Summary
Biz FLLIT, serbestçe Drosophila melanogaster ve diğer böcekler hareket bacak pençe hareketi izleme için tam otomatik bir makine öğrenme yöntemi kullanmak için ayrıntılı protokoller açıklar. Bu protokoller, vahşi sinekler, mutant sinekler ve nörodejenerasyon modelleri sinek ince yürüyüş hareketleri nicel ölçmek için kullanılabilir.
Abstract
Drosophila modeli nörolojik fonksiyon çalışması ve nörodejenerasyon altında yatan moleküler ve hücresel mekanizmaları anlamak için paha biçilmez olmuştur. Manipülasyon ve nöronal alt kümelerin çalışma için sinek teknikleri giderek sofistike büyüdü iken, ortaya çıkan davranışsal fenotiplerin zenginliği benzer bir ayrıntıda yakalanmış değil. Mutantlar arasında karşılaştırma için ince sinek bacak hareketleri çalışma yapabilmek için otomatik olarak ölçmek ve yüksek hız ve hızlı bacak hareketleri ölçmek için yeteneği gerektirir. Bu nedenle, serbestçe yürüyen sineklerde otomatik bacak pençesi takibi, Özellik Öğrenme tabanlı Uzuv segmentasyonu ve takibi (FLLIT) için bir makine öğrenme algoritması geliştirdik. Çoğu derin öğrenme yönteminin aksine, FLLIT tam otomatiktir ve öğrenme algoritması yerleşik morfolojik parametreleri kullanarak, kullanıcı ek açıklama için gerek kalmadan kendi eğitim setleri oluşturur. Bu makalede, FLLIT kullanarak yürüyüş analizi yürütmek için derinlemesine bir protokol açıklanmaktadır. Bu kamera kurulumu, arena yapımı, video kayıt, bacak segmentasyon ve bacak pençe izleme prosedürleri ayrıntıları. Ayrıca, her video karesinde ham izlenmiş gövde ve bacak konumlarını, 20 yürüyüş parametrelerini, 5 çizimi ve izlenen videoyu içeren FLLIT tarafından üretilen verilere genel bir bakış sunar. FLLIT kullanımını göstermek için, spinocerebellar ataksi 3 bir sinek modeli nde ilgili hastalıklı yürüyüş parametrelerini ölçmek.
Introduction
Son birkaç on yıl içinde, nörodejeneratif hastalıklar ve hareket bozuklukları bizim yaşlanan popülasyonlarda daha yaygın büyüdü. Birçok nörodejeneratif hastalık anlayışımız moleküler ve hücresel düzeyde ilerlemiş olsa da, hastalığın altında yatan etkilenen nöronal devrenin temel özellikleri tam olarak anlaşılamamıştır. Son zamanlarda geliştirilen davranış takip araçları1,2,3,4 şimdi bize moleküler, hücresel ve devre disregülasyon altta yatan hastalığı belirlemek için hayvan hastalığı modellerinde hareket anormallikleri çalışma sağlar.
Birçok nörodejeneratif hastalıklarda yer moleküler yollar meyve sinek Drosophila melanogasterkorunur , ve Drosophila hastalığı modelleri nörodejenerasyon altında yatan temel mekanizmaları açıklamak için yardımcı oldu5,6. Yakın zamanda Parkinson Hastalığı (PD) ve Spinocerebellar ataksi 3 (SCA3) sinek modelleri farklı, ilgili insan hastalıkları1benzer korunmuş yürüyüş imzaları sergilemek gösterdi , sinek modeli belirli hareket bozukluklarında hareket bozukluğu altında yatan devre mekanizmaları anlamak için kullanılabilir gösteren. Tek gen ve tek hücre düzeyinde nöronların hedeflenen manipülasyon ve görselleştirme için sinek modeli araçların zengin ve sürekli büyüyen cephanelik7,8,9,10 sinek hastalık yolları arasındaki ilişkiyi araştırmak için ideal bir model yapar, nöronal devre ve davranışsal phenotipic tezahürü in vivo. Hassas, otomatik böcek yürüyüşü analizini sağlamak için, yakın zamanda bir makine öğrenme yöntemi, Feature Lkazanç tabanlı LImb segmentasyon ve Traflama (FLLIT)1geliştirdik.
FLLIT, daha sonra ilgili bacak pençelerini bulmak ve izlemek için kullanılan bacak piksellerini ilk bölümlere alan tam otomatik çok aşamalı bir algoritmadan oluşur. FLLIT segmentasyon için bir artırma algoritması kullanır, son çalışmada kullanılan derin öğrenme algoritmaları aksine2,3. Her iki çerçeve için de kıvrımlı sinir ağları ile bazı benzerlikler vardır, özellik çıkarma otomatik olarak kvolutional çekirdekleri öğrenme yoluyla yapılır. FLLIT'nin ilk adımı, otomatik olarak pozitif (bacaklarda piksel) ve yüksek güvene sahip negatif (arka plan veya sinek gövdesindeki pikseller) eğitim örneklerini oluşturmak için morfolojik işlemlerin (kenar ve iskeletleştirme) kullanılmasını içerir. Bu nedenle, FLLIT tam otomatiktir ve kullanıcı açıklamalı eğitim örnekleri gerektirmez. Yukarıdaki eğitim örneklerini kullanarak, bir sınıflandırıcı daha sonra bir artırma algoritması çerçevesinde eğitilir. Zayıf sınıflandırıcıların bir topluluk yinelemeli, her özellik çıkarma ve bir karar ağacı için kvolutional çekirdekleri bir dizi oluşan öğrenilir. Son öğrenilen sınıflandırıcı daha sonra bacak segmentasyonu için kullanılır ve daha iyi zor bölgeleri / sert örnekleri morfolojik işlemlerdaha iyi ayırt etmek mümkün, izleme için genel bir çok daha doğru segmentasyon üreten1. Parçalı bacaklardan, ipuçlarını bulur uzatır ve Macar algoritmasını kullanarak takip ederiz: her uçtarafından taşınan mesafenin toplamı en aza indirilmiş olacak şekilde çerçeveler arasında ipuçlarını eşleştirerek. FLLIT, son görülen konumu hatırlayarak tıkanma durumlarını (sinek merkezli koordinatlarda) işleyebilir, böylece bir bacak ucu artık tıkanma altında kaldıktan sonra geri kazanılır.
Daha önce FLLIT otomatik ve doğru bacak hareketleri izlemek ve işaretsiz, serbestçe hareket eden sinek veya örümcek yüksek hızlı video1yürüyüş analiz gösterdi ; FLLIT bu nedenle eklembacak takibi için geniş uygulanabilir olmalıdır. Morfolojik parametreleri kullanarak makine öğrenimi eğitim setleri ayıklayarak, FLLIT otomatik olarak segment ve en derin öğrenme yöntemleri için gerekli olan zahmetli manuel açıklama, gerek kalmadan böcek bacakları izlemek için kendini eğitiyor. FLLIT dolayısıyla tam otomatiktir. Bacak segmentasyonu ve takibinden sonra FLLIT, her video karesinde ham izlenmiş gövde ve bacak pozisyonları, 20 yürüyüş parametresi, 5 çizim ve yürüyüş analizi ve yürüyüş hareketlerinin görselleştirilmesi için izlenen bir video üretir. Bu protokol, FLLIT kullanmak için adım adım bir kılavuz sağlar.
Protocol
1. Sistem kurulumu
- Kayıt istasyonunun yüksek hızlı bir kameraya ve arena odasını tutmak için üzerinde bir sahneye sahip olduğundan emin olun(Şekil 1). Kamerayı saniyede en az 250 kare (fps) hızında, buna göre hızlı deklanşör hızıyla kaydacak şekilde ayarlayın (bu durumda kayıt 1 ms deklanşör hızıyla 1000 fps hızında gerçekleştirilir).
NOT: Tüm karelerde hareketli bacakların hareket bulanıklığı nın en az veya hiç hareket bulanıklığı olmadığından emin olarak videonun izleme için uygun olup olmadığını kontrol edin. Hareket eden bacak, bir insan ek noterinin onu izleyemeyeceği kadar bulanıksa, kamera kayıt hızı ve/veya deklanşör hızı artırılmalıdır. - Kızılötesi LED ışıklarını kamera ve örnek arasına bir difüzör (yarı saydam levha) ile sahnenin üst kısmında yerleştirin(Şekil 1A,B).
- 1,6 mm kalınlığında akrilik levha keserek kayıt odası olun. Bu deneyde, 11 mm x 11 mm. Odayı iki cam kaydırak arasına yerleştirin(Şekil 1C)bir alan-görünüm kullanın.
2. Kayıt için sinek hazırlanması
- Kayıttan önce 24 saat önce yeni bir gıda şişesine kaydedilecek sinekleri aktarın.
NOT: Kayıttan önce 24 saatten daha az olan sineklerde CO2 (genellikle ilk toplama üzerine sinekleri anestezik için kullanılır) kullanmayın. - Kayıt tan önce yaklaşık 40 dakika, boş şişeler halinde sinek aktarmak ve 5-7 dakika buz üzerinde tutmak.
- Bu arada, su ve bir silme ile arena ve temiz cam slaytlar silin.
NOT: Odaları ve slaytları temizlemek için etanol kullanmayın. - Kayıt odasını hazırlayın. Mikroskobik cam slaytlardan birini odanın altındaki bantla düzeltin.
- Sinekler buz üzerinde anestezi edildiğinde, temiz bir fırça kullanarak her odada bir sinek transfer.
NOT: Bu kurulumda hem erkek hem de dişi sinekler kullanılabilir ve mümkün olduğunca her iki cinsin sinekleri cinsiyete özgü önyargıdan kaçınmak için analiz edilmelidir. - Odayı başka bir mikroskobik cam kaydırakla bantla sabitleyin(Şekil 1C).
- Oda sıcaklığında oda sıcaklığında 15 - 20 dakika klimatizasyon için oda sıcaklığında oda sinektutun.
3. FLLIT analizi için video üretimi
NOT: Bu adım kullanılan video kameraya özgüdür. Bu durumda, ticari olarak kullanılabilen bir video kamera kullanılır (bkz. Malzemeler Tablosu).
- Güç kaynağını aç. Güç için yeşil LED'i ve ethernet arabirimi bağlantısının stabilize olması için turuncu LED'i bekleyin. Kızılötesi LED için gücü açın. Gerilimin 12,5 V'da kaldığından emin olun.
- Bağlı bilgisayar sisteminde Görüntüleyici uygulamasını açın.
- Kayıt kare hızını 1000 fps olarak değiştirin. Deklanşör hızını 1/1000 s (1 ms) olarak ayarlayın.
- Kayıt arenası üzerinde sinek ile oda yerleştirin ve CANLI düğmesini seçin. Sinek odanın zemininde dik yürürken kameranın bacak uçlarına odaklandığından emin olun; bacak uçları keskin odak olmalıdır.
- Kayıt (Şekil 2)'yi tıklatın.
- Sinek yürüyüş kaydedin, sağlanması:
Sinek arenanın kenarına dokunmadan nispeten düz bir yörüngede yürüdü.
Sinek bacak başına en az üç adım yürüdü.
Sinek yürüyüş sırasında duraksamaz.
Yürüme mesafesi en az bir vücut uzunluğuna eşittir.
NOT: Arka planın temiz bir şekilde çıkarılması doğru bölümleme için çok önemlidir. FLLIT tarafından kullanılan otomatik arka plan çıkarma algoritması, görüntülenmiş sineğin en az bir gövde uzunluğunu uzaklıkta hareket ettirir. - Kaydı durdurmak için Rec Done'yi tıklatın (Şekil 2).
- Kaydın yalnızca düz bir sineği kapsadığından emin olmak için videoyu kırpın (Adım 3.6'da açıklandığı gibi).
- Kaydet 'i tıklatın (Şekil 2). Dosyaları ilgili klasörlere '.mraw' veya '.tiff' biçiminde kaydedin.
NOT: '.mraw' biçimi, dosya adını (gerekirse) ve '.tiff' dosya biçimiyle karşılaştırıldığında videoların depolanması için daha fazla esneklik sağlar.
4. FLLIT programının kurulumu
NOT: Güncel talimatlara şu yolla https://github.com/BII-wushuang/FLLIT/blob/master/Compiled/Readme.pdf
- FLLIT'yi herhangi bir işletim sisteminden indirin
- Aşağıdaki Github bağlantısından FLLIT'yi indirin: https://github.com/BII-wushuang/FLLIT/archive/master.zip. Zip dosyasının içeriğini ayıklayın.
- Aşağıdaki Google Drive bağlantısından örnek veri kümelerini indirin: https://bit.ly/2EibvNY. FLLIT yöneticisi/Derlenmiş altında bir klasör Veri oluşturun ve veri kümesi klasörlerini bu Veri dizinine yerleştirin.
- Ubuntu'da FLLIT'yi yükleyin
- FLLIT/Derlenmiş dizine gidin.
- Sağ tıklayın ve Termina l'de Aç'ıseçin.
- MATLAB çalışma zamanı kitaplıklarını $HOME/MCR'ye indirmek ve yüklemek için aşağıdaki komutu sorun:
bash MCR_2016a.ş - MATLAB çalışma zamanı kitaplıklarının yüklenmesi tamamlandıktan sonra, yürütülebilir hakların FLLIT'ye verilmesi için aşağıdaki komutu düzenleyin:
chmod +x FLLIT - FLLIT/Derlenmiş dizinde bir terminal açın ve FLLIT'yi çalıştırmak için aşağıdaki komutu sorun:
bash run_FLLIT.sh $HOME/MCR/v901
- Windows'a FLLIT yükleme
- 7 ve 10.
(https://github.com/docker/toolbox/releases/download/v19.03.1/DockerToolbox-19.03.1.exe). - Windows 10 Pro veya Enterprise Edition için Şu adresi (https://download.docker.com/win/stable/Docker\%20Desktop\%20Installer.exe) Windows için Docker Desktop'ı yükleyin.
- GUI uygulamalarının Windows'daki docker kapsayıcısında yürütülmesini etkinleştirmek için önce VcXSrV'yi (https://sourceforge.net/projects/vcxsrv) yükleyin. VcXsrv'i başlatırken, ayarları Şekil S1'dekigibi yapılandırın.
NOT: FLLIT'yi başlatmadan önce Docker ve VcXsrv'in çalışmaya başladığından emin olun. - FLLIT çalıştırmak için FLLIT.bat çift tıklayın.
NOT: İlk kez çalıştırıldığında Docker görüntüsünü Docker Hub'dan çekmek biraz zaman alacaktır.
- 7 ve 10.
- MacOS'ta FLLIT'yi yükleyin
- MacOS için Docker Desktop'ı https://download.docker.com/mac/stable/Docker.dmg'da indirin
- Bir terminal açarak ve aşağıdaki komutu vererek socat yükleyin:
demlemek socat yüklemek - Socat ile başlayın:
socat TCP-DİnLE:6000,reuseaddr,çatal UNIX-CLIENT:\"$DISPLAY\" & reddi - GUI uygulamalarının MacOS'taki Docker konteynerinde yürütülmesini sağlamak için XQuartz (https://www.xquartz.org) yükleyin. XQuartz'ı başlatın ve Şekil S2'de gösterildiği gibi Güvenlik sekmesindeki ağ istemcilerinden bağlantılara izin ver'i denetleyerek tercihleri değiştirin.
NOT: Docker, socat ve XQuartz'ın FLLIT'yi başlatmadan önce çalıştığını unutmayın. - FLLIT/Derlenmiş dizinde bir terminal açın ve Aşağıdaki komutla FLLIT'yi çalıştırın:
bash FLLIT_Mac.ş
NOT: İlk kez çalıştırıldığında Docker görüntüsünü Docker Hub'dan çekmek biraz zaman alacaktır.
5. Otomatik bacak takibi için FLLIT'nin çalıştırıl
- Segmentasyon
- Videoyu tek tek TIFF dosyalarına dönüştürün ve FLLIT veri klasörüne kopyalayın.
- FLLIT çalıştırın (Ubuntu'da, Terminal'de FLLIT'yi açmak için sağ tıklatın).
- İzlenecek videonun kare kare TIFF görüntülerini içeren klasörü seçin ve Ekle düğmesini tıklatın.
- Açılır pencerede yalnızca bacak segmentasyonu gerçekleştirmek için 0'ı veya bacak segmentasyonu ile bacak izlemeyi içerecek şekilde 1'i seçin.
- Seçili videonun bölümlenmesini ve izlenmesini başlatmak için Bitti'yi tıklatın.
- Izleme
- İzlemenin doğruluğunu kontrol etmek ve hata düzeltmeleri gerçekleştirmek için (varsa), Veri Klasörünü Seç'etıklayın. İzlenecek klasörü seçin ve Aç'ıtıklatın.
- İzlemeyi Görüntüle'yetıklayın.
NOT: İzlenen bacak konumlarını görüntülerken Görüntüleyici Modu'nun seçili olup olmadığını kontrol edin. Aksi takdirde, yapılan önceki düzeltmeler aşırı basmış olacaktır. - İlk karedeki tüm bacaklar için etiketlemeyi kontrol edin
NOT: Bacak etiketleri ekrandaki konuma göre yerleştirildiğinden, sinek dik yürüyorsa, sineğin sağ tarafı L1 (ön bacak), L2 (orta bacak), L3 (arka bacak) ve sineğin SOL tarafı Sırasıyla R1 (ön bacak), R2 (orta bacak), R3 (arka bacak), sırasıyla(Şekil 3)olarak etiketlenir. Sinek baş aşağı yürüyorsa, bacak etiketleri doğru bir şekilde açıklamalı olacaktır. - Bir bacak yanlış etiketlenmişse ve düzeltme gerekiyorsa, Görüntülemeyi Duraklat'ıtıklatın, ardından Tahmin'i Ayarla (Şekil 3).
- Ayarlamak için sağ panelbaşlı Bacak,düzeltme gerektiren bacak seçin.
- Görüntü penceresindeki bu bacak için doğru konuma çift tıklayın, Kaydet'etıklayın ve sonra Çık. Önceki çerçeveye veya sonraki çerçeveye gitmek için, sırasıyla ileri ve geri ve I> düğmeleri izleyen Görüntülemeyi Duraklat'ı tıklatın (Şekil 3).
- Yanlış izlenen videoları düzeltmek için, yeniden izlenecek videonun Veri klasörünü açın ve El ile İzlemebaşlat'ıseçin.
- Daha sonra etiketini Başlangıçolarak değiştirecek olan İzleme düğmesini tıklatın.
- Tahmin'i ayarla'yı tıklatın ve her bacak ucunu çift tıklatıp doğru bacak etiketiyle atayarak bacak etiketlerini düzeltin. Kaydet ve Çıkar'ıtıklatın.
- İzlemebaşlatmak için Devam'ı tıklatın.
- Veri işleme ve video oluşturma
- Veri İşlemi'netıklayın. Açılır pencerede, videoların kaydedildiği saniyebaşına kare sayısını (fps) yazın (örn. 1.000 fps).
- Yürüyüş parametrelerinin milimetre cinsinden ölçülebilmeleri için yakalanan videonun gerçek görüş alanını hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın:
NOT: Örneğin, gerçek oda boyutu 7 mm ise, görüntü çerçevesinin genişliği 137 mm, bilgisayar ekranındaki görüntü çerçevesindeki haznenin genişliği 81 mm ve görüş alanının genişliği 11,83 mm(Şekil S3)idi. - İzleme sonuçlarını görmek için Sonuçlar klasörünaltındaki İzleme klasörüne gidin.
- İzlenen sineğin videosunu oluşturmak için Video Yap'ıseçin. Video, analiz edilen orijinal video verileriyle aynı Sonuçlar klasörüne kaydedilir.
NOT: Videonun Başlat (ilk) ve Bitiş (son) kareleri seçilebilir.
- Her sineğin vücut uzunluğuna normalleştirme.
NOT: Her sinek boyutu biraz farklı olabilir gibi, bazı yürüyüş parametreleri karşılaştırmalar kolaylaştırmak için her sinek vücut uzunluğu normalleştirilmiş olmalıdır (örneğin, adım uzunluğu daha büyük sinekler daha uzun olabilir, ve küçük sineklerde daha kısa).- Görüntü yazılımını kullanarak her bir sineğin videosundan (genellikle ilk, orta ve son kareler) üç hareketsiz görüntü açın.
- Her görüntü çerçevesini %800 büyütün ve orta hattaki başın en ön pikselini ve karın arka daki en pikselini parlak bir renk (örn. sarı) kullanarak etiketleyin.
- ImageJ'de etiketli görüntüleri açın.
- Ölçeği buna göre giriş yapmak için Ayarla Ölçeği'ni kullanın: Piksellerde Mesafeyi Ayarlama: 512; Bilinen uzaklık: 5.3.2.'de ölçülen gerçek görüş alanı (mm); Uzunluk birimi: mm.
- Vücut uzunluğunu elde etmek için etiketli baş ve karın ucu pikselleri arasında düz bir çizgi çizin.
- Mm'deki gövde uzunluğu olan bilinen bir mesafedeki değeri elde etmek için Set Ölçeği'ni tekrar açın.
- Mm ortalama vücut boyutunu elde etmek için üç görüntünün her birinde belirlenen uzunluğun ortalamasını alın.
Representative Results
Bacak segmentasyonu, izleme ve veri işlemesonrasında, FLLIT otomatik olarak vücut ve her bacak pençe pozisyonları, 20 yürüyüş parametreleri, 5 çizimler ve izlenen bir video(Tablo 1)pozisyonları için ham veri üretir.
Burada bu analizleri Spinocerebellar ataksi 3 (SCA3) sinek modeli ile gösteriyoruz. Pan-nöronal sürücü Elav-GAL4 polyQ yolu (UAS-SCA3-flQ27) 27 glutamin ile tam uzunlukta wildtype insan SCA3 sürücü için kullanılan (UAS-SCA3-flQ27), ya da tam uzunlukta mutant insan SCA3 poliQ yolu 84 glutaminler ile (UAS-SCA3-flQ84)11. SCA3 vücut veering, düzensiz ayak yerleştirme ve kısa, lurching adımları12,13 (Tablo 2)ile bir ataksik yürüyüş tarafından typified olduğunu. Mutant SCA3 sineklerinin yürüyüşkarakterize ve insan hastaların benzer bir yürüyüş görüntülemek olup olmadığını araştırmak için, biz FLLIT tarafından oluşturulan ilgili yürüyüş parametreleri analiz, yani: vücut dönüşleri sayısı, ayak izi düzenlilik, bacak etki alanı örtüşme ve boyutları, ve bacak adım uzunlukları(Tablo 2).
Biz SCA3-Q84 sinekler daha fazla dönüşler sergiledi bulundu(Şekil 4A,A'),düşük ayak izi düzenlilik tarafından sergilenen düzensiz ayak yerleşimi (AEP14genişletilmiş standart sapmalar ) (Şekil 4B), artan bacak etki alanı örtüşme (Şekil 4C-D), uzunluk ve alan(Şekil 4E,F), ve azalmış adım uzunluğu(Şekil 4G).
FLLIT ayrıca arena merkezli ve vücut merkezli görünümlerde izlenen sinek ve bacakları, vücut yörüngesini ve yön ünü ve her bacağın dikey ve yanal yer değiştirmelerini gösteren bir video oluşturur(Şekil 5). İzlenen videolar, farklı sineklerde bacak hareketlerinin yan yana karşılaştırılmasına olanak tanır. Elav-GAL4>SCA3-flQ27 (Video 1) ve Elav-GAL4>SCA3-flQ84 (Video 2) sineklerinin temsili videoları, Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ27 sineklerine göre(Şekil 5A),düzensiz bir şekilde uçar. farklı boyutlarda kesişen bacak etki alanları, bir lurching göstergesi, ataxic yürüyüş.Figure 5A
Şekil 1. Kayıt istasyonu ve arena kurulumu. (A) ön ve (B) yan görünümlerinden gelen kayıtlar. (C) FLLIT izleme için sinek kayıtları yapmak için kullanılan bir arena örneği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İki sinek aynı anda kayıt sağlayan çift başlı kamera kullanarak sinek yürüyüşü kaydı sırasında aktif pencerenin görünümü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Segmentasyon ve izleme den sonra düğme panelini ve etiketli bacakları gösteren aktif FLLIT penceresi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Yabani tipi (SCA3-flQ27) ve mutant (SCA3-flQ84) SCA3. (A) Vücut yörüngesinde dönüş sayısını ifade eden sineklerin ilgili yürüyüş parametreleri için Temsili FLLIT tarafından oluşturulan veriler. (B) Orta bacak ayak izi düzenliliği vücut uzunluğuna göre normale döndü. (C-C') Her bacağın çapraz bacak etki alanları. (D) Etki alanı bacaklar arasında çakışıyor. (E) Orta bacak etki alanı uzunluğu vücut uzunluğuna göre normale döndü. (F) Orta bacak etki alanı vücut uzunluğu2normalleştirilmiş . (G) Orta bacak adım uzunluğu vücut uzunluğuna göre normale döndü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Temsili FLLIT tarafından oluşturulan videoların anlık görüntüsü. (A) Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ27 ve (B) Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ84 uçar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayın.
Video 1: Pan-nöronal vahşi tip insan tam uzunlukta SCA3(Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ27)ifade eden bir sinek Temsilcisi video. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Video 2: Pan-nöronal mutant insan tam uzunlukta SCA3 ifade eden bir sinek Temsilcisi video (Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ84). Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Ek Şekil 1: VcXSrv için yapılandırmalar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 2: Xquartz için yapılandırma. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 3: Görüş Alanı'nın hesaplanması için gerekli boyutlarla etiketlenmiş resim. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Kategori | Parametre | Açıklama | Dosya/Çizim (varsa) |
| Ham veriler | Gövde pozisyonu | Her çerçevede vücut centroid konumsal koordinatları | CoM.csv'nin ilk iki sütunu |
| Vücut yörüngesi | Vücut ekseninin derece dönüş açısı (y eksenine göre) | CoM.csv üçüncü sütun | |
| Arena merkezli bacak pençesi Pozisyon |
Arena koordinatları dayalı her karede her bacak pençesinin konumsal koordinatları | yörünge.csv | |
| Vücut merkezli bacak pençesi Pozisyon |
Her çerçevedeki her bacak pençesinin konumsal koordinatları arena koordinatları dayalı |
norm_trajectory.csv | |
| Vücut hareketi | Gövde uzunluğu (mm) | Her karede tahmin edilen örnek hayvanın uzunluğu (arka-en baş üzerinde anterior-en pozisyon kanatlarda pozisyon) |
bodylength.csv |
| Anlık vücut hızı (mm/s) |
Örnek hayvanda vücudun anlık hızı (centroid) | BodyVelocity.csv; BodyVelocity.pdf | |
| Vücudun dönüm noktaları Yörünge |
Dönüş noktalarını bulmak için, yörünge Dougl asâASPeucker kullanılarak parça yönünde doğrusal bir eğriye indirgenir algoritma, bir tornalama olayının iki komşu arasında bir açı içeren olarak tanımlanmasını takiben > 50 deg basitleştirilmiş yörüngeyi oluşturan doğrusal segmentler |
BodyTrajectory.pdf | |
| Bireysel adım parametreleri | Adım süresi (ms) | Bir adım etkinliğinin süresi | StrideParametreler.csv |
| Adım dönemi (ms) | Bir adım olayından diğerine süre | ||
| Adım deplasmanı (mm) | Bir adım olay sırasında bacak pençe deplasman | ||
| Kapalı adım yolu (mm) | Bir adım olay sırasında bacak pençesi ile kaplı toplam yol | ||
| Anterior aşırı pozisyon (mm) |
Bir adım olayın sonunda bir bacak pençesinin iniş pozisyonu (gövdeye göre) | ||
| Posterior aşırı konum (mm) | Bir adım etkinliğinin başlangıcında bacak pençesinin kalkış pozisyonu (vücuda göre) | ||
| Adım genliği (mm) | Bir adım olayı için hareket yönünde yer değiştirme | ||
| Duruş doğrusallığı (mm) | (20ms aralıklarla) üzerinde düzgünleştirilmiş bir eğriden adım yolunun sapması olarak tanımlanan ve adım arka aşırı pozisyonlar |
||
| Adım gerilmesi (mm) | Bir adım olayın ortasında vücut merkezinden bacak pençe pozisyonu mesafesi | ||
| Bacak hareketi | Bacak hızı (mm/s) | Her bacağın anlık hızı | LegSpeed.csv; Yürüyüş.pdf |
| Yürüyüş dizini | Bu, hareket sırasında (altı ayaklı) örnek hayvan tarafından sergilenen yürüyüş koordinasyonu türünü ölçer. Bir yürüyüş 1 indeksi bir tripod yürüyüşüne karşılık gelir, _1 tetrapod yürüyüşüne karşılık gelirken 0 kanonik olmayan bir yürüyüş oluşturur. Uygulamamızda, yürüyüş indeksi 120 ms pencere üzerinde hareketli bir ortalama ile elde edilir |
GaitIndex.csv; GaitIndex.pdf | |
| Hareket yüzdesi | Bir bacağın hareket halinde olduğu süre yüzdesi | LegParameters.csv | |
| Ortalama adım dönemi (ms) | Bir adım etkinliğinden diğerine ortalama süre | LegParameters.csv | |
| Ayak izi düzenliliği (mm) | Posterior ve standart sapmaları olarak ölçülen | LegParameters.csv | |
| bir bacağın ön aşırı pozisyonları | |||
| Bacak yörünge etki alanı (mm2) |
Referans vücut merkezli çerçeve içinde tüm bacak yörüngesini içeren minimal konveks gövde alanı | LegParameters.csv; LegDomain.pdf | |
| Uzunluk ve genişlik bacak yörünge etki alanı (mm) |
Pençe pozisyonlarının öngörülen maksimum uzaklığı ile elde edilen büyük (etki alanı uzunluğu) ve minör (etki alanı genişliği) ana eksenleri |
LegParameters.csv | |
| Bacak etki alanı kesişim/çakışma (mm2) |
Her olası arasında kesişim/çakışma | BacakDomainOverlap.csv | |
| Duruş genişliği (mm) | Sol ve orta bacakların AEP ve PEP arasındaki mesafenin ortalaması | Duruş Genişliği.csv |
Tablo 1: FLLIT tarafından oluşturulan yürüyüş parametreleri.
| Yürüyüş özelliği | ||||
| Spinocerebellar ataksi 3 (SCA3) yürüyüş özellikleri | Veering | Düzensiz ayak yerleşimi ve bacak üzerinden geçiş | Lurching adımları | Kısa adımlar |
| Ölçüm Parametresi | Gövde dönüş olaylarının sayısı | Ayak izi düzenliliği | Bacak etki alanlarının boyutu, etki alanının çakışma derecesi | Adım uzunluğu |
| FLLIT Dosyası | BodyTrajectory.pdf | LegParameters.csv | BacakDomainOverlap.csv | StrideParametreler.csv |
Tablo 2: İnsan hastalarda sca3 yürüyüş özelliklerini ilgili FLLIT parametreleri ve çıktı dosyaları ile gösteren tablo.
Discussion
Bu el yazmasında, biz ayrıntılı olarak FLLIT, otomatik bir makine öğrenme programı1kullanarak ilgili adımları açıklamak , serbestçe Drosophilayürüyüş analiz etmek . İzleme ve veri analizinden sonra, FLLIT otomatik olarak vücut ve bacak pençeleri konumsal bilgi için ham veri üretir, yirmi gövde ve yürüyüş özellikleri yanı sıra yürüyüş görselleştirme sağlamak için izlenen sinek bir video üreten.
Drosophila ve diğer hayvanların bacak hareketi izleme için yöntemler bir dizi şimdi vardır1,2,3,4,14,1515,16, araştırmacılar deney hedeflerine bağlı olarak seçenekleri geniş bir yelpazede vererek. Bunlardan bazıları son derece doğru ama algılama yüzeyi 4 ile sadece pençe temas noktaları rapor ayak baskı tabanlı yaklaşımlar vardır4,14. Öte yandan, son derin öğrenme yaklaşımları2,3,16 son derece çok yönlüdür, herhangi bir hayvanbacak eklemleri ve diğer vücut parçalarının izlenmesi gerektiren davranışların analizi sağlayan, algoritmalar ilk kullanıcı açıklamalı veri setleri ile eğitilmesi gerektiğini uyarı ile. Yaklaşım üçüncü bir tür pençe pozisyonları tanımlamak için her bacak anahat bulmak için morfoloji veya görüntü kontrast tabanlı yöntemler1,15,17 kullanır. Genel olarak, bu yöntemler bacakların çapraz olduğu davranışlarla kötü bir şekilde ilgilidir (örn. tımar sırasında). FLLIT, bacak segmentasyonu için bir artırıcı algoritma eğitmek için morfolojik parametreleri kullanarak ikinci ve üçüncü yaklaşımları birleştirir. Bu, FLLIT'nin, makine öğrenimini kullanarak doğruluğu artırırken, eğitim veri kümesini oluşturmak için kullanıcı ek açıklamalarının zahmetli görevini atlamasına olanak tanır. FLLIT'de yapılacak iyileştirmeler, daha karmaşık davranışların analizine olanak sağlamak için bacakların çapraz geçtiği örneklerle uğraşmak zorunda kalacaktır.
FLLIT aydınlatma, kayıt çözünürlüğü ve kare hızı1hafif değişikliklere dayanıklıdır. Ancak, kaydedilen videoların kare hızı 250 fps'nin altına düşmemelidir ve FLLIT 1000 fps hızında kaydedilen videolar için en iyi şekilde çalışır. Görüntülerde hareket bulanıklığı varsa, ki bu bir insan ek açıklamacısının bacak pozisyonunu belirlemesi zorlaşıyorsa, FLLIT bu karelerde bacak uçlarını doğru bir şekilde tanımlayamayacaktır. Bunun ışığında, kameranın bacak uçlarına keskin bir şekilde odaklanması şarttır. Segmentasyon yapıtlarını önlemek için, arena iyice temizlenmeli ve kayıt sırasında taşınmamalıdır. Doğru arka plan çıkarma ve temiz segmentasyon için, sinek kayıt sırasında en az bir gövde uzunluğu hareket etmelidir, duraklatma olmadan. Otomatik segmentasyon ve tüm bacakların etiketleme takip sonra kontrol edilmelidir. Sinek yürüyüşü yanlış izlenmezse veya izlenmezse, dosya El Ile İzLe seçeneğini (adım 5.2.7 – 5.2.10) kullanılarak el ile yeniden izlenmelidir.
Nörodejeneratif hastalıklar ve hareket bozuklukları yaşlanan toplumlarımızda giderek daha sık görülür. Nörodejenerasyon Fly modelleri fazla 2 00yıldır çalışılmıştır, sırasında gelişmeler hastalık patofizyolojisi moleküler ve hücresel yönleri ile ilgili yapılmıştır. Ancak, hastalığın belirli davranışsal sonuçlarını değerlendirmek teknik olarak zor olmuştur. Örneğin, sinek titreme hareketleri raporları yapılmış olsa da18,19, Bu sayısal yakınzamanakadar incelenmemişti 1 . Tırmanma tsay yararlı ve nicel, henüz nispeten kaba ölçmekolmuştur 6. Bu teknik açık da benzer şekilde diğer hayvan modellerinde yüksek çözünürlüklü hareket analizini engellemiştir. Davranış analizi için yeni araçların gelişi, dolayısıyla, araştırmacılar ın nöromüsküler hastalıkların moleküler ve hücresel mekanizmaları hayvan modellerinde belirli davranışsal sonuçlara yol nasıl çalışma sağlamak için hareket bozuklukları alanında gençleştirmek için söz verdi. Bu yazıda ve önceki çalışmamızda1, biz SCA3 modelleri hiperkinetik ataksik yürüyüş sergileyen uçan FLLIT kullanarak gösterdi, PD sinek modelleri bir hipokinetik sert yürüyüş sergilerken, ilgili insan hastalıklarının hareket işaretleri özetleyen1. Yürüyüş analizi ayrıca spesifik hareket bozukluklarının altında yatan farklı nöronal popülasyonları belirlememizi sağladı. İleriye dönük olarak, ayrıntılı hareket analizi, sinek mevcut güçlü görüntüleme ve fonksiyonel araçlar ile birlikte, bize lokomotor disfonksiyon mekanizmaları içine yeni bir fikir elde etmek için izin verecektir, devre mekanizmaları ile ilgili nörodejeneratif hastalıklar anlayışımızı aydınlatan.
FLLIT yaygın olarak diğer küçük eklembacaklılar yürüyüş çalışması için geçerli olmalıdır, daha önce örümcek bacakhareketleriizlemek için son derece doğru olduğu gösterilmiştir 1 . Burada patojenik yürüyüş ve altta yatan devreleri ölçmek için ayrıntılı hareket fenotiplerinin kullanımına odaklanırken, hareket takibindeki ilerlemeler zaten devrim yaratmış ve normal yürüyüş koordinasyonu ve yürüyüş ve onun altında yatan devreler üzerinde, özellikle evrim ağacının sayısız farklı dallarında, üzerinde sürekli bir etki yaratacaktır.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar teknik destek için Moumita Chatterjee ve Alice Liu teşekkür etmek istiyorum, ve Bloomington Drosophila Stok Merkezi (Indiana, ABD) mevcut Drosophila suşları bu çalışmada kullanılan yapmak için. Bu çalışma Singapur Moleküler ve Hücre Biyolojisi Enstitüsü tarafından desteklenmiştir; Biyoinformatik Enstitüsü, Singapur; Bilim Teknoloji ve Araştırma Ortak Konseyi Örgütü Ajansı (Hibe numarası 15302FG149 SA ve LC için); Singapur Sağlık Bakanlığı Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi (NMRC/TCR/013-NNI/2014 sa), Alberta Üniversitesi (LC'ye başlangıç hibesi) ve Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Discovery Grant (hibe numarası RGPIN-2019-04575-LC) tarafından yönetilen Klinik Araştırma Amiral Gemisi Programı (Parkinson Hastalığı).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic Sheets | Dama | 1.6 mm thickness, Clear sheets | Singapore, Singapore |
| Clear Glass slides | Biomedia | BMH 880101 | Singapore, Singapore |
| High speed camera | Photron | Fastcam MC2.1 | Tokyo, Japan. A shutter speed of 1 msec or faster is ideal to reduce motion blur of captured images |
| Infra Red LED | Any - Generic from hardware store | 940nm Infrared Light Board | Singapore, Singapore |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155-01LS | Irving, Texas, USA |
References
- Wu, S., et al. Fully automated leg tracking of Drosophila neurodegeneration models reveals distinct conserved movement signatures. PLoS Biology. 17 (6), 3000346 (2019).
- Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neuroscience. 19, 1281-1289 (2018).
- Pereira, T. D., et al. Fast animal pose estimation using deep neural networks. Nature Methods. 16 (1), 117-125 (2019).
- Machado, A. S., Darmohray, D. M., Fayad, J., Marques, H. G., Carey, M. R. A quantitative framework for whole-body coordination reveals specific deficits in freely walking ataxic mice. eLife. 4, (2015).
- Lu, B., Vogel, H.
- McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an In Vivo Model for Human Neurodegenerative Disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
- Dionne, H., Hibbard, K., Cavallaro, A., Kao, J. -C., Rubin, G. M. Genetic reagents for making split-GAL4 lines in Drosophila. bioRxiv. , (2017).
- Cande, J., et al. Optogenetic dissection of descending behavioral control in Drosophila. eLife. 7, (2018).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (22), 2967-2976 (2015).
- Xie, T., et al. A Genetic Toolkit for Dissecting Dopamine Circuit Function in Drosophila. Cell Reports. 23 (2), 652-665 (2018).
- Warrick, J. M., et al. Ataxin-3 suppresses polyglutamine neurodegeneration in Drosophila by a ubiquitin-associated mechanism. Molecular Cell. 18 (1), 37-48 (2005).
- Ebersbach, G., et al. Comparative analysis of gait in Parkinson's disease, cerebellar ataxia and subcortical arteriosclerotic encephalopathy. Brain. 122 (7), 1349-1355 (1999).
- Stolze, H., et al. Typical features of cerebellar ataxic gait. Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry. 73 (3), 310-312 (2002).
- Mendes, C. S., Bartos, I., Akay, T., Marka, S., Mann, R. S. Quantification of gait parameters in freely walking wild type and sensory deprived Drosophila melanogaster. eLife. 2, 00231 (2013).
- DeAngelis, B. D., Zavatone-Veth, J. A., Clark, D. A. The manifold structure of limb coordination in walking Drosophila. eLife. 8, (2019).
- Gunel, S., et al. DeepFly3D, a deep learning-based approach for 3D limb and appendage tracking in tethered, adult Drosophila. eLife. 8, (2019).
- Isakov, A., et al. Recovery of locomotion after injury in Drosophila melanogaster depends on proprioception. The Journal of Experimental Biology. 219, Pt 11 1760-1771 (2016).
- Aw, S. S., Lim, I. K. H., Tang, M. X. M., Cohen, S. M. A Glio-Protective Role of mir-263a by Tuning Sensitivity to Glutamate. Cell Reports. 19 (9), 1783-1793 (2017).
- Eberl, D. F., Duyk, G. M., Perrimon, N. A genetic screen for mutations that disrupt an auditory response in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14837-14842 (1997).
