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Neuroscience

माइक्रोफ्लूइडिक चैम्बर्स सिस्टम का उपयोग करके मोटर न्यूरॉन संस्कृतियों में ऑर्गेनेल्स का एक्सोनल परिवहन

Published: May 5, 2020 doi: 10.3791/60993
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1,2
1Department of Physiology and Pharmacology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Sagol School of Neuroscience, Tel Aviv University
* These authors contributed equally

Summary

अक्षीय परिवहन मोटर न्यूरॉन स्वास्थ्य के लिए एक महत्वपूर्ण तंत्र है। इस प्रोटोकॉल में हम माइक्रोफ्लूइडिक कक्षों का उपयोग करके मोटर न्यूरॉन एक्सोन में अम्लीय डिब्बों और माइटोकॉन्ड्रिया के अक्षीय परिवहन को ट्रैक करने के लिए एक विस्तृत विधि प्रदान करते हैं।

Abstract

मोटर न्यूरॉन्स (एमएनएस) बहुत लंबे समय तक अक्षतके साथ अत्यधिक ध्रुवीकृत कोशिकाएं हैं। एक्सोनल परिवहन एमएन स्वास्थ्य के लिए एक महत्वपूर्ण तंत्र है, जो न्यूरोनल विकास, विकास और अस्तित्व में योगदान देता है। हम एमएन एक्सॉन में फ्लोरोसेंटी लेबल ऑर्गेनेल्स के एक्सोनल परिवहन पर नज़र रखने के लिए माइक्रोफ्लूइडिक कक्षों (एमएफसी) के उपयोग के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन करते हैं। यह विधि तेजी से, अपेक्षाकृत सस्ती है, और अंतरिक्ष और समय में इंट्रासेलुलर संकेतों की निगरानी के लिए अनुमति देती है। हम के लिए कदम प्रोटोकॉल द्वारा एक कदम का वर्णन: 1) पॉलीडिमिथाइलसिलिक्साने (पीडीएम) एमएफसी का निर्माण; 2) मेएफसी में वेंट्रल रीढ़ की हड्डी के एक्सप्लांट ्स और एमएन विसोसिएटेड संस्कृति की चढ़ाना; 3) माइटोकॉन्ड्रिया और अम्लीय डिब्बों की लेबलिंग लाइव कॉन्फोकल इमेजिंग के बाद; 4) मैनुअल और अर्धस्वचालित एक्सोनल परिवहन विश्लेषण। अंत में, हम एचबी9 के माइटोकॉन्ड्रिया और अम्लीय डिब्बों के परिवहन में अंतर प्रदर्शित करते हैं::GFP वेंट्रल रीढ़ की हड्डी एक्सप्लांट एक्सप्लांट एक्सोन सिस्टम वैधता के सबूत के रूप में। कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल विभिन्न एक्सोनल घटकों के अक्षीय परिवहन का अध्ययन करने के साथ-साथ स्थानिक प्रयोगात्मक संभावनाओं की खोज में मदद करने के लिए एमएफसी उपयोग के लिए एक सरलीकृत मैनुअल प्रदान करता है।

Introduction

एमएनएस लंबे अक्षों के साथ अत्यधिक ध्रुवीकृत कोशिकाएं हैं, जो वयस्क मनुष्यों में एक मीटर तक लंबी तक पहुंच ती हैं। यह घटना एमएन कनेक्टिविटी और कार्य के रखरखाव के लिए एक महत्वपूर्ण चुनौती पैदा करती है। नतीजतन, एमएनएस अपने सेल शरीर से सिनेप्स और बैक तक एक्सोन के साथ जानकारी, ऑर्गेनेल्स और सामग्रियों के उचित परिवहन पर निर्भर करते हैं। विभिन्न सेलुलर घटक, जैसे प्रोटीन, आरएनए और ऑर्गेनेल्स को नियमित रूप से एक्सोन के माध्यम से शटल किया जाता है। माइटोकॉन्ड्रिया महत्वपूर्ण ऑर्गेनेल्स हैं जिन्हें नियमित रूप से एमएनएस में ले जाया जाता है। मिटोकॉन्ड्रिया एमएनएस की उचित गतिविधि और कार्य के लिए आवश्यक हैं, जो एटीपी प्रावधान, कैल्शियम बफरिंग और सिग्नलिंग प्रक्रियाओं1,,2के लिए जिम्मेदार हैं। माइटोकॉन्ड्रिया का एक्सोनल ट्रांसपोर्ट एक अच्छी तरह से अध्ययन की गई प्रक्रिया3,4है । दिलचस्प बात यह है कि माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन में दोष कई न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों में और विशेष रूप से एमएनरोगों 5में शामिल होने की सूचना मिली थी । अम्लीय डिब्बे आंतरिक ऑर्गेनेल्स के लिए एक और उदाहरण के रूप में काम करते हैं जो एमएन एक्सॉन के साथ चलते हैं। अम्लीय डिब्बों में लिसोसोम्स, एंडोसोम्स, ट्रांस-गोलगी उपकरण और कुछ स्रावात्मक वेसिकल्स6शामिल हैं। अम्लीय डिब्बों के अक्षत के परिवहन में दोष कई न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के साथ - साथ7में पाए गए और हाल के पत्र एमएनरोगों 8में उनके महत्व को उजागर करते हैं ।

एक्सोनल परिवहन का कुशलतापूर्वक अध्ययन करने के लिए, सूक्ष्म तरल कक्ष जो अलग-अलग दैहिक और एक्सोनल डिब्बों का उपयोग अक्सर9,,10करते हैं। माइक्रोफ्लूइडिक प्रणाली के दो महत्वपूर्ण फायदे, और डिब्बेीकरण और एक्सोन का अलगाव, इसे उपसेलुलर प्रक्रियाओं11के अध्ययन के लिए आदर्श प्रदान करता है। न्यूरोनल सेल निकायों और एक्सोन के बीच स्थानिक अलगाव का उपयोग विभिन्न न्यूरोनल डिब्बों (जैसे, अक्षों बनाम सोमा) के बाह्य वातावरण में हेरफेर करने के लिए किया जा सकता है। जैव रासायनिक, न्यूरोनल विकास/पतन, और इम्यूनोफ्लोरेसेंस इस मंच से सभी लाभ कहते हैं । एमएफसी अन्य सेल प्रकारों के साथ न्यूरॉन्स को कोकुल्चरिंग करके सेल-टू-सेल संचार का अध्ययन करने में भी सहायता कर सकता है, जैसे कंकाल की मांसपेशियां12,,13,,14।

यहां, हम मोटर न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रिया और अम्लीय डिब्बे परिवहन की निगरानी के लिए एक सरल अभी तक सटीक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम आगे प्रतिगामी और पूर्ववर्ती चलती ऑर्गेनेल्स के सापेक्ष प्रतिशत की तुलना करके इस विधि के उपयोग को दिखाते हैं, साथ ही परिवहन वेग के वितरण को भी दिखाते हैं।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में जानवरों की देखभाल और उपचार तेल अवीव विश्वविद्यालय की पशु नैतिकता समिति की देखरेख और अनुमोदन के तहत किया गया था ।

1. एमएफसी तैयारी

  1. प्राथमिक मोल्डों में पीडीएम कास्टिंग(चित्रा 1)
    1. एक विस्तृत प्रोटोकॉल9के बाद प्राथमिक मोल्ड (वेफर्स) खरीदया या बनाते हैं।
    2. कोटिंग स्टेप पर आगे बढ़ने से पहले वेफर प्लेटफॉर्म से किसी भी तरह की गंदगी को हटाने के लिए दबाव वाली हवा का इस्तेमाल करें। वेफर्स की सतह चिकनी और स्पष्ट दिखनी चाहिए।
    3. 50 मीटर तरल नाइट्रोजन के साथ एक कंटेनर भरें। इसके लिए 10 मिलीआर सिरिंज और 23 जी की सुई तैयार करें।
      नोट: इस कदम से सभी प्रक्रियाओं को आगे एक रासायनिक हुड में किया जाना चाहिए ।
    4. रासायनिक हुड में, तरल नाइट्रोजन के पूल 2 मिलील के लिए सिरिंज और सुई का उपयोग करें। हालांकि यह हवा की तरह लग सकता है खींचा गया था, सिरिंज नाइट्रोजन से भर जाता है(चित्रा 1ए)। वेफर युक्त प्लेट को सीलकंटेनर में रखें।
    5. स्क्रू एक क्लोरोट्रिमेथिलसिलेन की बोतल खोलें, नाइट्रोजन से भरी सिरिंज का उपयोग करके रबर कैप को छेदें, और बोतल में सिरिंज की पूरी सामग्री इंजेक्ट करें। सुई को बाहर निकालने के बिना, बोतल को उल्टा करें और क्लोरोमाइमेथिलसिलेन के 2 mL को वापस खींचें।
      नोट: सिरिंज दबाव के कारण, सुई से थोड़ी मात्रा में क्लोरोट्रिमेथिलसिलेन का छिड़काव किया जाता है। एक खतरे से बचने के लिए, हुड की भीतरी दीवार की ओर सुई बिंदु(चित्रा 1बी)।
    6. कंटेनर (चरण 1.1.4 से) में क्लोरोमाइमेथिलसिलेन को समान रूप से फैलाएं, लेकिन सीधे वेफर या वेफर युक्त प्लेट पर नहीं। कंटेनर बंद करें और प्रति वेफर 5 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: यदि यह पहली बार वेफर क्लोरोमाइमेथिलस्लाईलेन के साथ लेपित है, तो प्रत्येक वेफर के लिए 1 घंटे इनक्यूबेशन की अनुमति दी जानी चाहिए।
    7. वेफर्स और कंटेनर को 30 मिन के लिए रासायनिक हुड से बाहर न लें।
      सावधानी: क्लोरोमाइमेथिलसिलेन अत्यधिक अस्थिर है।
    8. 50 एमएल ट्यूब में पीडीएम बेस (सामग्री की तालिकादेखें) का वजन करें और क्रमशः 16:1 के अनुपात में पीडीएफ क्यूरिंग एजेंट जोड़ें (उदाहरण के लिए, 47.05 ग्राम आधार और 2.95 ग्राम क्यूरिंग एजेंट)। कम स्पीड रोटेटर का उपयोग करके 10 मिन के लिए मिलाएं।
    9. प्रत्येक वेफर युक्त प्लेट में पीडीएमएस को वांछित ऊंचाई(चित्रा 1सी)में डालें।
      नोट: पतले माइक्रोफ्लूइडिक कक्षों (3-4 मिमी तक) का उपयोग करने से संस्कृति पकवान का पालन बेहतर होता है और रिसाव को रोकता है।
    10. सभी प्लेटों को 2 घंटे(चित्रा 1ई)के लिए वैक्यूम डिसिकाटर के अंदर एक साथ रखें। यह प्रक्रिया पीडीएम के भीतर फंसी हवा को हटा ती है, इस प्रकार हवा के बुलबुले को नष्ट करती है और एक स्पष्ट, समान मोल्ड बनाती है।
    11. प्लेटों को 3 घंटे (या रात भर) के लिए एक ओवन के अंदर 70 डिग्री सेल्सियस(चित्रा 1ई)पर रखें।
      नोट: ओवन में रखे जाने पर प्लेटें स्तर की होनी चाहिए।
  2. एपॉक्सी मोल्ड्स में पीडीएम कास्टिंग
    नोट: क्योंकि वेफर तैयारी महंगी है, विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है, और नाजुक वेफर्स को नुकसान पहुंचा सकती है, वेफर्स की एपॉक्सी प्रतिकृतियां उत्पन्न करना संभव है। प्रतिकृतियां सस्ती, अधिक टिकाऊ हैं, और इसका उपयोग माइक्रोफ्लूइडिक कक्षों के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए किया जा सकता है।
    1. कास्ट और इलाज PDMS (के रूप में 1.1.8-1.1.11 में वर्णित) मूल वेफर में ।
    2. पीडीएम के अतिरिक्त हिस्सों को हटा दें और काट दें, जिससे केवल माइक्रोफ्लूइडिक तत्व और उन्हें माइक्रोफ्लूइडिक कक्षों में संसाधित करने के लिए आवश्यक कार्यात्मक क्षेत्र।
    3. इसे धूल जमने से रोकने के लिए तुरंत पीडीएम को मोटी, चिपचिपा टेप से लपेटें।
    4. एक ऊतक संस्कृति ग्रेड प्लास्टिक पकवान है कि अंदर पूरे PDMS फिट बैठता है और इसके चारों ओर epoxy के लिए कमरे छोड़ चुनें । पीडीएम से प्लास्टिक डिश की दूरी 5 एमएम से कम होनी चाहिए।
    5. 10:1 (आधार: इलाज एजेंट) के अनुपात में मिश्रित पीडीएफ की एक छोटी राशि तैयार करें। ताजा तरल पीडीएफएस का उपयोग प्लास्टिक प्लेट के नीचे ठोस पीडीएफको गोंद करने के लिए किया जाएगा।
    6. प्लास्टिक प्लेट के केंद्र तल पर तरल पीडीएम की न्यूनतम मात्रा लागू करें और फिर पीडीएफएम से चिपचिपा टेप निकालें और प्लास्टिक डिश बॉटम का पालन करें। सुनिश्चित करें कि माइक्रोफ्लूइडिक तत्व ऊपर की ओर सामना कर रहे हैं।
    7. पीडीएम को 70 डिग्री सेल्सियस ओवन में 30 मिन का इलाज करने दें।
    8. एक टेस्ट ट्यूब में क्रमशः 100:45 के अनुपात में आधार और इलाज एजेंट को मिलाकर एपॉक्सी राल तैयार करें। विभिन्न एपॉक्सी रेजिन में अलग-अलग मिश्रण अनुपात हो सकते हैं। एक नियमित रूप से 100 मिमी प्लेट के लिए आवश्यक मात्रा लगभग 40 मिमी है।
    9. एपॉक्सी को एक रोटेटर में 10 मिन के लिए अच्छी तरह से मिलाएं जब तक मिश्रण समरूप दिख नहीं जाता (यानी, तरल में कोई दिखाई फाइबर जैसी कलाकृतियां नहीं हैं)।
    10. 5 मिन के लिए 400 x ग्राम पर एपॉक्सी मिश्रण को सेंट्रलाइज करें ताकि अंदर पकड़े गए हवा के बुलबुले को हटाया जा सके।
    11. केंद्रीकरण के दौरान, दीवारों और संस्कृति पकवान के अन्य सभी उजागर प्लास्टिक भागों के चारों ओर सिलिकॉन तेल की एक पतली परत फैलाएं। इससे एपॉक्सी को डिश प्लास्टिक के साथ पॉलीमरेज होने से रोका जा सकेगा और प्रोटोकॉल के अंत में आसानी से ठीक एपॉक्सी को हटाने में आसानी से काम आएगा।
    12. एपॉक्सी को धीरे-धीरे डिश में तब तक डालें जब तक कि यह पीडीएफएमएस को पूरी तरह से कवर न कर दे और कम से कम 5 मिमी तक इससे आगे न जाए। ट्यूब और प्लेट के बीच शून्य दूरी रखकर एपॉक्सी के भीतर किसी भी बुलबुले के गठन को रोकें। प्लेट को एक सुरक्षित जगह पर रखें ताकि इसे अगले 48 एच के लिए स्थानांतरित नहीं किया जाएगा।
    13. 48 घंटे के बाद एपॉक्सी पूरी तरह से ठीक हो जाना चाहिए। अंतिम इलाज के लिए 3 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर एक पहले से गरम ओवन में प्लेट डालें।
    14. प्लेट से ठीक एपॉक्सी और मूल पीडीएम मोल्ड को प्लेट की प्लास्टिक की दीवार को धीरे से तब तक निकालें जब तक कि यह टूट न जाए। इसके बाद इसे आसानी से एपॉक्सी से अलग कर के छील देना चाहिए।
    15. एक बार निकाले जाने के बाद, शेष तेल को नई एपॉक्सी प्रतिकृति से मिटा दें और इसे उल्टा (यानी, प्रतिकृति वाले माइक्रोफ्लूइडिक तत्वों के साथ) को एक नई संस्कृति डिश में मिटा दें। एप्डॉक्स प्रतिकृति अब पीडीएम कास्टिंग के लिए तैयार है।
    16. एपॉक्सी मोल्ड से पीडीएफएमएस या गंदगी के किसी भी अवशेष को उड़ाने के लिए दबाव वाली हवा या एन2 का उपयोग करें और इसे आइसोप्रोपेनॉल के साथ 2x कुल्ला दें। इसे तीसरी बार भरें और ऑर्बिटल शेकर प्लेट पर 10 सीन के लिए इनक्यूबेट करें । आइसोप्रोपेनॉल के साथ मोल्ड को फिर से 3x कुल्लाएं और शेष तरल को त्याग दें। हवा या एन2 के साथ सूखी उड़ा या सूखी जब तक एक 70 डिग्री सेल्सियस ओवन में जगह है।
      नोट: आइसोप्रोपेनॉल के साथ काम करते समय और त्यागते समय सुरक्षा प्रक्रियाओं का पालन करें।
    17. ढलाई तक मोल्ड प्लेटें बंद रखें। चरणों का पालन करें 1.1.8.-1.1.11।
  3. छिद्रण और एक एमएफसी में PDMS मूर्तिकला(चित्रा 2)
    1. स्केलपेल का उपयोग करके वेफर्स पर (+) के निशान का पालन करके प्लेट से पीडीएमएस मोल्ड को काटें और हटा दें। बल का उपयोग न करें, क्योंकि मोल्ड नाजुक हैं(चित्र ा 2ए)।
    2. स्केच पर तैयार निर्देशों का पालन करने के लिए पंच और प्रयोगात्मक सेटअप(चित्रा 2बी एफ)के आधार पर कक्षों में कटौती ।
      1. रीढ़ की हड्डी के लिए संस्कृति(चित्रा 2सी, ई),पंच एक बड़े एमएफसी के डिस्टल साइड में दो 7 मिमी कुओं । कुओं का पता लगाएं कि वे चैनल किनारों के साथ ओवरलैप होंगे। समीपस्थ पक्ष पर, चैनल के बीच में एक 7 मिमी अच्छी तरह से पंच करें, न्यूनतम ओवरलैप के साथ ताकि एक्सप्लांट्स के लिए पर्याप्त स्थान छोड़ दिया जाएगा। समीपस्थ चैनल के दो किनारों में दो अतिरिक्त 1 मिमी छेद पंच करें। ऊपर की ओर सामना कर रहे माइक्रोफ्लूइडिक तत्वों के साथ एमएफसी को चालू करें, और 20 जी सुई का उपयोग करके, मुक्का मारने वाले 7 मिमी कुएं पर तीन छोटे एक्सप्लांट गुफाओं को तराशें।
      2. अलग एमएन संस्कृति के लिए(चित्रा 2डी, एफ),एक छोटे से एमएफसी के दो चैनलों के किनारों में चार 6 मिमी कुओं पंच ।
  4. ऊतक संस्कृति के उपयोग के लिए एमएफसी नसबंदी
    1. बेंच पर 50 सेमी लंबे चिपचिपा टेप बैंड फैलाएं। चिपचिपा टेप (ऊपरी और निचले दोनों चेहरों) का सामना करने और कच्चे कचरे को हटाने के लिए कक्ष को वापस खींचें और खींचें। साफ-सुथरे कक्षों को नई 15 सेमी प्लेट में रखें।
      नोट: जब ये ऊपर की ओर सामना कर रहे हों तो सीधे माइक्रोफ्लूइडिक तत्वों पर न दबाएं।
    2. एक कक्षीय शेखर पर 10 मेंस के लिए विश्लेषणात्मक ग्रेड 70% इथेनॉल में कक्षों को इनक्यूबेट।
    3. इथेनॉल का निपटान करें और कक्षों को ऊतक संस्कृति हुड में या 70 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में सुखालें।
  5. एक गिलास नीचे पकवान पर एमएफसी रखकर
    1. एक ऊतक संस्कृति ग्रेड 35 मिमी/50 मिमी ग्लास नीचे पकवान के केंद्र में चैंबर रखें और पीडीएम और डिश नीचे बांध बनाने के लिए किनारों पर मामूली बल लागू होते हैं। कांच के नीचे तोड़ने से बचने के लिए, हमेशा एक ठोस सतह के शीर्ष पर बल लागू करें।
    2. 70 डिग्री सेल्सियस में 10 मिन। थाली के पालन को मजबूत करने के लिए कक्षों को दबाएं।
    3. 10 मिन के लिए यूवी लाइट के तहत इनक्यूबेट।
  6. कोटिंग और पुलिया
    1. दोनों डिब्बों में 1.5 एनजी/एमएल पॉली-एल-ऑर्निथिन (पीईओ) जोड़ें। सुनिश्चित करें कि पीएलओ चैनल के प्रवेश द्वार में कई बार सीधे कोटिंग मीडिया को पाइपिंग करके चैनलों के माध्यम से चल रहा है।
    2. हवा के बुलबुले की उपस्थिति की जांच करने के लिए 10x आवर्धन के साथ एक हल्के माइक्रोस्कोप के नीचे माइक्रोफ्लूइडिक कक्ष की जांच करें। यदि हवा के बुलबुले माइक्रोग्रूव को अवरुद्ध कर रहे हैं, तो एमएफसी को 2 मिन के लिए वैक्यूम डिसिकाटर में रखें। बाद में चैनलों में पकड़ी गई अतिरिक्त हवा को उनके माध्यम से कोटिंग मीडिया को पाइप करके हटा दें। रातोंरात इनक्यूबेट।
    3. पीएलओ को उसी तरीके से रातोंरात इनक्यूबेशन के लिए लेमिनिन (डीडीडब्ल्यू में 3 μg/mL) से बदलें ।
    4. चढ़ाना से पहले, लेमिनिन को न्यूरोनल कल्चर माध्यम से धोएं।

2. न्यूरोनल कल्चर चढ़ाना

  1. विसोसिएटेड मोटर न्यूरॉन संस्कृति
    1. सीधे कैंची और ठीक संदंश का उपयोग करना, एक E12.5 आईसीआर-HB9 से बाहर एक रीढ़ की हड्डी विच्छेदन:: GFP माउस भ्रूण । 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी/एस)(चित्रा 3ए-सी)के साथ 1X एचबीएस समाधान में काम करें।
    2. माइक्रोडिसेक्शन कैंची का उपयोग करके, मेनिंग्स और पृष्ठीय सींग(चित्रा 3डी)को हटा दें।
    3. रीढ़ की हड्डी के टुकड़ों को इकट्ठा करें और 1 एमएल एचबीएस + 1% पी/एस के साथ ट्यूब(#1)में स्थानांतरित करें।
    4. घुमावदार कैंची का उपयोग करके रीढ़ की हड्डी को छोटे टुकड़ों में काट लें और टुकड़ों को व्यवस्थित करने का इंतजार करें।
    5. ट्राइप्सिन के 10 μL 2.5% जोड़ें और 10 00 0के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में रखें। 5 मिन के बाद ट्यूब को टैप करके मिला लें। टुकड़ों को हेलिक्स जैसा झुरमुट बनाना चाहिए।
    6. झुरमुट को एक नई ट्यूब(#2)में स्थानांतरित करें जिसमें पूर्वगरम एल-15 के 800 माइक्रोन, बीएसए के 100 माइक्रोन 4%, और 10 मिलीग्राम/एमएल डीएनस के 100 माइक्रोन शामिल हैं। 2x पीसलें, फिर 2 मिन का इंतजार करें ताकि अडिसाइज्ड टुकड़े व्यवस्थित हो सकें। अधिनान्तर को एक नई ट्यूब(#3)में स्थानांतरित करें।
    7. बीएसए के 100 माइक्रोन 4%, 10 मिलीग्राम/mL DNase के 20 μL, और पूरा न्यूरोबेसल माध्यम के ९०० μL जोड़ें (सीएनबी, सामग्री और तालिका 1की तालिका देखें) । 8x पीसलें और 2 मिन रुको। ट्यूब #3के लिए सुपरनेटेंट लीजिए।
    8. चरण 2.1.7 दोहराएं और 10x पीस लें। ट्यूब #3के लिए अलौकिक ले लीजिए । ऊतक की एक छोटी राशि ट्यूब के तल पर छोड़ दिया जाना चाहिए।
      नोट: यदि एक बड़ा झुरमुट अभी भी ट्यूब #2के तल पर रहता है, तो 2.1.8 कदम दोहराएं।
    9. ट्यूब #3के नीचे बीएसए 4% तकिया के 1 mL जोड़ें ।
    10. 5 मिन के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। अधिस्थान को त्यागें।
    11. ट्यूब को धीरे से टैप करके सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें, फिर सीएनबी माध्यम के 1 mL जोड़ें। पिपेट 6x और 10 मिलीग्राम/mL DNase के 20 μL जोड़ें ।
    12. सीएनबी माध्यम के अतिरिक्त 5 mL के साथ पूरक और एक नई ट्यूब(#4)के लिए 3 mL हस्तांतरण ।
    13. प्रत्येक ट्यूब(#3 और #4)के नीचे 10.4% घनत्व ढाल माध्यम (तालिका 2देखें) का 1 एल जोड़ें। दोनों इंटरफेस के बीच एक तेज चरण जुदाई दिखाई चाहिए।
    14. कमरे के तापमान (आरटी) पर 20 न्यूनतम के लिए ७७५ x ग्राम पर अपकेंद्रित्र । चरण अलगाव के टूटने से बचने के लिए अपकेंद्रित्र मंदी को निम्न स्तर तक सेट किया जाना चाहिए।
    15. कोशिकाओं को तैरना चाहिए, मीडिया के बीच एक बादल अंतरचरण के रूप में प्रदर्शित होने । दोनों ट्यूबों से कोशिकाओं को एक नई ट्यूब(#5)में एकत्र करें जिसमें पहले से ही 1 mL CNB माध्यम शामिल है।
    16. सीएनबी माध्यम का अतिरिक्त 4-6 mL जोड़ें।
    17. ट्यूब के नीचे बीएसए 4% तकिया के 1 mL जोड़ें।
    18. आरटी में 5 मिन के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। सुपरनेटेंट को त्यागें और सीएनबी मीडियम के 1 mL के साथ पैलेट को धीरे से फिर से सस्पेंड करें।
    19. कोशिकाओं की गणना करें। रीढ़ की हड्डी के हिसाब से 0.75-1 x 106 एमएन की पैदावार की उम्मीद है।
      नोट: वेंट्रल रीढ़ की हड्डी में मोटर न्यूरॉन्स (जैसे, इंटरन्यूरॉन्स) के अलावा अन्य न्यूरोनल उपप्रकार भी होते हैं। एमएन शुद्धता ज्यादातर विच्छेदन के दौरान पृष्ठीय क्षेत्रों को हटाने और एमएन समृद्ध रोस्ट्रल क्षेत्रों तक पहुंचने की क्षमता पर निर्भर करती है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि इमेजड न्यूरॉन्स एमएनएस हैं, एचबी9 जैसे एंडोजेनस एमएन मार्कर के साथ चूहों के तनाव का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है: GFP चूहों की सिफारिश की जाती है। शुद्ध एमएन संस्कृति प्राप्त करने के लिए (लेकिन कम सेल उपज के साथ), FACS शुद्धि15 का उपयोग संभव है।
    20. एमएफसी में एमएन संस्कृति को चढ़ाना
      1. 5 मिन के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्री द्वारा प्रति कक्ष 150,000 एमएन ध्यान केंद्रित करें।
      2. अधिष्णक्य को एस्पिरेट करें और अमीर न्यूरोबेसल मीडियम (आरएनबी) में कोशिकाओं को 4 माइक्रोन प्रति एमएफसी पर धीरे से फिर से निलंबित करें। आरएनबी सीएनबी अतिरिक्त 2% B27 और 25 एनजी/mL BDNF के साथ पूरक है ।
      3. दोनों डिब्बों से माध्यम निकालें, डिस्टल डिब्बे के कुओं में ~ 10 μL के बराबर एक कम मात्रा छोड़ । यह अच्छी तरह से परिधि में मध्यम की एक पतली अंगूठी के रूप में प्रकट होता है।
      4. धीरे-धीरे चैनल में कोशिकाओं के 4 μL लोड करें। चैनल के दूसरी तरफ कुएं के 4 μL को बाहर निकालें, और धीरे-धीरे उन्हें वर्तमान प्रवाह को रिवर्स करने और चैनल में सेल घनत्व को अधिकतम करने के लिए सीधे चैनल में वापस लोड करें।
      5. सत्यापित करें कि कोशिकाओं को एक 10x प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर चैनल में प्रवेश किया है और अधिक मीडिया जोड़ने के बिना 30 मेंस के लिए इनक्यूबेटर में चैंबर जगह है ।
      6. धीरे-धीरे समीपस्थ और डिस्टल कुओं में आरएनबी के ~ 10-15 माइक्रोन जोड़ें और कक्षों को एक और 15 मिन के लिए इनक्यूबेटर में रखें।
      7. इस इनक्यूबेशन के बाद, धीरे-धीरे प्रत्येक कुएं में आरएनबी के ~ 75-80 माइक्रोन जोड़ें।
    21. विसंबद्ध एमएन संस्कृति रखरखाव
      1. चढ़ाना (DIV1) के एक दिन बाद, जीएलईल विकास को बाधित करने के लिए 1 μM साइटोसाइन अरेबिन अरेबिनसाइड (आरा-सी) के साथ पूरक आरएनबी के साथ मध्यम की जगह।
      2. आरा-सी आवेदन (DIV3) के दो दिन बाद समीपस्थ डिब्बे (बिना आरा-सी) में ताजा सीएनबी माध्यम के साथ मध्यम की जगह ।
      3. माइक्रोग्रूवके माध्यम से एक्सोन को पार करने को बढ़ाने के लिए, केवल डिस्टल कंपार्टमेंट के लिए ग्लियल सेल-व्युत्पन्न न्यूरोट्रोफिक फैक्टर (जीडीएनएफ) के 25 एनजी/एमएल और ब्रेन-व्युत्पन्न न्यूरोट्रोफिक फैक्टर (बीडीएनएफ) के 25 एनजी/एमएल के साथ पूरक आरएनबी लागू करें । एक्सोनल डिस्टल वेल्स (उच्च मात्रा) और समीपस्थ कुओं के बीच कम से कम 10 माइक्रोन प्रति अच्छी तरह से एक मात्रा ढाल बनाए रखें।
      4. हर 2 दिन में मीडियम को रिफ्रेश करें। डिस्टली पार करने में एक्सॉन को 4-6 दिन तक का समय लग सकता है।
  2. रीढ़ की हड्डी निकालने की संस्कृति
    1. सीधे कैंची और ठीक संदंश का उपयोग करना, एक E12.5 आईसीआर-HB9 से बाहर एक रीढ़ की हड्डी विच्छेदन:: GFP माउस भ्रूण । 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी/एस)(चित्रा 3ए-सी)के साथ 1X एचबीएस समाधान में काम करें।
    2. माइक्रोडिसेक्शन कैंची का उपयोग करके, मेनिंग्स और पृष्ठीय सींग(चित्रा 3डी)को हटा दें।
    3. रीढ़ की हड्डी को 1 मिमी मोटी ट्रांसवर्स सेक्शन(चित्रा 3ई)में काट लें। एमएफसी के समीपस्थ डिब्बे से सभी माध्यम ों का निपटान करें।
    4. 4 μL की कुल मात्रा में एक पिपेट के साथ एक रीढ़ की हड्डी का पौधा उठाएं। गुफा के जितना संभव हो एक्सप्लांट इंजेक्ट करें और पार्श्व दुकानों (1 मिमी घूंसे) के माध्यम से समीपस्थ से किसी भी अत्यधिक तरल को बाहर निकालें। एक्सप्लांट्स को समीपस्थ चैनल में चूसा जाना चाहिए।
    5. धीरे-धीरे रीढ़ की हड्डी के 150 माइक्रोन जोड़ें (एससीईएक्स, सामग्री और तालिका 3की तालिका देखें) समीपस्थ अच्छी तरह से।
    6. रीढ़ की हड्डी निकालना संस्कृति रखरखाव
      1. समीपस्थ डिब्बे में एससीईएक्स माध्यम जोड़ें, और डिस्टल डिब्बे में समृद्ध एससीईएक्स मीडियम (बीडीएनएफ और जीडीएनएफ के 50 एनजी/एमएल के साथ एससीईएक्स) जोड़ें। डिस्टल कुओं (उच्च मात्रा) और समीपस्थ अच्छी तरह से के बीच अच्छी तरह से कम से कम 15 μL प्रति अच्छी तरह से एक मात्रा ढाल बनाए रखें।
      2. हर 2 दिन में मीडियम को रिफ्रेश करें। डिस्टली पार करने में एक्सॉन को 3-5 दिन तक का समय लग सकता है।

3. एक्सोनल परिवहन(चित्रा 4ए)

  1. माइटोकॉन्ड्रिया और अम्लीय डिब्बों की लेबलिंग
    1. 100 एनएम मिटोट्रैकर डीप रेड एफएम और 100 एनएम लासोट्रैकर रेड वाले ताजा एससीईएक्स मीडियम (या अलग एमएन के लिए सीएनबी) तैयार करें। 30-60 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। अन्य रंगों का उपयोग तब तक किया जा सकता है जब तक कि उनके फ्लोरोफोरस ओवरलैप नहीं होते हैं।
    2. गर्म सीएनबी/एससीईएक्स माध्यम के साथ 3x धोएं। इमेजिंग के लिए प्लेटें तैयार हैं।
  2. लाइव इमेजिंग
    1. 3 एस अंतराल पर एक्सोनल परिवहन की 100 समय-चूक छवि श्रृंखला प्राप्त करें, जिसमें प्रति फिल्म कुल 5 मिन हैं।
      नोट: इस अध्ययन में इस्तेमाल इमेजिंग प्रणाली एक उल्टे डिस्क confocal कताई के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप, औचित्य सेल इमेजिंग सॉफ्टवेयर, 60x तेल लेंस, NA = १.४, और एक EMCCD कैमरा के माध्यम से नियंत्रित शामिल थे । फिल्मों को नियंत्रित वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर अधिग्रहित किया गया था।
      नोट: प्रयोग पर निर्भर लंबे या कम समय-चूक वाली फिल्मों को चित्रित किया जा सकता है. जरूरत पड़ने पर रातोंरात फिल्में भी रिकॉर्ड की जा सकती हैं। हालांकि, फिल्म अधिग्रहण के दौरान फोटोटॉक्सिकिचन और ब्लीचिंग को कम करने के लिए एक्सपोजर टाइम और लेजर पावर के साथ-साथ कुल छवियों की संख्या को कम करने की कोशिश करना महत्वपूर्ण है।

4. छवि विश्लेषण (आंकड़े 4-5)

  1. काइमोग्राफ विश्लेषण का उपयोग करकण परिवहन वितरण और घनत्व का विश्लेषण
    1. फिजी में फ़ाइल खोलें। छवि को दबाने वाले अलग चैनल । ढेर । उपकरण । डिइंटरलीव।
    2. छवि दबाकर छवि गुण सेट करें । गुण।
    3. लाइन आइकनपर सही क्लिक करके खंडित लाइन टूल चुनें। लाइन आइकनको डबल-क्लिक करके चौड़ाई 8-10 तक सेट करें। पूरे विश्लेषण में एक ही लाइन चौड़ाई के अनुरूप रहें।
    4. डिस्टल से समीपस्थ तक एक्सोन पथ के बाद एक खंडित रेखा चिह्नित करें। लाइन मार्किंग को रोकने के लिए डबल क्लिक करें।
    5. आरओआई प्रबंधकके लिए ब्याज की एक नई लाइन क्षेत्र (आरओआई) जोड़ने के लिए टी क्लिक करें । इसे स्प्रेडशीट विश्लेषण तालिका में जोड़ें।
    6. एक्सॉन के क्षेत्र और लंबाई को मापने के लिए एम पर क्लिक करें। इसे विश्लेषण तालिका में जोड़ें।
    7. प्लगइन्स पर क्लिक करके एक किमोग्राफ उत्पन्न करें। KymoToolBox । ड्रा कीमो। वैकल्पिक रूप से, उपलब्ध अन्य केमोग्राफ पीढ़ी प्लगइनका उपयोग किया जा सकता है।
    8. मैन्युअल रूप से चलती (प्रतिगामी या पूर्ववर्ती) और गैर-चलती कणों को गिनें और उन्हें सही कॉलम में तालिका में जोड़ें।
      नोट: कणों को चलती एंटेरोग्रेड (यानी, किमोग्राफ में बाएं जाने) या प्रतिगामी (यानी, दाएं बढ़ते हुए) के रूप में वर्गीकृत किया जाता है यदि उनका विस्थापन विशिष्ट दिशा में 10 माइक्रोन से अधिक है। यह संभव है कि बस लाइन आइकन के साथ एक क्षैतिज रेखा को चिह्नित करके और एमको दबाकर विस्थापन को मापना हो । स्थिर कणों या विस्थापन मानदंडों को पूरा नहीं करने वाले को गैर-प्रेरित(चित्र 4बी)के रूप में परिभाषित किया गया है ।
  2. एकल कण ट्रैकिंग: मैनुअल ट्रैकिंग
    1. फिजी सॉफ्टवेयर (फैब्रिक पी कॉर्डेलेयर द्वारा विकसित) के लिए मैनुअल ट्रैकिंग प्लगइन डाउनलोड http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html से
    2. फिजी/इमेजजेमें फाइल खोलें । एमएफसी खांचे क्षैतिज संरेखित करने के लिए घुमाने के विकल्प का उपयोग करें।
    3. जरूरत पड़ने पर सिग्नल-टू-शोर अनुपात में सुधार करने के लिए, क्लिक करें प्रक्रिया । पृष्ठभूमि घटाना।
    4. मैनुअल ट्रैकिंग प्लगइन खोलें। इमेजिंग के लिए इस्तेमाल होने वाले विशिष्ट माइक्रोस्कोप के अनुसार पैरामीटर (जैसे, पिक्सल साइज, टाइम इंटरवल आदि) सेट करें। यहां दिखाए गए परिणामों के लिए माइक्रोस्कोप और लेंस का अनुपात ०.२३९ माइक्रोएम/पिक्सल था और फ्रेम इंटरवल 3 एस था ।
    5. पटरियों एक्स और वाई निर्देशांक प्राप्त करें और स्प्रेडशीट के लिए पाठ की नकल करके परिणामों को बचाने के लिए।
    6. इमेज क्लिक करके कई चैनल फिल्मों का विश्लेषण करें । रंग । चैनलों को मर्ज करने के लिए चैनलों को मर्ज करें और फिर केवल सहस्थानीयकृत पुक्टा को ट्रैक करें।
  3. एकल कण ट्रैकिंग: अर्ध-स्वचालित ट्रैकिंग (चित्रा 5)
    1. विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें। इस अध्ययन में बिटप्लेन इमरिस सॉफ्टवेयर संस्करण 8.4.1 का उपयोग किया गया।
    2. शीर्ष मेनू में पार करने के लिए स्विच करें।
    3. इमेज प्रोसेसिंग पर क्लिक करें । स्वैप समय और जेड । ठीक है।
    4. क्लिक करें संपादित करें . इमेज प्रॉपर्टीज (सीटीआरएल +I) । ज्यामिति । वोक्सल साइज रो। इस्तेमाल किए गए माइक्रोस्कोपी सेटअप के अनुसार इमेज प्रॉपर्टीज सेट करें।
      नोट: यहां प्रदर्शित आंकड़ों के लिए, माइक्रोस्कोप और लेंस अनुपात ०.२३९ μm/pixel था ।
    5. सभी इक्वेशन पर क्लिक करें और समय अंतरालबदलें । उदाहरण के लिए, अंतराल के रूप में 3 एस का उपयोग करें। दाईं ओर रीसेट बटन पर क्लिक करें या Ctrl +Bपर क्लिक करें ।
    6. छोटे पीले धब्बेके एक आइकन पर क्लिक करके छोड़ दिया शीर्ष में स्पॉट की एक परत जोड़ें । नीचे स्पॉट संपादन के लिए एक नया मेनू छोड़ दिया खोला जाता है ।
    7. स्पॉट डिटेक्शन शुरू होने तक सही ब्लू एरो दबाएं।
      नोट: खिड़की के नीचे बाईं ओर फिल्टर का उपयोग करके कुछ बिंदुओं को फ़िल्टर करना महत्वपूर्ण है। फिल्म की जांच कई बार देखने के लिए कि डॉट्स की एक पर्याप्त संख्या का चयन किया है ।
    8. प्रायोगिक जरूरतों को पूरा करने के लिए मापदंडों को सत्यापित या कॉन्फ़िगर करें। उदाहरण के लिए, मैक्स डिस्टेंस = 12 माइक्रोन (दो अलग-अलग स्थानों के बीच अधिकतम अनुमति दूरी अभी भी उन्हें एक ही ट्रैक में शामिल करने के लिए); मैक्स गैप आकार = 1 (फ्रेम की संख्या है कि एक ट्रैक को याद करने की अनुमति दी है और अभी भी एक ट्रैक माना जाता है) ।
    9. सेटिंग्स पर क्लिक करें और फिर ट्रैक शैली = बंद, अंक = क्षेत्र।
    10. फ़िल्टर बारका उपयोग करना, समायोजन के लिए अलग-अलग फ़िल्टर चुनें। उदाहरण के लिए, यहां आपूर्ति किए गए डेटा में, ट्रैक अवधि = 9 ने 3 से कम फ्रेम वाले सभी पटरियों को हटा दिया। जब सभी पैरामीटर सेट किए जाएं, तो सही ग्रीन एरोपर क्लिक करें। इस कदम के बाद आगे संपादन संभव नहीं है।
    11. सभी पटरियों को मैन्युअल रूप से संपादित करने के लिए डॉट्स के साथ छोटी पेंसिल पर क्लिक करें।
    12. फिल्म देखें(चित्रा 5बी)। यदि कोई त्रुटि होती है, तो कई संभावित विकल्प हैं:
      1. ट्रैक डिस्कनेक्ट करने के लिए, ऑब्जेक्ट विकल्प पर क्लिक करें और उन दो स्थानों का चयन करें जिन्हें सीटीआरएलको काट ने की आवश्यकता है, और डिस्कनेक्टचुनें।
      2. किसी ट्रैक को कनेक्ट करने के लिए, ऑब्जेक्ट विकल्प पर क्लिक करें, उन दो स्थानों का चयन करें जिन्हें सीटीआरएल को रखने और कनेक्टचुनने की आवश्यकता है।
      3. सही विकल्प(ट्रैक/ऑब्जेक्ट)के साथ ट्रैक या स्पॉट को हटाने के लिए, नियमित पेंसिल आइकनके साथ स्क्रीन पर स्विच करें, और डिलीटचुनें।
      4. मैन्युअल रूप से स्पॉट जोड़ने के लिए, नियमित पेंसिल आइकन स्क्रीनपर स्विच करें। स्क्रीन के नीचे एक मैनुअल ट्रैकिंग मार्कहै। सुनिश्चित करें कि ऑटो-कनेक्ट चेकबॉक्स वीहै। फिल्म पर ही, एक जगह जोड़ने के लिए, शिफ्ट बटन और बाएं क्लिकपकड़ो ।
    13. मौजूदा ट्रैक में स्पॉट जोड़ने के लिए, एक वांछित ट्रैक (पीला) और फ्रेम चुनें, नियमित पेंसिल आइकन स्क्रीन पर स्विच करें और मैन्युअल रूप से एक स्थान जोड़ें। जब पूरी फिल्म समाप्त हो जाती है, तो आइकन पर स्विच करें जो लाल ग्राफ (सांख्यिकी) की तरह दिखताहै। बाद में विश्लेषण किए गए मापदंडों को संपादित करना संभव है। संपादित करने के लिए, स्क्रीन के नीचे बाईं ओर, स्वीडिश कुंजी आइकनदबाएं। उदाहरण के लिए: स्थिति एक्स, स्थिति वाई।
    14. आइकन पर प्रेस है कि कई फ्लॉपी डिस्क की तरह लग रहा है, निर्यात सभी सांख्यिकी।
      नोट: स्प्रेडशीट आउटपुट को या तो सीधे संभाला जा सकता है या इस विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रकाशित कोड9 का उपयोग करके इसका विश्लेषण किया जा सकता है, जिसे मांग पर साझा किया जाएगा। निम्नलिखित पैरामीटर विश्लेषण से निकाले जाते हैं: स्पीड, ट्रैक विस्थापन, रन लेंथ, वेग (दिशात्मकता सहित), स्टॉप काउंट, एवरेज स्टॉप अवधि, अल्फा, दिशा परिवर्तन, और तात्कालिक वेग। प्रत्येक पैरामीटर का एक विस्तृत विवरण ग्लूस्का एट अल9में वर्णित है।

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Representative Results

वर्णित प्रोटोकॉल के बाद, माउस भ्रूणीय HB9:: GFP रीढ़ की हड्डी explants एमएफसी में सुसंस्कृत थे(चित्रा 4ए)। एक्सप्लांट्स 7 दिनों के लिए उगाए गए थे, जब एक्सॉन पूरी तरह से डिस्टल डिब्बे में पार हो गए थे। माइटोट्रैकर डीप रेड और लासोट्रैकर रेड रंगों को माइटोकॉन्ड्रिया और अम्लीय डिब्बों(चित्रा 4सी)लेबल करने के लिए डिस्टल और समीपस्थ डिब्बों में जोड़ा गया था। डिस्टल खांचे में एक्सॉन को इमेज किया गया था, और फिल्मों का विश्लेषण इस प्रकार किया गया था: सबसे पहले, हमने काइमोग्राफ विश्लेषण(आंकड़े 4बी, डी)का उपयोग करके सामान्य आंदोलन वितरण की तुलना की। इस विश्लेषण से प्रतिगामी दिशा में केवल अम्लीय डिब्बों में पूर्वाग्रह का पता चला (गैर-चलती = 77.1 ± 9.5%; प्रतिगामी = 16.9 ± 8.3%, एंट्रोग्रेड = 6 ± 5%; चित्रा 4ई)लेकिन माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन में नहीं (नॉनमूविंग = 83.4 ± 6.8%; प्रतिगामी = 10.5 ± 6.9%; एंट्रोग्रेड = 6.8 ± 5.1%; चित्रा 4एफ)। Kymograph विश्लेषण का उपयोग कण घनत्व की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया गया था, एचबी9 में अम्लीय डिब्बों की तुलना में माइटोकॉन्ड्रियल कणों की अधिक संख्या का खुलासा:: GFP रीढ़ की हड्डी एक्सप्लांट एक्सोन (Mitochondria = 0.46 ± 0.13; अम्लीय डिब्बे = 0.3 ± 0.07 कण/μm एक्सोन, चित्र4जी)।

इसके बाद, इन-हाउस कोड(चित्रा 5ए-बी)के बाद अर्धस्वचालित सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एकल कण परिवहन विश्लेषण किया गया। इस विश्लेषण से पता चला है कि सामान्य रूप से इसी तरह के कण वेग होने के बावजूद(चित्रा 5सी),वेग के वितरण को देखते समय(चित्रा 5डी)केवल अम्लीय डिब्बों लेकिन माइटोकॉन्ड्रिया ने प्रतिगामी आंदोलन की ओर पूर्वाग्रह प्रदर्शित नहीं किया।

Figure 1
चित्रा 1: सिलिकॉन मोल्ड तैयारी। क्लोरोट्रिमेथिल्सीलेन वेफर सफाई की प्रक्रिया का वर्णन करते हुए योजनाबद्ध ड्राइंग। (A)सबसे पहले, एक उपयुक्त कंटेनर में 50 मिलीआर तरल नाइट्रोजन जोड़ा गया था। एक रासायनिक हुड में काम करते हुए, एक सिरिंज और सुई का उपयोग 8 मिलील तरल नाइट्रोजन को आकर्षित करने के लिए किया जाता था। सिरिंज की पूरी सामग्री क्लोरोट्रिमेथिल्सीन बोतल में इंजेक्ट की गई थी। बोतल नीचे का सामना करना पड़ टोपी के साथ बदल गया था और क्लोरोमाइमेथिलसिलेन के 8 mL वापस खींचा गया । (ख)क्लोरोट्रिमेथिलसिलेन कंटेनर में फैल गया (सीधे वेफर पर नहीं)। कंटेनर को बंद करने की आवश्यकता है, इसके बाद प्रत्येक मोल्ड के लिए 5 मिन इनक्यूबेशन हैं। (ग)तरल पीडीएम को वांछित ऊंचाई तक प्रत्येक वेफर में डाला गया था। (घ)सभी प्लेटों को 2 घंटे के लिए एक वैक्यूम डेसिकेटर के अंदर एक साथ रखा गया था, जिसके बाद 70 डिग्री सेल्सियस ओवन में 3 घंटे रात भर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एमएफसी विशेष डिजाइन। (A)धातु स्केलपेल का उपयोग करके मोल्ड से बाहर निकाला गया पॉलीमरेज पीडीएमटेलेट। (ख)पीडीएम टेम्पलेट्स छिद्रण के लिए प्रायोगिक सेटअप के आधार पर या तो 6 मिमी, 7 मिमी या 1 मिमी छिद्रकों का उपयोग किया गया था। (ग)एमएफसी में एक्सप्लांट कल्चर के लिए 7 एमएम और 1 एमएम पंचर का इस्तेमाल किया गया और आसान एक्सप्लांट सम्मिलन के लिए "गुफाएं" बनाने के लिए 20 जी सिरिंज का इस्तेमाल किया गया । (D)अलग एमएन संस्कृति एमएफसी के लिए, चैनल किनारों पर चार कुओं बनाने के लिए 6 मिमी छिद्रक का उपयोग किया गया था। (ई-एफ) सी और डीमें वर्णित अंतिम एमएफसी आकृतियों के चित्र क्रमशः। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: न्यूरोनल संस्कृति। (A)तंत्रिका ट्यूब को बेनकाब करने के लिए सिर, पूंछ और त्वचा को हटाने के बाद E12.5 माउस भ्रूण को स्थिति में रखा गया था। (ख)पूरी रीढ़ की हड्डी का विच्छेदन। (ग)कोमल संदंश का उपयोग करके, मेनिंग्स रीढ़ की हड्डी से दूर खुली हुई थी। (D)लेफ्ट पैनल: बेहतर एमएन शुद्धिकरण प्राप्त करने के लिए वेंट्रल रीढ़ की हड्डी से रीढ़ की हड्डी के पार्श्व खंडों को हटाना। सही पैनल: एमएफसी में विसोसिएटेड एमएन संस्कृति की प्रतिनिधि छवि। HB9:: GFP एक्सोन डिस्टल डिब्बे (हरे) को पार कर गया। Hoechst धुंधला न्यूरोनल नाभिक (नीला) इंगित करता है। (ई)रीढ़ की हड्डी के एक्सप्लांट वेंट्रल रीढ़ की हड्डी के 1 मिमी मोटे ट्रांसवर्स सेक्शन को विच्छेदन करके उत्पन्न होते हैं। HB9 की प्रतिनिधि छवि:: GFP (हरी) रीढ़ की हड्डी एक्सप्लांट एक्सोन एक एमएफसी में । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एमएनएस में माइटोकॉन्ड्रिया और अम्लीय डिब्बे का एक्सोनल परिवहन। (A)अक्षीय परिवहन निबंध का चित्रण। लासोट्रैकर रेड और माइटोट्रैकर डीप रेड को एमएफसी के समीपस्थ और डिस्टल डिब्बों दोनों में जोड़ा गया, जिसमें एचबी9::जीएफपी वेंट्रल रीढ़ की हड्डी का एक्सप्लांट शामिल था। (ख)काइमोग्राफ विश्लेषण। चलती कणों को उस दिशा में 10 से अधिक माइक्रोन के विस्थापन के बाद पूर्ववर्ती या प्रतिगामी के रूप में परिभाषित किया गया था । घूर्णन या स्थिर कणों को गैर-चलती के रूप में गिना जाता था। स्केल बार = 10 μm.(C)प्राथमिक HB9 प्रदर्शित करने वाली टाइम-लैप्स फिल्म का पहला फ्रेम::GFP माउस स्पाइनल कॉर्ड एक्सप्लांट एक्सोन ्सन लासोट्रैकर रेड के साथ अम्लीय डिब्बों को टैग करने के लिए और माइटोट्रैकर डीप रेड को माइटोकॉन्ड्रिया टैग करने के लिए। स्केल बार = 10 माइक्रोन (डी)प्रतिनिधि केमोग्राफ अम्लीय डिब्बों और माइटोकॉन्ड्रिया के एक विशिष्ट एक्सोनल आंदोलन को प्रदर्शित करते हैं। स्केल बार = 10 माइक्रोन.(ई)माइटोकॉन्ड्रियल एक्सोनल परिवहन का Kymograph विश्लेषण, ****p <0.0001, होल्म-सिदक करेक्शन के साथ अनोवा (एन = 77 एक्सोन)। स्केल बार = 10 माइक्रोन(एफ)अम्लीय डिब्बे अक्षत परिवहन का Kymograph विश्लेषण, ** पी एंड एलटी; 0.01, ****p <0.0001, होल्म-सिदक करेक्शन के साथ नोवा (एन = 77 एक्सोन)। (जी)माइटोकॉन्ड्रिया और अम्लीय डिब्बों का एक्सोनल पार्टिकल घनत्व विश्लेषण, ****पी एंड एलटी; 0.0001, छात्र का टी-टेस्ट (एन = 77 एक्सन)। त्रुटि बार एसडी के साथ मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: ऑर्गेनेल वेग को मापने के लिए अर्ध-स्वचालित एकल कण विश्लेषण। (A)अर्धस्वचालित एकल कण परिवहन विश्लेषण के लिए योजनाबद्ध कार्यप्रवाह। (ख)एकल कण ट्रैकिंग के लिए वेंट्रल रीढ़ की हड्डी एक्सप्लांट एक्सोन का विश्लेषण किया गया। विश्लेषण सॉफ्टवेयर समय-चूक फिल्मों में एकल एक्सोनल कणों को ट्रैक करने में सक्षम है, जैसा कि माइटोकॉन्ड्रिया (पीले बिंदुओं, ऊपरी पैनल) और अम्लीय डिब्बों (हरी डॉट्स, लोअर पैनल) के लिए संकेत दिया गया है। (ग)माइटोकॉन्ड्रिया और अम्लीय डिब्बों, मान व्हिटनी परीक्षण (एन = 417 माइटोकॉन्ड्रिया, एन = 371 अम्लीय डिब्बों) के बीच औसत वेग में परिवर्तन नहीं हुआ। त्रुटि सलाखों के एसडी के साथ मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं(डी)माइटोकॉन्ड्रियल और अम्लीय डिब्बों प्रतिगामी और पूर्ववर्ती वेग के वितरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरा न्यूरोबेसल मीडियम - 50mL के लिए
घटक आयतन एकाग्रता
न्यूरोबेसल 47mL
B27 1 एमएल 2%
घोड़ा सीरम 1 एमएल 2%
पी/एस 0.5 लाख 1%
एल-ग्लूटामाइन (ग्लूटामैक्स) 0.5 लाख 1%
बीटा-मर्काप्तोइथेनल (50 mM) 25 माइक्रोन 25μM
BDNF (10ug/mL) 5 माइक्रोन 1एनजी/एमएल
जीडीएनएफ (10ug/mL) 5 माइक्रोन 1एनजी/एमएल
सीएनटीएफ (10ug/mL) 2.5 माइक्रोन 0.5एनजी/एमएल

तालिका 1: पूर्ण न्यूरोबेसल (सीएनबी) समाधान तैयार करने के लिए नुस्खा।

ऑप्टिप्रेप सॉल्यूशन - 10mL के लिए
घटक आयतन एकाग्रता
डीडीडब्ल्यू 5.27 लाख
घनत्व ढाल माध्यम (ऑप्टिप्रेप) 60% 1.73 करोड़ 10.4% (w/v)
ट्रिसिन 100 मीटर 1 एमएल 2%
ग्लूकोज 20% (w/v) 2 एल 2%

तालिका 2: घनत्व ढाल मध्यम समाधान की तैयारी के लिए नुस्खा।

रीढ़ की हड्डी एक्सप्लांट मीडियम (एससीएक्स) - 20mL के लिए
घटक आयतन एकाग्रता
न्यूरोबेसल 19.5 लाख
B27 200 माइक्रोन 2%
पी/एस 100 माइक्रोन 1%
एल-ग्लूटामाइन (ग्लूटामैक्स) 100 माइक्रोन 1%
बीडीएनएफ 50 माइक्रोन 25एनजी/एमसीएल

तालिका 3: रीढ़ की हड्डी के एक्सप्लांट (एससीईएक्स) समाधान की तैयारी के लिए नुस्खा।

एमएन कल्चर रीढ़ की हड्डी एक्सप्लांट्स
चढ़ाना से पहले लंबी प्रक्रिया लघु प्रक्रिया - विच्छेदन और प्लेट
एमएफसी में चढ़ाना के लिए अतिरिक्त सावधानी की जरूरत एमएफसी में प्लेट करना आसान
कोई ग्लिल कोशिकाओं के साथ मोटर न्यूरॉन्स की उच्च एकाग्रता - अधिक सटीक ग्लियाल कोशिकाओं और अन्य न्यूरोनल प्रकारों की उपस्थिति - अधिक शारीरिक
सोमा और अक्षत दोनों पर असीमित हेरफेर संभावनाएं सेल निकायों पर सीमित हेरफेर संभावनाएं
कोशिका निकायों और अक्षों दोनों के लिए आसान इम्यूनोधुंधला एक्सप्लांट के भीतर सेल निकायों के इम्यूनोस्टेनिंग के दौरान कम दक्षता।
वायरल संक्रमण की उच्च दक्षता वायरल संक्रमण की बहुत कम दक्षता

तालिका 4: गति, व्यवहार्यता, ग्लियल उपस्थिति, हेरफेर संभावनाओं, इम्यूनोस्टेनिंग और वायरल संक्रमण के परिधि के आधार पर रीढ़ की हड्डी के एक्सप्लांट और डिसोसिएटेड एमएन संस्कृति के बीच तुलना।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हम मोटर न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रिया और अम्लीय डिब्बों के अक्षत परिवहन को ट्रैक करने के लिए एक प्रणाली का वर्णन करते हैं। यह सरलीकृत इन विट्रो प्लेटफ़ॉर्म मोटर न्यूरॉन स्थानीय कार्यों के प्रयोगात्मक विश्लेषण को सक्षम करते हुए उपकोशिकीय न्यूरोनल डिब्बों के सटीक नियंत्रण, निगरानी और हेरफेर की अनुमति देता है। यह प्रोटोकॉल10,,16रोग में अक्षीय परिवहन शिथिलता के अंतर्निहित तंत्र को समझने पर ध्यान केंद्रित करने के लिए एएलएस जैसी एमएन बीमारियों का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हो सकता है। इसके अलावा, इस प्रणाली को ट्रोफिक कारकों9,16,माइक्रोआरएनए10,एमआरएनए8के परिवहन का अध्ययन करने के लिए भी लागू किया जा सकता है, और स्वस्थ और रोगग्रस्त एमएनएस में या अन्य न्यूरॉन्स में प्रोटीन लेबल किया जा सकता है, जैसे संवेदी9 या सहानुभूति अक्षत14।, एक समान विधि को सहसंस्कृति प्रणाली में ऑर्गेनेल परिवहन का अध्ययन करने के लिए भी लागू किया जा सकता है, जैसे कि कंकाल मांसपेशियों की कोशिकाओं12 या सहानुभूति न्यूरॉन्स के साथ सुसंस्कृत एमएनएस कार्डियोमायोसाइट्स14के साथ सहसंस्कारी। एमएफसी प्रणाली का उपयोग सक्रिय एनएमजेएस17,18 उत्पन्न करने और एक्सोनल परिवहन16पर सिनेप्स गठन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है ।

एमएफसी में न्यूरॉन्स की खेती के लिए अन्य प्रोटोकॉल की तुलना में इस प्रोटोकॉल के कई फायदे हैं और एक्सोनल परिवहन का विश्लेषण करने के लिए लाइव इमेजिंग का उपयोग कर रहे हैं: 1) एमएफसी कई निर्माताओं द्वारा व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। हालांकि, एमएफसी का स्व-विनिर्माण वाणिज्यिक विकल्प की तुलना में बेहद लागत प्रभावी है। एक एकल पीडीएस वेफर पीडीएम रेसिन के लिए कई अमेरिकी डॉलर के न्यूनतम खर्च पर चार बड़े एमएफसी या नौ छोटे लोगों की पैदावार करता है। 2) स्व-निर्मित एमएफसी को विशिष्ट प्रयोगात्मक आवश्यकताओं का उत्तर देने के लिए संशोधित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, आकार और कुओं के स्थान को बदलना, एमएफसी पीडीएफएम की मोटाई को बढ़ाना)। 3) एमएफसी अपरिवर्तनीय रूप से एक प्लेट (प्लाज्मा बॉन्डिंग के माध्यम से) से जुड़ा हो सकता है, लेकिन संदूषण की संभावना को कम करने के लिए कई बार पुनर्नवीनीकरण भी किया जा सकता है। 4) पीडीएम एमएफसी पारदर्शी हैं, जिससे उन्हें कम पृष्ठभूमि होने से लाइव इमेजिंग के लिए आदर्श बना दिया जाता है, जो अक्षीय परिवहन परखों के लिए महत्वपूर्ण है जहां सिग्नल-टू-शोर भेद एक सीमित कारक हो सकता है। 5) रीढ़ की हड्डी एक्सप्लांट संस्कृति बहुत कुशल और तेज है। एक भ्रूणरी रीढ़ की हड्डी 30 एक्सप्लांट तक निकल सकती है, जो 10 एमएफसी के लिए पर्याप्त है। यह समय और सामग्री को बचाने में मदद कर सकता है, और यह सुनिश्चित करता है कि कुछ भ्रूण ों के साथ एक गर्भवती माउस भी एक सफल प्रयोग का उत्पादन कर सकता है। तालिका 4में रीढ़ की हड्डी के एक्सप्लांट और विसोसिएटेड एमएन संस्कृति की विस्तृत तुलना देखें ।

यह प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत सरल और सस्ता है। हालांकि, इसके लिए कई तकनीकी मामलों में विशेषज्ञता की जरूरत होती है । उदाहरण के लिए, संरचनात्मक दोषों और अनिवार्य वैक्यूम चरण (1.1.10) में वायु बुलबुले के निर्माण से बचने के लिए एमएफसी के विनिर्माण और हैंडलिंग को सटीक और कोमल होने की आवश्यकता है। वैकल्पिक वैक्यूम चरण (1.6.2) के दौरान सभी हवा को साफ ़ करना महत्वपूर्ण है, या यह एक्सोनल क्रॉसिंग को अवरुद्ध कर देगा, लेकिन ग्लास से एमएफसी की टुकड़ी से बचने के लिए वैक्यूम को भी कम रखेगा। विच्छेदन प्रोटोकॉल चरणों पर करीब से ध्यान दें, क्योंकि मेनिंग्स और पृष्ठीय सींगों को ठीक से हटाना महत्वपूर्ण है, साथ ही साथ टुकड़ों को सही आकार में डालने की कोशिश करना और काटना महत्वपूर्ण है ताकि उन्हें भौतिक बल का उपयोग किए बिना एमएफसी की गुफा में डालने की कोशिश की जा सके। एमएफसी पर लागू कोई भी अत्यधिक शारीरिक बल आसानी से खांचे या पूरे एमएफसी को अलग कर सकता है, इस प्रकार प्रक्रिया को धीरे से किया जाना चाहिए। एमएनएस की मात्रा और एमएफसी में उन्हें चढ़ाना अपेक्षाकृत तेजी से होने की जरूरत है, क्योंकि एमएनएस कुल और चढ़ाना कदम की कम मध्यम मात्रा जैसे तनाव की स्थिति में जल्दी से व्यवहार्यता खो देते हैं । एमएफसी चैनल में न्यूरॉन्स के उचित लगाव की अनुमति देने के लिए एमएफसी में चढ़ाना कम मात्रा में किया जाना चाहिए, और एमएनएस की टुकड़ी को रोकने के लिए 30 से अधिक नहीं गर्म माध्यम को बहुत धीरे से जोड़ा जाना चाहिए।

संस्कृति में कई दिनों के बाद, और एक बार एक्सोन डिस्टल डिब्बे तक बढ़ा दिया है, संस्कृतियों को अक्षीय परिवहन फिल्मों के अधिग्रहण और अंत में छवि विश्लेषण के लिए एक विशिष्ट प्रक्रिया के बाद ऑर्गेनेल धुंधला से गुजरना करने के लिए तैयार हैं। विश्लेषण या तो समय के साथ एकल कण ट्रैकिंग द्वारा किया जा सकता है, या एक स्वचालित या अर्धस्वचालित ट्रैकिंग एल्गोरिदम का उपयोग करके । हमारे अनुभव में, स्वचालित तरीके कम समय लेने वाले हैं, लेकिन कई नुकसान हैं। मुख्य रूप से, स्वचालित ट्रैकिंग विश्वसनीयता कम हो जाती है, भीड़ वाले अक्षों के साथ जो रास्तों को पार करते हैं। इसके अलावा, स्वचालित एल्गोरिदम में ओवरलैपिंग कणों के बीच अंतर करने की क्षमता कम हो जाती है। नतीजतन, मैनुअल या अर्धस्वचालित ट्रैकिंग करने की सिफारिश की जाती है। सामान्य तौर पर, सेमीऑटोमेटेड ट्रैकिंग बेहतर है क्योंकि यह कम समय लेने वाली है, लेकिन जब कोई उपलब्ध भुगतान सॉफ्टवेयर नहीं है तो मैनुअल ट्रैकिंग एक अच्छा विकल्प हो सकता है। मैनुअल और स्वचालित विश्लेषण के बीच एक पूरी तरह से तुलना ग्लूस्का एट अल9में पाई जा सकती है।

वास्तव में, इस सरल प्रोटोकॉल को अपनाने से विभिन्न सेलुलर घटकों के अक्षीय परिवहन के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण डेटा निकल सकता है। इसे इमेजिंग सेटअप और न्यूरोनल उपप्रकारों की विविधता के साथ-साथ अन्य कोशिकाओं के साथ न्यूरॉन्स की सहसंस्कृतियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यह न्यूरोनल स्वास्थ्य के बुनियादी तंत्र को समझने और परिवर्तित अक्षीय परिवहन के साथ रोगों के लिए दवा विकास में सुधार करने के लिए कोशिका निकायों या एक्सोन के अलग स्थानिक औषधीय हेरफेर की अनुमति देता है।

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Disclosures

लेखक हितों का कोई टकराव नहीं घोषित करते हैं ।

Acknowledgments

इस काम को इज़राइल साइंस फाउंडेशन (आईएसएफ, 561/11) और यूरोपियन रिसर्च काउंसिल (ईआरसी, 309377) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35mm Fluodish – glass bottom dish World Precision Instruments WPI FD35-100
50mm Fluodish – glass bottom dish World Precision Instruments WPI FD5040-100
Andor iXon DU-897 EMCCD camera Andor
ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside) Sigma-Aldrich C1768 stock of 2mM in filtered DDW
B-27 Supplement (50X) Thermo Fisher 17504044
BDNF Alomone Labs B-250 Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Biopsy punch 1.25mm World Precision Instruments WPI 504530 For preperation of large MFC
Biopsy punch 6mm World Precision Instruments WPI 504533 For preperation of small MFC
Biopsy punch 7mm World Precision Instruments WPI 504534 For preperation of large MFC
Bitplane Imaris software - version 8.4.1 Imaris
Bovine Serum Albumine (BSA) Sigma-Aldrich #A3311-100G 5% w/v in ddw
Chlorotrimetylsilane Sigma-Aldrich #386529-100ML
CNTF Alomone Labs C-240 Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Density Gradient Medium - Optiprep Sigma-Aldrich D1556
Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas Sigma-Aldrich DN-25 stock 10mg/mL in neurobasal
Dow Corning High-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554-1EA For epoxy mold preperation
DPBS 10X Thermo Fisher #14200-067 dilute 1:10 in ddw
Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm F.S.T 1125520
Epoxy Hardener Trias Chem S.R.L IPE 743 For epoxy mold preperation
Epoxy Resin Trias Chem S.R.L RP 026UV For epoxy mold preperation
FIJI software ImageJ
GDNF Alomone Labs G-240 Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Glutamax 100X Thermo Fisher #35050-038
HB9:GFP mice strain Jackson Laboratories 005029
HBSS 10X Thermo Fisher #14185-045 Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter
iQ software Andor
Iris scissors, curved, 10 cm AS Medizintechnik 11-441-10
Iris scissors, straight, 9 cm AS Medizintechnik 11-440-09
Laminin Sigma-Aldrich #L-2020
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Fisher 11415064
LysoTracker Red Thermo Fisher L7528
Mitotracker Deep-Red FM Thermo Fisher M22426
Neurobasal medium Thermo Fisher 21103049
Nikon Eclipse Ti micorscope Nikon
Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution Biological Industries 03-031-1
Poly-L-Ornithin (PLO) Sigma-Aldrich #P8638 Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS
Sylgard 184 silicone elastomer kit DOW Corning Corporation #3097358-1004
Trypsin from bovine pancreas Sigma-Aldrich T1426 stock 25 mg/mL in 1XPBS
Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade F.S.T 15000-00
Yokogawa CSU X-1 Yokogawa

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References

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Altman, T., Maimon, R., Ionescu, A., … More

Altman, T., Maimon, R., Ionescu, A., Pery, T. G., Perlson, E. Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System. J. Vis. Exp. (159), e60993, doi:10.3791/60993 (2020).

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