与荧光淬火剂的需要，如Trypan蓝色19，26。19,这是因为任何不与细胞结合或被细胞吞没的颗粒在洗涤步骤中被冲走。相反，替代方法可能更容易执行，因为它们不需要解剖。虽然解剖背船很容易学习，但此步骤增加了一定程度的复杂性，在某些实验设计中可能并不可行。
虽然这种在体内的邻带性测定的描述是评估和量化不同年龄之间的噬菌体事件，但该协议具有很强的适应性，可用于分析基因型、性别或组织类型之间的噬菌体病的不同方面。由于噬菌体是大多数多细胞动物的中心重要性，了解这一过程如何随着年龄的增长而下降，可以导致对老龄化人群更好的治疗。这种方法为阐明免疫反应中与年龄相关变化的各个方面提供了长期潜力，并特别关注噬菌体。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家卫生研究院R03 AG061484-02和UMBC自然和数学科学学院Becton Dickinson教师研究基金的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.10 mm Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Here: pins are cut in half, and the sharp end is used |
| 1 mL sterile syringes | Becton Dickinson | 309602 | Filled with mineral oil to load needle |
| 15% Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | for dissection media |
| 16 % Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | EM-grade, 4% working, diluted in 1X PBS |
| 1x Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
| 3 mL Trasnfer Pipet | Falcon | 357524 | |
| 3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | 1.14mm O.D X 3.5" length X 0.53" I.D |
| 35x10 mm Petri dishes | Becton Dickinson | 351008 | Used as dissection plate, filled half way with Sylgard |
| 6x penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | for dissection media |
| 70% Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Analog Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
| Biological point forceps, Dumont No. 5 | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Life Technologies | D1306 | Diluted 1:1000 in 1x PBST |
| Drosophila strain | w[*]; P{w[+mC]=He-GAL4.Z}85, P{w[+mC]=UAS-GFP.nls}8 | ||
| E. coli (K-12 strain) BioParticles™, Alexa Fluor™ 594 conjugate | Life Technologies | E23370 | |
| Glass slides | Premiere | D17026102 | |
| Live cell imaging solution | Life Technologies | A14291DJ | preferred buffer for particle preparation and dilutions |
| Mineral oil | Mpbio | 194836 | |
| Nanoject II automatic nanoliter injector | Drummond | 3-000-204 | |
| Narrow Polystyrene Super Bulk Drosophila Vials | Genesee | 32-116SB | Size: 25 X 95 mm |
| Nutating Mixer | Fisher Scientific | 88-861-043 | Speed used: 20 rpm |
| pHrodo™ Red E. coli BioParticles™ Conjugate for Phagocytosis | Life Technologies | P35361 | |
| Schneider's Drosophila cell culture media (1x) | Gibco | 21720-024 | Dissection media, combine: Schneiders, FBS, and pen/strep; filter sterilize |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | 2mM (or 20%) working |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Prepare according to provided protocol |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | For PBS + 0.1% tween |
| Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 812368 | Heater: 55? Solenoid: 45 |
| Zeiss AxioImager.Z1 fluorescent microscope | Zeiss | Here: Apotome structural interference system with Zeiss Zen imaging software |
References
- Abhyankar, V., Kaduskar, B., Kamat, S. S., Deobagkar, D., Ratnaparkhi, G. S. Drosophila DNA/RNA methyltransferase contributes to robust host defense in ageing animals by regulating sphingolipid metabolism. The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 22 (2018).
- DeVeale, B., Brummel, T., Seroude, L. Immunity and aging: the enemy within. Aging Cell. 3 (4), 195-208 (2004).
- Gomez, C. R., Nomellini, V., Faunce, D. E., Kovacs, E. J. Innate immunity and aging. Experimental Gerontology. 43 (8), 718-728 (2008).
- Panda, A., et al. Human innate immunosenescence: causes and consequences for immunity in old age. Trends in Immunology. 30 (7), 325-333 (2009).
- Aw, D., Silva, A. B., Palmer, D. B. Immunosenescence: emerging challenges for an ageing population. Immunology. 120 (4), 435-446 (2007).
- Min, K. -J., Tatar, M. Unraveling the molecular mechanism of immunosenescence in Drosophila. International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), 2472 (2018).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
- Banerjee, U., Girard, J. R., Goins, L. M., Spratford, C. M. Drosophila as a genetic model for hematopoiesis. Genetics. 211 (2), 367-417 (2019).
- Rämet, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. B. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416 (6881), 644-648 (2002).
- Garschall, K., Flatt, T. The interplay between immunity and aging in Drosophila. F1000Research. 7, (2018).
- Brennan, C. A., Anderson, K. V. Drosophila: The genetics of innate immune recognition and response. Annual Review of Immunology. 22 (1), 457-483 (2004).
- Rosales, C., Uribe-Querol, E. Phagocytosis: a fundamental process in immunity. BioMed Research International. 9042851, Research article (2017).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (10), 781-795 (2008).
- Stuart, L., et al. A systems biology analysis of the Drosophila phagosome. Nature. 445 (7123), 95-101 (2007).
- Mackenzie, D. K., Bussière, L. F., Tinsley, M. C. Senescence of the cellular immune response in Drosophila melanogaster. Experimental Gerontology. 46 (11), 853-859 (2011).
- Horn, L., Leips, J., Starz-Gaiano, M. Phagocytic ability declines with age in adult Drosophila hemocytes. Aging Cell. 13 (4), 719-728 (2014).
- Elrod-Erickson, M., Mishra, S., Schneider, D. Interactions between the cellular and humoral immune responses in Drosophila. Current Biology. 10 (13), 781-784 (2000).
- Garg, A., Wu, L. P. Drosophila Rab14 mediates phagocytosis in the immune response to Staphylococcus aureus. Cellular Microbiology. 16 (2), 296-310 (2014).
- Bloomington Drosophila Stock Center: Indiana University Bloomington. , Available from: https://bdsc.indiana.edu/innformation/recipes/molassesfood.html (2019).
- Fellous, S., Lazzaro, B. P. Larval food quality affects adult (but not larval) immune gene expression independent of effects on general condition. Molecular Ecology. 19 (7), 1462-1468 (2010).
- Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2622-2627 (2003).
- Goto, A., et al. A Drosophila haemocyte-specific protein, hemolectin, similar to human von Willebrand factor. Biochemical Journal. 359, Pt 1 99-108 (2001).
- Cevik, D., Acker, M., Michalski, C., Jacobs, J. R. Pericardin, a Drosophila collagen, facilitates accumulation of hemocytes at the heart. Developmental Biology. 454 (1), 52-65 (2019).
- Ghosh, S., Mandal, S., Mandal, L. Detecting proliferation of adult hemocytes in Drosophila by BrdU incorporation and PH3 expression in response to bacterial infection. Wellcome Open Research. 3, (2018).
- Hao, Y., Yu, S., Luo, F., Jin, L. H. Jumu is required for circulating hemocyte differentiation and phagocytosis in Drosophila. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 95 (2018).
- Petraki, S., Alexander, B., Brückner, K. Assaying blood cell populations of the Drosophila melanogaster larva. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
- Gyoergy, A., et al. Tools allowing independent visualization and genetic manipulation of Drosophila melanogaster macrophages and surrounding Tissues. G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (3), 845-857 (2018).
- Bosch, P. S., et al. Blood cells of adult Drosophila do not expand, but control survival after bacterial infection by induction of Drosocin around their reservoir at the respiratory epithelia. BioRxiv. 578864, (2019).
