Summary
Vi beskriver detaljerade protokoll för att använda FLLIT, en helt automatiserad maskininlärningsmetod för benklo rörelse spårning i fritt rörliga Drosophila melanogaster och andra insekter. Dessa protokoll kan användas för att kvantitativt mäta subtila gångrörelser i vilda typflugor, muterade flugor och flugamodeller av neurodegeneration.
Abstract
Drosophila-modellen har varit ovärderlig för studier av neurologisk funktion och för att förstå de molekylära och cellulära mekanismer som ligger till grund för neurodegeneration. Medan flyga tekniker för manipulation och studier av neuronala undergrupper har blivit alltmer sofistikerade, har rikedomen i de resulterande beteendefenotyper inte fångats på en liknande detalj. För att kunna studera subtila fly benrörelser för jämförelse mellan mutanter kräver förmågan att automatiskt mäta och kvantifiera snabba och snabba benrörelser. Därför utvecklade vi en maskininlärningsalgoritm för automatiserad benklospårning i fritt gångflugor, Feature Learning-based Limb segmentation and Tracking (FLLIT). Till skillnad från de flesta djupinlärningsmetoder är FLLIT helt automatiserat och genererar sina egna träningsuppsättningar utan att behöva använda sig av användarinteckningar, med hjälp av morfologiska parametrar som är inbyggda i inlärningsalgoritmen. I den här artikeln beskrivs ett djupgående protokoll för att utföra gånganalys med FLLIT. Den beskriver förfarandena för kamera setup, arena konstruktion, videoinspelning, ben segmentering och ben klo spårning. Det ger också en översikt över de data som produceras av FLLIT, som inkluderar rå spåras kropp och ben positioner i varje video ram, 20 gång parametrar, 5 tomter och en spårad video. För att demonstrera användningen av FLLIT kvantifierar vi relevanta sjuka gångparametrar i en flugamodell av Spinocerebellar ataxi 3.
Introduction
Under de senaste decennierna har neurodegenerativa sjukdomar och rörelsestörningar blivit vanligare i våra åldrande populationer. Även om vår förståelse av många neurodegenerativa sjukdomar har avancerat på molekylär och cellulär nivå, grundläggande funktioner i de drabbade neuronala kretsar underliggande sjukdomen fortfarande dåligt förstås. Nyligen utvecklade beteendemässiga spårningsverktyg1,2,3,4 tillåter oss nu att studera rörelse avvikelser i djursjukdom modeller för att identifiera molekylära, cellulära och krets dysregulation underliggande sjukdom.
Molekylära vägar som är involverade i många neurodegenerativa sjukdomar bevaras i fruktflugan Drosophila melanogaster, och Drosophila sjukdomsmodeller har bidragit till att belysa grundläggande mekanismer som ligger till grund för neurodegeneration5,6. Vi visade nyligen att flyga modeller av Parkinsons sjukdom (PD) och Spinocerebellar ataxi 3 (SCA3) uppvisar distinkta, bevarade gång signaturer som liknar de av de respektive mänskliga sjukdomar1, visar att flugan modellen kan användas för att förstå krets mekanismer underliggande rörelse dysfunktion i specifika rörelsestörningar. De rika och ständigt växande arsenal av verktyg i flugan modell för riktad manipulation och visualisering av nervceller på den enda genen och encellig nivå7,8,9,10 gör flugan en idealisk modell en att sondera förhållandet mellan sjukdomen vägar, neuronala kretsar och beteendemässiga fenotypiska manifestation in vivo. För att möjliggöra exakt, automatiserad insektsgång analys, vi nyligen utvecklat en maskininlärningsmetod, Feature Ltjäna-baserade LImb segmentering och Tracking (FLLIT)1.
FLLIT består av en helt automatiserad flerstegsalgoritm som först segmenterar benpixlarna, som sedan används för att lokalisera och spåra motsvarande benklor. FLLIT använder en öka algoritm för segmentering, i motsats till djupinlärning algoritmer som används i senaste arbetet2,3. Det finns vissa likheter med faltning neurala nätverk i att för båda ramverken, funktionen utvinning sker automatiskt genom lärande faltningskärnor. Det första steget i FLLIT innebär att använda morfologiska operationer (kant och skeletonization) för att automatiskt generera positiva (pixlar på benen) och negativa (bakgrund eller pixlar på flugkroppen) träningsprover med högt förtroende. Fllit är därför helt automatiserat och kräver inte användarkompederade utbildningsprover. Med hjälp av ovanstående träningsprover tränas en klassificerare sedan inom ramen för en ökande algoritm. En ensemble av svaga klassificerare är iterativt lärt, med varje bestående en uppsättning faltningskärnor för funktionen utvinning och ett beslut träd. Den slutliga learnt classifier används sedan för ben segmentering och kan bättre urskilja svåra regioner / hårda prover bättre än morfologiska operationer, vilket ger en övergripande mycket mer exakt segmentering för spårning1. Från de segmenterade benen hittar vi tipsen och spårar dem med den ungerska algoritmen: genom att matcha tips över ramar så att summan av avståndet som flyttas av varje spets minimeras. FLLIT kan hantera ocklusion fall genom att komma ihåg den senast sett plats (i flyga centrerad koordinater) så att ett ben spets återvinns när det inte längre är under ocklusion.
Vi visade tidigare att FLLIT automatiskt och exakt kan spåra benrörelser och analysera gång i en omärkt, fritt rörlig fluga eller spindel från höghastighetsvideo1; FLLIT bör därför i stort sett vara tillämpligt för benspårning av leddjur. Genom att extrahera maskininlärningsutbildningsuppsättningar med hjälp av morfologiska parametrar tränar FLLIT automatiskt sig själv för att segmentera och spåra insektsben utan behov av mödosam manuell anteckning, vilket krävs för de flesta djupinlärningsmetoder. FLLIT är därför helt automatiserad. Efter bensegmentering och spårning producerar FLLIT automatiskt råspårade kropps- och benpositioner i varje videoram, 20 gångparametrar, 5 ritordningar och en spårad video för gånganalys och visualisering av gångrörelser. Det här protokollet innehåller en steg-för-steg-guide för att använda FLLIT.
Protocol
1. Systeminstallation
- Se till att inspelningsstationen har en höghastighetskamera och en scen över den för att hålla arenakammaren (figur 1). Justera kameran för att spela in på minst 250 bilder per sekund (fps), med en därmed snabb slutartid (i detta fall utförs inspelningen med 1000 fps med en slutartid på 1 ms).
OBS: Kontrollera att videon är lämplig för spårning genom att se till att det finns minimal eller ingen rörelseoskärpa av rörliga ben i alla ramar. Om det rörliga benet är så suddigt att en mänsklig annotator inte kan spåra det, måste kamerans inspelningshastighet och/eller slutartid ökas. - Placera de infraröda LED-lamporna högst upp på scenen med en diffusor (genomskinligt blad) mellan kameran och provet (bild 1A,B).
- Gör inspelningskammaren genom att skära ett 1,6 mm tjockt akrylplåt. I det här experimentet använder du ett synfält på 11 mm x 11 mm. Placera kammaren mellan två glasrutschbanor (bild 1C).
2. Beredning av flugor för inspelning
- Överför flugorna som ska spelas in i en ny matflaska 24 timmar före registrering.
OBS: Använd inte CO2 (används vanligtvis för att söva flugorna vid första samlingen) på flugorna mindre än 24 timmar före inspelning. - Ca 40 min före inspelning, överför flugorna till tomma flaskor och håll på is i 5-7 min.
- Under tiden, torka arenan och klart glas diabilder med vatten och en torka.
OBS: Använd inte etanol för att rengöra kamrarna och rutschbanorna. - Förbered inspelningskammaren. Fäst en av de mikroskopiska glasrutschbanorna under kammaren med tejp.
- När flugorna har sövts på is, överför en fluga i varje kammare med en ren borste.
OBS: Både manliga och kvinnliga flugor kan användas i denna inställning, och så långt det är möjligt bör flugor av båda könen analyseras för att undvika könsspecifik bias. - Säkra kammaren med en annan mikroskopisk glasskiva med tejp (bild 1C).
- Håll de kamrade flugorna i rumstemperatur i 15 - 20 min för acklimatisering.
3. Generering av videor för FLLIT-analys
Det här steget är specifikt för den videokamera som används. I det här fallet används en videokamera som är tillgänglig i kommersiellt tid (se Tabell över material).
- Slå på strömkällan. Vänta tills den gröna lysdioden om ström och den orangea lysdioden för att Ethernet-gränssnittsanslutningen ska stabiliseras. Slå på strömmen till den infraröda lysdioden. Se till att spänningen förblir vid 12,5 V.
- Öppna viewer-programmet på det anslutna datorsystemet.
- Ändra inspelningsbildhastigheten till 1000 fps. Ställ in slutartiden på 1/1000 s (1 ms).
- Placera kammaren med flugan på inspelningsarenan och välj LIVE-knappen. Se till att kameran är fokuserad på benspetsarna när flugan går upprätt på kammarens golv; benspetsarna ska vara i skarpt fokus.
- Klicka på Post (bild 2).
- Spela in flugan som går och se till att:
Flugan gick i en relativt rak bana utan att röra kanten av arenan.
Flugan gick minst tre steg per ben.
Flugan pausar inte under promenaden.
Avståndssten är likvärdig med minst en kroppslängd.
OBS: Att ha bakgrunden subtraheras rent är avgörande för korrekt segmentering. Den automatiserade bakgrundssubtraktionsalgoritmen som används av FLLIT kräver att den avbildade flugan rör sig minst en kroppslängd i fjärran. - Klicka på Rec Done för att stoppa inspelningen (bild 2).
- Beskär videon för att säkerställa att inspelningen endast omfattar en rak promenad i flugan (enligt beskrivningen i steg 3.6).
- Klicka på Spara (bild 2). Spara filerna i formatet ".mraw" eller '.tiff i respektive mappar.
OBS: ".mraw" format ger större flexibilitet att ändra filnamnet (om det behövs) och för lagring av videor jämfört med ".tiff" filformat.
4. Installation av FLLIT-programmet
OBS: Uppdaterade instruktioner finns på: https://github.com/BII-wushuang/FLLIT/blob/master/Compiled/Readme.pdf
- Ladda ner FLLIT på alla operativsystem
- Ladda ner FLLIT från följande Github länk: https://github.com/BII-wushuang/FLLIT/archive/master.zip. Extrahera innehållet i zip-filen.
- Hämta exempeldatauppsättningar från följande Google Drive-länk: https://bit.ly/2EibvNY. Skapa en mapp Data under FLLIT-master/Compiled och placera datauppsättningsmappar i den här datakatalogen.
- Installera FLLIT i Ubuntu
- Navigera till fllit/kompilerad katalog.
- Högerklicka och välj Öppna i Terminal.
- Utfärda följande kommando för att hämta och installera MATLAB-körningsbiblioteken för att $HOME/MCR:
bash MCR_2016a.sh - När installationen av MATLAB-körningsbiblioteken har slutförts utfärdar du följande kommando för att säkerställa att körbara rättigheter tillmäts FLLIT:
chmod +x FLLIT - Öppna en terminal i FLLIT/Kompilerade katalogen och utfärda följande kommando för att köra FLLIT:
bash run_FLLIT.sh $HOME/MCR/v901
- Installera FLLIT i Windows
- För 7 och 10th Home Edition, installera Docker Toolbox på:
(https://github.com/docker/toolbox/releases/download/v19.03.1/DockerToolbox-19.03.1.exe). - För Windows 10 Pro eller Enterprise Edition installerar du Docker Desktop för Windows på: (https://download.docker.com/win/stable/Docker\%20Desktop\%20Installer.exe).
- Om du vill aktivera körning av GUI-program i en Docker-behållare i Windows installerar du först VcXSrV (https://sourceforge.net/projects/vcxsrv). När du startar VcXsrv konfigurerar du inställningarna som i figur S1.
Se till att Docker och VcXsrv körs innan DU startar FLLIT. - Dubbelklicka på FLLIT.bat för att köra FLLIT.
När du kör för första gången tar det lite tid att hämta Docker-avbildningen från Docker Hub.
- För 7 och 10th Home Edition, installera Docker Toolbox på:
- Installera FLLIT i MacOS
- Ladda ner Docker Desktop för MacOS på https://download.docker.com/mac/stable/Docker.dmg
- Installera socat genom att öppna en terminal och utfärda följande kommando:
brygga installera socat - Börja socat med:
socat TCP-LISTEN:6000,reuseaddr,fork UNIX-CLIENT:\"$DISPLAY\" och förneka - Installera XQuartz (https://www.xquartz.org) för att möjliggöra körning av GUI-program i en Docker-behållare på MacOS. Starta XQuartz och ändra inställningarna genom att kontrollera Tillåt anslutningar från nätverksklienter på fliken Säkerhet enligt figur S2.
Se till att Docker, socat och XQuartz alla körs innan du startar FLLIT. - Öppna en terminal i FLLIT/Kompilerad katalog och kör FLLIT med följande kommando:
bash FLLIT_Mac.sh
När du kör för första gången tar det lite tid att hämta Docker-avbildningen från Docker Hub.
5. Köra FLLIT för automatisk benspårning
- Segmentering
- Konvertera videon till enskilda TIFF-filer och kopiera till FLLIT-datamappen.
- Kör FLLIT (I Ubuntu högerklickar du för att öppna FLLIT i Terminal).
- Markera mappen som innehåller TIFF-bilder på bildruta för bildruta för video som ska spåras och klicka på knappen Lägg till.
- I popup-fönstret väljer du 0 endast för att utföra bensegmentering, eller 1 för att inkludera benspårning med bensegmentering.
- Klicka på Klar om du vill initiera segmentering och spårning av den valda videon.
- Spårning
- Om du vill kontrollera riktigheten i spårningen och utföra eventuella felkorrigeringar (om någon) klickar du på Välj datamapp. Markera mappen som ska spåras och klicka på Öppna.
- Klicka på Visa spårning.
Kontrollera att visningsläget förblir markerat när du visar de spårade benpositionerna. Annars kommer eventuella tidigare korrigeringar som gjorts att överridas. - Kontrollera märkning för alla ben i den första ramen
OBS: Eftersom benetiketterna är placerade i enlighet med positionen på skärmen, är flugans högra sida märkt som R1 (framben), R3 (bakben), L3 (bakben) och flugans vänstra sida märkt som R1 (framben), R2 (mitten av benet), R3 (bakben), respektive (figur 3). Om flugan går upp och ner på benetiketterna kommer att kommenteras korrekt. - Om ett ben är felaktigt märkt och en korrigering krävs klickar du på Pausa visning, följt av Justera förutsägelse (bild 3).
- Välj det ben som kräver korrigering från den högra panelen med huvudet på Leg för att justera.
- Dubbelklicka på rätt position för detta ben i bildfönstret, klicka på Sparaoch avslutasedan . Om du vill gå till föregående bildruta eller efterföljande bildruta klickar du på Pausa visning följt av knapparna framåt och bakåt och I> (Bild 3).
- Om du vill korrigera felaktiga spårade videor öppnar du mappen Data för videon som ska spåras igen och väljer Manuellt initiera spårning.
- Klicka på knappen Spårning, som sedan ändrar etiketten till Initial.
- Klicka på Justera förutsägelse och korrigera benetiketterna genom att dubbelklicka på varje benspets och sedan tilldela den med rätt benetikett. Klicka på Spara och avsluta.
- Klicka på Återuppta för att initiera spårning.
- Databehandling och videogenerering
- Klicka på Data Process. I popup-fönstret skriver du in antalet bildrutor per sekund (fps) där videorna spelades in (t.ex. 1 000 fps).
- Använd följande ekvation för att beräkna det faktiska synfältet för den infångade videon så att gångparametrar kan mätas i millimeter:
Obs: Om den faktiska kammarens storlek är 7 mm, är bredden på bildramen 137 mm, bredden på kammaren i bildramen på datorskärmen är 81 mm och bredden på synfältet var 11,83 mm (figur S3). - Om du vill se spårningsresultaten går du till mappen Spårning under mappen Resultat.
- Om du vill generera en video av den spårade flugan väljer du Gör video. Videon sparas i samma resultatmapp som för de ursprungliga videodata som analyseras.
Videons startbildrutor (första) och (sista) kan väljas.
- Normalisering till kroppslängd för varje fluga.
OBS: Eftersom varje fluga kan vara något annorlunda i storlek, bör vissa gångparametrar normaliseras till varje flugs kroppslängd för att underlätta jämförelser (t.ex. kan steglängden vara längre i större flugor och kortare i mindre flugor).- Öppna tre stillbilder från videon av varje fluga (vanligtvis första, mellersta och sista bildrutor) med hjälp av bildprogramvara.
- Förstora varje bildram till 800% och märk huvudets främre mest pixel och de bakre mest pixlarna i buken vid mittlinjen med hjälp av en ljus färg (t.ex. gul).
- Öppna de märkta bilderna i ImageJ.
- Använd Ange skala för att mata in vågen därefter: Ange avstånd i pixlar: 512; Känt avstånd: Verkligt synfält (mm) mätt i steg 5.3.2. Längdenhet: mm.
- Rita en rak linje mellan det märkta huvudet och bukspetspixlarna för att få kroppslängden.
- Öppna Ställ skala igen för att erhålla värdet på ett känt avstånd, vilket är kroppslängden i mm.
- Ta ett genomsnitt av längden bestäms i var och en av de tre bilderna för att få den genomsnittliga kroppsstorleken i mm.
Representative Results
Efter bensegmentering, spårning och databehandling genererar FLLIT automatiskt rådata för kroppens och varje benklos positioner, 20 gångparametrar, 5 tomter och en spårad video (tabell 1).
Här demonstrerar vi dessa analyser med hjälp av en flugamodell av Spinocerebellar ataxi 3 (SCA3). Pan-neuronal föraren Elav-GAL4 användes för att köra antingen fullängds wildtype mänskliga SCA3 med 27 glutaminer i polyQ-tarmkanalen (UAS-SCA3-flQ27), eller en fullängds mutant människa SCA3 med 84 glutaminer i polyQ-tarmkanalen (UAS-SCA3-flQ84)11. SCA3 kännetecknas av en ataxisk gång med kroppsvrå, oregelbunden fotplacering och korta, lurching steg12,13 ( tabell2). För att karakterisera gång av muterade SCA3 flugor och undersöka om de visar en liknande gång som mänskliga patienter, analyserade vi relevanta gångparametrar som genereras av FLLIT, nämligen: Antal kroppsvarv, fotavtryck regelbundenhet, ben domän överlappning och storlekar, och ben steg längder (Tabell 2).
Vi fann att SCA3-Q84 flugor uppvisade fler svängar(Figur 4A, A'), oregelbunden fotplacering som uppvisas av låg fotavtryck regelbundenhet (förstorade standardavvikelser av AEP14) (Figur 4B), ökad ben domän överlappning ( figur4C-D), förstorade ben domäner i längd och område (figur 4E, F), och minskade steglängd ( figur4G).
FLLIT genererar också en video som visar den spårade flugan och benen i arenacentrerade och kroppscentrerade vyer, kroppsbana och riktning samt vertikala och laterala förskjutningar av varje ben (figur 5). De spårade videorna tillåter jämförelse sida vid sida av benrörelser i olika flugor. Representativa videor av Elav-GAL4>SCA3-flQ27 (Video 1) och Elav-GAL4>SCA3-flQ84 (Video 2) flugor visar att jämfört med Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ27 flugor (figur 5A), Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ84 flugor(figur 5B)uppvisar oregelbunden, skär ben domäner av olika storlekar, vilket tyder på en lurching, attaxa gång.
Bild 1. Inställning av inspelningsstationen och arenan. Inspelningar från(A)fram- och(B)sidovyer. (C)Ett exempel på en arena som används för att göra flyginspelningar för FLLIT-spårning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Vy över det aktiva fönstret under flyga gång inspelning med hjälp av en dubbel huvud kamera, vilket möjliggör samtidig inspelning av två flugor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Aktivt FLLIT-fönster som visar knapppanelen och märkta ben efter segmentering och spårning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Representativa FLLIT-genererade data för relevanta gångparametrar för flugor som uttrycker vildtyp (SCA3-flQ27) vs. mutant (SCA3-flQ84) SCA3. (A) Antal varv i karossbanan. (B)Mid-leg fotavtryck regelbundenhet normaliserad till kroppslängd. (C-C". Korsade bendomäner för varje ben. (D)Domänöverlappning mellan benen. (E)Mid-leg domän längd normaliserad till kroppslängd. F)Domänområde i mitten av benet normaliserat till kroppslängd2. (G)Steglängd mellan benen normaliserad till kroppslängd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 5: Ögonblicksbild av representativa FLLIT-genererade videor. (A) Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ27 och (B) Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ84 flugor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: Representativ video av en fluga som uttrycker pan-neuronal wild-type human full-length SCA3 (Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ27). Klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video 2: Representativ video av en fluga som uttrycker pan-neuronal mutant människa fullängds SCA3 (Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ84). Klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ner.)
Tilläggsfigur 1: Konfigurationer för VcXSrv. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 2: Konfiguration för Xquartz. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 3: Bild märkt med de dimensioner som behövs för beräkning av synfält. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Kategori | Parametrar | Beskrivning | Arkiv/tomt (om tillämpligt) |
| Rådata | Kroppsposition | Karossens karossens positionella koordinater i varje ram | De två första kolumnerna i CoM.csv |
| Kroppsbana | Rotationsvinkel för karossaxeln i grader (i förhållande till y-axeln) | Tredje kolumnen i CoM.csv | |
| Arenacentrerad benklo Positioner |
Positionella koordinater för varje benklo i varje ram baserat på arenakoordinater | trajectory.csv (på väg tillbaka) | |
| Kroppscentrerad benklo Positioner |
Positionella koordinater för varje benklo i varje ram baserat på arenakoordinater |
norm_trajectory.csv | |
| Kroppsrörelse | Kroppslängd (mm) | Längden på det provdjur som uppskattas i varje ram (den främre mest position på huvudet till den bakre position på vingarna) |
bodylength.csv |
| Momentan kroppshastighet (mm/s) |
Momentan hastighet av kroppen (centroid) i provet djuret | BodyVelocity.csv; BodyVelocity.pdf | |
| Vändpunkter i kroppen Bana |
För att lokalisera vändpunkterna reduceras banan till en bitvis linjär kurva med Dougl asâASPeucker algoritm, varefter en svarvhändelse identifieras som en vinkel > 50°mellan två angränsande linjära segment som utgör den förenklade banan |
BodyTrajectory.pdf | |
| Individuella stegparametrar | Strid varaktighet (ms) | Varaktigheten av en steghändelse | StrideParameters.csv |
| Stegperiod (ms) | Varaktigheten från ett steg händelse till nästa | ||
| Stegförskjutning (mm) | Förskjutning av benklo under ett steg händelse | ||
| Stegbana täckt (mm) | Total väg som täcks av benklotet under ett steg händelse | ||
| Främre extrem position (mm) |
Landningsposition (i förhållande till kroppen) på en benklo i slutet av ett steg händelse | ||
| Bakre extrem position (mm) | Startposition (i förhållande till kroppen) på en benklo i början av ett steg händelse | ||
| Stride amplitud (mm) | Förskjutning längs rörelseriktningen för ett steg händelse | ||
| Hållning linjäritet (mm) | Definieras som avvikelsen för stegbanan från en kurva utjämnad över (med 20ms intervall) motsvarande främre och bakre extrema positioner av steget |
||
| Stegsträcka (mm) | Avstånd från benklopositionen från karossens centrum mitt i en steghändelse | ||
| Ben rörelse | Benhastighet (mm/s) | Den momentana hastigheten på varje ben | LegSpeed.csv; Gång.pdf |
| Gångindex | Detta mäter den typ av gångsamordning som det (sexbentade) provdjuret uppvisar under dess rörelse. En gång index på 1 motsvarar ett stativ gång, _1 motsvarar en tetrapod gång medan 0 utgör en icke-kanonisk gång. I vårt genomförande erhålls gångindexet med ett glidande medelvärde över ett fönster på 120 ms |
GaitIndex.csv; GaitIndex.pdf | |
| Rörelseprocent | Procentandel av tiden som ett ben är i rörelse | LegParameters.csv | |
| Genomsnittlig stegperiod (ms) | Genomsnittlig varaktighet från en steghändelse till nästa | LegParameters.csv | |
| Fotavtryck regelbundenhet (mm) | Mätt som standardavvikelser för den bakre och | LegParameters.csv | |
| främre extrema positioner i ett ben | |||
| Domänområde för benbana (mm2) |
Området för det minimala konvexa skrovet som innehåller hela benbanan i den kroppscentrerade referensramen | LegParameters.csv; LegDomain.pdf | |
| Längd och bredd på ben bana domän (mm) |
Erhålls via det maximala beräknade avståndet för klopositionerna på större (domänlängd) och mindre (domänbredd) huvudaxlar |
LegParameters.csv | |
| Skärningspunkten/överlappning av bendomäner (mm2) |
Skärningspunkten/överlappningen mellan varje möjlig | LegDomainOverlap.csv | |
| Hållningsbredd (mm) | Medelvärdet av avståndet mellan AEP och PEP på vänster och mellersta ben | StanceWidth.csv |
Tabell 1: Gångparametrar som genereras av FLLIT.
| Gångfunktion | ||||
| Gång funktioner i Spinocerebellar ataxi 3 (SCA3) | Svängning | Oregelbunden fotplacering och benpassage över | Lurching steg | Korta steg |
| Mätparameter | Antal händelser för kroppsvändningar | Fotavtryck regelbundenhet | Storleken på bendomäner, graden av domänöverlappning | Steglängd |
| FLLIT-fil | BodyTrajectory.pdf | LegParameters.csv | LegDomainOverlap.csv | StrideParameters.csv |
Tabell 2: Tabell som visar kännetecknet SCA3 gång funktioner hos mänskliga patienter med motsvarande FLLIT parametrar och utgångsfiler.
Discussion
I detta manuskript beskriver vi i detalj de steg som ingår i att använda FLLIT, ett automatiserat maskininlärningsprogram1, för att analysera gång i fritt gående Drosophila. Efter spårning och dataanalys genererar FLLIT automatiskt rådata för positionsinformationen för kroppen och benklor, producerar tjugo kropp och gång funktioner samt en video av spårade flyga för att möjliggöra gångvisualisering.
Det finns nu ett antal metoder för ben rörelse spårning av Drosophila och andra djur1,2,3,4,,14,15,16, vilket ger forskarna ett brett utbud av alternativ beroende på målen för experimentet. Några av dessa är fotutskriftsbaserade metoder, som är mycket exakta men som endast rapporterar klo kontaktpunkter med detektionsytan4,14. Å andra sidan, senaste djupinlärning metoder2,3,16 är mycket mångsidig, vilket möjliggör analys av beteenden som kräver spårning av ben leder och andra kroppsdelar i alla djur, med förbehållet att algoritmerna måste först utbildas med användaren kommenterade datamängder. En tredje typ av metod använder morfologi eller bild-kontrast-baserade metoder1,15,17 för att hitta konturerna av varje ben för att identifiera klo positioner. I allmänhet behandlar dessa metoder dåligt beteenden där benen korsar över (t.ex. under grooming). FLLIT kombinerar den andra och tredje metoder, med hjälp av morfologiska parametrar för att träna en öka algoritm för ben segmentering. Detta gör fllit att kringgå den mödosamma uppgiften för användaren anteckning för att generera utbildning datauppsättning, samtidigt öka noggrannheten med hjälp av maskininlärning. Framtida förbättringar av FLLIT måste ta itu med fall där benen korsar över, för att möjliggöra analys av mer komplexa beteenden.
FLLIT är robust för små förändringar i belysning, inspelningsupplösning och ramhastighet1. Ramhastigheten för inspelade videor bör dock inte sjunka under 250 fps, och FLLIT körs optimalt för videor som spelats in med 1000 fps. Om det finns rörelseoskärpa i bilderna, så att det är utmanande för en mänsklig annotator att identifiera benet position, FLLIT kommer inte att kunna exakt identifiera ben tips i dessa ramar. Mot bakgrund av detta är det viktigt att kameran fokuseras kraftigt på benspetsarna. För att förhindra segmentering artefakter, bör arenan rengöras noggrant, och bör inte flyttas under inspelningen. För korrekt bakgrund subtraktion och ren segmentering, bör flugan flytta minst en kroppslängd under inspelningen, utan att pausa. Efter automatisk segmentering och spårning märkning av alla ben måste kontrolleras. Om fly-gången inte spåras eller spåras felaktigt ska filen spåras manuellt med alternativet Initiera spårning manuellt (steg 5.2.7 – 5.2.10).
Neurodegenerativa sjukdomar och rörelsestörningar blir allt vanligare i våra åldrande samhällen. Fly modeller av neurodegeneration har studerats i mer än 2 decennier, under vilka framsteg har gjorts när det gäller de molekylära och cellulära aspekterna av sjukdomen patofysiologi. Specifika beteendemässiga konsekvenser av sjukdomen har dock varit tekniskt svåra att bedöma. Till exempel, medan rapporter om darrande rörelser i flugan har gjorts18,19, hade dessa inte kvantitativt studerats förrän nyligen1. Klättringsanalysen har varit en användbar och kvantitativ, men relativt grov åtgärd6. Detta tekniska underskott har på liknande sätt hämmat analys av högupplösningsrörelser i andra djurmodeller. Tillkomsten av nya verktyg för beteendeanalys, därför har lovat att föryngra området rörelsestörningar för att forskare ska kunna studera hur molekylära och cellulära mekanismer för neuromuskulära sjukdomar leder till specifika beteendemässiga resultat i djurmodeller. I detta dokument och i vårt tidigare arbete1,visade vi med FLLIT att flyga modeller av SCA3 uppvisar en hyperkinetisk attaxa gång, medan PD flyga modeller uppvisar en hypokinetisk styv gång, recapitulating rörelse kännetecken för respektive mänskliga sjukdomar1. Gånganalys gjorde det också möjligt för oss att identifiera distinkta neuronala populationer bakom specifika rörelse dysfunktioner. Framöver, detaljerad rörelse analys, i kombination med kraftfulla bildframställning och funktionella verktyg som finns i farten, gör det möjligt för oss att få ny insikt i mekanismer för rörelsedysfunktion, belysa vår förståelse av neurodegenerativa sjukdomar med avseende på kretsmekanismer.
FLLIT bör vara allmänt tillämplig på studiegång i andra små leddjur, eftersom det tidigare visat sig vara mycket exakt för spårning av spindelbensrörelser1. Medan vi fokuserar här på användningen av detaljerad rörelse fenotypning för att kvantifiera patogena gång och dess underliggande kretsar, framsteg i rörelse spårning har redan revolutionerat, och kommer att ha fortsatt inverkan på, förståelsen av normal gång samordning och gång och dess underliggande kretsar, särskilt i otaliga olika grenar av det evolutionära trädet.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Moumita Chatterjee och Alice Liu för tekniskt stöd, och Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana, USA) för att göra tillgängliga Drosophila stammar som används i detta arbete. Detta arbete stöddes av Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore; Bioinformatics Institute, Singapore; Byrån för vetenskapsteknik och forskningssambandsorganisation (anslag nr 15302FG149 till SA och LC). Det kliniska forskningsflaggprogrammet (Parkinsons sjukdom) som administreras av Singapore Ministry of Health's National Medical Research Council (bidragsnummer NMRC/TCR/013-NNI/2014 till SA), University of Alberta (startbidrag till LC) och Science Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grant (bidragsnummer RGPIN-2019-04575 till LC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic Sheets | Dama | 1.6 mm thickness, Clear sheets | Singapore, Singapore |
| Clear Glass slides | Biomedia | BMH 880101 | Singapore, Singapore |
| High speed camera | Photron | Fastcam MC2.1 | Tokyo, Japan. A shutter speed of 1 msec or faster is ideal to reduce motion blur of captured images |
| Infra Red LED | Any - Generic from hardware store | 940nm Infrared Light Board | Singapore, Singapore |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155-01LS | Irving, Texas, USA |
References
- Wu, S., et al. Fully automated leg tracking of Drosophila neurodegeneration models reveals distinct conserved movement signatures. PLoS Biology. 17 (6), 3000346 (2019).
- Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neuroscience. 19, 1281-1289 (2018).
- Pereira, T. D., et al. Fast animal pose estimation using deep neural networks. Nature Methods. 16 (1), 117-125 (2019).
- Machado, A. S., Darmohray, D. M., Fayad, J., Marques, H. G., Carey, M. R. A quantitative framework for whole-body coordination reveals specific deficits in freely walking ataxic mice. eLife. 4, (2015).
- Lu, B., Vogel, H.
- McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an In Vivo Model for Human Neurodegenerative Disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
- Dionne, H., Hibbard, K., Cavallaro, A., Kao, J. -C., Rubin, G. M. Genetic reagents for making split-GAL4 lines in Drosophila. bioRxiv. , (2017).
- Cande, J., et al. Optogenetic dissection of descending behavioral control in Drosophila. eLife. 7, (2018).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (22), 2967-2976 (2015).
- Xie, T., et al. A Genetic Toolkit for Dissecting Dopamine Circuit Function in Drosophila. Cell Reports. 23 (2), 652-665 (2018).
- Warrick, J. M., et al. Ataxin-3 suppresses polyglutamine neurodegeneration in Drosophila by a ubiquitin-associated mechanism. Molecular Cell. 18 (1), 37-48 (2005).
- Ebersbach, G., et al. Comparative analysis of gait in Parkinson's disease, cerebellar ataxia and subcortical arteriosclerotic encephalopathy. Brain. 122 (7), 1349-1355 (1999).
- Stolze, H., et al. Typical features of cerebellar ataxic gait. Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry. 73 (3), 310-312 (2002).
- Mendes, C. S., Bartos, I., Akay, T., Marka, S., Mann, R. S. Quantification of gait parameters in freely walking wild type and sensory deprived Drosophila melanogaster. eLife. 2, 00231 (2013).
- DeAngelis, B. D., Zavatone-Veth, J. A., Clark, D. A. The manifold structure of limb coordination in walking Drosophila. eLife. 8, (2019).
- Gunel, S., et al. DeepFly3D, a deep learning-based approach for 3D limb and appendage tracking in tethered, adult Drosophila. eLife. 8, (2019).
- Isakov, A., et al. Recovery of locomotion after injury in Drosophila melanogaster depends on proprioception. The Journal of Experimental Biology. 219, Pt 11 1760-1771 (2016).
- Aw, S. S., Lim, I. K. H., Tang, M. X. M., Cohen, S. M. A Glio-Protective Role of mir-263a by Tuning Sensitivity to Glutamate. Cell Reports. 19 (9), 1783-1793 (2017).
- Eberl, D. F., Duyk, G. M., Perrimon, N. A genetic screen for mutations that disrupt an auditory response in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14837-14842 (1997).
