Summary
Wir präsentieren ein Protokoll zur Kennzeichnung und Analyse pyramidaler Neuronen, das für die Bewertung potenzieller morphologischer Veränderungen in Neuronen und dendritischen Stacheln, die neurochemischen und verhaltensbedingten Anomalien zugrunde liegen können, entscheidend ist.
Abstract
Es wurde berichtet, dass die Größe und Form der dendritischen Stacheln mit ihrer strukturellen Plastizität zusammenhängt. Um die morphologische Struktur von pyramidenförmigen Neuronen und dendritischen Stacheln zu identifizieren, kann eine ballistische Etikettierungstechnik verwendet werden. Im vorliegenden Protokoll werden pyramidale Neuronen mit DilC18(3)-Farbstoff gekennzeichnet und mit neuronaler Rekonstruktionssoftware analysiert, um neuronale Morphologie und dendritische Stacheln zu bewerten. Zur Untersuchung der neuronalen Struktur werden dendritische Verzweigungsanalysen und Sholl-Analysen durchgeführt, die es den Forschern ermöglichen, Rückschlüsse auf die dendritische Verzweigungskomplexität bzw. die neuronale Arbor-Komplexität zu ziehen. Die Auswertung der dendritischen Stacheln erfolgt mit einem automatischen assistierten Klassifizierungsalgorithmus, der zur Rekonstruktionssoftware integriert ist und die Stacheln in vier Kategorien einreibt (d. h. dünn, Pilz, stumpf, filopodia). Darüber hinaus werden weitere drei Parameter (z. B. Länge, Kopfdurchmesser und Volumen) ausgewählt, um Veränderungen in der dendritischen Wirbelsäulenmorphologie zu bewerten. Um das Potenzial einer breiten Anwendung der ballistischen Etikettierungstechnik zu validieren, wurden pyramidale Neuronen aus der In-vitro-Zellkultur erfolgreich gekennzeichnet. Insgesamt ist die ballistische Etikettierungsmethode einzigartig und nützlich für die Visualisierung von Neuronen in verschiedenen Hirnregionen bei Ratten, was es Forschern ermöglicht, die möglichen Mechanismen zu klären, die neurokognitive Dysfunktion.
Introduction
Im Jahr 2000 beschrieben Gan et al. eine schnelle Etikettierungstechnik für einzelne Neuronen und Glia im Nervensystem, die verschiedene lipophile Farbstoffe kombinierte, was die gleichzeitige Kennzeichnung vieler Gehirnzellen mit verschiedenen Farben1,2ermöglichte. In jüngerer Zeit wurde eine ballistische Etikettierungstechnik von Seabold et al.3 beschrieben, die fluoreszierende Farbstoffe (Dil) in die Neuronen von Gehirnscheiben einführte. Eine vielseitige Färbetechnik, ballistische Etikettierung wird für seine Fähigkeit geschätzt, in mehreren Tierarten und über eine breite Palette von Altersgruppen verwendet werden. Darüber hinaus kann es mit Immunostainierung kombiniert werden, um Subpopulationen von Gehirnzellen3zu identifizieren. Im Vergleich zu herkömmlichen Techniken (z. B. Golgi-Cox Silberimprägnierung, Mikroinjektion)4bietet die ballistische Etikettierung die Möglichkeit, morphologische Merkmale, einschließlich dendritischer Stacheln, klarer zu unterscheiden, ein Merkmal, das entscheidend ist, um Rückschlüsse auf neuronale Komplexität und synaptische Konnektivität zu ziehen5.
Exzitatorische pyramidale Neuronen zeichnen sich durch einen einzigen, großen apikalen Dendrit, mehrere kürzere Basaldendriten und Tausende von dendritischen Stacheln6aus. Pyramidale Neuronen sind in mehreren Gehirnregionen im Zusammenhang mit höherer Ordnung kognitive Verarbeitung gefunden, einschließlich der präfrontalen Kortex (PFC) und Hippocampus. In der PFC werden pyramidale Neuronen in den Schichten II/III und Schicht V beobachtet, wobei jede eine einzigartige Morphologie aufweist. Insbesondere pyramidenförmige Neuronen in Schicht II/III der PFC haben einen kürzeren apikalen Dendrit und weniger verzweigt als pyramidale Neuronen in Schicht V6. Innerhalb des Hippocampus befinden sich pyramidale Neuronen sowohl in den CA1- als auch in der CA3-Region, wobei jede unterschiedliche Morphologie zeigt. Insbesondere pyramidenförmige Neuronen in der CA1-Region weisen einen ausgeprägteren apikalen Dendrit auf, wobei verzweigte Verbindungen weiter vom Soma entfernt auftreten, relativ zur CA3-Region6.
Dendritische Stacheln auf pyramidenförmigen Neuronen sowohl im PFC als auch im Hippocampus sind die primäre Stelle für exzitatorische Synapsen7. Morphologische Eigenschaften der dendritischen Stacheln, die klassisch in drei primäre Kategorien (d.h. dünn, stumpf oder Pilz8) charakterisiert sind, wurden mit der Größe der exzitatorischen Synapse9in Verbindung gebracht. Dünne Stacheln, die sich durch einen langen, dünnen Hals, einen kleinen bauchigen Kopf und kleinere postsynaptische Dichten auszeichnen, sind instabiler und entwickeln schwächere Verbindungen. Pilzdornen, die einen größeren dendritischen Wirbelsäulenkopf haben, sind jedoch dafür bekannt, stärkere synaptische Verbindungen zu bilden, ein Effekt, der sich aus ihrer größeren Größe ergibt. Im scharfen Kontrast sind stumpfe Dornen ohne Wirbelsäulenhals, die ein ungefähr gleiches Kopf- und Nackenvolumenverhältnisvon 8aufweisen. Innerhalb des Hippocampus können auch verzweigte Stacheln beobachtet werden, wobei die Wirbelsäule mehrere Köpfe hat, die aus dem gleichen dendritischen Wirbelsäulenhals10hervorgehen. Daher könnten die morphologischen Veränderungen der dendritischen Stacheln Funktionalität und strukturelle Kapazität widerspiegeln. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass die Größe und Form der dendritischen Stacheln mit ihrer strukturellen Plastizität zusammenhängt, was zu der Idee führt, dass kleine Stacheln am Lernen und an der Aufmerksamkeit beteiligt sind, während größere, stabilere Stacheln an langfristigen Prozessen beteiligt sind, einschließlich Gedächtnis11. Darüber hinaus kann die Verteilung der dendritischen Stacheln entlang des Dendriten mit synaptischen Konnektivität5,12verbunden sein.
So hat das vorliegende methodische Papier drei Ziele: 1) Präsentieren Sie unser Protokoll für die ballistische Kennzeichnung, das mit einer Erfolgsrate (d. h. Neuronen, die Auswahlkriterien erfüllen und für die Analyse geeignet sind) von 83,3%5,12,13 und über mehrere Hirnregionen hinweg (d. h. PFC, Nucleus accumbens, hippocampus) verwendet wurde. 2) Nachweis der Verallgemeinerbarkeit der Technik und ihrer Anwendung auf in vitro angebaute Neuronen; 3) Erläutern Sie die In-Neuronal-Rekonstruktionssoftware verwendete Methodik und die Schlussfolgerungen, die aus solchen Daten gezogen werden können.
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Protocol
Alle Tierprotokolle wurden vom Animal Care and Use Committee der University of South Carolina überprüft und genehmigt (Bundesversicherungsnummer: D16-00028).
1. Herstellung von DiI/Tungsten-Perlenschläuchen
- 100 mg Polyvinylpyrrolidon (PVP) mit 10 ml ddH2O. Vortex die PVP-Lösung leicht auflösen.
- Füllen Sie den Schlauch mit der PVP-Lösung (siehe Materialtabelle) und lassen Sie ihn 20 min. Dann vertreiben Sie die PVP-Lösung durch das andere Ende des Schlauches mit einer 10 ml Spritze.
- Kombinieren Sie 170 mg Wolfram-Mikroträger-Perlen mit 250 l Methylenchlorid. Wirbel die Wolfram-Perle Suspension gründlich.
- Kombinieren Sie 6 mg lipophilen DilC18(3)-Farbstoff mit 300 l Methylenchlorid. Wirbel die DilC18(3) Farbstofflösung gründlich.
HINWEIS: Führen Sie die Schritte 1.3–1.4 in einer Dunstabzugshaube aus. - Pipette 250 l der Wolfram-Perlen-Suspension auf einem Glasschlitten. Warten Sie, bis die Suspension an der Luft trocken ist (ca. 3 min).
- Fügen Sie 300 L DilC18(3) Farbstofflösung auf der Oberseite der Wolfram-Perlen-Suspensionsschicht hinzu. Mischen Sie die DiIC18(3) Farbstofflösung und Wolfram-Perlensuspension gründlich mit einer Pipettenspitze und lassen Sie die Mischung an der Luft trocknen (ca. 3 min).
- Nach dem Trocknen verwenden Sie eine Rasierklinge, um die Mischung in zwei 1,5 ml Zentrifugenrohre aufzuteilen. Füllen Sie die Rohre mit Wasser.
- Beschallung im Wasserbad (Amp I, 100%) bis homogen (ca. 5 min). Stellen Sie sicher, dass die Spitze des Beschallungsators direkt auf den Rohren mit der Perlenaufhängung liegt.
- Kombinieren Sie die beiden 1,5 ml homogenisierten Mischungen zu einem 15 ml konischen Rohr. Sonicate die Mischung für weitere 3 min.
- Ziehen Sie die Wolframperlen-DilC18(3) Farbstoffmischung mit einer 10 ml Spritze in den PVP-beschichteten Schlauch. Führen Sie die Schläuche in die Aufbereitungsstation ein (siehe Materialtabelle).
- Drehen Sie für 1 min auf der Vorbereitungsstation. Entfernen Sie vorsichtig das gesamte Wasser aus dem Schlauch mit einer 10 ml Spritze.
- Schalten Sie das Stickstoffgas ein und stellen Sie den Stickstoffstrom auf ca. 0,5 Liter pro Minute (LPM) ein, drehen Sie die Schläuche in der Aufbereitungsstation und trocknen Sie 30 min mit Stickstoff.
- Entfernen Sie die Schläuche von der Aufbereitungsstation und schneiden Sie sie mit einem Rohrschneider in 13 mm Länge (entsprechend der Ladegröße der Patrone). Halten Sie die 13 mm Längen in Szintillationsfläschchen im Dunkeln.
2. Vorbereitung von Hirnabschnitten
HINWEIS: Erwachsene männliche F344/N-Ratten waren paar in einer kontrollierten Umgebung unter einem 12/12 licht:dunklen Zyklus mit ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser untergebracht. Alle Tiere wurden nach den Richtlinien der National Institutes of Health im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren gepflegt.
- Ratten mit 5% Sevofluran tief animieren.
- Fahren Sie mit dem folgenden Schritt fort, wenn die Ratten nicht auf schädliche Reize reagieren und Reflexe fehlen.
- Sichern Sie die Ratte in einer Supine-Position in einer chemischen Rauchhaube.
- Machen Sie einen Schnitt durch die Haut entlang der brustbrusten Mittellinie. Trennen Sie das Zwerchfell und öffnen Sie die Brust mit einer Schere. Setzen Sie eine Nadel aus dem 20 G x 25 mm in den linken Ventrikel ein.
- Sofort das rechte Atrium mit einer Schere schneiden. Durchlaufen Sie 50 ml 100 ml PBS mit 5 ml/min Durchfluss. Durchfuse 100 ml von 4% Paraformaldehyd gepuffert in 100 mM PBS.
- Entfernen Sie das gesamte Rattenhirn direkt nach der Perfusion.
- Postfix das gesamte Gehirn für 10 min mit 4% Paraformaldehyd.
HINWEIS: Postfix nicht in 4% Paraformaldehyd für mehr als 30 min, weil es die Etikettierung beeinflussen. - Schneiden Sie 500 m dicke koronale Abschnitte mit einer Rattenhirnmatrix (siehe Tabelle der Materialien). Machen Sie den ersten Schnitt und halten Sie die Klinge an Ort und Stelle. Machen Sie einen zweiten Schnitt mit einer zweiten Klinge und entfernen Sie vertikal die erste Klinge, wobei das Gewebe auf der Klingenoberfläche bleibt.
- Legen Sie die Gehirnscheiben in eine 24-Well-Platte mit 1 ml von 100 mM PBS in jedem Brunnen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Slices geschnitten wurden.
3. Ballistische Etikettierung und Visualisierung von Hirnabschnitten
- Entfernen Sie die PBS von jedem Zielbrunnen.
- Legen Sie die Patrone mit einem Stück DiI/Tungsten-Perlenschlauch und legen Sie sie in den Applikator.
- Legen Sie ein Stück Filterpapier zwischen zwei Netzsiebe. Schließen Sie den Applikator an den Heliumschlauch an. Stellen Sie den Ausgangsdruck von Helium auf 90 Pfund pro Quadratzoll (psi) ein.
- Platzieren Sie den Applikator vertikal von Hand auf der Mitte des Zielbrunnens in einem Abstand von 1,5 cm zwischen der Probe und dem Netzbildschirm. Feuern Sie die DiI/Tungsten Perlen Rohre.
HINWEIS: Achten Sie darauf, alle PBS aus den Zielbrunnen zu entfernen, bevor Sie schießen. - Laden Sie die Patrone mit dem nächsten DiI/Tungsten-Perlenschlauch. Die DiI/Tungsten-Perlen aus den Schläuchen auf den restlichen Scheiben abfeuern.
- Füllen Sie die 24 Wellplatte mit 100 mM PBS. Waschen Sie mit 500 l frische 100 mM PBS 3x. Lassen Sie die Scheiben beim Waschen mit PBS nicht umkippen.
- Fügen Sie 500 l frische 100 mM PBS hinzu und halten Sie die Scheiben bei 4 °C im Dunkeln für 3 h.
- Übertragen Sie die Gehirnscheiben mit einem feinen Pinsel auf Glasscheiben.
HINWEIS: Drei Gehirnabschnitte können auf jede Glasrutsche übertragen werden. - Fügen Sie sofort 1 ml Antifade-Montagemedium auf jeden Abschnitt. Legen Sie einen 22 mm x 50 mm Coverslip über die Hirnteile. Trocknen Sie die Glasgleitet im Dunkeln für 2 Tage.
- Schalten Sie das konfokale Mikroskopsystem ein und wechseln Sie zu einem 60-Zoll-Objektiv.
- Stellen Sie das konfokale Mikroskopsystem auf eine Vergrößerung von 60 " (A/1,4, Öl) und ein Z-Ebenen-Intervall von 0,15 m (Lochgröße 30 m, rückprojizierter Lochradius 167 nm) ein. Verwenden Sie eine Wellenlänge von 543 nm, um Bilder der Neuronen von Interesse zu erfassen.
- Erhalten Sie Z-Stack-Bilder für den zielgerichteten Neuronentyp basierend auf Gehirnregionsgrenzen und morphologischen Eigenschaften von Neuronen.
HINWEIS: Erfassen Sie mindestens drei Bilder von m jedes Tier.
4. Anwendung der Methodik mit Zellkultur
- Isolieren Sie primäre kortikale Neuronen von F344/N Ratten am ersten Tag der Geburt mit zuvor berichteter Methodik14.
- Kultur primäre kortikale Neuronen in einem 35 mm Glas Bodenschale für eine Woche. Ändern Sie die Hälfte des Kulturmediums mit frischem Neuronenwachstumsmedium am dritten Tag nach der Isolation. Waschen Sie die Glasbodenschale 2x mit 1 ml von 100 mM PBS.
- Fix mit 4% Paraformaldehyd für 15 min bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie die Schritte 3.2–3.6, um die Zellen ballistisch zu beschriften.
- Waschen mit 1 ml von 100 mM PBS 3x. Fügen Sie 500 l frische 100 mM PBS hinzu und halten Sie sie bei 4 °C im Dunkeln für 3 h.
- Fügen Sie 200 l Antifade-Montagemedium hinzu.
- Erhalten Sie Z-Stack-Bilder für jedes Zielneuron mit den Parametern in Schritt 3.10.
5. Neuronale Analyse und dendritische Wirbelsäulenquantifizierung
- Blinde Neuronen, die Codenummern verwenden, um Experimentierverzerrungen zu verhindern.
- Legen Sie Auswahlkriterien für Neuronen basierend auf der von Interesse interessierten Hirnregion fest.
HINWEIS: Auswahlkriterien für Neuronen sind kontinuierliche dendritische Färbung, niedriger Hintergrund, keine Farbstoffcluster innerhalb der Zellen, minimale Diffusion des DiI-Farbstoffs in den extrazellulären Raum, korrekte Morphologie pyramidaler Neuronen (Abbildung 1). - Öffnen Sie neuronale Rekonstruktionssoftware (siehe das beigefügte Video 1).
- Laden Sie eine Bilddatei, indem Sie auf das Bild"Dateiordner" in der oberen linken Ecke klicken.
- Klicken Sie auf "Soma" und markieren Sie das Soma der Neuronen auf dem Bild.
- Klicken Sie auf "Baum" und wählen Sie "User-Guided".
- Verfolgen Sie alle dendritischen Interessensgebiete.
HINWEIS: Bei pyramidenförmigen Neuronen, die sich durch einen apikalen Dendrit und mehrere Basilardendriten auszeichnen, wird nur der apikale Dendrit zurückverfolgt. Stellen Sie sicher, dass alle verbindungsenden Zweige miteinander verbunden sind. - Klicken Sie auf "Wirbelsäule".
- Definieren Sie Erkennungsparameter, und klicken Sie auf"Alle erkennen".
HINWEIS: Bei Gehirnscheiben sind die konsistenten Parameter, die in den Hirnregionen verwendet werden,: 2,0 (Äußere randalanierte, 0,3 (Mindesthöhe), 100 % (Detektorempfindlichkeit) und 10 (Mindestanzahl). Für die Zellkultur ist es notwendig, die Detektorempfindlichkeit zu erhöhen und die Minimale Anzahl zu verringern. - Klassifizieren Sie Diesen, indem Sie "Alle klassifizieren" auswählen.
HINWEIS: Dendritische Stacheln werden mit einem Algorithmus klassifiziert, der integral in der neuronalen Rekonstruktionssoftware15integriert ist. - Speichern Sie die Ablaufverfolgung, indem Sie das Datenträgerabbild in der oberen linken Ecke auswählen.
- Führen Sie neuronale und dendritische Wirbelsäulemorphologische Analysen durch.
- Offene neuronale Rekonstruktion quantitative Analyse-Software (siehe beigefügtvideo 2).
- Laden Sie das Bild, indem Sie auf "Datei" und "Datendatei öffnen" klicken.
- Klicken Sie auf "Analyse" und "Branchenstrukturanalyse", um neuronale Morphologie und dendritische Wirbelsäulenmorphologie zu analysieren.
- Für neuronale Morphologie klicken Sie auf "Baumsummen" und wählen Sie das Feld für "Dendritensummen".
- Für dendritische Wirbelsäulenmorphologie, klicken Sie auf "Spines" und wählen Sie dann das Feld für "Spine Details".
- Speichern Sie die Ausgabe als Textdatei (.txt), indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Ausgabetabelle klicken und "In Datei speichern" auswählen.
- Klicken Sie auf "Analysieren" und "Sholl Analysis".
- Legen Sie den Startradius auf 10 m und das Radius-Inkrement auf 10 m fest.
- Klicken Sie auf das Feld "Dendrites" und klicken Sie auf "Anzeigen".
- Speichern Sie die Ausgabe als Textdatei (.txt), indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Ausgabetabelle klicken und "In Datei speichern" auswählen.
6. Datenanalyse
- Analysieren Sie die neuronalen Morphologiedaten (d. h. dendritische Verzweigungskomplexität).
- Fügen Sie die Anzahl der Dendriten in jeder Zweigreihenfolge hinzu und dividieren Sie durch die Gesamtzahl der Dendriten. Multiplizieren Sie mit 100, um die relativen Frequenzen für die Anzahl der Dendriten in jeder Zweigreihenfolge zu berechnen.
- Analysieren Sie die Sholl-Analysedaten, um die Komplexität der neuronalen Arbor und die dendritische Wirbelsäulenkonnektivität zu untersuchen.
- Berechnen Sie den Mittelwert und den Standardfehler des Mittelwerts für die Anzahl der Schnittpunkte in jedem Radius.
- Summieren Sie die Anzahl der Stacheln abhängig von Wirbelsäulentyp (d. h. dünn, stumpf, Pilz) in jedem Radius und dividieren durch die Gesamtzahl der Stacheln für diesen Wirbelsäulentyp. Multiplizieren Sie mit 100, um die relativen Frequenzen für die Anzahl der Stacheln in jedem Radius zu berechnen.
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Representative Results
In Abbildung 2Awurden die typischen pyramidenförmigen Neuronen in der Hippocampusregion in den Hirnabschnitten der Ratte durch ballistische Etikettierungstechnologie identifiziert, die sich durch einen großen apikalen Dendrit und mehrere kleinere Basaldendriten um das Soma auszeichnete. Abbildung 2B zeigt das Neuron in der quantitativen Analysesoftware für die neuronale Rekonstruktion, nachdem das Soma nachgewiesen, dendritische Zweige und Stacheln nachgewiesen wurden. Anschließend wurden die Daten mit hilfe einer quantitativen Analysesoftware für die neuronale Rekonstruktion analysiert, die die Möglichkeit bot, die dendritische Verzweigungskomplexität (Abbildung 2C) und die neuronale Arbor-Komplexität (Abbildung 2D) zu bewerten.
In Abbildung 2Chaben wir die zentrifugale Verzweigungsmethode verwendet, die aus der Ausgabe "Baumsummen" gesammelt wurde, um die Anzahl der Segmente zu zählen, die entlang jeder Dendriten- und zugewiesenen Zweigreihenfolge durchquert werden. Die relative Häufigkeit der Segmente in jedem Zweigauftrag wurde für Zweigaufträge 1–15 untersucht. Wenn Verschiebungen in der Verteilung der dendritischen Zweige zwischen den Gruppen beobachtet wurden, konnten Veränderungen in der dendritischen Verzweigungskomplexität abgeleitet werden. Darüber hinaus wurde eine Sholl-Analyse als ergänzendes Maß für die komplexität der neuronalen Lauben durchgeführt, wobei die Anzahl der dendritischen Schnittpunkte, die alle 10 m aus dem Soma auftreten, in jedem Stichprobenabschnitt quantifiziert wurde (Abbildung 2D). Wenn Verschiebungen in der Anzahl der dendritischen Schnittmengen zwischen Gruppen beobachtet wurden, konnten Veränderungen in der neuronalen Arbor-Komplexität abgeleitet werden.
Morphologische Veränderungen der dendritischen Stacheln konnten anhand von Länge (m), Kopfdurchmesser (m) und Volumen (m3) beurteilt werden, wie in Abbildung 3A–Bdargestellt. Darüber hinaus wurden Stacheln mit dem automatischen assistierten Klassifizierungssystem in der neuronalen Rekonstruktionssoftware klassifiziert. Die relative Häufigkeit der Anzahl der Stacheln zwischen den einzelnen Radien wurde auf dünne, Pilz- und Stumpfdorndorne untersucht. Angesichts unseres Verständnisses, welche Wirbelsäulentypen stärkere synaptische Verbindungen (d. h. Pilz relativ zu Stubby) und Neurotransmitter-Afferents bilden, können Verschiebungen in der Verteilung der Stacheln entlang des Neurons auf synaptische Konnektivität hinweisen.
Darüber hinaus validierten wir den Nutzen der ballistischen Etikettierungstechnik auf einem primären pyramidenförmigen Neuron in der Zellkultur. Zuerst kultivierten wir primäre Hippocampus-Neuronen bei postnatalen D1 (Tag 1) auf einer Zellkulturplatte, die 2 Wochen lang mit Poly-L-Lysin beschichtet war, oder bis etwa 70% Konfluenz. Dann wurden die Proben mit 4% PFA für 15 min fixiert und 2x mit PBS gewaschen. Ab Schritt 3.1 des vorliegenden Protokolls haben wir die primären pyramidenförmigen Neuronen aus dem Hippocampus ballistisch beschriftet und abgebildet. Die Daten zeigten eine stabilisierte Beschriftung und identifizierten pyramidale Neuronen basierend auf der Dreiecksform des Soma und dem großen apikalen Dendrit (Abbildung 4A). Die Nutzung neuronaler Rekonstruktionssoftware zur Untersuchung dendritischer Stacheln primärer pyramidaler Neuronen, die in der Zellkultur angebaut werden, bietet ähnliche Möglichkeiten wie im Rattenhirn. Die Beispielergebnisse werden für die Verteilung dünner dendritischer Stacheln (Abbildung 4B) und die dendritische Wirbelsäulenlänge, gemessen in m , veranschaulicht (Abbildung 4C). Es ist jedoch bemerkenswert, dass die primären pyramidenförmigen Neuronen, die in der Zellkultur angebaut wurden, weniger dendritische Verzweigung hatten, was die Bewertung, zumindest in diesem Beispiel, der dendritischen verzweigten Komplexität und neuronalen Laubenkomplexität ausschließt.
Abbildung 1: Auswahlkriterien für pyramidale Neuronen im medialen präfrontalen Kortex, der mit ballistischer Etikettierungstechnologie gekennzeichnet ist. (A) Ein repräsentatives konfokales Bild (60x) eines gut beschrifteten pyramidenförmigen Neurons aus dem medialen präfrontalen Kortex. Ein einziges pyramidenförmiges Neuron mit einem klaren Soma und apikalem Dendrit enummierte kontinuierliche, helle dendritische Färbung mit niedrigem Hintergrund. (B–C) Ein repräsentatives konfokales Bild (60x) eines pyramidenförmigen Neurons aus dem medialen präfrontalen Kortex mit Lichtfärbung an den distaleren Zweigen (B) und hohem Hintergrund (C). (D) Ein repräsentatives konfokales Bild (60x) eines beschrifteten Neurons aus dem medialen präfrontalen Kortex (basierend auf Bregma-Koordinaten), das fehlerhafte morphologische Eigenschaften aufweist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Die Kennzeichnung von pyramidenförmigen Neuronen im Hippocampus (HIP) mit ballistischer Etikettierungstechnologie und neuroanatomischen Bewertungen. (A) Drei repräsentative konfokale Bilder (60x) von pyramidenförmigen Neuronen, die durch ballistische Wolframperlen beschriftet sind. (B) Die Bewertung der neuronalen Morphologie: dendritische Zweigreihenfolgeanalyse und Sholl-Analyse. Das nachverfolgte Bild der dendritischen Wirbelsäule, in der die Wirbelsäulenmorphologie auch mit der dendritischen Wirbelsäulenanalyse-Software identifiziert wurde. (C) Branchenreihenfolgeanalysen, die zur Untersuchung der relativen Häufigkeit dendritischer Zweige bei verschiedenen Zweigreihenfolgen verwendet werden. (D) Die Anzahl der dendritischen Schnittpunkte, die alle 10 m aus dem Soma stammen, wurde anhand der Sholl-Analyse als Maß für die Komplexität der neuronalen Lauben untersucht. Die Daten werden als relative Frequenzen des gesamten Datensatzes (C) beschrieben oder passen zu 95% Konfidenzintervallen (D). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Die Bewertung der dendritischen Wirbelsäulenmorphologie. (A–B) Die Verteilung der dendritischen Stacheln als Funktion des Wirbelsäulentyps dargestellt (d. h. dünn, stumpf, Pilz). Zusätzliche dendritische Wirbelsäulenparameter wurden ebenfalls analysiert (z.B. Länge, Volumen, Kopfdurchmesser) als Bewertung der dendritischen Wirbelsäulenmorphologie. Die Daten werden als relative Frequenzen des gesamten Datasets dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4. Die Kennzeichnung von primärem kortikalen Neuron in vitro mit ballistischer Etikettierungstechnologie. (A) Repräsentative konfokale Bilder (60x) von primären kortikalen Neuronen, die durch ballistische Wolframperlen in vitro gekennzeichnet sind. Beispielergebnisse, die denen ähneln, die durch ballistische Kennzeichnung in Gehirnscheiben gewonnen wurden, werden für die Verteilung dünner dendritischer Dornen (B) und Länge (C) gezeigt. Die Daten werden als relative Frequenzen des gesamten Datasets dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Video 1: Verfahren der neuronalen Tracing und dendritischen Wirbelsäulendetektion. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Video 2: Verfahren der Datenerfassung und -ausgabe für die quantitative Analyse. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
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Discussion
In diesem Protokoll beschreiben wir eine vielseitige Etikettierungstechnik für Neuronen sowohl aus Rattenhirn als auch für in vitro angebaute. Darüber hinaus berichten wir über die Methodik für die Verwendung von neuronaler Rekonstruktionssoftware und neuronaler Rekonstruktionquantitativer Analysesoftware zur Bewertung der neuronalen Morphologie und dendritischer Stacheln. Die Bewertung der neuronalen Morphologie und dendritischen Stacheln bietet die Möglichkeit, Veränderungen in dendritischer Verzweigungskomplexität, neuronaler Laubenkomplexität, dendritischer Wirbelsäulenmorphologie und synaptischer Konnektivität zu bestimmen.
Bei der Durchführung des Protokolls sollten Forscher besonderes Augenmerk auf ein paar Schritte achten. Erstens, Nachfixierung in 4% PFA für zu lange wird die Integrität der lipophilen Membran beschädigen und dazu führen, dass der Farbstoff außerhalb der Zellen austritt. Zweitens führt die Etikettierung primärer kortikaler Neuronen in vitro im Vergleich zur Spezifität der ballistischen Kennzeichnung in Hirnscheiben, die nur auf Neuronen abzielt, eine unspezifische Kennzeichnung der Glia ein, da die ballistische Kennzeichnung in Hirnscheiben nicht spezifisch für eine Art von Neuron ist (d. h. pyramidenförmiges Neuron, mittleres stachelförmiges Neuron, Granulatzelle). Daher sollten Bregma-Koordinaten, morphologische Bewertungen oder spezifische Zellmarker mit der ballistischen Kennzeichnungsmethode kombiniert werden. Drittens kann die Dicke der Gehirnscheiben zwischen 200 und 500 m liegen; für beste Ergebnisse sollte optimiert werden. Viertens hängt die Effizienz der Etikettierung und Der Färbedurchdringung mit vielen Faktoren zusammen, wie heliumdruck, Inkubationszeiten nach ballistischer Anwendung, die DiI/Tungsten-Perlen, der Abstand zwischen dem Netzsieb und der Oberfläche von Gehirnscheiben usw. Das Protokoll sollte für jede Studie optimiert werden. Fünftens müssen große Klumpen oder Cluster von ballistischen Farbstoff beschichteten Wolframperlen während der Vorbereitung vermieden werden, da Klumpen nicht erlauben würden, einzelne Neuronen zu unterscheiden. Wir haben auch festgestellt, dass DiI in dieser ballistischen Methodik vollständiger als DiO in einzelnen Neuronen diffundiert.
Dennoch ermöglicht die ballistische Etikettierungstechnik im Vergleich zu herkömmlichen Etikettierungsmethoden4eine konfokale Bildgebung mit hoher Auflösung, die die Beurteilung der neuronalen und dendritischen Wirbelsäulenmorphologie ermöglicht. Darüber hinaus verwendet die neuronale Rekonstruktionssoftware einen Algorithmus für die automatische assistierte Klassifizierung von dendritischen Stacheln (d. h. dünn, Pilz, Stubby), Zweigreihenfolgemessungen, klassische Sholl-Analyse und Messung morphologischer Merkmale dendritischer Stacheln, wie Länge (m), Kopfdurchmesser (m) und Volumen(m 3). Die Quantifizierung mehrerer neuronaler Parameter bietet die Möglichkeit, die Mechanismen, die neurokognitiven Dysfunktionen zugrunde liegen, besser zu verstehen.
Insgesamt ermöglicht die ballistische Etikettierungsmethode die Visualisierung neuronaler Strukturen in verschiedenen Hirnregionen der Ratte und in der Zellkultur, was wichtig ist, um die möglichen Mechanismen zu klären, die neurokognitiven Dysfunktionzugrunde liegen. In der vorliegenden Studie stellen wir eine Methode zur Kennzeichnung pyramidaler Neuronen durch eine ballistische Etikettierungstechnik vor. Darüber hinaus demonstrierten wir in Kombination mit neuronaler Rekonstruktionssoftware die Fähigkeit, neuronale und dendritische Wirbelsäulenmorphologie in hippocampalen Pyramidenneuronen zu untersuchen. Gruppenunterschiede in der neuronalen und/oder dendritischen Wirbelsäulenmorphologie bieten die Möglichkeit, die Mechanismen zu verstehen, die der neurokognitiven Dysfunktion zugrunde liegen.
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Disclosures
Keiner der Autoren hat Interessenkonflikte zu erklären.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch NIH-Stipendien HD043680, MH106392, DA013137 und NS100624 finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20Gx25mm PrecisionGlide needle | BD | 305175 | |
| 24-well cell culture plate | Costar | 3562 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Barrel liner | BIO-RAD | 165-2417 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Cartridge holder | BIO-RAD | 165-2426 | |
| Confocal imaging software | Nikon | EZ-C1 | version 3.81b |
| Confocal microscope | Nikon | TE-2000E | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| DilC18(3) | Fisher Scientific | D282 | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| F344 rat | (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) | ||
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Helios diffusion screens | BIO-RAD | 165-2475 | |
| Helios gene gun kit | BIO-RAD | 165-2411 | |
| Helios gene gun system | BIO-RAD | 165-2431 | |
| Helium hose assembly | BIO-RAD | 165-2412 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Methylene chloride | Fisher Scientific | D150-1 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| Neurolucida 360 software | mbf bioscience | dendritic spine analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher Scientific | 5295 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Fisher Scientific | P36930 | mounting medium |
| Rat brain matrix, 300 - 600g, Coronal, 0.5mm | Ted Pella | 15047 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Syringe kit | BIO-RAD | 165-2421 | |
| Tefzel tubing | BIO-RAD | 165-2441 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Tubing cutter | BIO-RAD | 165-2422 | |
| Tubing Prep station | BIO-RAD | 165-2418 | |
| Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm | BIO-RAD | 165-2269 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
References
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
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