Summary
Vi presenterar ett protokoll för att märka och analysera pyramidala nervceller, som är avgörande för att utvärdera potentiella morfologiska förändringar i nervceller och dendritiska ryggar som kan ligga till grund för neurokemiska och beteendemässiga avvikelser.
Abstract
Det har rapporterats att storleken och formen på dendritiska taggar är relaterad till deras strukturella plasticitet. För att identifiera den morfologiska strukturen av pyramidala nervceller och dendritiska taggar, en ballistisk märkning teknik kan utnyttjas. I det nuvarande protokollet, pyramidala nervceller är märkta med DilC18(3) färgämne och analyseras med neuronal återuppbyggnad programvara för att bedöma neuronal morfologi och dendritiska taggar. För att undersöka neuronal struktur, dendritiska förgrening analys och Sholl analys utförs, så att forskare att dra slutsatser om dendritiska förgrening komplexitet och neuronal arbor komplexitet, respektive. Utvärderingen av dendritiska taggar utförs med hjälp av en automatisk assisterad klassificering algoritm integrerad i återuppbyggnaden programvara, som klassificerar ryggar i fyra kategorier (dvs tunn, svamp, stubby, filopodia). Dessutom väljs ytterligare tre parametrar (dvs. längd, huvuddiameter och volym) också för att bedöma förändringar i dendritisk ryggrad morfologi. För att validera potentialen för bred tillämpning av ballistiska märkning teknik, pyramidala nervceller från in vitro cell kultur var framgångsrikt märkt. Sammantaget är ballistisk märkningsmetoden unik och användbar för att visualisera nervceller i olika hjärnregioner hos råttor, vilket i kombination med sofistikerad rekonstruktionsprogramvara gör det möjligt för forskare att belysa de möjliga mekanismerna bakom neurokognitiv dysfunktion.
Introduction
År 2000 beskrev Gan et al. en snabb märkningsteknik för enskilda nervceller och glia i nervsystemet som kombinerade olika lipofila färgämnen, vilket möjliggör samtidig märkning av många hjärnceller med olika färger1,2. På senare tid, en ballistisk märkning teknik beskrevs av Seabold et al.3 som introducerade fluorescerande färgämnen (Dil) i nervceller i hjärnan skivor. En mångsidig färgning teknik, ballistiska märkning uppskattas för sin förmåga att utnyttjas i flera djurarter och över ett brett spektrum av åldrar. Dessutom kan det kombineras med immunstainning för att identifiera subpopulationer av hjärnceller3. Jämfört med traditionella tekniker (t.ex. Golgi-Cox silver impregnering, microinjection)4, ballistiska märkning ger en möjlighet att tydligare skilja morfologiska egenskaper, inklusive dendritiska taggar, en funktion som är avgörande för att dra slutsatser om neuronal komplexitet och synaptisk anslutning5.
Excitatoriska pyramidala nervceller kännetecknas av en enda, stor apical dendrit, flera kortare basala dendriter, och tusentals dendritiska taggar6. Pyramidala nervceller finns i flera hjärnan regioner relaterade till högre ordning kognitiv bearbetning, inklusive prefrontala cortex (PFC) och hippocampus. I PFC, pyramidala nervceller observeras i lager II/III och lager V, med varje uppvisar unika morfologi. Specifikt, pyramidala nervceller i lager II / III av PFC har en kortare apikal dendrit och mindre förgrening än pyramidala nervceller i lager V6. Inom hippocampus, pyramidala nervceller finns i både CA1 och CA3 regioner, med varje visar distinkta morfologier. Specifikt, pyramidala nervceller i CA1 regionen uppvisar en mer distinkt apikal dendrit, med förgrening inträffar längre från soma, i förhållande till CA3 regionen6.
Dendritiska taggar på pyramidala nervceller i både PFC och hippocampus är den primära platsen för excitatoriska synapser7. Morfologiska egenskaper hos dendritiska taggar, som klassiskt kännetecknas i tre primära kategorier (dvs. tunn, stubbig eller svamp8), har varit relaterade till storleken på excitatoriska synaps9. Tunna taggar, som kännetecknas av en lång, tunn hals, små bulbous huvud, och mindre postsynaptiska densiteter, är mer instabila och utveckla svagare anslutningar. Svampryggar, som har ett större dendritiskt ryggradshuvud, är dock erkända för att bilda starkare synaptiska anslutningar, en effekt som härrör från deras större storlek. I skarp kontrast, stubby taggar saknar en ryggrad hals, uppvisar en ungefär lika huvud och hals volymförhållande8. Inom hippocampus, grenade taggar kan också observeras, där ryggraden har flera huvuden som kommer ut från samma dendritiska ryggraden hals10. Därför kan morfologiska förändringar av dendritiska taggar återspegla funktionalitet och strukturell kapacitet. Dessutom har studier visat att storleken och formen på dendritiska taggar relaterar till deras strukturella plasticitet, vilket leder till tanken att små taggar är involverade i lärande och uppmärksamhet, medan större, mer stabila taggar, är involverade i långsiktiga processer, inklusive minne11. Dessutom kan fördelningen av dendritiska taggar längs dendriten associeras med synaptisk anslutning5,12.
Således har den nuvarande metodologiska papper tre mål: 1) Presentera vårt protokoll för ballistiska märkning, som har utnyttjats med en framgång (dvs. nervceller som uppfyller urvalskriterier och lämpliga för analys) av 83,3%5,12,13 och över flera regioner i hjärnan (dvs. PFC, nucleus accumbens, hippocampus); 2) Visa generaliserbarhet av tekniken och dess tillämpning på nervceller odlas in vitro; 3) Detalj den metod som används i neuronal återuppbyggnad programvara och slutsatser som kan dras från sådana data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur protokoll granskades och godkändes av Animal Care and Use Committee vid University of South Carolina (federal försäkran nummer: D16-00028).
1. Beredning av DiI/Volframpärla slangar
- Lös 100 mg polyvinylpyrrolidon (PVP) med 10 ml ddH2O. Vortex PVP-lösningen lätt.
- Fyll slangen med PVP-lösningen (se Tabell över material)och låt den stå i 20 minuter. Sedan, utvisa PVP-lösningen genom den andra änden av slangen med en 10 ml spruta.
- Kombinera 170 mg volframmikrokarärpärlor med 250 μl metylenklorid. Vortex volfram pärla suspension grundligt.
- Kombinera 6 mg lipofila DilC18(3) färgämne med 300 μL metylenklorid. Vortex DilC18(3) färgämne lösning noggrant.
OBS: Utför steg 1.3–1.4 i en rökhuva. - Pipettera 250 μL av volframpärlfjädringen på en glasrutschbana. Vänta tills fjädringen är lufttorkad (~3 min).
- Tillsätt 300 μl DilC18(3) färglösning på toppen av volframprästsuset. Blanda DiIC18(3) färglösning och volfram pärla suspension noggrant med en pipett spets och låt blandningen lufttorka (~ 3 min).
- När torkat, använd ett rakblad för att dela blandningen i två 1,5 ml centrifugrör. Fyll rören med vatten.
- Sonicate i ett vattenbad (Amp I, 100%) tills homogen (~5 min). Se till att ljudapparatens spets ligger direkt på rören med pärlfjädringen.
- Kombinera de två 1,5 ml homogeniserad blandning i en 15 ml konisk rör. Sonikera blandningen i ytterligare 3 min.
- Dra volframpärlor-DilC18(3) färgämne blandningen i PVP-belagda slangar med hjälp av en 10 ml spruta. Mata in slangen i beredningsstationen (se Tabell över material).
- Rotera i 1 min på beredningsstationen. Ta försiktigt ut allt vatten ur slangen med en 10 ml spruta.
- Slå på kvävegasen och justera kväveflödet till cirka 0,5 liter per minut (LPM), rotera slangen i beredningsstationen och torka med kväve i 30 min.
- Ta bort slangen från beredningsstationen och skär i 13 mm längder (som motsvarar patronens laststorlek) med hjälp av en slangfräs. Håll de 13 mm långa längderna i scintillationsflaska i mörker.
2. Beredning av hjärnsektioner
OBS: Vuxna handjur F344/N råttor var par inrymt i en kontrollerad miljö under en 12/12 ljus: mörk cykel med ad libitum tillgång till mat och vatten. Alla djur togs om hand med hjälp av riktlinjer som fastställts av National Institutes of Health i Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
- Djupt söva råttor med 5% sevofluran.
- Fortsätt till följande steg när råttorna inte är mottagliga för skadliga stimuli och reflexer saknas.
- Säkra råttan i ryggläge inuti en kemisk rökhuva.
- Gör ett snitt genom huden längs bröst mittlinjen. Separera membranet och öppna bröstet med sax. Sätt in en 20 G × 25 mm nål i den vänstra ventrikeln.
- Skär omedelbart höger atrium med sax. Perfuse 50 ml 100 mM PBS med 5 ml/min flöde. Perfuse 100 ml 4% paraformaldehyd buffrad i 100 mM PBS.
- Ta bort hela råtthjärna direkt efter perfusion.
- Postfix hela hjärnan i 10 min med 4% paraformaldehyd.
OBS: Postfix inte i 4% paraformaldehyd i mer än 30 min, eftersom det kommer att påverka märkningen. - Skär 500 μm tjocka koronarsektioner med hjälp av en råttahjärnematris (se Tabell över material). Gör det första snittet och håll bladet på plats. Gör ett andra snitt med ett andra blad och ta bort det första bladet vertikalt och håll vävnaden på bladytan.
- Placera hjärnan skivor i en 24 väl platta med 1 ml 100 mM PBS i varje brunn. Upprepa denna process tills alla segment har skurits ned.
3. Ballistisk märkning och visualisering av hjärnsektioner
- Ta bort PBS från varje riktad brunn.
- Ladda patronen med en bit DiI/Tungstenspädsrör och placera den i applikatorn.
- Lägg ett filterpapper mellan två nätskärmar. Anslut applikatorn till heliumslangen. Justera utmatningstrycket på helium till 90 pounds per kvadrattum (psi).
- Placera applikatorn vertikalt för hand på mitten av den riktade brunnen på ett avstånd av 1,5 cm mellan provet och nätskärmen. Avfyra DiI/Tungstenspärlorna.
OBS: Var noga med att ta bort alla PBS från riktade brunnar innan du fotograferar. - Ladda patronen med nästa DiI/Tungsten pärlslang. Avfyra kontinuerligt DiI/Volframpärlorna från slangen på de återstående skivorna.
- Fyll 24 brunnsplattan med 100 mM PBS. Tvätta med 500 μl färsk 100 mM PBS 3x. Låt inte skivorna vända på under tvättning med PBS.
- Tillsätt 500 μl färsk 100 mM PBS och håll skivorna vid 4 °C i mörker i 3 timmar.
- Överför hjärnan skivor på glasskivor med hjälp av en fin borste.
OBS: Tre hjärnsektioner kan överföras till varje glasrutschbana. - Tillsätt omedelbart 1 ml antifade monteringsmedium på varje sektion. Placera en 22 mm x 50 mm täckslip över hjärnsektionerna. Torka glasglaset i mörker i 2 dagar.
- Slå på konfokalmikroskopsystemet och växla till ett 60× mål.
- Ställ in konfokalmikroskopsystemet så att det har en förstoring på 60× (A/1,4, olja) och ett Z-planintervall på 0,15 μm (hålstorlek 30 μm, bakåtprojekterad hålradie 167 nm). Använd en 543 nm våglängd för att förvärva bilder av nervceller av intresse.
- Få Z-stack bilder för riktade neuron typ baserat på hjärnan region gränser och morfologiska egenskaper nervceller.
OBS: Skaffa minst tre bilder fromm varje djur.
4. Användning av metoden med cellodling
- Isolera primära när nervceller från F344/N råttor på postnatal dag ett med hjälp av tidigare rapporterade metod14.
- Kultur primära när nervceller i en 35 mm glas botten skålen för en vecka. Ändra hälften av odlingsmediet med färsk neuron tillväxtmedium på tredje dagen efter isolering. Tvätta glasbottenskålen 2x med 1 ml 100 mM PBS.
- Fix med 4% paraformaldehyd i 15 min vid rumstemperatur. Upprepa steg 3.2–3.6 för att märka cellerna ballistiskt.
- Tvätta med 1 ml 100 mM PBS 3x. Tillsätt 500 μl färsk 100 mM PBS och håll den vid 4 °C i mörker i 3 timmar.
- Tillsätt 200 μL antifade monteringsmedium.
- Skaffa Z-stack bilder för varje riktad neuron med hjälp av parametrarna i steg 3.10.
5. Neuronal analys och dendritisk ryggrad kvantifiering
- Blinda nervceller med kodnummer för att förhindra experimentör bias.
- Fastställa urvalskriterier för nervceller baserat på hjärnan region av intresse.
OBS: Urvalskriterier för nervceller inkluderar kontinuerlig dendritisk färgning, låg bakgrund, inga färgkluster inuti cellerna, minimal diffusion av DiI-färgämnet i det extracellulära utrymmet, korrekt morfologi av pyramidal nervceller (figur 1). - Öppen neuronal rekonstruktion programvara (Se bifogade Video 1).
- Läs in en bildfil genom att klicka på bilden "Arkivmapp" i det övre vänstra hörnet.
- Klicka på "Soma" och markera soma av nervceller på bilden.
- Klicka på "Träd" och välj "Användarstyrd".
- Spåra alla dendritiska grenar av intresse.
OBS: För pyramidala nervceller, som kännetecknas av en apical dendrite och flera basilar dendriter, endast denaptiska dendrit spåras. Kontrollera att alla anslutande grenar är anslutna till varandra. - Klicka på "Ryggrad".
- Definiera identifieringsparametrar och klicka på "Identifiera alla".
OBS: För hjärnan skivor, de konsekventa parametrar som används över hjärnan regioner är: 2,0 (Outer Range), 0,3 (minsta höjd), 100% (Detector Sensitivity) och 10 (Minsta antal). För cellodling är det nödvändigt att öka detektorkänsligheten och minska det minsta antalet. - Klassificera taggar genom att välja "Klassificera alla".
OBS: Dendritiska taggar klassificeras med hjälp av en algoritm integrerad i neuronal återuppbyggnad programvara15. - Spara spårning genom att välja diskbilden i det övre vänstra hörnet.
- Utför neuronala och dendritiska ryggraden morfologiska analyser.
- Öppen kvantitativ analys av kvantitativ analys av neuronal rekonstruktion (se bifogad video 2).
- Läs in bilden genom att klicka på "Arkiv" och "Öppna datafil".
- Klicka på "Analys" och "Branched Structure Analysis" för att analysera neuronal morfologi och dendritisk ryggrad morfologi.
- För neuronal morfologi klickar du på "Trädsummor" och väljer rutan för "Dendrite Totals".
- För dendritisk ryggradsmorfologi klickar du på "Spines" och väljer sedan rutan för "Spine Details".
- Spara utdata som en textfil (.txt) genom att högerklicka på utdatatabellen och välja "Spara i fil".
- Klicka på "Analysera" och "Sholl Analysis".
- Ställ in startradien på 10 μm och radieökningen till 10 μm.
- Klicka på rutan "Dendrites" och klicka på "Visa".
- Spara utdata som en textfil (.txt) genom att högerklicka på utdatatabellen och välja "Spara i fil".
6. Dataanalys
- Analysera neuronal morfologi (dvs. dendritic förgrening komplexitet) data.
- Lägg till antalet dendriter vid varje grenordning och dividera med det totala antalet dendriter. Multiplicera med 100 för att beräkna de relativa frekvenserna för antalet dendriter vid varje grenordning.
- Analysera Sholl analysdata för att undersöka neuronal arbor komplexitet och dendritiska ryggraden anslutning.
- Beräkna medelvärdet och standardfelet för medelvärdet för antalet korsningar vid varje radie.
- Summera antalet taggar beroende på ryggradstyp (t.ex. tunn, stubbig, svamp) vid varje radie och dividera med det totala antalet taggar för den ryggradstypen. Multiplicera med 100 för att beräkna de relativa frekvenserna för antalet taggar vid varje radie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 2Aidentifierades de typiska pyramidala nervcellerna i hippocampus regionen i råttahjärnans sektioner av ballistiska märkningsteknik, som kännetecknas av en stor apical dendrite och flera mindre basala dendriter runt soma. Figur 2B visar neuronal återuppbyggnad kvantitativ analys programvara efter soma upptäcktes, dendritiska grenar spårades och ryggar upptäcktes. Därefter analyserades data med hjälp av neuronal återuppbyggnad kvantitativ analys programvara, som gav en möjlighet att bedöma dendritiska förgrening komplexitet (Figur 2C) och neuronal berså komplexitet (Figur 2D).
I figur 2Canvände vi centrifugalgrensordningen, som samlats in från utdata för "Trädsumtal", för att räkna antalet segment som korsas längs varje dendrit och tilldelad grenorder. Den relativa frekvensen av segment vid varje filialorder undersöktes för branchorder 1–15. När förändringar i fördelningen av dendritiska grenar observerades mellan grupper, kan förändringar i dendritiska förgrening komplexitet härledas. Dessutom genomfördes en Sholl-analys som ett kompletterande mått på komplexiteten i neuronalskarslar, där antalet dendritiska korsningar som inträffade var 10 μm från soma kvantifierades i varje provavsnitt (figur 2D). När förändringar i antalet dendritiska korsningar observerades mellan grupper, ändringar i neuronal arbor komplexitet kunde härledas.
Morfologiska förändringar i dendritiska taggar kan bedömas med hjälp av längd (μm), huvuddiameter (μm) och volym (μm3), vilket framgår av figur 3A–B. Dessutom klassificerades ryggar med hjälp av det automatiska assisterade klassificeringssystemet i neuronal återuppbyggnad programvara. Den relativa frekvensen av antalet taggar mellan varje radie undersöktes för tunna, svamp och stubby ryggar. Med tanke på vår förståelse för vilka ryggradstyper bildar starkare synaptiska anslutningar (dvs. svamp i förhållande till stubby) och signalsubstans afferenter, förändringar i fördelningen av taggar längs neuron kan indikera synaptisk anslutning.
Dessutom validerade vi nyttan av ballistiska märkning teknik på en primär pyramidal neuron i cellkultur. Först odlade vi primära hippocampus nervceller vid postnatala D1 (dag 1) på en cell kultur platta belagd med poly-L-lysin i 2 veckor eller tills cirka 70% konfluensitet. Därefter fixerades proverna med 4% PFA i 15 min och tvättades 2x med PBS. Med början i steg 3.1 i det nuvarande protokollet, vi ballistiskt märkt och avbildade den primära pyramidala nervceller från hippocampus. Data visade stabiliserad märkning och identifierade pyramidala nervceller baserat på triangeln formen av soma och stora apikal dendrit (figur 4A). Utnyttjande av neuronal återuppbyggnad programvara för att undersöka dendritiska taggar av primära pyramidala nervceller odlas i cellkultur erbjuder möjligheter som liknar dem i råtta hjärnan. Exempel resultat illustreras för fördelningen av tunna dendritiska taggar (figur 4B) och dendritisk rygglängd mätt i μm (figur 4C). Emellertid, Det är anmärkningsvärt att den primära pyramidala nervceller odlas i cellkultur hade mindre dendritic förgrening, utesluter bedömningen, åtminstone i detta exempel, av dendritiska förgrening komplexitet och neuronal berså komplexitet.
Figur 1: Urvalskriterier som används för pyramidala nervceller i den mediala prefrontala cortex märkt med hjälp av ballistisk märkningsteknik. (A) En representativ confocal bild (60x) av en väl märkt pyramidal neuron från den mediala prefrontala cortex. En enda pyramidal neuron med en klar soma och apical dendrit ingår kontinuerlig, ljusa dendritiska färgning med låg bakgrund. (B–C) En representativ konfokal bild (60x) av en pyramidal neuron från den mediala prefrontala cortex med ljus färgning på de mer distala grenar (B) och hög bakgrund (C). (D)En representativ konfokal bild (60x) av en märkt neuron från den mediala prefrontala cortex (baserat på Bregma koordinater) som har bristfälliga morfologiska egenskaper. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Märkning av pyramidala nervceller i hippocampus (HIP) med hjälp av ballistisk märkning teknik och neuroanatomiska bedömningar. (A) Tre representativa confocal bilder (60x) av pyramidala nervceller märkta av ballistiska volfram pärlor. (B)Bedömning av neuronal morfologi: dendritiska gren ordning analys och Sholl analys. Den spårade bilden av dendritiska ryggraden där ryggraden morfologi identifierades också med hjälp av dendritiska ryggraden analys programvara. (C)Branch orderanalyser som används för att undersöka den relativa frekvensen av dendritiska grenar vid olika filialorder. (D)Antalet dendritiska korsningar var 10 μm från soma bedömdes med Sholl analys som ett mått på neuronal arbor komplexitet. Data beskrivs som relativa frekvenser för hela datauppsättningen (C) eller passar med 95% konfidensintervall (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3. Bedömningen av dendritiska ryggraden morfologi. (A–B) Fördelningen av dendritiska taggar illustreras som en funktion av ryggraden typ (dvs tunn, stubbig, svamp). Ytterligare dendritiska ryggraden parametrar analyserades också (dvs längd, volym, huvud diameter) som en bedömning av dendritiska ryggraden morfologi. Data illustreras som relativa frekvenser för hela datauppsättningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4. Märkning av primära när neuron in vitro med hjälp av ballistiska märkning teknik. (A)Representativa konfokala bilder (60x) av primära när nervceller märkta med ballistiska volframpärlor in vitro. Exempel resultat som liknar dem som förvärvats från ballistiska märkning i hjärnan skivor visas för fördelningen av tunna dendritiska taggar (B) och längd (C). Data illustreras som relativa frekvenser för hela datauppsättningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: Förfaranden för neuronal spårning och dendritiska ryggraden upptäckt. Klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video 2: Förfaranden för insamling av uppgifter och utdata för kvantitativ analys. Klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll beskriver vi en mångsidig märkningsteknik för nervceller från både råttahjärna och de som odlas in vitro. Dessutom rapporterar vi metoden för att utnyttja neuronal återuppbyggnad programvara och neuronal återuppbyggnad kvantitativ analys programvara för att bedöma neuronal morfologi och dendritiska taggar. Bedömning av neuronal morfologi och dendritiska ryggar ger en möjlighet att bestämma förändringar i dendritiska förgrening komplexitet, neuronal arbor komplexitet, dendritiska ryggraden morfologi och synaptisk anslutning.
När de utför protokollet bör forskarna ägna särskild uppmärksamhet åt några steg. För det första, efter fixering i 4% PFA för länge kommer att skada integriteten hos lipofila membranet och orsaka färgämnet att läcka utanför cellerna. För det andra, jämfört med specificiteten av ballistiska märkning i hjärnan skivor, som riktar sig endast nervceller, märkning av primära när nervceller in vitro introducerar ospecificerad märkning av glia eftersom ballistiska märkning i hjärnan skivor är inte specifik för en typ av neuron (dvs. pyramidal neuron, medium taggiga neuron, granulat cell). Bregma-koordinater, morfologiska bedömningar eller specifika cellmarkörer bör därför kombineras med ballistiska märkningsmetoden. För det tredje kan tjockleken på hjärnan skivor vara mellan 200-500 μm; för bästa resultat bör den optimeras. För det fjärde är effektiviteten i märkning och färgpenetration relaterad till många faktorer, såsom heliumtryck, inkuberingstider efter ballistisk applicering, DiI/Tungsten-pärlorna, avståndet mellan nätskärmen och ytan av hjärnskivor etc. Protokollet bör optimeras för varje studie. Femte, stora klumpar eller kluster av ballistiska färgämne belagda volfram pärlor under förberedelserna måste undvikas, eftersom klumpar inte skulle tillåta enskilda nervceller att skiljas. Vi bestämde också att DiI sprider sig i hela enskilda nervceller mer fullständigt än DiO i denna ballistiska metod.
Ändå, jämfört med traditionella märkningsmetoder4, gör ballistiska märkning teknik högupplösta confocal imaging möjligt, möjliggör bedömning av neuronal och dendritiska ryggraden morfologi. Dessutom använder neuronal rekonstruktion programvara en algoritm för automatisk assisterad klassificering av dendritiska taggar (dvs tunn, svamp, stubby), gren beställning mätningar, klassisk Sholl analys, och mätning av morfologiska funktioner i dendritiska taggar, såsom längd (μm), huvud diameter (μm), och volym (μm3). Kvantifieringen av flera neuronala parametrar ger en möjlighet att bättre förstå de mekanismer som ligger till grund för neurokognitiv dysfunktion.
Övergripande, ballistiska märkning metoden tillåter visualisering av neuronala strukturer i olika hjärnregioner av råtta och i cellkultur, vilket är viktigt att belysa de möjliga mekanismerna bakom neurokognitiv dysfunktion. I den aktuella studien presenterar vi en metod för att märka pyramidala nervceller med en ballistisk märkningsteknik. Dessutom, i kombination med neuronal återuppbyggnad programvara, vi visat förmågan att undersöka neuronal och dendritic ryggraden morfologi i hippocampus pyramidala nervceller. Grupp skillnader i neuronal och/eller dendritiska ryggraden morfologi ger en möjlighet att förstå de mekanismer som ligger till grund för neurokognitiv dysfunktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av författarna har intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av NIH bidrag HD043680, MH106392, DA013137 och NS100624.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20Gx25mm PrecisionGlide needle | BD | 305175 | |
| 24-well cell culture plate | Costar | 3562 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Barrel liner | BIO-RAD | 165-2417 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Cartridge holder | BIO-RAD | 165-2426 | |
| Confocal imaging software | Nikon | EZ-C1 | version 3.81b |
| Confocal microscope | Nikon | TE-2000E | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| DilC18(3) | Fisher Scientific | D282 | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| F344 rat | (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) | ||
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Helios diffusion screens | BIO-RAD | 165-2475 | |
| Helios gene gun kit | BIO-RAD | 165-2411 | |
| Helios gene gun system | BIO-RAD | 165-2431 | |
| Helium hose assembly | BIO-RAD | 165-2412 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Methylene chloride | Fisher Scientific | D150-1 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| Neurolucida 360 software | mbf bioscience | dendritic spine analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher Scientific | 5295 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Fisher Scientific | P36930 | mounting medium |
| Rat brain matrix, 300 - 600g, Coronal, 0.5mm | Ted Pella | 15047 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Syringe kit | BIO-RAD | 165-2421 | |
| Tefzel tubing | BIO-RAD | 165-2441 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Tubing cutter | BIO-RAD | 165-2422 | |
| Tubing Prep station | BIO-RAD | 165-2418 | |
| Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm | BIO-RAD | 165-2269 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
References
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).
- Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Spacek, J. Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections. Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).
- McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era. Science Reports. 9 (1), 827 (2019).
- Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
- Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).
- Harris, K. M., Sultan, P. Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses. Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).
- Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation. Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).
- Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging. Neuroscience. 251, 129-140 (2012).
- McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).
- Roscoe, R. F. Jr, Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).
- Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (108), e53697 (2016).
- Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).
