Summary
Apresentamos um protocolo para rotular e analisar neurônios piramidais, o que é fundamental para avaliar possíveis alterações morfológicas em neurônios e espinhas dendríticas que podem estar por trás de anormalidades neuroquímicas e comportamentais.
Abstract
Foi relatado que o tamanho e a forma das espinhas dendríticas estão relacionados com sua plasticidade estrutural. Para identificar a estrutura morfológica de neurônios piramidais e espinhos dendrípticos, uma técnica de rotulagem balística pode ser utilizada. No presente protocolo, os neurônios piramidais são rotulados com tintura DilC18(3) e analisados usando software de reconstrução neuronal para avaliar a morfologia neuronal e as espinhas dendríticas. Para investigar a estrutura neuronal, são realizadas análises de ramificação dendríticas e análise de Sholl, permitindo que os pesquisadores desenhem inferências sobre a complexidade de ramificação dendrítica e a complexidade da árvore neuronal, respectivamente. A avaliação das espinhas dendríticas é realizada utilizando-se um algoritmo de classificação assistida automática integral ao software de reconstrução, que classifica as espinhas em quatro categorias (ou seja, fina, cogumelo, stubby, filopodia). Além disso, três parâmetros adicionais (ou seja, comprimento, diâmetro da cabeça e volume) também são escolhidos para avaliar alterações na morfologia da coluna vertebral dendrítica. Para validar o potencial de ampla aplicação da técnica de rotulagem balística, neurônios piramidais da cultura celular in vitro foram rotulados com sucesso. No geral, o método de rotulagem balística é único e útil para visualizar neurônios em diferentes regiões cerebrais em ratos, o que, em combinação com um sofisticado software de reconstrução, permite aos pesquisadores elucidar os possíveis mecanismos subjacentes disfunção neurocognitiva.
Introduction
Em 2000, Gan et al. descreveram uma técnica de rotulagem rápida para neurônios individuais e glia no sistema nervoso que combinava vários corantes lipofílicos, permitindo a rotulagem simultânea de muitas células cerebrais com cores diferentes1,2. Mais recentemente, uma técnica de rotulagem balística foi descrita por Seabold et al.3 que introduziu corantes fluorescentes (Dil) nos neurônios das fatias cerebrais. Uma técnica versátil de coloração, a rotulagem balística é apreciada por sua capacidade de ser utilizada em múltiplas espécies animais e em uma ampla gama de idades. Além disso, pode ser combinado com imunocoloração para identificar subpopulações de células cerebrais3. Em comparação com as técnicas tradicionais (por exemplo, impregnação de prata golgi-cox, microinjeção)4, a rotulagem balística oferece uma oportunidade para distinguir mais claramente características morfológicas, incluindo colunas dendríticas, característica que é fundamental para desenhar inferências sobre complexidade neuronal e conectividade sináptica5.
Neurônios piramidais excitatórios são caracterizados por um único, grande dendrito apical, múltiplos dendritos basais mais curtos, e milhares de espinhas dendríticas6. Neurônios piramidais são encontrados em múltiplas regiões cerebrais relacionadas ao processamento cognitivo de ordem superior, incluindo o córtex pré-frontal (PFC) e o hipocampo. No PFC, os neurônios piramidais são observados nas camadas II/III e camada V, com cada um apresentando morfologia única. Especificamente, os neurônios piramidais na camada II/III do PFC têm um dendrito apical mais curto e menos ramificação do que os neurônios piramidais na camada V6. Dentro do hipocampo, os neurônios piramidais estão localizados nas regiões CA1 e CA3, com cada uma exibindo morfologias distintas. Especificamente, os neurônios piramidais na região ca1 apresentam um dendrito apical mais distinto, com ramificações ocorrendo mais longe do soma, em relação à região ca36.
Espinhos dendréticos em neurônios piramidais tanto no PFC quanto no hipocampo são o local principal das sinapses excitatórias7. As características morfológicas das espinhas dendríticas, que são classicamente caracterizadas em três categorias primárias (ou seja, finas, stubby ou cogumelo8), foram relacionadas com o tamanho da sinapse excitatória9. Espinhos finos, caracterizados por um pescoço longo e fino, cabeça bulbosa pequena e densidades postynapticas menores, são mais instáveis e desenvolvem conexões mais fracas. No entanto, as espinhas de cogumelos, que têm uma cabeça de coluna dendrítica maior, são reconhecidas por formar conexões sinápticas mais fortes, um efeito resultante de seu tamanho maior. Em contraste acentuado, as espinhas stubby são desprovidas de um pescoço de coluna, exibindo uma razão de volume de cabeça e pescoço aproximadamente igual8. Dentro do hipocampo, espinhos ramificados também podem ser observados, pelo qual a coluna vertebral tem múltiplas cabeças que emergem do mesmo pescoço dendrítico10. Portanto, as mudanças morfológicas das espinhas dendríticas poderiam refletir a funcionalidade e a capacidade estrutural. Além disso, estudos têm demonstrado que o tamanho e a forma das espinhas dendríticas estão relacionados à sua plasticidade estrutural, levando à ideia de que pequenas espinhas estão envolvidas na aprendizagem e na atenção, enquanto espinhas maiores e mais estáveis estão envolvidas em processos de longo prazo, incluindo a memória11. Além disso, a distribuição de espinhos dendréticos ao longo do dendrito pode estar associada à conectividade sináptica5,12.
Assim, o presente trabalho metodológico tem três metas: 1) Apresentar nosso protocolo de rotulagem balística, que tem sido utilizado com uma taxa de sucesso (ou seja, neurônios atendendo aos critérios de seleção e apropriados para análise) de 83,3%5,12,13 e em múltiplas regiões cerebrais (ou seja, PFC, núcleo accumbens, hipocampo); 2) Demonstrar a generalização da técnica e sua aplicação aos neurônios cultivados in vitro; 3) Detalhe a metodologia utilizada no software de reconstrução neuronal e as inferências que podem ser extraídas desses dados.
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Protocol
Todos os protocolos de animais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Carolina do Sul (número de garantia federal: D16-00028).
1. Preparação da tubulação de dii/tungstênio
- Dissolver 100 mg de polivinilpirrolido (PVP) com 10 mL de ddH2O. Vortex a solução PVP levemente.
- Encha a tubulação com a solução PVP (ver Tabela de Materiais) e deixe-a por 20 min. Em seguida, expulse a solução PVP através da outra extremidade do tubo usando uma seringa de 10 mL.
- Combine 170 mg de contas microtransportadoras de tungstênio com 250 μL de cloreto de metileno. Vórtice a suspensão de abelhas de tungstênio completamente.
- Combine 6 mg de corante lipofílico DilC18(3) com 300 μL de cloreto de metileno. Vórtice a solução de tine DilC18(3) completamente.
NOTA: Executar as etapas 1.3-1.4 em uma capa de fumaça. - Pipeta 250 μL da suspensão de conta de tungstênio em um escorregador de vidro. Aguarde a suspensão a secar a ar (~3 min).
- Adicione 300 μL de solução de corante DilC18(3) na parte superior da camada de suspensão do talude de tungstênio. Misture bem a solução de corantes DiIC18(3) e a suspensão de talitas de tungstênio com uma ponta de pipeta e deixe a mistura secar ao ar (~3 min).
- Uma vez seco, use uma lâmina de barbear para dividir a mistura em dois tubos de centrífuga de 1,5 mL. Encha os tubos com água.
- Sonicate em banho-maria (Amp I, 100%) até homogêneo (~5 min). Certifique-se de que a ponta do sônico esteja diretamente sobre os tubos com a suspensão do tale.
- Combine os dois 1,5 mL de mistura homogeneizada em um tubo cônico de 15 mL. Sonicate a mistura por mais 3 min.
- Desenhe a mistura de corante tungstênio-DilC18(3) na tubulação revestida de PVP usando uma seringa de 10 mL. Alimente o tubo na estação de preparação (ver Tabela de Materiais).
- Gire por 1 min na estação de preparação. Remova cuidadosamente toda a água do tubo usando uma seringa de 10 mL.
- Ligue o gás nitrogênio e ajuste o fluxo de nitrogênio para aproximadamente 0,5 Litros por minuto (LPM), gire o tubo na estação de preparação e seque com nitrogênio por 30 minutos.
- Remova o tubo da estação de preparação e corte em comprimentos de 13 mm (correspondendo ao tamanho de carregamento do cartucho) usando um cortador de tubos. Mantenha os comprimentos de 13 mm em frascos de cintilação no escuro.
2. Preparação de seções cerebrais
NOTA: Os ratos machos adultos F344/N foram alojados em um ambiente controlado um ciclo de luz 12/12: ciclo escuro com acesso a ad libitum a alimentos e água. Todos os animais foram atendidos utilizando diretrizes estabelecidas pelos Institutos Nacionais de Saúde no Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
- Ratos anestesiados usando 5% de sevofano.
- Siga para o passo seguinte quando os ratos não respondem a estímulos nocivos e os reflexos estão ausentes.
- Fixe o rato em uma posição supina dentro de uma capa de fumaça química.
- Faça uma incisão através da pele ao longo da linha média torácica. Separe o diafragma e abra o peito com uma tesoura. Insira uma agulha de 20 G × 25 mm no ventrículo esquerdo.
- Corte imediatamente o átrio direito com uma tesoura. Perfuse 50 mL de 100 mM PBS com 5 mL/min de vazão. Perfusão 100 mL de 4% de paraformaldeído tamponado em 100 mM PBS.
- Remova todo o cérebro de rato logo após a perfusão.
- Fixe todo o cérebro por 10 min com 4% de paraformaldeído.
NOTA: Não poste em 4% de paraformaldeído por mais de 30 min, pois afetará a rotulagem. - Corte seções coronais de 500 μm de espessura usando uma matriz cerebral de rato (ver Tabela de Materiais). Faça o primeiro corte e mantenha a lâmina no lugar. Faça um segundo corte usando uma segunda lâmina e remova verticalmente a primeira lâmina, mantendo o tecido na superfície da lâmina.
- Coloque as fatias cerebrais em uma placa de 24 poços com 1 mL de 100 mM PBS em cada poço. Repita este processo até que todas as fatias tenham sido cortadas.
3. Rotulagem balística e visualização de seções cerebrais
- Remova o PBS de cada bem direcionado.
- Carregue o cartucho com um pedaço de tubo de dii/tungstênio e coloque-o no aplicador.
- Coloque um pedaço de papel filtro entre duas telas de malha. Conecte o aplicador à mangueira de hélio. Ajuste a pressão de saída do hélio para 90 libras por polegada quadrada (psi).
- Coloque o aplicador verticalmente à mão no centro do poço direcionado a uma distância de 1,5 cm entre a amostra e a tela de malha. Atire a tubulação de contas DiI/Tungstênio.
NOTA: Certifique-se de remover todos os PBS dos poços alvo antes de atirar. - Carregue o cartucho com o próximo tubo de dii/tungstênio. Dispare continuamente as contas DiI/Tungstênio do tubo sobre as fatias restantes.
- Encha a placa de 24 poços com 100 mM de PBS. Lave com 500 μL de 100 mM frescos de PBS 3x. Não deixe as fatias virarem enquanto lava com PBS.
- Adicione 500 μL de PBS fresco de 100 mM e mantenha as fatias a 4 °C no escuro por 3 h.
- Transfira as fatias cerebrais para lâminas de vidro usando um pincel fino.
NOTA: Três seções cerebrais podem ser transferidas para cada lâmina de vidro. - Adicione imediatamente 1 mL de meio de montagem antifade em cada seção. Coloque um deslizamento de cobertura de 22 mm x 50 mm sobre as seções cerebrais. Seque as lâminas de vidro no escuro por 2 dias.
- Ligue o sistema de microscópio confocal e mude para um objetivo de 60×.
- Defina o sistema de microscópio confocal para ter uma ampliação de 60× (A/1.4, óleo) e um intervalo de plano Z de 0,15 μm (tamanho pinhole 30 μm, raio de orifício projetado para trás 167 nm). Use um comprimento de onda de 543 nm para adquirir imagens dos neurônios de interesse.
- Obter imagens de pilha Z para o tipo de neurônio direcionado com base nos limites da região cerebral e características morfológicas dos neurônios.
NOTA: Adquira pelo menos três imagens de cada animal.
4. Uso da metodologia com cultura celular
- Isolar os neurônios corticais primários dos ratos F344/N no primeiro dia pós-natal utilizando a metodologia previamente relatada14.
- Cultura neurônios corticais primários em uma placa de fundo de vidro de 35 mm por uma semana. Mude metade do meio de cultura com meio de crescimento de neurônios frescos no terceiro dia após o isolamento. Lave o prato de fundo de vidro 2x com 1 mL de 100 mM PBS.
- Fixe com 4% de paraformaldeído por 15 min à temperatura ambiente. Repita as etapas 3.2-3.6 para rotular balísticamente as células.
- Lave com 1 mL de 100 mM PBS 3x. Adicione 500 μL de 100 mM frescos de PBS e mantenha-o a 4 °C no escuro por 3 h.
- Adicione 200 μL de meio de montagem antifade.
- Obtenha imagens de pilha Z para cada neurônio alvo usando os parâmetros na etapa 3.10.
5. Análise neuronal e quantificação da coluna vertebral dendrítica
- Neurônios cegos usando números de código para evitar viés experimentador.
- Estabelecer critérios de seleção para neurônios com base na região de interesse cerebral.
NOTA: Os critérios de seleção dos neurônios incluem coloração dendrítica contínua, baixo fundo, sem aglomerados de tinos dentro das células, difusão mínima do dii no espaço extracelular, morfologia correta dos neurônios piramidais(Figura 1). - Abra o software de reconstrução neuronal (Veja o vídeo anexo 1).
- Carregue um arquivo de imagem clicando na imagem "File Folder" no canto superior esquerdo.
- Cliqueem "Soma" e marque a soma dos neurônios na imagem.
- Clique em"Árvore" e selecione "Guiado pelo usuário".
- Rastreie todos os ramos de interesse dendrético.
NOTA: Para neurônios piramidais, que são caracterizados por um dendrito apical e múltiplos dendritos basilares, apenas o dendrito apical é rastreado. Certifique-se de que todas as ramificações de conexão estão conectadas umas às outras. - Cliqueem" Espinha ".
- Defina parâmetros de detecção e clique em "Detectar tudo".
NOTA: Para fatias cerebrais, os parâmetros consistentes utilizados em todas as regiões cerebrais são: 2,0 (Faixa Externa), 0,3 (Altura Mínima), 100% (Sensibilidade ao Detector) e 10 (Contagem Mínima). Para a cultura celular, é necessário aumentar a Sensibilidade do Detector e diminuir a Contagem Mínima. - Classifique as espinhas selecionando "Classificar tudo".
NOTA: As espinhas dendríticas são classificadas usando um algoritmo integral ao software de reconstrução neuronal15. - Salve o rastreamento selecionando a Imagem de Disco no canto superior esquerdo.
- Realizar análises morfológicas da coluna neuronal e dendrítica.
- Software de análise quantitativa de reconstrução neuronal aberta (Ver vídeo anexado 2).
- Carregar imagem clicando em "Arquivo" e "Abrir arquivo de dados".
- Clique em "Análise" e "Análise de Estrutura Ramificada" para analisar a morfologia neuronal e a morfologia da coluna vertebral dendrítica.
- Para morfologia neuronal, clique em "Tree Totals" e selecione a caixa para "Dendrite Totals".
- Para morfologia dendrítica da coluna vertebral, clique em "Espinhas" e, em seguida, selecione a caixa para "Detalhes da Coluna".
- Salvar saída como um arquivo de texto (.txt) clicando com o botão direito do mouse na tabela de saída e selecionando "Salvar ao arquivo".
- Cliqueem" Analisar " e "Análise de Sholl".
- Coloque o raio de partida em 10 μm e o incremento de raio a 10 μm.
- Clique na caixa "Dendrites" e clique em "Exibir".
- Salvar saída como um arquivo de texto (.txt) clicando com o botão direito do mouse na Tabela de saída e selecionando " Salvar paraarquivo".
6. Análise de dados
- Analisar os dados da morfologia neuronal (ou seja, complexidade de ramificação dendrítica).
- Adicione o número de dendritos em cada ordem de filial e divida pelo número total de dendritos. Multiplique por 100 para calcular as freqüências relativas para o número de dendritos em cada ordem de ramo.
- Analise os dados de análise de Sholl para examinar a complexidade da árvore neuronal e a conectividade da coluna vertebral dendrítica.
- Calcule o erro médio e padrão da média para o número de intersecções em cada raio.
- Soma o número de espinhas dependentes do tipo de coluna vertebral (ou seja, fina, stubby, cogumelo) em cada raio e dividida pelo número total de espinhas para esse tipo de coluna vertebral. Multiplique por 100 para calcular as frequências relativas para o número de espinhas em cada raio.
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Representative Results
Na Figura 2A,os neurônios piramidais típicos na região hipocampal nas seções cerebrais de ratos foram identificados pela tecnologia de rotulagem balística, caracterizada por um grande dendrito apical e vários dendritos basais menores ao redor do soma. A Figura 2B mostra o neurônio no software de análise quantitativa da reconstrução neuronal após a destécnica, os ramos dendréticos foram rastreados e as espinhas foram detectadas. Posteriormente, os dados foram analisados por meio de um software de análise quantitativa de reconstrução neuronal, que proporcionou uma oportunidade para avaliar a complexidade de ramificação dendrítica (Figura 2C)e a complexidade da árvore neuronal(Figura 2D).
Na Figura 2C,utilizou-se o método de ordenação de ramificações centrífugas, coletado da saída "Totais de Árvores", para contar o número de segmentos percorridos ao longo de cada dendrito e a ordem de ramificação atribuída. A freqüência relativa dos segmentos em cada ordem de ramo foi examinada para ordens de ramificação de 1 a 15. Quando foram observadas mudanças na distribuição de ramos dendréticos entre os grupos, alterações na complexidade de ramificação dendrítica poderiam ser inferidas. Além disso, foi realizada uma análise de Sholl como medida complementar da complexidade da árvore neuronal, pela qual o número de intersecções dendríticas que ocorrem a cada 10 μm do soma foi quantificado em cada seção amostral (Figura 2D). Quando foram observadas mudanças no número de intersecções dendríticas entre os grupos, alterações na complexidade da árvore neuronal poderiam ser inferidas.
Alterações morfológicas nas espinhas dendríticas poderiam ser avaliadas utilizando comprimento (μm), diâmetro da cabeça (μm) e volume (μm3), como visto na Figura 3A–B. Além disso, as espinhas foram classificadas utilizando-se o sistema de classificação assistida automática no software de reconstrução neuronal. A freqüência relativa do número de espinhas entre cada raio foi examinada para espinhos finos, cogumelos e stubby. Dada a nossa compreensão de quais tipos de coluna formam conexões sinápticas mais fortes (ou seja, cogumelo em relação ao stubby) e neurotransmissores aferentes, mudanças na distribuição de espinhas ao longo do neurônio podem indicar conectividade sináptica.
Além disso, validamos a utilidade da técnica de rotulagem balística em um neurônio piramidal primário na cultura celular. Primeiro, culturamos neurônios hipocampais primários no pós-natal D1 (dia 1) em uma placa de cultura celular revestida com poli-L-lisina por 2 semanas ou até aproximadamente 70% de confluência. Em seguida, as amostras foram fixadas com 4% de PFA por 15 min e lavadas 2x com PBS. A partir do passo 3.1 do protocolo atual, rotulamos balísticamente e imagens dos neurônios piramidais primários do hipocampo. Os dados mostraram rotulagem estabilizada e identificaram neurônios piramidais com base na forma do triângulo do soma e grande dendrite apical(Figura 4A). A utilização de software de reconstrução neuronal para investigar espinhas dendríticas de neurônios piramidais primários cultivados na cultura celular oferece oportunidades semelhantes às do cérebro de ratos. Os resultados do exemplo são ilustrados para a distribuição de espinhas dendríticas finas(Figura 4B)e comprimento da coluna vertebral dendrítica medido em μm(Figura 4C). No entanto, destaca-se que os neurônios piramidais primários cultivados na cultura celular apresentaram menor ramificação dendrítica, impedindo a avaliação, pelo menos neste exemplo, da complexidade ramificada dendrítica e da complexidade arbórea neuronal.
Figura 1: Critérios de seleção utilizados para neurônios piramidais no córtex pré-frontal medial rotulados utilizando tecnologia de rotulagem balística. (A)Uma imagem confocal representativa (60x) de um neurônio piramidal bem rotulado do córtex pré-frontal medial. Um único neurônio piramidal com um soma claro e dendrite apical incluía coloração dendrítica contínua e brilhante com fundo baixo. (B–C) Uma imagem confocal representativa (60x) de um neurônio piramidal do córtex pré-frontal medial com coloração de luz nos ramos mais distais(B)e fundo alto(C). (D) Uma imagem confocal representativa (60x) de um neurônio rotulado do córtex pré-frontal medial (baseado nas coordenadas bregma) que tem características morfológicas defeituosas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A rotulagem de neurônios piramidais no hipocampo (HIP) utilizando tecnologia de rotulagem balística e avaliações neuroanatômicas. (A)Três imagens confocais representativas (60x) de neurônios piramidais rotulados por contas de tungstênio balísticos. (B) A avaliação da morfologia neuronal: análise de ordem dedivisão dendrítica e análise de Sholl. A imagem traçada da coluna vertebral dendrítica em que a morfologia da coluna vertebral também foi identificada usando software de análise dendrítica da coluna vertebral. (C) Análises de ordem de ramificação utilizadas para examinar a freqüência relativa de ramos dendréticos em diferentes ordens de ramo. (D) Os números de intersecções dendríticas a cada 10 μm do soma foram avaliados utilizando-se a análise de Sholl como medida da complexidade da árvore neuronal. Os dados são descritos como freqüências relativas de todo o conjunto de dados(C)ou se encaixam com intervalos de confiança de 95%(D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. A avaliação da morfologia da coluna vertebral dendrítica. (A–B) A distribuição de espinhas dendríticas ilustradas em função do tipo de coluna vertebral (ou seja, fina, stubby, cogumelo). Também foram analisados parâmetros adicionais de coluna dendrítica (ou seja, comprimento, volume, diâmetro da cabeça) como avaliação da morfologia da coluna vertebral dendrítica. Os dados são ilustrados como freqüências relativas de todo o conjunto de dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. A rotulagem de neurônio cortical primário in vitro usando tecnologia de rotulagem balística. (A) Imagens confocais representativas (60x) de neurônios corticais primários rotulados por contas de tungstênio balístico in vitro. Resultados similares aos adquiridos a partir da rotulagem balística em fatias cerebrais são mostrados para a distribuição de espinhas dendríticas finas(B)e comprimento(C). Os dados são ilustrados como freqüências relativas de todo o conjunto de dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1: Procedimentos de rastreamento neuronal e detecção de coluna dendrítica. Clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
Vídeo 2: Procedimentos de coleta e saída de dados para análise quantitativa. Clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
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Discussion
Neste protocolo, descrevemos uma técnica de rotulagem versátil para neurônios tanto do cérebro de ratos quanto daqueles cultivados in vitro. Além disso, relatamos a metodologia de utilização do software de reconstrução neuronal e do software de análise quantitativa de reconstrução neuronal para avaliar a morfologia neuronal e as espinhas dendríticas. A avaliação da morfologia neuronal e das espinhas dendríticas fornece uma oportunidade para determinar alterações na complexidade de ramificação dendrítica, complexidade da árvore neuronal, morfologia dendrítica da coluna vertebral e conectividade sináptica.
Ao conduzir o protocolo, os pesquisadores devem prestar atenção especial a alguns passos. Primeiro, a pós-fixação em 4% de PFA por muito tempo danificará a integridade da membrana lipofílica e fará com que o corante vaze fora das células. Em segundo lugar, em comparação com a especificidade da rotulagem balística em fatias cerebrais, que tem como alvo apenas neurônios, a rotulagem de neurônios corticais primários in vitro introduz rotulagem inespecífica da glia porque a rotulagem balística em fatias cerebrais não é específica para um tipo de neurônio (ou seja, neurônio piramidal, neurônio espinhoso médio, célula granulada). Assim, as coordenadas bregma, avaliações morfológicas ou marcadores celulares específicos devem ser combinados com o método de rotulagem balística. Em terceiro lugar, a espessura das fatias cerebrais pode ser entre 200-500 μm; para melhores resultados, deve ser otimizado. Em quarto lugar, a eficiência da rotulagem e penetração do corante está relacionada a muitos fatores, como pressão de hélio, tempo de incubação após a aplicação balística, as contas DiI/Tungstênio, a distância entre a tela de malha e a superfície das fatias cerebrais, etc. O protocolo deve ser otimizado para cada estudo. Em quinto lugar, grandes aglomerados ou aglomerados de contas de tungstênio revestidas de corantes balísticos durante a preparação devem ser evitados, porque os aglomerados não permitiriam que os neurônios individuais fossem distinguidos. Também determinamos que diI se difunde em todos os neurônios individuais mais completamente do que DiO nesta metodologia balística.
No entanto, em comparação com os métodos tradicionais de rotulagem4, a técnica de rotulagem balística possibilita a imagem confocal de alta resolução, permitindo a avaliação da morfologia da coluna vertebral neuronal e dendrítica. Além disso, o software de reconstrução neuronal utiliza um algoritmo para classificação assistida automática de espinhas dendríticas (ou seja, finas, cogumelos, stubby), medidas de ordenação de ramo, análise clássica de Sholl e medição de características morfológicas de colunas dentrióticas, como comprimento (μm), diâmetro da cabeça (μm) e volume (μm3). A quantificação de múltiplos parâmetros neuronais oferece uma oportunidade de entender melhor os mecanismos subjacentes à disfunção neurocognitiva.
No geral, o método de rotulagem balística permite a visualização de estruturas neuronais em diferentes regiões cerebrais do rato e na cultura celular, o que é importante para elucidar os possíveis mecanismos subjacentes à disfunção neurocognitiva. No presente estudo, apresentamos um método para rotular neurônios piramidais por uma técnica de rotulagem balística. Além disso, combinado com o software de reconstrução neuronal, demonstramos a capacidade de examinar a morfologia da coluna vertebral neuronal e dendrítica em neurônios piramidais hipocampais. As diferenças de grupo na morfologia da coluna vertebral neuronal e/ou dendrítica fornecem uma oportunidade para compreender os mecanismos subjacentes à disfunção neurocognitiva.
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Disclosures
Nenhum dos autores tem conflitos de interesse para declarar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelas subvenções do NIH HD043680, MH106392, DA013137 e NS100624.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20Gx25mm PrecisionGlide needle | BD | 305175 | |
| 24-well cell culture plate | Costar | 3562 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Barrel liner | BIO-RAD | 165-2417 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Cartridge holder | BIO-RAD | 165-2426 | |
| Confocal imaging software | Nikon | EZ-C1 | version 3.81b |
| Confocal microscope | Nikon | TE-2000E | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| DilC18(3) | Fisher Scientific | D282 | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| F344 rat | (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) | ||
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Helios diffusion screens | BIO-RAD | 165-2475 | |
| Helios gene gun kit | BIO-RAD | 165-2411 | |
| Helios gene gun system | BIO-RAD | 165-2431 | |
| Helium hose assembly | BIO-RAD | 165-2412 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Methylene chloride | Fisher Scientific | D150-1 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| Neurolucida 360 software | mbf bioscience | dendritic spine analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher Scientific | 5295 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Fisher Scientific | P36930 | mounting medium |
| Rat brain matrix, 300 - 600g, Coronal, 0.5mm | Ted Pella | 15047 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Syringe kit | BIO-RAD | 165-2421 | |
| Tefzel tubing | BIO-RAD | 165-2441 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Tubing cutter | BIO-RAD | 165-2422 | |
| Tubing Prep station | BIO-RAD | 165-2418 | |
| Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm | BIO-RAD | 165-2269 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
References
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
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