Här beskriver vi en metod för retroviral överuttryck och adoptivöverföring av murine B-1a celler för att undersöka in vivo B-1a cell migration och lokalisering. Detta protokoll kan förlängas för olika nedströms funktionella analyser inklusive kvantifiering av givaren B-1a cell lokalisering eller analys av givaren cell-härledda utsöndrade faktorer post-adoptivöverföring.
Eftersom cellfunktionen påverkas av nischspecifika faktorer i den cellulära mikromiljön kan metoder för att dissekera celllokalisering och migrering ge ytterligare insikt om cellfunktionen. B-1a celler är en unik B-cell delmängd hos möss som producerar skyddande naturliga IgM antikroppar mot oxidation-specifika epitoper som uppstår under hälsa och sjukdom. B-1a cell IgM produktion skiljer sig beroende på B-1a cell plats, och därför blir det användbart ur terapeutisk synvinkel att rikta B-1a lokalisering till nischer som stöder hög antikroppsproduktion. Här beskriver vi en metod för att rikta B-1a cell migration till benmärgen genom retroviral-medierad överuttryck av C-X-C motiv chemokine receptor 4 (CXCR4). Geninduktion i primära murine B-celler kan vara utmanande och ger vanligtvis låg känsveffektivitet på 10-20% beroende på teknik. Här visar vi att retroviral transduktion av primära murine B-1a celler resulterar i 30-40% transduktion effektivitet. Denna metod använder adoptivcellöverföring av transducerade B-1a-celler till B-cell-saknas mottagare möss så att givaren B-1a cellmigrering och lokalisering kan visualiseras. Detta protokoll kan ändras för andra retrovirala konstruktioner och kan användas i olika funktionella analyser post-adoptivöverföring, inklusive analys av givaren cell eller värdcell fenotyp och funktion, eller analys av lösliga faktorer utsöndras efter B-1a cell överföring. Användningen av olika donator- och mottagarmöss som differentieras med CD45.1 och CD45.2 allotyp och förekomsten av en GFP-reporter inom den retrovirala plasmid kan också möjliggöra detektion av givarceller i andra, immun-tillräckliga musmodeller som innehåller endogena B-cellpopulationer.
Nyligen genomförda studier har visat betydande immuncell, och specifikt B-cell, fenotypisk och funktionell heterogenitet beroende på celllokalisering1,,2,,3,,4,5. B-1a celler är en sådan population med heterogen kapacitet att producera skyddande IgM antikroppar; Benmärg B-1a celler utsöndrar IgM constitutively och bidrar avsevärt till plasma IgM titers6, medan peritoneal B-1a celler har låg nivå IgM sekretion på homeostasis och istället kan aktiveras genom medfödda vägtull-liknande receptor (TLR) eller cytokin-medierad signalerar att snabbt föröka sig, migrera och utsöndra IgM7,,8,9,10. B-1a cell IgM antikroppar känner igen oxidation-specifika epitoper (OSE) som finns på patogener, apoptotiska celler, och oxiderad LDL, och IgM bindning till OSE kan förhindra inflammatoriska nedströms signalering i sjukdomar som åderförkalkning11. Därför kan strategier för att öka IgM-produktionen via ökande peritoneal B-1a cellmigration till platser som benmärgen vara terapeutiskt användbara. Emellertid, Det är viktigt för sådana strategier som skall riktas och cell-typ specifika, som off-target effekter kan negativt påverka immunförsvaret eller hälsa.
Här beskriver vi en metod för riktad och långsiktig överuttryck av CXCR4 i primära murine B-1a celler och efterföljande adoptivöverföring för att visualisera cellmigration och funktionell IgM-antikroppsproduktion (figur 1). Genetisk manipulation av primära B-celler begränsas av låg transfection effektivitet jämfört med transfection av transformerade cellinjer. Men eftersom transformerade cellinjer kan avvika avsevärt från primära celler12,13, är användningen av primära celler sannolikt att ge resultat som närmare anpassar sig till normal fysiologi. Flera tekniker har beskrivits för genöverföring i primära murine B-celler, inklusive retroviral transduktion, adenoviral transduktion, lipofection, eller elektroporation-baserade transfection, som har varierande nivåer av effektivitet, transience, och inverkan på cellhälsa13,14,15. Följande metod utnyttjade retroviral transduktion eftersom det gav tillräcklig genöverföring effektivitet på >30% medan minimalt påverkar cellens livskraft. CXCR4-uttryck retrovirus genererades med hjälp av den tidigare beskrivna retrovirala konstruktionen murine stamceller virus-inre ribosomal posten webbplats-gröna fluorescerande protein (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, i vilken musen CXCR4 genen var sub-klonade4. MigR1 (control(Ctl)-GFP) och CXCR4-GFP retrovirala partiklar genererades med kalciumfosfattransfection enligt beskrivningen i tidigare publicerade protokoll4,14.
Framgångsrikt transduced B-1a celler överfördes sedan intravenöst till lymfocyter-saknas Rag1-/- möss. Både givare och mottagare möss innehöll dessutom knockout av apolipoprotein E (ApoE) genen, vilket resulterar i ökad OSE ackumulering och åderförkalkning, vilket ger en modell för in vivo B-1 cell aktivering och IgM produktion. Dessutom skilde sig donator- och mottagarmöss i cd45 allotyp. givaren B-1 celler kom från CD45.1+ ApoE-/- möss och överfördes till Rag1-/- CD45.2+ ApoE-/- mottagare. Detta möjliggjorde differentiering av givaren CD45.1 från mottagaren CD45.2 B-celler efter överföringen utan att behöva ytterligare fläck för B-cell markörer under flöde cytometri analys. De resultat som anges här visar att riktade CXCR4 överuttryck på B-1a celler associerar med ökad förmåga B-1a celler att migrera till benmärgen, som associerar med ökad plasma anti-OSE IgM. Vi tillhandahåller dessutom en metod för anrikning av bukhinnans B-1 celler genom negativt urval och visa kravet på B-1 cell aktivering för effektiv transduktion. Denna metod kan anpassas för andra retrovirala konstruktioner för att studera effekten av proteinöveruttryck på B-1a cellmigration, fenotyp eller funktion. Dessutom skulle användningen av CD45.1 jämfört med CD45.2 allotype skillnad teoretiskt tillåta överföring till andra immun-tillräckliga murine modeller som innehåller endogena B-celler.
Den metod som tillhandahålls här möjliggör stabil och relativt effektiv primär B-1a cell gen leverans, in vivo adoptivöverföring, och identifiering och lokalisering av injicerade celler. Celler kunde upptäckas 17 veckor post-cell överföring och behöll ökad CXCR4 uttryck. Retrovirusmedierad leverans gav 30-40% transduktionseffektivitet primära murine B-1a celler med minimal inverkan på cellens livskraft i våra händer(figur 4e). Detta är i linje med resultaten från en tidigar…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, Projekt 3 av P01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara) och R01GM100776 (T.P. Bender). A. Upadhye stöddes av American Heart Association Pre-doctoral fellowship 16PRE30300002 och 5T32AI007496-20. Vi tackar Joanne Lannigan, Mike Solga och Claude Chew från University of Virginia Flow Cytometry Core för deras utmärkta tekniska hjälp.
70 micron filter caps | Falcon | 352235 | |
anti-biotin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
anti-CD16/CD32, or Fc block | Life Technologies | MFCR00 | |
B220 APC | eBioscience | 17-0452-83 | Clone: RA3-6B2 |
Beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
CD19 APCef780 | eBioscience | 47-0193-82 | Clone: eBio1D3 |
CD23 biotin | eBioscience | 13-0232-81 | Clone: B3B4 |
CD23 PECy7 | eBioscience | 25-0232-82 | Clone: B3B4 |
CD3e biotin | eBioscience | 13-0033-85 | Clone: eBio500A2 |
CD45.1 ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
CD45.1 PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560580 | Clone: A20 |
CD45.2 BV421 | BD Biosciences | 562895 | Clone: 104 |
CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
CD5 PE | eBioscience | 12-0051-83 | Clone: 53-7.3 |
Ctl-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender |
CXCR4 APC | eBioscience | 17-9991-82 | Clone: 2B11 |
CXCR4-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid |
F4/80 biotin | Life Technologies | MF48015 | Clone: BM8 |
Flowjo Software v. 9.9.6 | Treestar Inc. | License required | |
Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
Gr-1 biotin | eBioscience | 13-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
heat-inactivated fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
HEPES | Gibco | 15630-080 | |
IgM PECF594 | BD Biosciences | 562565 | Clone: R6-60.2 |
Insulin syringes | BD Biosciences | 329461 | |
Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 029405 | |
Live/Dead Yellow | Life Technologies | L34968 | |
LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
NK1.1 biotin | BD Biosciences | 553163 | Clone: PK136 |
Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
ODN 1668 | InvivoGen | tlrl-1668 | |
PBS | Gibco | 14190-144 | |
RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
Ter119 biotin | eBioscience | 13-5921-82 | Clone: Ter119 |