Summary
Vi beskriver detaljerte protokoller for bruk av FLLIT, en helautomatisk maskinlæringsmetode for benklobevegelsessporing i fritt bevegelige Drosophila melanogaster og andre insekter. Disse protokollene kan brukes til å kvantitativt måle subtile gangbevegelser i villtypefluer, muterte fluer og flymodeller av neurodegenerasjon.
Abstract
Drosophila-modellen har vært uvurderlig for studiet av nevrologisk funksjon og for å forstå molekylære og cellulære mekanismer som ligger til grunn for nevrodegenerasjon. Mens fly teknikker for manipulering og studie av nevronale undergrupper har vokst stadig mer sofistikert, rikdommen av de resulterende atferdsfenotypene har ikke blitt fanget på en lignende detalj. For å kunne studere subtile fluebensbevegelser for sammenligning blant mutanter krever evnen til å automatisk måle og kvantifisere høyhastighets og raske benbevegelser. Derfor utviklet vi en maskinlæringsalgoritme for automatisert benklosporing i fritt gående fluer, Feature Learning-baserte Limb-segmentering og sporing (FLLIT). I motsetning til de fleste dype læringsmetoder, fllit er helautomatisk og genererer sine egne treningssett uten behov for brukermerknad, ved hjelp av morfologiske parametere innebygd i læringsalgoritmen. Denne artikkelen beskriver en grundig protokoll for å utføre ganganalyse ved hjelp av FLLIT. Den beskriver prosedyrene for kameraoppsett, arenabygging, videoopptak, bensegmentering og benklosporing. Det gir også en oversikt over dataene produsert av FLLIT, som inkluderer rå sporede kropps- og benposisjoner i hver videoramme, 20 gangartparametere, 5 tomter og en sporet video. For å demonstrere bruken av FLLIT kvantifiserer vi relevante syke gangartparametere i en flymodell av Spinocerebellar ataksi 3.
Introduction
I de siste tiårene har nevrodegenerative sykdommer og bevegelsesforstyrrelser blitt mer utbredt i våre aldrende populasjoner. Selv om vår forståelse av mange nevrodegenerative sykdommer har avansert på molekylært og cellulært nivå, forblir grunnleggende trekk ved den berørte nevronale kretsen underliggende sykdommen dårlig forstått. Nylig utviklet atferdssporingsverktøy1,2,3,4 nå tillate oss å studere bevegelse snormiteter i dyresykdommodeller for å identifisere molekylær, cellulær og kretsdysregulering underliggende sykdom.
Molekylære veier involvert i mange nevrodegenerative sykdommer er bevart i fruktfluen Drosophila melanogaster, og Drosophila sykdommodeller har bidratt til å belyse grunnleggende mekanismer underliggende neurodegeneration5,6. Vi viste nylig at flymodeller av Parkinsons sykdom (PD) og Spinocerebellar ataksi 3 (SCA3) viser distinkte, bevarte gangartsignaturer som ligner de av de respektive menneskelige sykdommene1, som viser at flymodellen kan brukes til å forstå kretsmekanismer underliggende bevegelsesdysfunksjon i spesifikke bevegelsesforstyrrelser. Det rike og stadig voksende arsenalet av verktøy i flymodellen for målrettet manipulering og visualisering av nevroner på enkeltgenet og enkeltcellenivå7,,8,9,10 gjør flyet til en ideell modell for å undersøke forholdet mellom sykdomsveier, nevronale kretser og atferdsfenotypisk manifestasjon in vivo. For å muliggjøre presis, automatisert insektganganalyse utviklet vi nylig en maskinlæringsmetode, Feature Linntjeningsbasert LImb segmentering og Tracking (FLLIT)1.
FLLIT består av en helautomatisk flertrinnsalgoritme som først segmenterer benpikslene, som senere brukes til å finne og spore de tilsvarende benklørne. FLLIT benytter en økende algoritme for segmentering, i motsetning til dype læringsalgoritmer som brukes i nyere arbeid2,3. Det er noen likheter med convolutional nevrale nettverk i at for begge rammer, funksjonen utvinning gjøres automatisk gjennom læring convolutional kjerner. Det første trinnet i FLLIT innebærer å bruke morfologiske operasjoner (kant og skjelettisering) for å automatisk generere positive (piksler på beina) og negative (bakgrunn eller piksler på flykroppen) treningsprøver med høy tillit. FlLIT er derfor helautomatisk og krever ikke brukerkommenterte opplæringsprøver. Ved hjelp av de ovennevnte treningsprøvene blir en klassifikater deretter opplært innenfor rammen av en økende algoritme. Et ensemble av svake klassifikater er iterativt lært, med hver består av et sett med convolutional kjerner for funksjonen utvinning og et beslutningstre. Den endelige læreklassifisereren brukes deretter til bensegmentering og er i stand til å bedre skjelne vanskelige regioner / harde prøver bedre enn morfologiske operasjoner, noe som gir en samlet mye mer nøyaktig segmentering for sporing1. Fra de segmenterte beina finner vi tipsene og sporer dem ved hjelp av den ungarske algoritmen: ved å matche tips på tvers av rammer slik at summen av avstanden som flyttes av hvert tips minimeres. FLLIT kan håndtere okklusjonstilfeller ved å huske det siste sted (i fly sentrertkoordinater) slik at en benspiss gjenopprettes når det ikke lenger er under okklusjon.
Vi har tidligere vist at FLLIT kan automatisk og nøyaktig spore benbevegelser og analysere gangart i en umerket, fritt bevegelig fly eller edderkopp fra høyhastighets video1; FLLIT bør derfor være bredt anvendelig for leddyr ben sporing. Ved å trekke ut maskinlæringstreningssett ved hjelp av morfologiske parametere, trener FLLIT seg automatisk til å segmentere og spore insektben uten behov for arbeidskrevende manuell merknad, som kreves for de fleste dype læringsmetoder. FLLIT er dermed helautomatisk. Etter bensegmentering og sporing produserer FLLIT automatisk rå sporede kropps- og benposisjoner i hver videoramme, 20 gangartparametere, 5 tomter og en sporet video for ganganalyse og visualisering av gangbevegelser. Denne protokollen gir en trinnvis veiledning for bruk av FLLIT.
Protocol
1. Systemoppsett
- Kontroller at opptaksstasjonen har et høyhastighetskamera og en scene over den for å holde arenakammeret (Figur 1). Juster kameraet for å ta opp minst 250 bilder per sekund (fps), med en tilsvarende rask lukkerhastighet (i dette tilfellet utføres opptaket med 1000 fps med en lukkerhastighet på 1 ms).
MERK: Kontroller at videoen er egnet for sporing ved å sikre at det er minimal eller ingen bevegelsesuskarphet av bevegelige ben i alle rammer. Hvis det bevegelige benet er så uskarpt at en menneskelig merknador ikke kan spore det, må kameraets opptakshastighet og/eller lukkertid økes. - Plasser de infrarøde LED-lampene øverst på scenen med en diffuser (gjennomsiktig ark) mellom kameraet og prøven (figur 1A,B).
- Lag opptakskammeret ved å kutte et 1,6 mm tykt akrylark. I dette eksperimentet bruker du et synsfelt på 11 mm x 11 mm. Plasser kammeret mellom to glasslysbilder (figur 1C).
2. Forberedelse av fluer for opptak
- Overfør fluene for å bli registrert i et nytt mathetteglass 24 timer før opptak.
MERK: Ikke bruk CO2 (vanligvis brukt til å bedøve fluene ved første samling) på fluene mindre enn 24 timer før opptak. - Ca 40 min før opptak, overføre fluene til tomme hetteglass og holde på is i 5-7 min.
- I mellomtiden tørker du av arenaen og fjerner glasssklier med vann og en klut.
MERK: Ikke bruk etanol til å rengjøre kamrene og lysbildene. - Forbered opptakskammeret. Fest en av de mikroskopiske glassskliene under kammeret med tape.
- Når fluene har blitt bedøvet på is, overfør en flue i hvert kammer ved hjelp av en ren børste.
MERK: Både mannlige og kvinnelige fluer kan brukes i dette oppsettet, og så langt som mulig bør fluer av begge kjønn analyseres for å unngå kjønnsspesifikk bias. - Fest kammeret med et annet mikroskopisk glasslysbilde med tape (figur 1C).
- Hold de kamret fluene ved romtemperatur i 15 - 20 min for akklimatisering.
3. Generering av videoer for FLLIT-analyse
MERK: Dette trinnet er spesifikt for videokameraet som brukes. I dette tilfellet brukes et kommersielt tilgjengelig videokamera (se Materialtabellen).
- Slå på strømkilden. Vent til den grønne LED-lampen for strøm og den oransje LED-lampen for ethernet-grensesnitttilkoblingen stabiliseres. Slå på strømmen for den infrarøde LED-lampen. Kontroller at spenningen forblir ved 12,5 V.
- Åpne Viewer-programmet på det tilkoblede datasystemet.
- Endre opptaksbildefrekvensen til 1000 bps. Sett lukkertiden til 1/1000 s (1 ms).
- Plasser kammeret med fluen på opptaksarenaen, og velg LIVE-knappen. Sørg for at kameraet er fokusert på beinspissene når flyet går oppreist på gulvet i kammeret; benspissene skal være i skarpt fokus.
- Klikk Post (Figur 2).
- Ta opp flyvandringen, og sørg for at:
Flyet gikk i en relativt rett bane uten å berøre kanten av arenaen.
Flyet gikk minst tre skritt per ben.
Flyet stopper ikke midlertidig under turen.
Avstanden som går tilsvarer minst en kroppslengde.
MERK: Å ha bakgrunnen trukket rent er avgjørende for nøyaktig segmentering. Den automatiserte bakgrunnssubtraksjonsalgoritmen som brukes av FLLIT, krever at den avbildede fluen beveger minst én kroppslengde i avstand. - Klikk Rec Ferdig for å stoppe opptaket ( Figur2).
- Beskjær videoen for å sikre at opptaket bare omfatter en rett tur av flyet (som beskrevet i trinn 3.6).
- Klikk Lagre (Figur 2). Lagre filene i '.mraw' eller '.tiff'-format i de respektive mappene.
MERK: '.mraw'-format gir større fleksibilitet til å endre filnavnet (om nødvendig) og for lagring av videoer sammenlignet med 'TIFF'-filformat.
4. Installasjon av FLLIT-programmet
MERK: Oppdaterte instruksjoner finner du på: https://github.com/BII-wushuang/FLLIT/blob/master/Compiled/Readme.pdf
- Last ned FLLIT på alle operativsystemer
- Last ned FLLIT fra følgende Github-kobling: https://github.com/BII-wushuang/FLLIT/archive/master.zip. Pakk ut innholdet i zip-filen.
- Last ned eksempeldatasett fra følgende Google Disk-kobling: https://bit.ly/2EibvNY. Opprett en mappe Data under FLLIT-master/Kompilert og plasser datasettmapper i denne datakatalogen.
- Installer FLLIT i Ubuntu
- Naviger til FLLIT/Compiled-katalogen.
- Høyreklikk og velg Åpne i Terminal.
- Send følgende kommando for å laste ned og installere MATLAB-kjøretidsbibliotekene til $HOME/MCR:
bash MCR_2016a.sh - Når installasjonen av MATLAB-kjøretidsbibliotekene er fullført, utsteder du følgende kommando for å sikre at kjørbare rettigheter er tildelt FLLIT:
chmod +x FLLIT - Åpne en terminal i mappen FLLIT/Compiled, og gi følgende kommando følgende kommandoen ut for å kjøre FLLIT:
bash run_FLLIT.sh $HOME/MCR/v901
- Installere FLLIT i Windows
- For 7 og tiende Home Edition, installer Docker Toolbox på:
(https://github.com/docker/toolbox/releases/download/v19.03.1/DockerToolbox-19.03.1.exe). - For Windows 10 Pro eller Enterprise Edition installerer du Docker Desktop for Windows på: (https://download.docker.com/win/stable/Docker\%20Desktop\%20Installer.exe).
- Hvis du vil aktivere kjøring av GUI-programmer i en Docker-beholder på Windows, må du først installere VcXSrV (https://sourceforge.net/projects/vcxsrv). Når du starter VcXsrv, konfigurerer du innstillingene som i figur S1.
MERK: Kontroller at Docker og VcXsrv kjører før du starter FLLIT. - Dobbeltklikk FLLIT.bat for å kjøre FLLIT.
MERK: Når du utfører for første gang, vil det ta litt tid å trekke Docker-bildet fra Docker Hub.
- For 7 og tiende Home Edition, installer Docker Toolbox på:
- Installere FLLIT i MacOS
- Last ned Docker Desktop for MacOS på https://download.docker.com/mac/stable/Docker.dmg
- Installer socat ved å åpne en terminal og utstede følgende kommando:
brygge installere socat - Start socat med:
socat TCP-LISTEN:6000, reuseaddr, gaffel UNIX-KLIENT:\"$DISPLAY\" & disown - Installer XQuartz (https://www.xquartz.org) for å aktivere kjøring av GUI-programmer i en Docker-beholder på MacOS. Start XQuartz og endre innstillingene ved å kontrollere Tillat tilkoblinger fra nettverksklienter i kategorien Sikkerhet som vist i Figur S2.
MERK: Kontroller at Docker, socat og XQuartz kjører alle før du starter FLLIT. - Åpne en terminal i FLLIT/Compiled-katalogen og kjør FLLIT med følgende kommando:
bash FLLIT_Mac.sh
MERK: Når du utfører for første gang, vil det ta litt tid å trekke Docker-bildet fra Docker Hub.
5. Kjører FLLIT for automatisert bensporing
- Segmentering
- Konverter videoen til individuelle TIFF-filer og kopier til FLLIT-datamappen.
- Kjør FLLIT (I Ubuntu høyreklikker du for å åpne FLLIT i Terminal).
- Velg mappen som inneholder TIFF-bildene fra bilde for bilde av videoen som skal spores, og klikk på Legg til-knappen.
- I popup-vinduet velger du 0 for å utføre bensegmentering bare, eller 1 for å inkludere bensporing med bensegmentering.
- Klikk på Ferdig for å starte segmentering og sporing av den valgte videoen.
- Sporing
- For å sjekke nøyaktigheten av sporing og utføre feilrettinger (hvis noen), klikk på Velg datamappe. Velg mappen som skal spores, og klikk Åpne.
- Klikk på Vis sporing.
MERK: Kontroller at visningsmodus forblir valgt mens du viser de sporede benposisjonene. Ellers vil eventuelle tidligere rettelser bli overridd. - Kontroller merkingen for alle beina i den første rammen
MERK: Siden beinetikettene er plassert i henhold til posisjonen på skjermen, hvis flyet går oppreist, er flyets høyre side merket som L1 (for-ben), L2 (midten av benet), L3 (bakbenet) og flyets VENSTRE side er merket som R1 (for-ben), R2 (midten av benet), R3 (bakbenet), henholdsvis (Figur 3). Hvis flyet går opp, vil ned beinetikettene bli riktig kommentert. - Hvis et ben er feil merket og en rettelse er nødvendig, klikker du Pausevisning, etterfulgt av Juster prediksjon (Figur 3).
- Fra høyre panel ledet Leg til Adjust, velg benet som krever korreksjon.
- Dobbeltklikk på riktig posisjon for dette benet i bildevinduet, klikk på Lagre, og deretter Avslutt. Hvis du vil gå til forrige ramme eller etterfølgende ramme, klikker du Pausevisning etterfulgt av knappene forover og bakover og I> (Figur 3).
- Hvis du vil rette opp feil sporede videoer, åpner du Data-mappen for videoen som skal spores på nytt, og velger Start sporing manuelt.
- Klikk på Sporing-knappen, som deretter endrer etiketten til Initial.
- Klikk Juster prediksjon og korriger benetikettene ved å dobbeltklikke på hvert bentips og deretter tilordne den med riktig benetikett. Klikk Lagre og avslutt.
- Klikk på Fortsett for å starte sporing.
- Databehandling og videogenerering
- Klikk på Dataprosess. I popup-vinduet skriver du inn antall bilder per sekund (fps) der videoene ble tatt opp (f.eks. 1000 fps).
- Bruk følgende formel til å beregne det faktiske synsfeltet for den innspilte videoen slik at gangparametere kan måles i millimeter:
MERK: Hvis for eksempel den faktiske kammerstørrelsen er 7 mm, er bredden på bilderammen 137 mm, bredden på kammeret i bilderammen på dataskjermen er 81 mm, og bredden på synsfeltet var 11,83 mm (Figur S3). - Hvis du vil se sporingsresultatene, går du til Sporings-mappen under Resultater-mappen.
- Hvis du vil generere en video av den sporede fluen, velger du Lag video. Videoen lagres i samme resultatmappe som de opprinnelige videodataene som analyseres.
MERK: Start-bildene (første) og Slutt (siste) i videoen kan velges.
- Normalisering til kroppslengde på hver fly.
MERK: Siden hver fly kan være litt forskjellig i størrelse, bør visse gangparametere normaliseres til kroppslengden på hver fly for å lette sammenligninger (f.eks. skrittlengden kan være lengre i større fluer og kortere i mindre fluer).- Åpne tre stillbilder fra videoen av hver fly (vanligvis første, midtre og siste rammer) ved hjelp av bildeprogramvare.
- Forstørre hver bilderamme til 800% og merk den anterior-mest pixel av hodet og bakre-mest piksel av magen på midtlinjen ved hjelp av en lys farge (f.eks gul).
- Åpne de merkede bildene i ImageJ.
- Bruk Angi skala til å skrive inn skalaen tilsvarende: Angi avstand i piksler: 512; Kjent avstand: Faktisk synsfelt (mm) målt i trinn 5.3.2.; Lengdeenhet: mm.
- Tegn en rett linje mellom de merkede hode- og magespissene for å oppnå kroppslengden.
- Åpne Angi skala igjen for å oppnå verdien i en kjent avstand, som er kroppslengden i mm.
- Ta et gjennomsnitt av lengden bestemt i hvert av de tre bildene for å oppnå gjennomsnittlig kroppsstørrelse i mm.
Representative Results
Etter bensegmentering, sporing og databehandling genererer FLLIT automatisk rådata for kroppens posisjoner og hver benklo, 20 gangartparametere, 5 tomter og en sporet video (tabell 1).
Her demonstrerer vi disse analysene ved hjelp av en fluemodell av Spinocerebellar ataksi 3 (SCA3). Den pan-neuronale driveren Elav-GAL4 ble brukt til å kjøre enten full lengde wildtype human SCA3 med 27 glutaminer i polyQ kanalen (UAS-SCA3-flQ27), eller en full lengde mutant menneskelig SCA3 med 84 glutaminer i polyQ kanalen (UAS-SCA3-flQ84)11. SCA3 er preget av en ataksik gangart med kroppsveering, uberegnelig fotplassering og korte, lurching trinn12,13 (Tabell 2). For å karakterisere gangart av mutant SCA3 fluer og undersøke om de viser en lignende gangart til at av menneskelige pasienter, analyserte vi relevante gangartparametere generert av FLLIT, nemlig: Antall kroppssvinger, fotavtrykk regularitet, bendomeneoverlapping og størrelser, og benskrittlengder (Tabell 2).
Vi fant at SCA3-Q84 fluer viste flere svinger (Figur 4A,A'), uberegnelig fotplassering som utstilt av lav fotavtrykk regularitet (forstørret standardavvik i AEP14) (Figur 4B), økt bendomene overlapping (Figur 4C-D), forstørrede bendomener i lengde og område (Figur 4E,F) og redusert skrittlengde (figur 4G).
FLLIT genererer også en video som viser den sporede fluen og bena i de arenasentrerte og kroppssentrerte visningene, kroppsbanen og retningsretningen, og vertikale og laterale forskyvninger av hvert ben (figur 5). De sporede videoene tillater side-ved-side sammenligning av benbevegelser i forskjellige fluer. Representative videoer av Elav-GAL4>SCA3-flQ27 (Video 1) og Elav-GAL4> SCA3-flQ84 (Video 2) fluer viser at sammenlignet med Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ27 fluer (Figur 5A), Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ84 fluer (Figur 5B) utstilling uregelmessig, kryssende bendomener av forskjellige størrelser, som indikerer en lurching, ataksisk gangart.
Figur 1. Oppsett av opptaksstasjonen og arenaen. Opptak fra siden (A) foran og (B). (C) Et eksempel på en arena som brukes til å lage flyopptak for FLLIT-sporing. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Visning av det aktive vinduet under flygangopptak ved hjelp av et dobbelt hodekamera, noe som gjør det mulig å ta opp to fluer samtidig. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Aktivt FLLIT-vindu som viser knappepanelet og merkede ben etter segmentering og sporing. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative FLLIT-genererte data for relevante gangartparametere av fluer som uttrykker wildtype (SCA3-flQ27) vs. mutant (SCA3-flQ84) SCA3. (A) Antall svinger i kroppsbanen. (B) Mid-leg fotavtrykk regularitet normalisert til kroppslengde. Jeg har ikkenoe å sitil deg. Kryssede bendomener i hvert ben. (D) Domene overlapper mellom bena. (E) Mid-leg domene lengde normalisert til kroppslengde. (F) Mid-leg domeneområdet normalisert til kroppslengde2. (G) Midtbenet skritt lengde normalisert til kroppen lengde. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Øyeblikksbilde av representative FLLIT-genererte videoer. (A) Elav-GAL4> UAS-SCA3-flQ27 og (B) Elav-GAL4> UAS-SCA3-flQ84 fluer. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Video 1: Representativ video av en flue som uttrykker pan-neuronal wild-type menneske full lengde SCA3 (Elav-GAL4> UAS-SCA3-flQ27). Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video 2: Representativ video av en flue som uttrykker pan-neuronal mutant menneskelig full lengde SCA3 (Elav-GAL4> UAS-SCA3-flQ84). Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Tilleggsfigur 1: Konfigurasjoner for VcXSrv. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 2: Konfigurasjon for Xquartz. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 3: Bilde merket med dimensjonene som trengs for beregning av synsfelt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Kategori | Parametere | Beskrivelse | Fil/plott (hvis aktuelt) |
| Rådata | Kroppsstilling | Posisjonskoordinater av kroppen centroid i hver ramme | De to første kolonnene i CoM.csv |
| Kroppsbane | Rotasjonsvinkelen på kroppsaksen i grader (i forhold til y-aksen) | Tredje kolonne med CoM.csv | |
| Arena-sentrert benklo Posisjoner |
Posisjonskoordinater for hver benklo i hver ramme basert på arenakoordinater | bane.csv | |
| Body-sentrert ben klo Posisjoner |
Posisjonskoordinater for hver benklo i hver ramme basert på arenakoordinater |
norm_trajectory.csv | |
| Kroppsbevegelse | Kroppslengde (mm) | Lengden på prøvedyret estimert i hver ramme (fremre-mest posisjon på hodet til bakre-mest posisjon på vingene) |
kroppslengde.csv |
| Øyeblikkelig kroppshastighet (mm/s) |
Øyeblikkelig hastighet på kroppen (centroid) i prøvedyret | BodyVelocity.csv; BodyVelocity.pdf (engelsk) | |
| Vendepunkter i kroppen Banen |
For å finne vendepunktene reduseres banen til en stykkevis lineær kurve ved hjelp av Dougl asâASPeucker algoritme, hvoretter en svinghendelse identifiseres som involverer en vinkel > 50 grader mellom to nærliggende lineære segmenter som utgjør den forenklede banen |
BodyTrajectory.pdf (engelsk) | |
| Individuelle skrittparametere | Skritt varighet (ms) | Varigheten av en skritthendelse | StrideParameters.csv (Andre) |
| Skrittperiode (ms) | Varigheten fra ett skritt-hendelse til neste | ||
| Skritt forskyvning (mm) | Forskyvning av benkloen under en skritthendelse | ||
| Skrittsti dekket (mm) | Total bane dekket av benkloen under en skritthendelse | ||
| Fremre ekstrem posisjon (mm) |
Landingposisjon (i forhold til kroppen) av en benklo på slutten av en skritthendelse | ||
| Bakre ekstrem posisjon (mm) | Take-off posisjon (i forhold til kroppen) av en benklo i begynnelsen av en skritthendelse | ||
| Løpeamplitude (mm) | Forskyvning langs bevegelsesretningen for en skritthendelse | ||
| Holdning linearitet (mm) | Definert som avviket av skrittbanen fra en kurve glattet over (ved 20ms intervaller) tilsvarende framtid og bakre ekstreme posisjoner av skrittet |
||
| Løpestrekk (mm) | Avstand av benkloposisjon fra kroppssenteret midt i en skritthendelse | ||
| Bevegelse av ben | Benhastighet (mm/s) | Den øyeblikkelige hastigheten på hvert ben | LegSpeed.csv; Gangart.pdf |
| Gangart indeks | Dette måler typen gangkoordinering utstilt av (seksbent) prøvedyret under bevegelsen. En gangart indeks på 1 tilsvarer en stativ gangart, _1 tilsvarer en tetrapod gangart mens 0 utgjør en ikke-kanonisk gangart. I vår implementering oppnås gangindeksen med et glidende gjennomsnitt over et 120 ms-vindu |
GaitIndex.csv; GaitIndex.pdf (engelsk) | |
| Bevegelsesprosent | Prosentandel av tiden et ben er i bevegelse | LegParameters.csv (Andre) | |
| Gjennomsnittlig skrittperiode (ms) | Gjennomsnittlig varighet fra én skritthendelse til neste | LegParameters.csv (Andre) | |
| Fotavtrykk regularitet (mm) | Målt som standardavvikene til bakre og | LegParameters.csv (Andre) | |
| fremre ekstreme posisjoner av et ben | |||
| Domeneområde for benbane (mm2) |
Området for det minimale konvekse skroget som inneholder hele benbanen i den kroppssentrerte referanserammen | LegParameters.csv; LegDomain.pdf (Engelsk) | |
| Lengde og bredde på ben bane domene (mm) |
Oppnådd via maksimal forventet avstand av kloposisjoner på de store (domenelengde) og mindre (domenebredde) hovedakser |
LegParameters.csv (Andre) | |
| Bendomeneskjæring/overlapping (mm2) |
Skjæringspunktet/overlappingen mellom hver mulige | LegDomainOverlap.csv (Andre) | |
| Holdning bredde (mm) | Gjennomsnitt av avstanden mellom AEP og PEP i venstre og mellomben | HoldningBredde.csv |
Tabell 1: Gangparametere generert av FLLIT.
| Gangart-funksjon | ||||
| Gait funksjoner i Spinocerebellar ataksi 3 (SCA3) | Veering | Uberegnelig fotplassering og benkryssing over | Lurching trinn | Korte skritt |
| Måleparameter | Antall body turn hendelser | Fotavtrykk regularitet | Størrelse på bendomener, grad av domeneoverlapping | Skritt lengde |
| FLLIT-fil | BodyTrajectory.pdf (engelsk) | LegParameters.csv (Andre) | LegDomainOverlap.csv (Andre) | StrideParameters.csv (Andre) |
Tabell 2: Tabell som viser kjennetegn sca3 gangart funksjoner hos menneskelige pasienter med sine tilsvarende FLLIT parametere og utdatafiler.
Discussion
I dette manuskriptet beskriver vi i detalj trinnene som er involvert i bruk av FLLIT, et automatisert maskinlæringsprogram1,for å analysere gangart i fritt gående Drosophila. Etter sporing og dataanalyse genererer FLLIT automatisk rådata for posisjonsinformasjon fra kropp og benklør, som produserer tjue kropps- og gangfunksjoner samt en video av den sporede fluen for å muliggjøre gangartvisualisering.
Det finnes nå en rekke metoder for benbevegelsesporing av Drosophila og andre dyr1,2,3,4,14,15,16, noe som gir forskerne et bredt spekter av alternativer avhengig av målene for eksperimentet. Noen av disse er fotutskrift-baserte tilnærminger, som er svært nøyaktige, men som rapporterer bare klo kontaktpunkter med deteksjonsoverflaten4,14. På den annen side, nylig dyp læring tilnærminger2,3,16 er svært allsidig, slik at analyse av atferd som krever sporing av benledd og andre kroppsdeler i ethvert dyr, med forbehold om at algoritmene må først trenes med bruker kommenterte datasett. En tredje type tilnærming bruker morfologi eller bildekontrastbaserte metoder1,,15,17 for å finne omrisset av hvert ben for å identifisere kloposisjoner. Generelt handler disse metodene dårlig med atferd der beina krysser over (f.eks. under pleie). FLLIT kombinerer andre og tredje tilnærminger, ved hjelp av morfologiske parametere for å trene en økende algoritme for bensegmentering. Dette gjør det mulig for FLLIT å omgå den møysommelige oppgaven med brukermerknad for å generere opplæringsdatasettet, samtidig som nøyaktigheten forbedres ved hjelp av maskinlæring. Fremtidige forbedringer av FLLIT må håndtere tilfeller der beina krysser over, for å tillate analyse av mer kompleks atferd.
FLLIT er robust til små endringer i belysning, opptaksoppløsning og bildehastighet1. Rammehastigheten til innspilte videoer bør imidlertid ikke falle under 250 fps, og FLLIT kjører optimalt for videoer tatt opp med 1000 fps. Hvis det er bevegelsesuskarphet i bildene, slik at det er utfordrende for en menneskelig merknador å identifisere benposisjonen, vil FLLIT ikke kunne nøyaktig identifisere bentips i disse rammene. I lys av dette er det viktig at kameraet fokuseres kraftig på beinspissene. For å forhindre segmentering sartefakter, bør arenaen rengjøres grundig, og bør ikke flyttes under opptaket. For nøyaktig bakgrunnssubtraksjon og ren segmentering, bør flyet bevege seg minst én kroppslengde under opptaket, uten å sette den på pause. Etter automatisk segmentering og sporing må merkingen av alle beina kontrolleres. Hvis flygangarten ikke spores eller spores feil, bør filen spores manuelt ved hjelp av alternativet Start sporing manuelt (trinn 5.2.7 – 5.2.10).
Nevrodegenerative sykdommer og bevegelsesforstyrrelser blir stadig mer utbredt i våre aldrende samfunn. Fly modeller av neurodegeneration har blitt studert i mer enn 2 tiår, der fremskritt har blitt gjort om molekylære og cellulære aspekter av sykdom patofysiologi. Spesifikke atferdskonsekvenser av sykdom har imidlertid vært teknisk vanskelige å vurdere. For eksempel, mens rapporter om skjelvende bevegelser i fly har blitt gjort18,19, disse hadde ikke blitt kvantitativt studert før nylig1. Klatreanalysen har vært et nyttig og kvantitativt, men relativt grovt mål6. Dette tekniske underskuddet har på samme måte hindret høyoppløselig bevegelsesanalyse i andre dyremodeller. Bruk av nye verktøy for atferdsanalyse, derav, har lovet å forynge feltet av bevegelsesforstyrrelser for å gjøre det mulig for forskere å studere hvordan molekylære og cellulære mekanismer for nevromuskulære sykdommer fører til spesifikke atferdsresultater i dyremodeller. I dette papiret og i vårt tidligere arbeid1viste vi ved hjelp av FLLIT at flymodeller av SCA3 viser en hyperkinetisk ataksisk gangart, mens PD flymodeller viser en hypokinetisk stiv gangart, rekapitulerende bevegelseskjennetegn på de respektive menneskelige sykdommene1. Ganganalyse gjorde det også mulig for oss å identifisere forskjellige nevronale populasjoner underliggende spesifikke bevegelsesdysfunksjoner. Fremover vil detaljert bevegelsesanalyse, kombinert med de kraftige bildebehandlings- og funksjonelle verktøyene som er tilgjengelige i fluen, tillate oss å få ny innsikt i mekanismer for lokomotorisk dysfunksjon, og belyse vår forståelse av nevrodegenerative sykdommer med hensyn til kretsmekanismer.
FLLIT bør være allment anvendelig for å studere gangart i andre små leddyr, da det tidligere ble vist å være svært nøyaktig for sporing av edderkoppbenbevegelser1. Mens vi fokuserer her på bruk av detaljert bevegelse fenotyping for kvantifisere patogen gangart og dens underliggende kretser, har fremskritt i bevegelsessporing allerede revolusjonert, og vil ha fortsatt innvirkning på, forståelsen av normal gangkoordinering og gangart og dens underliggende kretser, spesielt i utallige forskjellige grener av det evolusjonære treet.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Moumita Chatterjee og Alice Liu for teknisk støtte, og Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana, USA) for å gjøre tilgjengelig drosophila stammer som brukes i dette arbeidet. Dette arbeidet ble støttet av Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore; Bioinformatikk instituttet, Singapore; Agency for Science Technology and Research Joint Council Organization (gi nummer 15302FG149 til SA og LC); Clinical Research Flagship Programme (Parkinsons sykdom) administrert av Singapore Ministry of Health's National Medical Research Council (gi nummer NMRC /TCR/013-NNI/2014 til SA), University of Alberta (oppstartsstipend til LC), og Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grant (gi nummer RGPIN-2019-04575 til LC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic Sheets | Dama | 1.6 mm thickness, Clear sheets | Singapore, Singapore |
| Clear Glass slides | Biomedia | BMH 880101 | Singapore, Singapore |
| High speed camera | Photron | Fastcam MC2.1 | Tokyo, Japan. A shutter speed of 1 msec or faster is ideal to reduce motion blur of captured images |
| Infra Red LED | Any - Generic from hardware store | 940nm Infrared Light Board | Singapore, Singapore |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155-01LS | Irving, Texas, USA |
References
- Wu, S., et al. Fully automated leg tracking of Drosophila neurodegeneration models reveals distinct conserved movement signatures. PLoS Biology. 17 (6), 3000346 (2019).
- Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neuroscience. 19, 1281-1289 (2018).
- Pereira, T. D., et al. Fast animal pose estimation using deep neural networks. Nature Methods. 16 (1), 117-125 (2019).
- Machado, A. S., Darmohray, D. M., Fayad, J., Marques, H. G., Carey, M. R. A quantitative framework for whole-body coordination reveals specific deficits in freely walking ataxic mice. eLife. 4, (2015).
- Lu, B., Vogel, H.
- McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an In Vivo Model for Human Neurodegenerative Disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
- Dionne, H., Hibbard, K., Cavallaro, A., Kao, J. -C., Rubin, G. M. Genetic reagents for making split-GAL4 lines in Drosophila. bioRxiv. , (2017).
- Cande, J., et al. Optogenetic dissection of descending behavioral control in Drosophila. eLife. 7, (2018).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (22), 2967-2976 (2015).
- Xie, T., et al. A Genetic Toolkit for Dissecting Dopamine Circuit Function in Drosophila. Cell Reports. 23 (2), 652-665 (2018).
- Warrick, J. M., et al. Ataxin-3 suppresses polyglutamine neurodegeneration in Drosophila by a ubiquitin-associated mechanism. Molecular Cell. 18 (1), 37-48 (2005).
- Ebersbach, G., et al. Comparative analysis of gait in Parkinson's disease, cerebellar ataxia and subcortical arteriosclerotic encephalopathy. Brain. 122 (7), 1349-1355 (1999).
- Stolze, H., et al. Typical features of cerebellar ataxic gait. Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry. 73 (3), 310-312 (2002).
- Mendes, C. S., Bartos, I., Akay, T., Marka, S., Mann, R. S. Quantification of gait parameters in freely walking wild type and sensory deprived Drosophila melanogaster. eLife. 2, 00231 (2013).
- DeAngelis, B. D., Zavatone-Veth, J. A., Clark, D. A. The manifold structure of limb coordination in walking Drosophila. eLife. 8, (2019).
- Gunel, S., et al. DeepFly3D, a deep learning-based approach for 3D limb and appendage tracking in tethered, adult Drosophila. eLife. 8, (2019).
- Isakov, A., et al. Recovery of locomotion after injury in Drosophila melanogaster depends on proprioception. The Journal of Experimental Biology. 219, Pt 11 1760-1771 (2016).
- Aw, S. S., Lim, I. K. H., Tang, M. X. M., Cohen, S. M. A Glio-Protective Role of mir-263a by Tuning Sensitivity to Glutamate. Cell Reports. 19 (9), 1783-1793 (2017).
- Eberl, D. F., Duyk, G. M., Perrimon, N. A genetic screen for mutations that disrupt an auditory response in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14837-14842 (1997).
