Summary
Nörokimyasal ve davranışsal anormalliklerin altında yatan nöronlar ve dendritik dikenlerde potansiyel morfolojik değişikliklerin değerlendirilmesi için kritik olan piramidal nöronları etiketlemek ve analiz etmek için bir protokol salıyoruz.
Abstract
Dendritik dikenlerin büyüklüğü ve şeklinin yapısal plastisite ile ilişkili olduğu bildirilmiştir. Piramidal nöronların ve dendritik dikenlerin morfolojik yapısını belirlemek için balistik etiketleme tekniği nden yararlanılabilir. Bu protokolde, piramidal nöronlar DilC18(3) boya ile etiketlenmiş ve nöronal morfolojive dendritik dikenleri değerlendirmek için nöronal rekonstrüksiyon yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir. Nöronal yapıyı araştırmak için, dendritik dallanma analizi ve Sholl analizi yapılır, araştırmacılar dendritik dallanma karmaşıklığı ve nöronal arbor karmaşıklığı hakkında çıkarımlar çizmek için izin, sırasıyla. Dendritik dikenlerin değerlendirilmesi, rekonstrüksiyon yazılımının ayrılmaz bir parçası olan ve omurgaları dört kategoriye ayıran otomatik destekli sınıflandırma algoritması kullanılarak yapılır (örn. ince, mantar, güdük, filopodia). Ayrıca dendritik omurga morfolojisindeki değişiklikleri değerlendirmek için ek üç parametre (uzunluk, kafa çapı ve hacim) seçilir. Balistik etiketleme tekniğinin geniş uygulama potansiyelini doğrulamak için, in vitro hücre kültüründen piramidal nöronlar başarıyla etiketlendi. Genel olarak, balistik etiketleme yöntemi benzersiz ve farelerde farklı beyin bölgelerinde nöronları görselleştirmek için yararlıdır, hangi sofistike yeniden yapılanma yazılımı ile birlikte, araştırmacılar altta yatan olası mekanizmaları açıklamak için izin verir nörokognitif disfonksiyon.
Introduction
2000 yılında, Gan ve ark bireysel nöronlar ve çeşitli lipophilic boyalar kombine sinir sisteminde glia için hızlı bir etiketleme tekniği açıklanan, farklı renklerde birçok beyin hücrelerinin eşzamanlı etiketleme için izin1,2. Daha yakın zamanda, bir balistik etiketleme tekniği Seabold ve ark.3 tarafından bu floresan boyalar tanıttı (Dil) beyin dilimleri nöronların içine. Çok yönlü bir boyama tekniği olan balistik etiketleme, birden fazla hayvan türünde ve çok çeşitli yaşlarda kullanılabilme yeteneğinden dolayı takdir edilmektedir. Ayrıca, beyin hücrelerinin alt popülasyonları belirlemek için immünboyama ile kombine edilebilir3. Geleneksel tekniklerle karşılaştırıldığında (örneğin, Golgi-Cox gümüş emprenye, mikroenjeksiyon)4, balistik etiketleme daha net morfolojik özellikleri ayırt etmek için bir fırsat sunuyor, dendritik dikenler de dahil olmak üzere, nöronal karmaşıklık ve sinaptik bağlantı hakkında çıkarımlar çizim için kritik bir özellik5.
Uyarıcı piramidal nöronlar tek, büyük apikal dendrit, birden fazla kısa bazal dendritler ve dendritik omurgalar binlerce ile karakterizedir6. Piramidal nöronlar yüksek derecede bilişsel işleme ile ilgili birden fazla beyin bölgelerinde bulunur, prefrontal korteks dahil (PFC) ve hipokampus. PFC'de piramidal nöronlar II/III ve V tabakasında gözlenir ve her biri benzersiz morfoloji sergiler. Özellikle, PFC katman II / III piramidal nöronlar daha kısa apikal dendrite ve katman Vpiramidalnöronlar daha az dallanma var 6 . Hipokampus içinde, piramidal nöronlar ca1 ve CA3 bölgelerinde hem de bulunan, her farklı morfolojileri gösteren. Özellikle, CA1 bölgesindeki piramidal nöronlar daha belirgin bir apikal dendit sergilerler, dallanma somadan daha uzakta meydana gelen, CA3 bölgesine göre6.
Hem PFC hem de hipokampuspiral nöronlar üzerinde Dendritik dikenler uyarıcı sinapsların birincil site7. Klasik olarak üç ana kategoriye (yani ince, güdük veya mantar8)ayrılır, dendritik dikenlerin morfolojik özellikleri, uyarıcı sinaps9'unbüyüklüğüile ilişkilidir. İnce dikenler, uzun, ince boyun ile karakterize, küçük soğanlı kafa, ve küçük postsinaptik yoğunlukları, daha kararsız ve zayıf bağlantılar geliştirmek. Ancak, mantar dikenleri, daha büyük bir dendritik omurga kafası var, güçlü sinaptik bağlantılar oluşturmak için tanınan, onların büyük boyutu kaynaklanan bir etki. Keskin kontrast olarak, güdük dikenler bir omurga boyun yoksun, yaklaşık eşit baş ve boyun hacim oranı sergileyen8. Hipokampus içinde, dallı dikenler de görülebilir, omurga aynı dendritik omurga boyun ortaya birden fazla başları vardır nerede10. Bu nedenle, dendritik dikenlerin morfolojik değişiklikleri işlevselliği ve yapısal kapasiteyi yansıtabilir. Ayrıca, çalışmalar dendritik dikenlerin boyutu ve şekli yapısal plastisite ile ilgili olduğunu göstermiştir, küçük dikenler öğrenme ve dikkat dahil olduğu fikrine yol açan, daha büyük ise, daha istikrarlı dikenler, bellek dahil olmak üzere uzun vadeli süreçlerde yer almaktadır11. Ayrıca, dendrit boyunca dendritik dikenlerin dağılımı sinaptik bağlantıileilişkili olabilir 5,12.
Böylece, mevcut metodolojik kağıt üç hedefleri vardır: 1) bir başarı oranı ile kullanılmıştır balistik etiketleme için protokol mevcut (yani, nöronlar seçim kriterleri toplantı ve analiz için uygun) 83.3%5,12,13 ve birden fazla beyin bölgeleri arasında (yani, PFC, çekirdek accumbens, hipokampus); 2) Tekniğin genellenebilirliğini ve in vitro olarak yetiştirilen nöronlara uygulanmasını göstermek; 3) Nöronal rekonstrüksiyon yazılımında kullanılan metodolojiyi ve bu verilerden çıkarılabilen çıkarımları ayrıntılı olarak inceleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan protokolleri Gözden geçirildi ve Güney Carolina Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı (federal güvence numarası: D16-00028).
1. DiI/Tungsten boncuk tüp hazırlanması
- 100 mg polivinilpyrrolidone (PVP) ile 10 mL ddH2O. Vortex PVP çözeltisini hafifçe çözün.
- Tüpü PVP çözeltisi ile doldurun (Bkz. Malzeme Tablosu)ve 20 dk bekletin. Daha sonra PVP çözeltisini 10 mL şırınga kullanarak tüpün diğer ucundan geçirin.
- 170 mg tungsten mikrotaşıyıcı boncukları 250 μL metilen klorür ile birleştirin. Tungsten boncuk süspansiyon iyice Vortex.
- Metilen klorür 300 μL ile lipophilic DilC18(3) boya 6 mg birleştirin. Girdap DilC18(3) boya çözeltisi iyice.
NOT: 1.3-1.4 adımlarını duman kaputunda gerçekleştirin. - Pipet 250° tungsten boncuk süspansiyonu cam bir kaydırak üzerine. Hava kuru (~ 3 dk) için süspansiyon bekleyin.
- Tungsten boncuk süspansiyon tabakasının üstüne 300 μL DilC18(3) boya çözeltisi ekleyin. DiIC18(3) boya çözeltisini ve tungsten boncuk süspansiyonunu pipet ucuyla iyice karıştırın ve karışımın kurumasını bekleyin (~3 dk).
- Kuruduktan sonra, karışımı 1,5 mL santrifüj tüpüne bölmek için jilet kullanın. Tüpleri suyla doldurun.
- Su banyosunda sonicate (Amp I, %100) homojen (~5 dk) kadar. Sonicator ucu boncuk süspansiyon ile tüpler üzerinde doğrudan yatıyor emin olun.
- İki 1,5 mL homojen karışımı 15 mL konik bir tüp halinde birleştirin. Başka bir 3 dakika için karışımı Sonicate.
- Tungsten boncuk-DilC18(3) boya karışımını 10 mL şırınga kullanarak PVP kaplı boruya çekin. Tüpü hazırlama istasyonuna yedirin (bkz. Malzemeler Tablosu).
- Hazırlık istasyonunda 1 dakika döndürün. 10 mL'lik bir şırınga kullanarak borudaki tüm suyu dikkatlice çıkarın.
- Azot gazını açın ve azot akışını dakikada yaklaşık 0,5 Litre 'ye (LPM) ayarlayın, preparat istasyonundaki tüpü döndürün ve 30 dakika boyunca azotla kurulayın.
- Boruyu hazırlama istasyonundan çıkarın ve bir boru kesicisi kullanarak 13 mm uzunlukta (kartuşun yükleme boyutuyla eşleşen) kesin. 13 mm uzunluktaki uzunlukları karanlıkta sintillasyon şişelerinde tutun.
2. Beyin bölümlerinin hazırlanması
NOT: Yetişkin erkek F344/N sıçanlar 12/12 ışık altında kontrollü bir ortamda barındırılabildiler: yiyecek ve suya reklam libitum erişimi ile karanlık döngü. Tüm hayvanlar, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nda Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından belirlenen yönergeleri kullanarak bakıldı.
- %5 sevofluran kullanarak fareleri derinden anesteziye alın.
- Sıçanlar zararlı uyaranlara yanıt vermiyor ve refleksleri yok olduğunda aşağıdaki adıma geçin.
- Kimyasal bir duman kaputu içinde bir supine pozisyonda sıçan güvenli.
- Torasik orta hat boyunca deri yoluyla bir kesi olun. Diyaframı ayırın ve göğsü makasla açın. Sol ventriküle 20 G × 25 mm iğne takın.
- Hemen makasla sağ atriyumu kesin. 5 mL/dk akış hızı ile 100 mM PBS'nin 50 mL'sini perfuse. Perfuse 100 mL % 4 paraformaldehit 100 mM PBS tamponlu.
- Perfüzyondan hemen sonra tüm fare beynini çıkarın.
- Postfix 10 dakika için tüm beyin için% 4 paraformaldehit ile.
NOT: Etiketlemeyi etkileyeceği için %4 paraformaldehit le 30 dakikadan fazla bir süre için postfix yapmayın. - Sıçan beyin matrisi kullanarak 500 μm kalınlığında koronal kesitler kesin (Bkz. Malzeme Tablosu). İlk kesme yi ve bıçağı yerinde tut. İkinci bir bıçak kullanarak ikinci bir kesim yapın ve ilk bıçağı dikey olarak çıkarın, dokuyu bıçak yüzeyinde tutarak.
- Beyin dilimlerini her kuyuda 1 mL 100 mM PBS içeren 24 kuyuluk bir tabağa yerleştirin. Tüm dilimler kesilene kadar bu işlemi tekrarlayın.
3. Beyin bölümlerinin balistik etiketleme ve görselleştirilmesi
- PBS'yi hedeflenen her kuyudan çıkarın.
- Kartuşunu bir parça DiI/Tungsten boncuk tüpü ile yükleyin ve aplikatöre yerleştirin.
- İki örgü ekran arasına bir parça filtre kağıdı koyun. Aplikatörü helyum hortumuna bağlayın. Helyumun çıkış basıncını inç kare (psi) başına 90 pound'a ayarlayın.
- Aplikatörü, numune ile örgü ekranı arasında 1,5 cm mesafede, hedeflenen kuyunun ortasına elle dikey olarak yerleştirin. Yangın DiI / Tungsten boncuk boru.
NOT: Çekimden önce tüm PBS'leri hedeflenen kuyulardan çıkardığınızdan emin olun. - Kartuşunu bir sonraki DiI/Tungsten boncuk borusuyla yükleyin. Kalan dilimlerin üzerindeki borudan DiI/Tungsten boncuklarını sürekli olarak ateşleyin.
- 24 kuyu plakasını 100 mM PBS ile doldurun. 500 μL taze 100 mM PBS 3x ile yıkayın. PBS ile yıkarken dilimlerin ters çevrilmesine izin vermeyin.
- 500 μL taze 100 mM PBS ekleyin ve dilimleri karanlıkta 4 °C'de 3 saat tutun.
- İnce bir fırça kullanarak beyin dilimlerini cam slaytlara aktarın.
NOT: Her cam slaytüzerine üç beyin bölümü aktarılabilir. - Hemen her bölüme 1 mL antifade montaj ortamı ekleyin. Beyin bölümlerinin üzerine 22 mm x 50 mm'lik bir kapak kaydırın. 2 gün boyunca karanlıkta cam slaytlar kuru.
- Konfokal mikroskop sistemini açın ve 60× hedefe geçin.
- Konfokal mikroskop sistemini 60× (A/1.4, yağ) büyütme ve 0,15 μm 'lik Z düzlem aralığı (iğne deliği boyutu 30 μm, arkadan yansıtılan iğne deliği yarıçapı 167 nm) olarak ayarlayın. İlgi çeken nöronların görüntülerini elde etmek için 543 nm dalga boyu kullanın.
- Beyin bölgesi sınırları ve nöronların morfolojik özelliklerine göre hedeflenen nöron tipi için Z-yığın görüntüleri elde edin.
NOT: Her hayvandan en az üç görüntü edinin.
4. Metodolojinin hücre kültürü ile birlikte kullanılması
- Daha önce bildirilen metodoloji14kullanarak doğum sonrası ilk gün F344/N sıçanlardan primer kortikal nöronları izole edin.
- Bir hafta boyunca 35 mm cam alt çanak kültür birincil kortikal nöronlar. İzolasyondan sonraki üçüncü günde taze nöron büyüme ortamı ile kültür ortamının yarısını değiştirin. Cam alt çanağı 2x 1 mL 100 mM PBS ile yıkayın.
- Oda sıcaklığında 15 dakika için% 4 paraformaldehit ile düzeltin. Hücreleri balistik olarak etiketlemek için 3.2-3.6 adımlarını tekrarlayın.
- 1 mL 100 mM PBS 3x ile yıkayın. 500 μL taze 100 mM PBS ekleyin ve 3 saat boyunca karanlıkta 4 °C'de tutun.
- 200 μL antifade montaj ortamı ekleyin.
- Adım 3.10 parametrelerini kullanarak her hedeflenen nöron için Z-yığın görüntüleri elde edin.
5. Nöronal analiz ve dendritik omurga nicelleştirme
- Deneyci önyargısını önlemek için kod numaralarını kullanan kör nöronlar.
- İlgi beyin bölgesine göre nöronlar için seçim kriterleri belirleyin.
NOT: Nöronlar için seçim kriterleri arasında sürekli dendritik boyama, düşük arka plan, hücrelerin içinde boya yok kümeleri, DiI boyasının hücre dışı uzaya minimal difüzyonu, piramidal nöronların doğru morfolojisi(Şekil 1)sayılabilir. - Açık nöronal rekonstrüksiyon yazılımı (Ekli Video 1bakınız).
- Sol üst köşedeki "Dosya Klasörü" resmine tıklayarak bir resim dosyasını yükleyin.
- "Soma" tuşuna tıklayın ve görüntüdeki nöronların soma'sını işaretleyin.
- "Ağaç" 'ı tıklatın ve " Kullanıcı Güdümlü " seçeneğinibelirleyin.
- İlgi çekici tüm dendritik dalları nizinizin izini sür.
NOT: Bir apikal dendrit ve birden fazla baziler dendrit ile karakterize piramidal nöronlar için sadece apikal dendrit izlenir. Tüm bağlantı dallarının birbirine bağlı olduğundan emin olun. - "Omurga" seçeneğini tıklatın.
- Algılama Parametrelerini tanımlayın ve "Tümlerini Algıla" düğmesine tıklayın.
NOT: Beyin dilimleri için, beyin bölgeleri arasında kullanılan tutarlı parametreler şunlardır: 2.0 (Dış Aralık), 0.3 (Minimum Yükseklik), %100 (Dedektör Hassasiyeti) ve 10 (Minimum Sayım). Hücre kültürü için Dedektör Hassasiyetini artırmak ve Minimum Sayımı azaltmak gerekir. - "Tümünü Sınıflandır" seçeneğini seçerek dikenleri sınıflandırın.
NOT: Dendritik dikenler nöronal rekonstrüksiyon yazılımı15entegre bir algoritma kullanılarak sınıflandırılır. - Sol üst köşedeki Disk Görüntüsünü seçerek izlemeden kaydedin.
- Nöronal ve dendritik omurga morfolojik analizleri yapın.
- Açık nöronal rekonstrüksiyon kantitatif analiz yazılımı (Bkz. eklenmiş Video 2).
- "Dosya" ve "Açık Veri Dosyası" butonuna tıklayarak görüntüyü yükleyin.
- Nöronal morfolojive dendritik omurga morfolojisini analiz etmek için "Analiz" ve "Dallı Yapı Analizi" seçeneğini tıklayın.
- Nöronal morfoloji için "Tree Totals" e tıklayın ve "Dendrite Toplamları" için kutuyu seçin.
- Dendritik omurga morfolojisi için "Omurgalar" seçeneğini tıklayın ve sonra "Omurga Ayrıntıları" için kutuyu seçin.
- Çıktı tablosuna sağ tıklayarak ve "Dosyaya Kaydet" seçeneğini seçerek çıktıyı metin (.txt) dosyası olarak kaydedin.
- "Analyze" ve "Sholl Analysis" i tıklayın.
- Başlangıç Yarıçapını 10 μm'ye, Yarıçap Artışını 10 m'ye ayarlayın.
- "Dendrites" kutusunu tıklatın ve "Ekran" düğmesine tıklayın.
- Çıktı Tablosu'na sağ tıklayarak ve "Dosyaya Kaydet" seçeneğini seçerek çıktıyı metin (.txt) dosyası olarak kaydedin.
6. Veri analizi
- Nöronal morfoloji (yani, dendritik dallanma karmaşıklığı) verilerini analiz edin.
- Her dal siparişinde dendrit sayısını ekleyin ve toplam dendrit sayısına bölün. Her dal siparişindeki dendrit sayısının göreli frekanslarını hesaplamak için 100 ile çarpın.
- Nöronal arbor karmaşıklığı nı ve dendritik omurga bağlantısını incelemek için Sholl analiz verilerini analiz edin.
- Her yarıçaptaki kavşak sayısı için ortalamanın ortalama ve standart hatasını hesaplayın.
- Her yarıçaptaki omurga tipine (yani ince, güdük, mantar) bağlı omurga sayısını toplamı ve bu omurga tipi için toplam diken sayısına bölün. Her yarıçaptaki diken sayısının göreli frekanslarını hesaplamak için 100 ile çarpın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 2A'da,sıçan beyin bölümlerinde hipokampal bölgede tipik piramidal nöronlar balistik etiketleme teknolojisi ile tespit edildi, bir büyük apikal dendrit ve soma etrafında birkaç küçük bazal dendrit ile karakterize. Şekil 2B, soma tespit edildikten sonra nöronal rekonstrüksiyon kantitatif analiz yazılımında nöronu gösterir, dendritik dallar izlenebilir ve omurgalar saptanmıştır. Daha sonra veriler nöronal rekonstrüksiyon kantitatif analiz yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir ve bu da dendritik dallanma karmaşıklığını(Şekil 2C)ve nöronal arbor karmaşıklığını(Şekil 2D)değerlendirmek için bir fırsat sağlamıştır.
Şekil 2C'de,"Ağaç Toplamları" çıkışından toplanan santrifüj dal sıralama yöntemini kullanarak her dendrite ve atanan dal sırası boyunca geçen segment sayısını sayabettik. 1-15 arasındaki şube siparişleri için her şube siparişindeki segmentlerin göreli sıklığı incelendi. Gruplar arasında dendritik dalların dağılımında kaymalar gözlendiğinde, dendritik dallanma karmaşıklığında değişiklikler ortaya çıkarılabilir. Ayrıca, bir Sholl analizi nöronal arbor karmaşıklığı tamamlayıcı bir ölçü olarak yapılmıştır, böylece soma her 10 μm meydana gelen dendritik kavşak ların sayısı her örnek bölümünde ölçüldü(Şekil 2D). Gruplar arasında dendritik kavşak sayısında ki değişimler gözlendiğinde, nöronal arbor karmaşıklığındaki değişiklikler ortaya çıkarılabilir.
Dendritik dikenlerde morfolojik değişiklikler Şekil 3A–B'degörüldüğü gibi uzunluk (μm), kafa çapı (μm) ve hacim (3m3)kullanılarak değerlendirilebilir. Ayrıca, dikenler nöronal rekonstrüksiyon yazılımında otomatik destekli sınıflandırma sistemi kullanılarak sınıflandırıldı. Her yarıçap arasındaki diken sayısının göreceli sıklığı ince, mantar ve güdük dikenler için incelenmiştir. Hangi omurga tiplerinin daha güçlü sinaptik bağlantılar (yani, mantar güdük göre) ve nörotransmitter afferents formu anlayışımız göz önüne alındığında, nöron boyunca spin dağılımında vardiya sinaptik bağlantı gösterebilir.
Ayrıca, hücre kültüründe birincil piramidal nöron üzerinde balistik etiketleme tekniğinin yarar doğruladı. İlk olarak, postnatal D1'de (gün 1) primer hipokampal nöronları poli-L-lizin ile kaplanmış bir hücre kültürü plakası üzerinde 2 hafta veya yaklaşık %70'lik bir araya kadar kültürledik. Daha sonra numuneler 15 dk için %4 PFA ile sabitlendi ve 2x PBS ile yıkandı. Mevcut protokolün 3.1. Veriler, soma ve büyük apikal denditin üçgen şekline göre stabilize etiketleme ve tanımlanmış piramidal nöronlar göstermiştir(Şekil 4A). Hücre kültüründe yetişen birincil piramidal nöronların dendritik dikenlerini araştırmak için nöronal rekonstrüksiyon yazılımının kullanılması fare beynindekine benzer fırsatlar sunar. Örnek sonuçlar, ince dendritik dikenlerin(Şekil 4B)ve dendritik omurga uzunluğunun μm(Şekil 4C)cinsinden dağılımı için gösterilmiştir. Ancak, hücre kültüründe yetişen birincil piramidal nöronların daha az dendritik dallanma, değerlendirme engel, en azından bu örnekte, dendritik dallanma karmaşıklığı ve nöronal arbor karmaşıklığı dikkat çekicidir.
Şekil 1: Balistik etiketleme teknolojisi kullanılarak etiketlenen medial prefrontal korteksteki piramidal nöronlar için kullanılan seçim kriterleri. (A) Medial prefrontal korteksten iyi etiketlenmiş piramidal nöronun temsili konfokal görüntüsü (60x). Açık soma ve apikal dendrit ile tek bir piramidal nöron düşük arka plan ile sürekli, parlak dendritik boyama dahil. (B–C) Medial prefrontal korteksten piramidal nöronun temsili konfokal görüntüsü (60x) daha distal dallarda ışık boyaması ile (B) ve yüksek arka plan(C). (D) Medial prefrontal korteksten etiketli bir nöronun temsili konfokal görüntüsü (60x) (Bregma koordinatları dayalı) kusurlu morfolojik özelliklere sahiptir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Balistik etiketleme teknolojisi ve nöroanatomik değerlendirmeler kullanılarak hipokampus (HIP) piramidal nöronların etiketlemi. (A) Balistik tungsten boncuklar etiketli piramidal nöronların üç temsili konfokal görüntüleri (60x). (B) Nöronal morfolojinin değerlendirilmesi: dendritik dal sırası analizi ve Sholl analizi. Omurga morfolojisinin de dendritik omurga analiz yazılımı kullanılarak tespit edildiği dendritik omurganın izlenen görüntüsü. (C) Farklı şube siparişlerinde dendritik dalların göreli sıklığını incelemek için kullanılan şube sipariş analizleri. (D) Soma'dan her 10 μm'lik dendritik kavşak sayısı nöronal arbor karmaşıklığının bir ölçüsü olarak Sholl analizi kullanılarak değerlendirildi. Veriler, tüm veri kümesinin(C)göreli frekansları olarak tanımlanır veya %95 güven aralıkları(D)ile uyum sağlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Dendritik omurga morfolojisinin değerlendirilmesi. (A–B) Omurga tipi (yani, ince, güdük, mantar) bir fonksiyonu olarak gösterilmiştir dendritik dikenlerin dağılımı. Ek dendritik omurga parametreleri de dendritik omurga morfolojisi değerlendirmesi olarak analiz edildi (yani, uzunluk, hacim, kafa çapı) Veriler, tüm veri kümesinin göreli frekansları olarak gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. Balistik etiketleme teknolojisi kullanılarak primer kortikal nöron in vitro etiketleme. (A) Temsili konfokal görüntüler (60x) primer kortikal nöronlar in vitro balistik tungsten boncuk lar tarafından etiketlenmiş. İnce dendritik dikenlerin (B) ve uzunluk(C)dağılımında beyin dilimlerinde balistik etiketlemeden elde edilenlere benzer örnek sonuçlar gösterilmiştir. Veriler, tüm veri kümesinin göreli frekansları olarak gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Video 1: Nöronal izleme ve dendritik omurga algılama prosedürleri. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Video 2: Kantitatif analiz için veri toplama ve çıktı prosedürleri. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolde, hem sıçan beyninden nöronlar hem de in vitro yetiştirilenler için çok yönlü bir etiketleme tekniğini tanımlıyoruz. Ayrıca nöronal morfoloji ve dendritik dikenleri değerlendirmek için nöronal rekonstrüksiyon yazılımı ve nöronal rekonstrüksiyon kantitatif analiz yazılımını kullanma metodolojisini de rapor ediyoruz. Nöronal morfoloji ve dendritik dikenlerin değerlendirilmesi dendritik dallanma karmaşıklığı, nöronal arbor karmaşıklığı, dendritik omurga morfolojisi ve sinaptik bağlantı değişiklikleri belirlemek için bir fırsat sağlar.
Protokolü yürütürken, araştırmacılar birkaç adıma özel dikkat etmelidir. İlk olarak, çok uzun süre% 4 PFA post-sabitleme lipophilic membran bütünlüğüne zarar verecek ve hücrelerin dışında sızıntı boya neden olur. İkinci olarak, beyin dilimlerinde balistik etiketlemenin özgüllüğü ile karşılaştırıldığında, sadece nöronları hedefleyen, primer kortikal nöronların in vitro olarak etiketlemesi glianın spesifik olmayan etiketlemesini tanıtır, çünkü beyin dilimlerinde balistik etiketleme bir nöron türüne özgü değildir (yani, piramidal nöron, orta dikenli nöron, granül hücre). Bu nedenle, Bregma koordinatları, morfolojik değerlendirmeler veya belirli hücre belirteçleri balistik etiketleme yöntemi ile birleştirilmelidir. Üçüncü olarak, beyin dilimlerinin kalınlığı 200-500 μm arasında olabilir; en iyi sonuçlar için optimize edilmelidir. Dördüncü olarak, etiketleme ve boya penetrasyonu verimliliği, helyum basıncı, balistik uygulama dan sonra kuluçka süreleri, DiI/Tungsten boncukları, örgü ekran ile beyin dilimlerinin yüzeyi arasındaki mesafe, vb. gibi birçok faktörle ilişkilidir. Protokol her çalışma için optimize edilmelidir. Beşinci, büyük kümeler veya balistik boya kaplı tungsten boncuk kümeleri hazırlık sırasında kaçınılmalıdır, kümeler bireysel nöronlar ayırt etmek için izin vermez çünkü. Ayrıca, Bu balistik metodolojide DiO'dan daha fazla dio'nun tüm nöronların her yerine DiI'nin yayıldığını belirledik.
Bununla birlikte, geleneksel etiketleme yöntemleri ile karşılaştırıldığında4, balistik etiketleme tekniği yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme mümkün kılar, nöronal ve dendritik omurga morfolojisi değerlendirilmesi için izin. Ayrıca nöronal rekonstrüksiyon yazılımı, dendritik dikenlerin (yani ince, mantar, güdük), dal sıralama ölçümleri, klasik Sholl analizi ve dendritik dikenlerin uzunluk (μm), kafa çapı (μm) ve hacim (3) gibi morfolojik özelliklerinin ölçülmesi için bir algoritmakullanır. Birden fazla nöronal parametrelerin nicelleştirilmesi daha iyi nörokognitif disfonksiyon altında yatan mekanizmaları anlamak için bir fırsat sunuyor.
Genel olarak, balistik etiketleme yöntemi sıçan farklı beyin bölgelerinde nöronal yapıların görselleştirilmesi sağlar ve hücre kültüründe, hangi nörokognitif disfonksiyon altında yatan olası mekanizmaları açıklamak için önemlidir. Bu çalışmada, piramidal nöronları balistik etiketleme tekniği ile etiketlemek için bir yöntem sürünmüşteyiz. Ayrıca, nöronal rekonstrüksiyon yazılımı ile birlikte, hipokampal piramidal nöronlarda nöronal ve dendritik omurga morfolojisini inceleme yeteneğini gösterdik. Nöronal ve/veya dendritik omurga morfolojisindeki grup farklılıkları nörokognitif disfonksiyonun altında yatan mekanizmaları anlama fırsatı sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların hiçbirinin beyan etmesi gereken çıkar çatışmaları yok.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH tarafından finanse edilmiştir HD043680, MH106392, DA013137, ve NS100624.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20Gx25mm PrecisionGlide needle | BD | 305175 | |
| 24-well cell culture plate | Costar | 3562 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Barrel liner | BIO-RAD | 165-2417 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Cartridge holder | BIO-RAD | 165-2426 | |
| Confocal imaging software | Nikon | EZ-C1 | version 3.81b |
| Confocal microscope | Nikon | TE-2000E | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| DilC18(3) | Fisher Scientific | D282 | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| F344 rat | (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) | ||
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Helios diffusion screens | BIO-RAD | 165-2475 | |
| Helios gene gun kit | BIO-RAD | 165-2411 | |
| Helios gene gun system | BIO-RAD | 165-2431 | |
| Helium hose assembly | BIO-RAD | 165-2412 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Methylene chloride | Fisher Scientific | D150-1 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| Neurolucida 360 software | mbf bioscience | dendritic spine analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher Scientific | 5295 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Fisher Scientific | P36930 | mounting medium |
| Rat brain matrix, 300 - 600g, Coronal, 0.5mm | Ted Pella | 15047 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Syringe kit | BIO-RAD | 165-2421 | |
| Tefzel tubing | BIO-RAD | 165-2441 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Tubing cutter | BIO-RAD | 165-2422 | |
| Tubing Prep station | BIO-RAD | 165-2418 | |
| Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm | BIO-RAD | 165-2269 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
References
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).
- Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Spacek, J. Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections. Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).
- McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era. Science Reports. 9 (1), 827 (2019).
- Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
- Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).
- Harris, K. M., Sultan, P. Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses. Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).
- Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation. Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).
- Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging. Neuroscience. 251, 129-140 (2012).
- McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).
- Roscoe, R. F. Jr, Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).
- Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (108), e53697 (2016).
- Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).
