Her beskriver vi en metode til retroviral overekspression og adoptivoverførsel af murine B-1a celler til at undersøge in vivo B-1a cellemigration og lokalisering. Denne protokol kan udvides til forskellige downstream funktionelle analyser, herunder kvantificering af donor B-1a celle lokalisering eller analyse af donor celle-afledte udskillede faktorer post-adoptivoverførsel.
Da cellefunktion påvirkes af nichespecifikke faktorer i det cellulære mikromiljø, kan metoder til dissekering af cellelokalisering og migration give yderligere indsigt i cellefunktion. B-1a celler er en unik B-celle delmængde i mus, der producerer beskyttende naturlige IgM antistoffer mod oxidation-specifikke epitoper, der opstår under sundhed og sygdom. B-1a celle IgM produktion varierer afhængigt af B-1a celle placering, og derfor bliver det nyttigt fra et terapeutisk synspunkt at målrette B-1a lokalisering til nicher støtter høj antistofproduktion. Her beskriver vi en metode til at målrette B-1a celle migration til knoglemarven ved retroviral-medieret overekspression af C-X-C motiv chemokine receptor 4 (CXCR4). Geninduktion i primære murine B-celler kan være udfordrende og giver typisk lave transfektioner på 10-20% afhængigt af teknikken. Her viser vi, at retroviral transduktion af primær murine B-1a celler resulterer i 30-40% transduktionseffektivitet. Denne metode anvender adoptivcelleoverførsel af trans inducerede B-1a-celler til B-cellemangel recipientmus, så donor B-1a cellemigration og lokalisering kan visualiseres. Denne protokol kan ændres for andre retrovirale konstruktioner og kan anvendes i forskellige funktionelle analyser efter adoptivoverførsel, herunder analyse af donorcelle- eller værtscellefænotype og funktion, eller analyse af opløselige faktorer, der udskilles efter B-1a-celleoverførsel. Anvendelse af forskellige donor- og recipientmus, der er differentieret efter CD45.1- og CD45.2-allotype, og tilstedeværelsen af en GFP-reporter i det retrovirale plasmid kan også gøre det muligt at detektere donorceller i andre, immunforsynende musemodeller, der indeholder endogene B-cellepopulationer.
Nylige undersøgelser har vist betydelig immuncelle, og specifikt B-celle, fænotypisk og funktionel heterogenitet afhængigt af cellelokalisering1,,2,,3,,4,5. B-1a celler er en sådan population med heterogen kapacitet til at producere beskyttende IgM antistoffer; knoglemarv B-1a celler udskiller IgM konstituerende og bidrager væsentligt til plasma IgM titere6,mens peritoneale B-1a celler har lavt niveau IgM sekretion på homøostase og i stedet kan aktiveres gennem medfødte vejafgift-lignende receptor (TLR) eller cytokin-medieret signalering til hurtigt at formere sig, migrere, og udskille IgM7,8,9,10. B-1a celle IgM antistoffer genkende oxidation-specifikke epitoper (OSE), der er til stede på patogener, apoptotiske celler, og oxideret LDL, og IgM bindende til OSE kan forhindre inflammatorisknedstrøm signalering i sygdomme som åreforkalkning11. Derfor kan strategier til at øge IgM produktion via stigende peritoneal B-1a celle migration til steder som knoglemarven være terapeutisk nyttige. Det er imidlertid vigtigt, at sådanne strategier målrettes og celletypespecifikke, da virkninger uden for målet kan have en negativ indvirkning på immunforsvaret eller sundheden.
Her beskriver vi en metode til målrettet og langsigtet overekspression af CXCR4 i primære murine B-1a celler og efterfølgende adoptivoverførsel for at visualisere cellemigration og funktionel IgM antistofproduktion (Figur 1). Genetisk manipulation af primære B-celler er begrænset af lav transfektion effektivitet sammenlignet med transfection af transformerede cellelinjer. Men da transformerede cellelinjer kan afvige betydeligt fraprimærcellerne 12,13, vil brugen af primærceller sandsynligvis give resultater, der i højere grad tilpasser sig normal fysiologi. Flere teknikker er blevet beskrevet for genoverførsel i primære murine B-celler, herunder retroviral transduktion, adenoviral transduktion, lipofection, eller elektroporation-baseret transinfektion, som har varierende niveauer af effektivitet, transience, og indvirkning på celle sundhed13,,14,15. Følgende metode anvendte retroviral transduktion, da den gav en tilstrækkelig genoverførselseffektivitet på >30%, mens den minimalt påvirkede cellernes levedygtighed. Den CXCR4-ekspresserende retrovirus blev genereret ved hjælp af den tidligere beskrevne retrovirale konstruktion murine stamcellevirus-interne ribosomal indrejse site-grøn fluorescerende protein (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, hvori musen CXCR4 genet var sub-klonede4. MigR1 (kontrol(Ctl)-GFP) og CXCR4-GFP retrovirale partikler blev genereret ved hjælp af calciumphosphattransfektion som beskrevet i tidligere offentliggjorte protokoller4,14.
Succesfuld trans induceret B-1a celler blev derefter intravenøst overført til lymfocyt-mangelfuld Rag1-/- mus. Både donor- og recipientmus indeholdt desuden knockout af apolipoprotein E (ApoE) genet, hvilket resulterer i øget OSE-akkumulering og åreforkalkning, hvilket giver en model for in vivo B-1-celleaktivering og IgM-produktion. Desuden var donor- og recipientmus forskellige i CD45-allotype; donor B-1 celler kom fra CD45.1 + ApoE-/- mus og blev overført til Rag1-/- CD45.2+ ApoE-/- modtagere. Dette gjorde det muligt at skelne mellem donor-CD45.1 fra modtager CD45.2 B-celler efter overførslen uden yderligere at plette for B-cellemarkører under flowcytometrianalyse. Resultaterne her viser, at målrettet CXCR4 overekspression på B-1a celler forbinder med øget evne til B-1a celler til at migrere til knoglemarven, som forbinder med øget plasma anti-OSE IgM. Vi leverer desuden en metode til berigelse af peritoneale B-1 celler gennem negativ udvælgelse og demonstrerer behovet for B-1 celleaktivering for effektiv transduktion. Denne metode kan tilpasses til andre retrovirale konstruktioner for at undersøge effekten af proteinoverekspression på B-1a cellemigration, fænotype eller funktion. Desuden kan anvendelsen af CD45.1 versus CD45.2 allotype skelnen teoretisk tillade overførsel til andre immunforsynende murinemodeller, der indeholder endogene B-celler.
Den metode, der her er angivet her, muliggør stabil og relativt effektiv primær B-1a celle genlevering, in vivo adoptivoverførsel og identifikation og lokalisering af injicerede celler. Celler var i stand til at blive opdaget 17 uger post-celle overførsel og bevaret øget CXCR4 udtryk. Retrovirus-medieret levering gav 30-40% transduktion effektivitet af primære murine B-1a celler med minimal indvirkning på cellens levedygtighed i vores hænder (Figur 4e). Dette er i overensstemmelse me…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, Projekt 3 af P01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara) og R01GM100776 (T.P. Bender). A. Upadhye blev støttet af American Heart Association Pre-ph.d.-stipendium 16PRE30300002 og 5T32AI007496-20. Vi takker Joanne Lannigan, Mike Solga, og Claude Chew fra University of Virginia Flow Cytometry Core for deres fremragende teknisk bistand.
70 micron filter caps | Falcon | 352235 | |
anti-biotin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
anti-CD16/CD32, or Fc block | Life Technologies | MFCR00 | |
B220 APC | eBioscience | 17-0452-83 | Clone: RA3-6B2 |
Beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
CD19 APCef780 | eBioscience | 47-0193-82 | Clone: eBio1D3 |
CD23 biotin | eBioscience | 13-0232-81 | Clone: B3B4 |
CD23 PECy7 | eBioscience | 25-0232-82 | Clone: B3B4 |
CD3e biotin | eBioscience | 13-0033-85 | Clone: eBio500A2 |
CD45.1 ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
CD45.1 PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560580 | Clone: A20 |
CD45.2 BV421 | BD Biosciences | 562895 | Clone: 104 |
CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
CD5 PE | eBioscience | 12-0051-83 | Clone: 53-7.3 |
Ctl-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender |
CXCR4 APC | eBioscience | 17-9991-82 | Clone: 2B11 |
CXCR4-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid |
F4/80 biotin | Life Technologies | MF48015 | Clone: BM8 |
Flowjo Software v. 9.9.6 | Treestar Inc. | License required | |
Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
Gr-1 biotin | eBioscience | 13-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
heat-inactivated fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
HEPES | Gibco | 15630-080 | |
IgM PECF594 | BD Biosciences | 562565 | Clone: R6-60.2 |
Insulin syringes | BD Biosciences | 329461 | |
Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 029405 | |
Live/Dead Yellow | Life Technologies | L34968 | |
LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
NK1.1 biotin | BD Biosciences | 553163 | Clone: PK136 |
Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
ODN 1668 | InvivoGen | tlrl-1668 | |
PBS | Gibco | 14190-144 | |
RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
Ter119 biotin | eBioscience | 13-5921-82 | Clone: Ter119 |