Summary
Nous présentons un protocole pour étiqueter et analyser les neurones pyramidaux, qui est essentiel pour évaluer les altérations morphologiques potentielles dans les neurones et les épines dendritiques qui peuvent sous-tendre les anomalies neurochimiques et comportementales.
Abstract
Il a été rapporté que la taille et la forme des épines dendritiques est liée à leur plasticité structurelle. Pour identifier la structure morphologique des neurones pyramidaux et des épines dendritiques, une technique d’étiquetage balistique peut être utilisée. Dans le protocole actuel, les neurones pyramidaux sont étiquetés avec le colorant DilC18(3) et analysés à l’aide d’un logiciel de reconstruction neuronale pour évaluer la morphologie neuronale et les épines dendritiques. Pour étudier la structure neuronale, l’analyse de branchement dendritique et l’analyse de Sholl sont exécutées, permettant aux chercheurs de tirer des inférences au sujet de la complexité de ramification dendritique et de la complexité neuronale d’arborescence, respectivement. L’évaluation des épines dendritiques est effectuée à l’aide d’un algorithme de classification assisté automatique faisant partie intégrante du logiciel de reconstruction, qui classe les épines en quatre catégories (c.-à-d. minces, champignons, stubby, filopode). De plus, trois autres paramètres (c.-à-d. longueur, diamètre de la tête et volume) sont également choisis pour évaluer les altérations de la morphologie de la colonne vertébrale dendritique. Pour valider le potentiel d’application large de la technique d’étiquetage balistique, les neurones pyramidaux de la culture cellulaire in vitro ont été étiquetés avec succès. Dans l’ensemble, la méthode d’étiquetage balistique est unique et utile pour visualiser les neurones dans différentes régions du cerveau chez les rats, ce qui, en combinaison avec un logiciel de reconstruction sophistiqué, permet aux chercheurs d’élucider les mécanismes possibles sous-jacents dysfonction neurocognitive.
Introduction
En 2000, Gan et coll. ont décrit une technique d’étiquetage rapide pour les neurones individuels et les glia dans le système nerveux qui a combiné divers colorants lipophiles, permettant l’étiquetage simultané de nombreuses cellules du cerveau avec des couleurs différentes1,2. Plus récemment, une technique d’étiquetage balistique a été décrite par Seabold et coll.3 qui a introduit des colorants fluorescents (Dil) dans les neurones des tranches de cerveau. Technique polyvalente de coloration, l’étiquetage balistique est apprécié pour sa capacité à être utilisée chez plusieurs espèces animales et à travers un large éventail d’âges. En outre, il peut être combiné avec l’immunostaining pour identifier les sous-populations des cellules du cerveau3. Par rapport aux techniques traditionnelles (p. ex., l’imprégnation argentée Golgi-Cox, microinjection)4, l’étiquetage balistique offre l’occasion de distinguer plus clairement les caractéristiques morphologiques, y compris les épines dendritiques, une caractéristique essentielle pour tirer des inférences sur la complexité neuronale et la connectivité synaptique5.
Les neurones pyramidaux excitatoires sont caractérisés par un seul, grand dendrite apical, de multiples dendrites basales plus courtes, et des milliers d’épines dendritiques6. Les neurones pyramidaux se trouvent dans plusieurs régions du cerveau liées au traitement cognitif de l’ordre supérieur, y compris le cortex préfrontal (PFC) et l’hippocampe. Dans le PFC, les neurones pyramidaux sont observés dans les couches II/III et la couche V, chacun présentant une morphologie unique. Plus précisément, les neurones pyramidaux dans la couche II/III du PFC ont un dendrite apique plus court et moins de ramification que les neurones pyramidaux dans la couche V6. Dans l’hippocampe, les neurones pyramidaux sont situés dans les régions CA1 et CA3, chacun affichant des morphologies distinctes. Plus précisément, les neurones pyramidaux dans la région de CA1 présentent un dendrite apical plus distinctif, avec la branche se produisant plus loin de la soma, par rapport à la région de CA36.
Les épines dendritiques sur les neurones pyramidaux dans le PFC et l’hippocampe sont le site primaire des synapses excitatrices7. Les caractéristiques morphologiques des épines dendritiques, qui sont classiquement caractérisées en trois catégories primaires (c.-à-d. minces, trapues, ou champignons8), ont été liées à la taille de la synapse excitatrice9. Les épines minces, caractérisées par un long cou mince, une petite tête bulbeuse et de plus petites densités postsynaptiques, sont plus instables et développent des connexions plus faibles. Cependant, les épines de champignon, qui ont une tête de colonne vertébrale dendritique plus grande, sont identifiées pour former des connexions synaptiques plus fortes, un effet résultant de leur plus grande taille. En contraste net, les épines trapues sont dépourvues d’un cou de la colonne vertébrale, présentant un rapport de volume de la tête et du cou à peu près égal8. Dans l’hippocampe, des épines ramifiées peuvent également être observées, auquel cas la colonne vertébrale a plusieurs têtes qui émergent du même cou de la colonne vertébrale dendritique10. Par conséquent, les changements morphologiques des épines dendritiques pourraient refléter la fonctionnalité et la capacité structurelle. En outre, des études ont démontré que la taille et la forme des épines dendritiques se rapportent à leur plasticité structurelle, conduisant à l’idée que les petites épines sont impliquées dans l’apprentissage et l’attention, tandis que de plus grandes épines plus stables, sont impliqués dans des processus à long terme, y compris la mémoire11. En outre, la distribution des épines dendritiques le long de la dendrite peut être associée à la connectivité synaptique5,12.
Ainsi, le présent document méthodologique a trois objectifs: 1) Présenter notre protocole d’étiquetage balistique, qui a été utilisé avec un taux de réussite (c’est-à-dire, neurones répondant aux critères de sélection et approprié pour l’analyse) de 83,3%5,12,13 et à travers les régions du cerveau multiples (c.-à-d., PFC, noyau accumbens, hippocampe); 2) Démontrer la généralisation de la technique et son application aux neurones cultivés in vitro; 3) Détail de la méthodologie utilisée dans le logiciel de reconstruction neuronale et les inférences qui peuvent être tirées à partir de ces données.
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Protocol
Tous les protocoles d’animaux ont été examinés et approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Caroline du Sud (numéro d’assurance fédéral : D16-00028).
1. Préparation de tubes de perles DiI/Tungsten
- Dissoudre 100 mg de polyvinylpyrrolidone (PVP) avec 10 ml de ddH2O. Vortex la solution PVP à la légère.
- Remplissez le tube avec la solution PVP (voir Tableau des matériaux) et laissez-le pendant 20 min. Ensuite, expulsez la solution PVP à l’autre extrémité de la tubulure à l’aide d’une seringue de 10 ml.
- Mélanger 170 mg de perles de microcarrier de tungstène avec 250 lil de chlorure de méthylène. Vortex la suspension de perle de tungstène à fond.
- Mélanger 6 mg de colorant lipophile DilC18(3) avec 300 lil de chlorure de méthylène. Vortex la solution de teinture DilC18(3) à fond.
REMARQUE : Effectuez les étapes 1.3-1.4 dans un capot de fumée. - Pipette 250 L de la suspension de perle de tungstène sur une glissière en verre. Attendez que la suspension soit sèche à l’air (3 min).
- Ajouter 300 L de solution de teinture DilC18(3) sur le dessus de la couche de suspension de perle de tungstène. Mélanger la solution de teinture DiIC18(3) et la suspension de perle de tungstène à fond avec une pointe de pipette et laisser sécher le mélange (3 min).
- Une fois séché, utiliser une lame de rasoir pour diviser le mélange en deux tubes de centrifugeuse de 1,5 mL. Remplir les tubes d’eau.
- Sonicate dans un bain d’eau (Amp I, 100%) jusqu’à consistance homogène (5 min). Assurez-vous que la pointe du sonicateur se trouve directement sur les tubes avec la suspension de perle.
- Mélanger les deux 1,5 ml de mélange homogénéisé dans un tube conique de 15 ml. Sonicate le mélange pour un autre 3 min.
- Dessiner le mélange de teinture de tungstène-DilC18(3) dans le tube enrobé de PVP à l’aide d’une seringue de 10 ml. Nourrir les tubes dans la station de préparation (voir Tableau des matériaux).
- Tourner pendant 1 min sur la station de préparation. Retirez soigneusement toute l’eau du tube à l’aide d’une seringue de 10 ml.
- Allumez le gaz azoté et ajustez le débit d’azote à environ 0,5 litre par minute (LPM), faites pivoter le tube dans la station de préparation et séchez avec de l’azote pendant 30 min.
- Retirer le tube de la station de préparation et couper en longueurs de 13 mm (correspondant à la taille de chargement de la cartouche) à l’aide d’un coupe-tubing. Gardez les longueurs de 13 mm dans les flacons scintillants dans l’obscurité.
2. Préparation des sections cérébrales
REMARQUE : Les rats mâles adultes F344/N étaient des rats de paire logés dans un environnement contrôlé sous un cycle clair:obscurité de 12/12 avec l’accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Tous les animaux ont été pris en charge à l’aide des lignes directrices établies par les National Institutes of Health dans le Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
- Anesthésiez profondément les rats à l’aide de 5 % de sévoflurane.
- Passez à l’étape suivante lorsque les rats ne sont pas sensibles aux stimuli nocifs et les réflexes sont absents.
- Fixez le rat en position de supine à l’intérieur d’une hotte chimique.
- Faire une incision à travers la peau le long de la ligne médiane thoracique. Séparer le diaphragme et ouvrir la poitrine avec des ciseaux. Insérez une aiguille de 20 G et 25 mm dans le ventricule gauche.
- Couper immédiatement l’oreillette droite avec des ciseaux. Perfuse 50 mL de 100 mM PBS avec un débit de 5 ml/min. Perfuse 100 ml de paraformaldéhyde de 4 % tamponné dans 100 mM PBS.
- Retirez tout le cerveau du rat juste après la perfusion.
- Postfix le cerveau entier pendant 10 min avec 4% de paraformaldéhyde.
REMARQUE : Ne pas postfixer dans 4% de paraformaldéhyde pendant plus de 30 minutes, car il affectera l’étiquetage. - Couper 500 m d’épaisseur sections coronales à l’aide d’une matrice du cerveau de rat (voir Tableau des matériaux). Faire la première coupe et garder la lame en place. Faire une deuxième coupe à l’aide d’une deuxième lame et enlever verticalement la première lame, en gardant le tissu sur la surface de la lame.
- Placer les tranches de cerveau dans une plaque de 24 puits avec 1 ml de PBS de 100 mM dans chaque puits. Répétez ce processus jusqu’à ce que toutes les tranches aient été coupées.
3. Étiquetage et visualisation balistiques des sections cérébrales
- Retirez le PBS de chaque puits ciblé.
- Chargez la cartouche avec un morceau de tuyauterie de perles DiI/Tungsten et placez-la dans l’applicateur.
- Mettez un morceau de papier filtre entre deux écrans en maille. Connectez l’applicateur au tuyau d’hélium. Ajuster la pression de sortie de l’hélium à 90 livres par pouce carré (psi).
- Placez l’applicateur verticalement à la main au centre du puits ciblé à une distance de 1,5 cm entre l’échantillon et l’écran de maille. Feu le tuyau de perles DiI/Tungsten.
REMARQUE: Assurez-vous de supprimer tous les PBS des puits ciblés avant le tournage. - Chargez la cartouche avec le prochain tube de perles DiI/Tungsten. Tirer continuellement les perles DiI/Tungstène de la tuyauterie sur les tranches restantes.
- Remplissez la plaque de 24 puits de 100 mM de PBS. Laver avec 500 L de frais 100 mM de PBS 3x. Ne laissez pas les tranches se retourner pendant le lavage avec PBS.
- Ajouter 500 L de PBS frais de 100 mM et garder les tranches à 4 oC dans l’obscurité pendant 3 h.
- Transférer les tranches de cerveau sur des toboggans en verre à l’aide d’une brosse fine.
REMARQUE : Trois sections cérébrales peuvent être transférées sur chaque lame de verre. - Ajouter immédiatement 1 ml d’antifade à montage moyen sur chaque section. Placez un housse de 22 mm x 50 mm sur les sections du cerveau. Sécher les toboggans en verre dans l’obscurité pendant 2 jours.
- Allumez le système de microscope confocal et passez à un objectif de 60 degrés.
- Réglez le système de microscope confocal pour avoir un grossissement de 60 '(A/1.4, huile) et un intervalle Z-plan de 0.15 'm (taille de trou d’épingle 30 'm, rétro-projeté rayon de trou d’épingle 167 nm). Utilisez une longueur d’onde de 543 nm pour acquérir des images des neurones d’intérêt.
- Obtenez des images Z-stack pour le type de neurone ciblé basé sur les limites de la région du cerveau et les caractéristiques morphologiques des neurones.
REMARQUE : Acquérir au moins trois images de chaque animal.
4. Utilisation de la méthodologie avec la culture cellulaire
- Isoler les neurones corticaux primaires des rats F344/N au premier jour postnatal en utilisant la méthodologie précédemmentrapportée 14.
- Culture principales neurones corticaux dans un plat de fond en verre de 35 mm pendant une semaine. Changer la moitié du milieu de culture avec le milieu de croissance de neurone frais au troisième jour après l’isolement. Laver le plat de fond de verre 2x avec 1 mL de 100 mM PBS.
- Fixer avec 4% de paraformaldéhyde pendant 15 minutes à température ambiante. Répétez les étapes 3.2-3.6 pour étiqueter balistiquement les cellules.
- Laver avec 1 mL de 100 mM PBS 3x. Ajouter 500 L de 100 mM frais de PBS et le garder à 4 oC dans l’obscurité pendant 3 h.
- Ajouter 200 L de milieu de montage d’antifade.
- Obtenez des images Z-stack pour chaque neurone ciblé en utilisant les paramètres de l’étape 3.10.
5. Analyse neuronale et quantification de la colonne vertébrale dendritique
- Neurones aveugles utilisant des numéros de code pour empêcher le biais d’expérimentateur.
- Établir des critères de sélection pour les neurones en fonction de la région cérébrale d’intérêt.
REMARQUE : Les critères de sélection des neurones comprennent la coloration dendritique continue, le bas fond, l’absence de grappes de colorant à l’intérieur des cellules, la diffusion minimale du colorant DiI dans l’espace extracellulaire, la morphologie correcte des neurones pyramidaux(figure 1). - Logiciel de reconstruction neuronale ouvert (Voir la vidéo ci-jointe 1).
- Chargez un fichier d’image en cliquant sur l’image «File Folder» dans le coin supérieur gauche.
- Cliquez sur "Soma" et marquez la sme des neurones sur l’image.
- Cliquez sur "Tree" et sélectionnez "User-Guided".
- Tracez toutes les branches d’intérêt dendritiques.
REMARQUE : Pour les neurones pyramidaux, qui sont caractérisés par un dendrite apique et de multiples dendrites basilaires, seul le dendrite apique est tracé. Assurez-vous que toutes les branches de connexion sont attachées les unes aux autres. - Cliquez sur "Spine".
- Définir les paramètres de détection et cliquez sur " Détectertous".
REMARQUE : Pour les tranches de cerveau, les paramètres cohérents utilisés dans les régions du cerveau sont : 2,0 (outer Range), 0.3 (hauteur minimale), 100% (sensibilité de détecteur), et 10 (compte minimum). Pour la culture cellulaire, il est nécessaire d’augmenter la sensibilité au détecteur et de diminuer le nombre minimum. - Classer les épines en sélectionnant «Classify All».
REMARQUE : Les épines dendritiques sont classées à l’aide d’un algorithme faisant partie intégrante du logiciel de reconstruction neuronale15. - Enregistrez le traçage en sélectionnant l’image de disque dans le coin supérieur gauche.
- Effectuez des analyses morphologiques neuronales et dendritiques de la colonne vertébrale.
- Logiciel d’analyse quantitative de reconstruction neuronale ouvert (Voir la vidéo ci-jointe 2).
- Chargez l’image en cliquant sur "File" et "Open Data File".
- Cliquez sur "Analyse" et "Analyse de structure ramifiée" pour analyser la morphologie neuronale et la morphologie de la colonne vertébrale dendritique.
- Pour la morphologie neuronale, cliquez sur "Tree Totals" et sélectionnez la case pour "Dendrite Totals".
- Pour la morphologie de la colonne vertébrale dendritique, cliquez sur "Spines" et sélectionnez ensuite la boîte pour "Spine Details".
- Enregistrez la sortie sous forme de fichier texte (.txt) en cliquant à droite sur la table de sortie et en sélectionnant «Enregistrer pour le fichier».
- Cliquez sur "Analyse" et "Analyse Sholl".
- Réglez le rayon de départ à 10 m et l’incrément de rayon à 10 m.
- Cliquez sur la case "Dendrites" et cliquez sur "Display".
- Enregistrez la sortie sous forme de fichier texte (.txt) en cliquant à droite sur la table de sortie et en sélectionnant « Enregistrer pour lefichier».
6. Analyse des données
- Analyser les données de morphologie neuronale (c.-à-d. complexité de branchement dendritique).
- Ajoutez le nombre de dendrites à chaque ordre de branche et divisez par le nombre total de dendrites. Multipliez par 100 pour calculer les fréquences relatives pour le nombre de dendrites à chaque commande de branche.
- Analyser les données d’analyse Sholl pour examiner la complexité neuronale de l’arborescence et la connectivité de la colonne vertébrale dendritique.
- Calculez l’erreur moyenne et standard de la moyenne pour le nombre d’intersections à chaque rayon.
- Résumez le nombre d’épines dépendantes du type de colonne vertébrale (c.-à-d. mince, trapue, champignon) à chaque rayon et divisez par le nombre total d’épines pour ce type de colonne vertébrale. Multipliez par 100 pour calculer les fréquences relatives pour le nombre d’épines à chaque rayon.
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Representative Results
Dans la figure 2A, les neurones pyramidaux typiques dans la région hippocampique dans les sections du cerveau de rat ont été identifiés par la technologie d’étiquetage balistique, caractérisée par un grand dendrite apical et plusieurs dendrites basales plus petites autour du soma. La figure 2B montre le neurone dans le logiciel d’analyse quantitative de reconstruction neuronale après que le soma ait été détecté, des branches dendritiques ont été tracées, et des épines ont été détectées. Par la suite, les données ont été analysées à l’aide d’un logiciel d’analyse quantitative de reconstruction neuronale, qui a permis d’évaluer la complexité de la ramification dendritique(figure 2C) et la complexité neuronale des arborescences(figure 2D).
Dans la figure 2C, nous avons utilisé la méthode de commande des branches centrifuges, recueillie à partir de la production « Arbor totals », pour compter le nombre de segments parcourus le long de chaque dendrite et l’ordre de branche assigné. La fréquence relative des segments à chaque commande de succursale a été examinée pour les commandes de succursales 1 à 15. Lorsque des changements dans la répartition des branches dendritiques ont été observés entre les groupes, des modifications dans la complexité de ramification dendritique pourraient être déduites. En outre, une analyse Sholl a été menée comme une mesure complémentaire de la complexité de l’arborescence neuronale, par laquelle le nombre d’intersections dendritiques se produisant tous les 10 m du soma a été quantifié dans chaque section d’échantillon(figure 2D). Quand des changements dans le nombre d’intersections dendritiques ont été observés entre les groupes, des altérations dans la complexité neuronale d’arborescence pourraient être déduites.
Les changements morphologiques dans les épines dendritiques pourraient être évalués à l’aide de la longueur (m), du diamètre de la tête (m) et du volume (m3),comme on peut le voir dans la figure 3AetB. En outre, les épines ont été classées à l’aide du système automatique de classification assistée dans le logiciel de reconstruction neuronale. La fréquence relative du nombre d’épines entre chaque rayon a été examinée pour les épines minces, de champignon et de chaume. Compte tenu de notre compréhension des types de colonne vertébrale forment des connexions synaptiques plus fortes (c.-à-d. champignon par rapport à stubby) et les afferents neurotransmetteurs, les changements dans la distribution des épines le long du neurone peuvent indiquer la connectivité synaptique.
En outre, nous avons validé l’utilité de la technique d’étiquetage balistique sur un neurone pyramidal primaire dans la culture cellulaire. Tout d’abord, nous avons cultivé les neurones hippocampiques primaires à la D1 postnatale (jour 1) sur une plaque de culture cellulaire enduite de poly-L-lysine pendant 2 semaines ou jusqu’à environ 70% de confluence. Ensuite, les échantillons ont été fixés avec 4% de PFA pour 15 min et lavé 2x avec PBS. À partir de l’étape 3.1 du protocole actuel, nous avons étiqueté et photographié les neurones pyramidaux primaires de l’hippocampe. Les données ont montré l’étiquetage stabilisé et identifié les neurones pyramidaux basés sur la forme triangle de la soma et le grand dendrite apical (figure 4A). L’utilisation du logiciel de reconstruction neuronale pour étudier les épines dendritiques des neurones pyramidaux primaires cultivés dans la culture cellulaire offre des possibilités similaires à celles du cerveau de rat. Exemple de résultats sont illustrés pour la distribution de fines épines dendritiques(figure 4B) et de longueur de la colonne vertébrale dendritique mesurée en m(figure 4C). Cependant, il est à noter que les neurones pyramidaux primaires cultivés dans la culture cellulaire avaient des ramifications moins dendritiques, empêchant l’évaluation, du moins dans cet exemple, de la complexité de ramification dendritique et de la complexité neuronale de l’arborescence.
Figure 1 : Critères de sélection utilisés pour les neurones pyramidaux du cortex préfrontal médial étiquetés à l’aide de la technologie d’étiquetage balistique. (A) Une image confocale représentative (60x) d’un neurone pyramidal bien étiqueté du cortex préfrontal médial. Un neurone pyramidal simple avec une soma claire et un dendrite apique incluait la coloration dendritique continue et lumineuse avec le bas fond. (B-C) Une image confocale représentative (60x) d’un neurone pyramidal du cortex préfrontal médial avec coloration de lumière aux branches plus distales (B) et arrière-plan élevé (C). (D) Une image confocale représentative (60x) d’un neurone étiqueté du cortex préfrontal médial (basé sur les coordonnées bregma) qui a des caractéristiques morphologiques erronées. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : L’étiquetage des neurones pyramidaux dans l’hippocampe (HIP) à l’aide de la technologie d’étiquetage balistique et des évaluations neuroanatomiques. (A) Trois images confocales représentatives (60x) de neurones pyramidaux étiquetés par des perles de tungstène balistique. (B) L’évaluation de la morphologie neuronale : analyse de l’ordre de branche dendritique et analyse de Sholl. L’image tracée de la colonne vertébrale dendritique dans laquelle la morphologie de la colonne vertébrale a également été identifiée à l’aide du logiciel d’analyse de la colonne vertébrale dendritique. (C) Analyses des ordonnances de branche utilisées pour examiner la fréquence relative des branches dendritiques à différents ordres de succursale. (D) Le nombre d’intersections dendritiques tous les 10 m du soma ont été évalués à l’aide de l’analyse Sholl comme mesure de la complexité neuronale des arborescences. Les données sont décrites comme des fréquences relatives de l’ensemble du jeu de données (C) ou s’adaptent à des intervalles de confiance de 95 %(D). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3. L’évaluation de la morphologie de la colonne vertébrale dendritique. (A-B) La distribution des épines dendritiques illustrée en fonction du type de colonne vertébrale (c.-à-d. mince, trapu, champignon). D’autres paramètres de la colonne vertébrale dendritique ont également été analysés (c.-à-d. longueur, volume, diamètre de tête) comme évaluation de la morphologie de la colonne vertébrale dendritique. Les données sont illustrées comme des fréquences relatives de l’ensemble du jeu de données. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4. L’étiquetage du neurone cortical primaire in vitro à l’aide de la technologie d’étiquetage balistique. (A) Images confocales représentatives (60x) des neurones corticaux primaires étiquetés par les perles de tungstène balistique in vitro. Exemple de résultats similaires à ceux acquis à partir de l’étiquetage balistique dans les tranches de cerveau sont montrés pour la distribution de fines épines dendritiques (B) et la longueur (C). Les données sont illustrées comme des fréquences relatives de l’ensemble du jeu de données. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Vidéo 1 : Procédures de traçage neuronal et détection de la colonne vertébrale dendritique. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit à télécharger.)
Vidéo 2 : Procédures de collecte et de sortie de données pour l’analyse quantitative. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit à télécharger.)
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Discussion
Dans ce protocole, nous décrivons une technique d’étiquetage polyvalente pour les neurones du cerveau de rat et ceux cultivés in vitro. En outre, nous rapportons la méthodologie pour utiliser le logiciel de reconstruction neuronale et le logiciel d’analyse quantitative de reconstruction neuronale pour évaluer la morphologie neuronale et les épines dendritiques. L’évaluation de la morphologie neuronale et des épines dendritiques fournit une occasion de déterminer des altérations dans la complexité de ramification dendritique, la complexité neuronale d’arborescence, la morphologie de la colonne vertébrale dendritique, et la connectivité synaptique.
Lors de la réalisation du protocole, les chercheurs doivent accorder une attention particulière à quelques étapes. Tout d’abord, la post-fixation en PFA à 4 % pendant trop longtemps endommagera l’intégrité de la membrane lipophile et causera la diétique à la fuite à l’extérieur des cellules. Deuxièmement, par rapport à la spécificité de l’étiquetage balistique dans les tranches de cerveau, qui ne cible que les neurones, l’étiquetage des neurones corticaux primaires in vitro introduit l’étiquetage non spécifique de la glia parce que l’étiquetage balistique dans les tranches de cerveau n’est pas spécifique pour un type de neurone (c.-à-d., neurone pyramidal, neurone spiny moyen, cellules de granule). Ainsi, les coordonnées bregma, les évaluations morphologiques ou les marqueurs cellulaires spécifiques doivent être combinés avec la méthode d’étiquetage balistique. Troisièmement, l’épaisseur des tranches cérébrales peut se situer entre 200 et 500 m; pour de meilleurs résultats, il devrait être optimisé. Quatrièmement, l’efficacité de l’étiquetage et de la pénétration du colorant est liée à de nombreux facteurs, tels que la pression de l’hélium, les temps d’incubation après l’application balistique, les perles DiI/Tungsten, la distance entre l’écran de maille et la surface des tranches de cerveau, etc. Le protocole doit être optimisé pour chaque étude. Cinquièmement, de grandes amas ou des grappes de perles de tungstène enduites de teinture balistique pendant la préparation doivent être évitées, parce que les touffes ne permettraient pas de distinguer les neurones individuels. Nous avons également déterminé que DiI diffuse à travers les neurones individuels plus complètement que DiO dans cette méthodologie balistique.
Néanmoins, par rapport aux méthodes d’étiquetagetraditionnelles 4, la technique d’étiquetage balistique rend possible l’imagerie confocale haute résolution, permettant l’évaluation de la morphologie neuronale et de la morphologie de la colonne vertébrale dendritique. En outre, le logiciel de reconstruction neuronale utilise un algorithme pour la classification assistée automatique des épines dendritiques (c.-à-d. minces, champignons, stubby), mesures de commande de branche, analyse classique de Sholl, et mesure des dispositifs morphologiques des épines dendritiques, telles que la longueur (m), le diamètre de tête (m), et le volume (m3). La quantification de plusieurs paramètres neuronaux offre l’occasion de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents au dysfonctionnement neurocognitif.
Dans l’ensemble, la méthode d’étiquetage balistique permet la visualisation des structures neuronales dans différentes régions du cerveau du rat et dans la culture cellulaire, ce qui est important pour élucider les mécanismes possibles sous-jacents dysfonction neurocognitive. Dans la présente étude, nous présentons une méthode pour étiqueter les neurones pyramidaux par une technique d’étiquetage balistique. En outre, combiné avec le logiciel de reconstruction neuronale, nous avons démontré la capacité d’examiner la morphologie neuronale et dendritique de la colonne vertébrale dans les neurones pyramidaux hippocampal. Les différences de groupe dans la morphologie neuronale et/ou dendritique de la colonne vertébrale fournissent l’occasion de comprendre les mécanismes sous-jacents au dysfonctionnement neurocognitif.
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Disclosures
Aucun des auteurs n’a de conflit d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par les subventions des NIH HD043680, MH106392, DA013137 et NS100624.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20Gx25mm PrecisionGlide needle | BD | 305175 | |
| 24-well cell culture plate | Costar | 3562 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Barrel liner | BIO-RAD | 165-2417 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Cartridge holder | BIO-RAD | 165-2426 | |
| Confocal imaging software | Nikon | EZ-C1 | version 3.81b |
| Confocal microscope | Nikon | TE-2000E | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| DilC18(3) | Fisher Scientific | D282 | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| F344 rat | (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) | ||
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Helios diffusion screens | BIO-RAD | 165-2475 | |
| Helios gene gun kit | BIO-RAD | 165-2411 | |
| Helios gene gun system | BIO-RAD | 165-2431 | |
| Helium hose assembly | BIO-RAD | 165-2412 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Methylene chloride | Fisher Scientific | D150-1 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| Neurolucida 360 software | mbf bioscience | dendritic spine analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher Scientific | 5295 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Fisher Scientific | P36930 | mounting medium |
| Rat brain matrix, 300 - 600g, Coronal, 0.5mm | Ted Pella | 15047 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Syringe kit | BIO-RAD | 165-2421 | |
| Tefzel tubing | BIO-RAD | 165-2441 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Tubing cutter | BIO-RAD | 165-2422 | |
| Tubing Prep station | BIO-RAD | 165-2418 | |
| Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm | BIO-RAD | 165-2269 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
References
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).
- Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
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- Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).
