Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

שיטות מתוקננת למדידת אינדוקציה של תגובת הלם חום באלבורבדיוטיס

Published: July 3, 2020 doi: 10.3791/61030
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical and Chemical Engineering and Sciences, Florida Institute of Technology

Summary

כאן, פרוטוקולים מתוקננת מוצגים כדי להעריך את האינדוקציה של תגובת הלם חום (HSR) בתוך האלגיה Caenorditis באמצעות RT-qpcr ברמה המולקולרית, כתבים פלורסנט ברמה התאית, ו thermorecovery אוד ברמה ארגונית.

Abstract

תגובת הלם חום (HSR) היא תגובה לחץ הסלולר הנגרמת על ידי מעוות חלבון ציטוסולג כי פונקציות כדי לשחזר חלבון קיפול הומאוסטזיס, או פרוטאוסטזיס. המחוז המרכזי תופס נישה ייחודית ורבת עוצמה למחקר hsr משום שניתן להעריך את hsr ברמות המולקולריות, הסלולר והאורגמטיות. לכן, שינויים ברמה המולקולרית יכולים להיות מדמיינו ברמה התאית וההשפעות שלהם על הפיזיולוגיה ניתן לכמת ברמה ארגונית. בעוד שהוא אומר למדידת HSR הם פשוטים, וריאציות בעיתוי, טמפרטורה, ומתודולוגיה המתוארת בספרות להפוך אותו מאתגר להשוות את התוצאות על פני הלימודים. יתר על כן, בעיות אלה לשמש מחסום עבור כל מי שמבקש לשלב ניתוח HSR למחקר שלהם. כאן, סדרה של פרוטוקולים מוצגת עבור מדידת אינדוקציה של HSR באופן חזק ומלא לשחזור עם RT-qPCR, כתבים פלורסנט, והוא מאוד שיטת אורגוריאלית. בנוסף, אנו מראים כי שימוש נרחב עמידות לשימוש תרמי אינו תלוי הרגולטור הראשי הוקמה היטב של HSR, HSR-1, ולכן לא צריך לשמש עבור מחקר HSR. לבסוף, וריאציות אלה מספרים שנמצאו בספרות הם דנו ושיטות הטובה ביותר מוצעות כדי לסייע לתקנן את התוצאות ברחבי השדה, בסופו של דבר הקלה על מחלות ניווניות, הזדקנות, ו HSR מחקר.

Introduction

תגובת הלם חום (HSR) היא תגובת מתח הסלולר אוניברסלי הנגרמת על ידי מתקפל חלבון ציטוסולג שנגרמו על ידי עליות טמפרטורה ומדגיש פרוטאורעילים אחרים. הפעלת HSR באוניברסיטת Caenorditis מובילה לupregulation של גנים זעזועים חום כגון hsr-70 ו -hsr-16.2. הרבה חלבונים בהלם חום (HSPs) פונקציה כמו המלווים מולקולריים כי לשחזר חלבון קיפול הומאוסטזיס, או פרוטאוסטזיס, על ידי אינטראקציה ישירה עם חלבונים שאינם מקופלים או פגומים. הרגולטור הראשי של HSR הוא גורם שעתוק הלם חום פקטור 1 (HSR-1), אשר ההפעלה שלו נשלטת באלגנטיות באמצעות מנגנונים מרובים1.

התפקיד של HSF-1 אינו מוגבל ללחץ. HSF-1 נדרש עבור צמיחה ופיתוח נורמלי, כמו מחיקה של hsf-1 מוביל זחל מעצר2. HSF-1 חשוב גם במהלך הזדקנות מחלות ניווניות הקשורות לגיל המאופיינת הצטברות של אגרגטים חלבון חוסר יכולת לשמור על פרוטאוסטזיס. נוק של hsf-1 גורם הצטברות של אגרגטים חלבון ותוחלת חיים מקוצר, בעוד הבעות יתר של hsf-1 מפחית את צבירת החלבון ומרחיב את תוחלת החיים3,4. לכן, התקנה של HSF-1 ברמה המולקולרית יש השלכות נרחבות עבור פיזיולוגיה ומחלות ארגונית.

ג. אלגיה הוא אורגניזם מודל רב-עוצמה עבור מחקר hsr מכיוון שניתן למדוד את hsr ברמות המולקולריות, הסלולר והאורגאממל4,5,6. הדגשת העוצמה של מודל זה, מקדמות מפתח בתיחום מסלול hsr, כגון הבדלים ספציפיים לרקמות ב hsr רגולציה, נתגלו ב -C. אלגיה7,8. יתר על כן, C. אלגיה משמש רבות עבור הזדקנות מחקר היא מערכת המתעוררים עבור דוגמנות מחלות הקשורות הפרעה פרוטאוסטזיס.

למרות שנסיונות התחשמלות עם הג יכולים להיות מהירים ומתכווצים, ישנן מספר שאלות שכדאי לשקול לפני תחילת הפעולה. לדוגמה, באיזו טמפרטורה יש להשתמש עבור אינדוקציה של HSR וכמה זמן יש לחשוף את התולעים? האם עדיף להשתמש באינקובטור יבש או באמבט מים? באיזה שלב התפתחותי יש להשתמש? למרבה הצער, המתודולוגיות המשמשות לחקירת ה-HSR משתנים באופן נרחב מהמעבדה למעבדה, גרימת בלבול בעת בחירת המתודולוגיות הטובות ביותר ומקשה על השוואת התוצאות ברחבי השדה.

אנו מציגים פרוטוקולים חזקים וסטנדרטיים עבור שימוש RT-qPCR, כתבים פלורסנט, ו thermorecovery למדוד את HSR. בעוד ששלושת הגישות הללו משלימות, לכל אחד מהם יתרונות וחסרונות ייחודיים. לדוגמה, RT-qPCR היא המדידה הישירה והכמותית ביותר של HSR, ואת האפשרות הזו ניתן להרחיב בקלות כדי לכלול רבים שונים הלם חום-inducible גנים. עם זאת, RT-qPCR הוא היקר ביותר, יכול להיות קשה טכנית, והוא דורש שימוש בציוד מיוחד. לעומת זאת, כתבים פלורסנט יש את היתרון של מדידת הבדלים ספציפיים לרקמות ב HSR אינדוקציה. עם זאת, הם קשים לכמת במדויק, יכול רק למדוד אינדוקציה מעל לסף מסוים, ולדרוש שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטית. בנוסף, זנים העיתונאי תיאר כאן הם מתעכבת באמצעות פיתוח בהשוואה למתח N2 סטנדרטי. למרות זנים כתבת חדשים המכילים העתק יחיד transgenes זמינים, הם לא נבדקו כאן9. הבחינה השלישית, thermorecovery אוד, יש את היתרון של מתן הבדיקה הרלוונטית מבחינה פיזיולוגית ברמה ארגונית. עם זאת, הספק הזה הוא ללא ספק הרגיש לפחות ועקיף ביותר. בסופו של דבר, אנו דנים כמה וריאציות נפוצות שנמצאו אלה מספר ולהציע סט של שיטות עבודה מומלצות כדי להקל על המחקר בתחום זה.

Protocol

1. אחזקה וסנכרון של ס. אלאנים

  1. לשמור על תולעים ב 20 ° c על הצמיחה Nematode בינונית (NGM) צלחות שנזרע עם OP50 es, חיידק קולי באמצעות העברת מספר מבוגרים לצלחות טריות כ 2x לשבוע10. הטיפול צריך להילקח כדי למנוע מתולעים מפני האוכל, כי זה יכול להשפיע על הפיזיולוגיה שלהם11.
    1. הכנת צלחות NGM.
      1. מערבבים 3 גרם של הנאל, 2.5 גרם של בקטו-פטון, 20 גרם של אגר, ו מושלו (DI) H2O עד 1 L בבקבוקון.
      2. החיטוי התערובת עבור עיקור.
      3. אפשר לתערובת להתקרר עד ~ 50 ° c.
      4. הוסף 25 מ ל של 1 M KH2פו4 (pH = 6), 1 מ ל של 1 m cacl2, 1 מ ל של 1 m mgso4, ו 1 מ ל של כולסטרול (5 מ"ג/mL ב 100% אתנול).
      5. באמצעות טכניקה סטרילית, יוצקים את התערובת לתוך 6 לוחות ס"מ כדי להניב כ 100 צלחות. מזיגת צלחות קלה יותר אם התערובת מועברת לראשונה לגביע סטרילי של 300 מ ל.
      6. אפשר יום אחד לגבש בטמפרטורת החדר (RT) לפני זריעה עם חיידקים או לאחסן ב 4 ° c.
    2. זריעת חיידקים OP50 על צלחות NGM.
      1. לגדל תרבות OP50 בקטריאלי לילה רווי ליברות ב 30 ° צ' או 37 ° c.
      2. מקום כ 300 μL של התרבות על המרכז של לוחית 6 ס"מ NGM.
      3. בואו לוחות יבשים ב-RT עבור 1-3 ימים לפי הצורך עבור הדשא החיידקי לדבוק לצלחת. לאחר מכן ניתן להשתמש בלוחות או לאחסנו ב-4 ° c.
  2. לגדל את התולעים באופן סינכרוני על ידי בידוד ביצים שהונחו טרי (מתוארים כאן) או לחילופין על ידי איסוף ביצים לאחר המסת תולעים עם אקונומיקה.
    1. להעביר כ 10 gravid למבוגרים תולעים לצלחת טרייה באמצעות תיל פלטינה לבחור. סנכרון ביצה עובד הכי טוב אם המבוגרים הם ביום הראשון של הבגרות.
    2. לאחר כ 1 h, להסיר את התולעים מן הצלחת. זה צריך לגרום 40-60 ביצים לכל צלחת, בהתאם לתנאים ואת המתח.

2. הדמיה פלואורסצנטית של כתבים HSR

  1. לסנכרן את התולעים (סעיף 1.2) ולשמור על 20 ° צ' עד לשלב ההתפתחותי הרצוי. עבור AM446 (hsp-70p:: gfp) ו CL2070 (hsp-16.2 p:: gfp) מזנים כתבת פלורסנט, תולעים צעירות למבוגרים שעדיין לא הגיעו לבגרות הרבייה נוצרות 64 h לאחר הסינכרון ביצה הנחת.
    הערה: העיתוי ההתפתחותי משתנה עם כל מאמץ והטמפרטורה בה מורמות התולעים. הזנים של כתבת HSR מציגים עיכוב התפתחותי קל יחסית N2. וחשוב מכך, היקף האינדוקציה של HSR מסרב כ-2-4x לאחר תחילת בגרות הרבייה (ראה דיון).
  2. החום מזעזע את התולעים על ידי עטיפת צלחות עם סרט פרפין ומיזוג באמבט מים מחזורי ב-33 ° c לשעה. רצועה דקה של סרט פרפין צריך להיות עטוף 2x סביב הצלחת לאטום את הקצוות. אין לכסות את קרקעית הצלחת או להפריע להעברת החום. הפוך את הלוחות הפוכים באמצעות מתלה לבדיקה ומשקל עופרת. זכור לכלול דגימת שליטה שלילית (ללא הלם חום) במידת הצורך.
    הערה: אם סרט הפרפין אינו בטוח, אז המים ייכנסו לצלחת ואין להשתמש בצלחת לאיסוף נתונים.
  3. לשחזר את התולעים על ידי הסרת לוחיות מתוך אמבט מים וייבוש עם מגבת נייר. להסיר את הסרט פרפין ו מודתיאת התולעים ב 20 ° c עבור 6-24 h. תקופת ההחלמה הזו מאפשרת זמן מספיק עבור סינתזה GFP וקיפול לפני הדמיה.
  4. הכן שקופיות לדימות. יש להכין שקופיות טריות לכל שימוש.
    1. להפוך את הפתרון 3% התעורר מים וחום באמצעות מיקרוגל עד התפרקה הוא הומס.
    2. מניחים שקופית מיקרוסקופ עבור הדמיה בין שני שקופיות מיקרוסקופ אחרים כי יש רצועה של קלטת מעבדה עליהם כדי ליצור מרווח עבור כרית agarose.
    3. באמצעות הפיפטה 1,000 μL, מניחים טיפה (~ 150 μL) של הצמח 3% מחומם במרכז שקופית המיקרוסקופ.
    4. מיד לכסות את שקופית המיקרוסקופ עם שקופית מיקרוסקופ ריק בניצב לשקופית הראשונה, כך השקופית העליונה נשענת על קלטת המעבדה על השקופיות הסמוכות. זה מתפשט את הירידה של agarose כדי ליצור משטח של רוחב אחיד.
    5. הסר בזהירות את השקופית העליונה.
  5. השתק את התולעים באמצעות מ200 μL הצינורות כדי להוסיף טיפה קטנה (~ 5 μL) של 1 מילימטר levamisole ב M9 מאגר למרכז של כרית agarose. ואז להעביר 10 תולעים לתוך הירידה של levamisole באמצעות תיל פלטינה לבחור. . כיסוי עם שמיכות איטום הכיסויים אינו הכרחי עבור מיקרוסקופ זקוף. באופן אופציונלי, התולעים ניתן ליישר כאשר הם נעשים משותק על ידי הפצת levamisole כבוי, מחוץ לשטח הצמח, וליישר את התולעים עם בוחר חוט פלטינה. לחלופין, ניתן לטבול את levamisole באמצעות ניגוב מעבדה.
    הערה: התמונה מוקדם ככל האפשר, כי דגירה ממושכת ב levamisole יכול לשנות את הזריחה.
  6. תמונה של תולעים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית. הפרטים של לכידת תמונה משתנים על ידי מיקרוסקופ ותוכנה.
    הערה: כדי להשוות באופן ישיר את עוצמות התמונה, השתמש בהגדרות מיקרוסקופ זהות בהפעלת הדמיה אחת. הימנע מלכייל את התמונה.

3. מדידה של ביטוי גנים HSR באמצעות RT-qPCR

  1. לסנכרן תולעים (סעיף 1.2) ולשמור על 20 ° c עד לשלב ההתפתחותי הרצוי. עבור תולעים N2, תולעים צעירות למבוגרים שעדיין לא הגיעו לבגרות הרבייה נוצרות 60 h לאחר הסינכרון ביצת הטלת.
    הערה: העיתוי ההתפתחותי משתנה עם כל מאמץ והטמפרטורה בה מורמות התולעים. וחשוב מכך, היקף האינדוקציה של HSR מסרב כ-2-4x לאחר תחילת בגרות הרבייה (ראה דיון).
  2. תולעי הלם מהחום כמתואר בשלב 2.2.
  3. קחו את הצלחות מתוך אמבט מים, להסיר את הסרט פרפין, ומיד לאסוף את התולעים. תולעים ניתן לאסוף על ידי שטיפת צלחות בעדינות עם 1 mL של M9, איסוף הנוזל בצינור מיקרוצנטריפוגה, ולאחר מכן הסרת M9 לאחר צנטריפוגה ב 400 x g עבור 1 דקות.
  4. ליאוס את התולעים ולטהר את ה-RNA באמצעות חילוץ אורגני.
    1. הוסף 250 μL של מגיב בידוד RNA (ראה טבלת חומרים).
    2. מערבולת צינורות ביד עבור 30 s.
    3. צינורות וורטקס למשך 20 דקות ב -4 ° צ' באמצעות אביזר שפופרת מיקרוצנטריפוגה (ראו טבלת חומרים).
    4. הוסף 50 μL של כלורופורם.
    5. . מערבולת ל -30 מנות
    6. מודקון את הדגימות ב RT עבור 3 דקות.
    7. צנטריפוגה ב ≥ 14,000 x g עבור 15 דקות ב 4 ° c.
    8. העבר את השכבה הימית (כלומר, השכבה העליונה, ~ 125 μL) לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש.
      הערה: הימנע מהשכבה האורגנית ומהחומר שבממשק.
    9. הוסף 50 μL של כלורופורם.
    10. . מערבולת ל -30 מנות
    11. מודקון את הדגימות ב RT עבור 3 דקות.
    12. צנטריפוגה ב ≥ 14,000 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
    13. העבר את השכבה הימית (~ 100 μL) לשפופרת מיקרוצנטריפוגה חדשה.
      הערה: הימנע מהשכבה האורגנית ומהחומר שבממשק.
    14. מזרז RNA עם כרך שווה (כלומר, 100 μL) של איזופנול.
    15. המלון ממוקם ב-20 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפחות, אבל עדיף בלילה.
      הערה: ניתן להשהות את הניסוי כאן, וניתן לאחסן את ה-RNA ב-20 ° c.
    16. גלולה RNA על ידי צנטריפוגה ב ≥ 14,000 x g עבור ≥ 30 דקות ב 4 ° c.
    17. הסירו ככל האפשר את הסופרנטנט. מבלי להפריע לגלולה
      הערה: הגלולה תהיה קטנה וייתכן שלא תהיה גלויה. הגלולה לא יכול לדבוק היטב בצד של הצינור, כך זהירות היא הכרחית כדי להימנע מלנופש אותו.
    18. לשטוף את הגלולה עם 250 μL של 70% קרח קר אתנול עשה עם RNase-H חינם2O.
    19. צנטריפוגה ב ≥ 14,000 x g עבור ≥ 5 דקות ב 4 ° c.
    20. הסר כמות גדולה ככל האפשר. מבלי להפריע לגלולה
    21. לבצע ספין מהיר ב RT כדי להסיר את כל השאר 70% אתנול.
    22. יבש את הגלולה על ידי עזיבת הצינורות לפתוח ב RT כל עוד יש צורך; בדרך כלל לפחות 20 דקות. צינורות יכולים להיות מכוסים בנייר טואלט נטול סיבים או אלומיניום כדי למנוע זיהום.
    23. השהה מחדש את הגלולה ב 20 μL של RNase-H חינם2O.
    24. לקבוע את הריכוז RNA באמצעות כמות קטנה ספקטרוסקופיה (2 μL).
      הערה: ניתן להשהות את הניסוי כאן, וניתן לאחסן את RNA באופן זמני ב-20 ° c או מתחתיו.
  5. הסר דנ א שיורית על ידי הדגירה עם DNase I. מומלץ להשתמש בערכה הזמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים) ולבצע את הוראות היצרן.
    1. עם ערכה זו, להכין את התגובה 20 μL עם 500 ng של RNA ו 1 μL של DNase I באמבט מים 37 ° c עבור 30 דקות.
    2. להוסיף 2.5 μL של הפעלה מגיב DNase (כלול בערכה) לכל דגם ו-מודטה ב RT עבור 5 דקות עם מזדמן/וורטקנג.
    3. ספין למטה ב 14,000 x g עבור 2 דקות.
    4. מבלי להפריע את הגלולה הלבנה, העבר 15 μL של סופרנטאנט למיקרוצינורית טרייה לסינתזה של cDNA.
  6. . התנהלות בסינתזה של דנ א מומלץ להשתמש בערכה הזמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים) ולבצע את הוראות היצרן.
    1. עם הערכה, להכין את התגובה 20 μL עם 15 μL של DNase I-שטופלו RNA מן השלב הקודם 1 μL של היפוך הטרנסקריפטאז.
    2. השתמש בתוכנית הבאה לסינתזה של cDNA: 25 ° c עבור 5 דקות, 46 ° c עבור 20 דקות, 95 ° c עבור 1 דקות, 4 ° c להחזיק.
    3. לדלל cDNA על ידי הוספת 80 μL של RNase-H חינם2O ישירות למדגם.
    4. מערבולת קצרה, ואז להסתובב ולאחסן ב-20 ° c עד הצורך.
  7. לבצע qPCR. מומלץ להשתמש בערכה הזמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים) ולבצע את הוראות היצרן.
    1. עם הערכה, להכין את התגובה 25 μL המכיל 2 μL של cDNA ו 200 ננומטר (כל אחד) של קדימה והפוך התחל באחד היטב של צלחת 96-באר.
    2. פריימר רצפים למדידת גנים זעזועים חום, hsp-70 ו -hsp-16.2, ו -18s rrna (עבור בקרת נורמליזציה) מפורטים בטבלת החומרים. ניתן להשתמש בבקרי נורמליזציה מרובים כרצונכם.
    3. לדלל cDNA דגימות 50x לפני מדידה של 18S כדי להבטיח את השיטת הוא בטווח הליניארי. תנאי ה-qPCR המתאימים משתנים בהתאם לערכת השימוש והתחל (ראה תוצאות מייצגות).
    4. השתמש במערכת זיהוי PCR בזמן אמת (ראה טבלת חומרים) עבור qpcr עם 40 מחזורים של 95 ° צ' עבור 5 s הדנטורציה, 58 ° צ' עבור 30 s ריפוי, ו 72 ° c עבור 30 הארכה.
      הערה: טמפרטורת ריפוי אופטימלית יכולה להשתנות באמצעות התחל והתנאים.
    5. ככמת באמצעות שיטת העקומה ΔΔCt או הרגילה12.

4. שיטת המדידה הגבוהה ביותר למדידת HSR ברמה ארגונית

  1. לסנכרן את התולעים (סעיף 1.2) ולשמור על 20 ° צ' עד לשלב ההתפתחותי הרצוי. עבור תולעים N2, תולעים צעירות למבוגרים שעדיין לא הגיעו לבגרות הרבייה נוצרות 60 h לאחר הסינכרון ביצת הטלת.
    הערה: העיתוי ההתפתחותי משתנה עם כל מאמץ והטמפרטורה בה מורמות התולעים. וחשוב מכך, היקף האינדוקציה של HSR מסרב כ-2-4x לאחר תחילת בגרות הרבייה (ראה דיון).
  2. החום מזעזע את התולעים כמתואר בשלב 2.2 עבור 6 h.
  3. הסר את לוחיות מאמבט מים, להסיר את הסרט פרפין, ולאפשר לתולעים להתאושש על ידי דגירה ב 20 ° c עבור 48 h.
  4. לספור את מספר התולעים שיכול מיד לזחול משם לאחר גירוי מכני ללא תנועה או שיתוק מיובש.
    הערה: הדגירה של 6 שעות היא אופטימלית לבדיקת התנאים הפחתת מאוד שעות החשיפה, אך ייתכן שיהיה צורך לחפש תנאים המשפרים מאוד את המצב התרמי.

Representative Results

השימוש בפרוטוקולים המתוארים בכתב היד הזה, אינדוקציה HSR נמדד באמצעות כתבים פלורסצנט, RT-qPCR, ו thermorecovery אוד assays ספר. בכל מקרה, הנוהל בסעיף 1.2 שימש להפקת מסונכרן, מבוגר צעיר שאינו מגיע לבגרות הרבייה.

כדי להמחיש את האינדוקציה HSR ברמה התאית, AM446 (hsr-70p:: gfp) ו CL2070 (hsr-16.2 p:: gfp) זני כתבת פלורסנט נותחו לאחר סעיף 2 של הפרוטוקול. בדגימות שליטה שלילית ללא התחשמלות, העיתונאי hsp-16.2 הראה רק התאמה אוטומטית רגילה, אך העיתונאי hsp-70 היה מכונן פלואורסצנטית בשריר אנאלי או שריר כמו שדווח בעבר4 (איור 1א). אחרי 1 h של הלם חום ב 33 ° c, זריחה חזקה נצפתה בשני הכתבים; עם זאת, תבנית הביטוי היתה ברורה בהתאם לכתב שנעשה בו שימוש (איור 1ב). העיתונאי hsp-70 היה המבריק ביותר במעי ובספרקה, ואילו העיתונאי hsp-16.2 היה המבריק ביותר בלוע. בנוסף, לעיתונאי hsp-16.2 הייתה רמה גבוהה של השתנות תולעת-לתולעת בכמות האינדוקציה שתוארה קודם לכן, אך הכתבת hsp-70 לא הייתהבת 13.

וריאציה בשימוש נפוץ של סעיף 2 היא לבצע את ההלם חום בחממה יבש במקום אמבטיה מים במחזור. לכן נבדק גם ההבדל בין שתי המתודולוגיות. זה נמצא כי שני הפרוטוקולים הובילו אינדוקציה חזקה של שני כתבים פלורסנט באמצעות התנאים שלנו, למרות אמבטיה מים מחזורי מומלץ כפרקטיקה הטובה ביותר (ראה דיון) (איור 1B).

כדי לבדוק את התלות של הכתבים על שעתוק פקטור HSF-1, האכלה RNAi שימש לנוק hsf-1 לפני האינדוקציה העיתונאי נמדד. התגלה כי הזריחה של שני הזנים הופחת באופן חמור על-ידי הסתרה HSF-1 למטה, המציין כי כתבים אלה הם HSF-1-תלוי כמתואר בספרות4 (איור 2). עם זאת, זה היה גם ציין כי זריחה הלוע המשיך בשני הכתבים על hsf-1 הסתרה, אשר עקבית עם דיווחים קודמים כי השריר הלוע עמידים rnai ידי האכלה14.

לכמת את התולעת כולה של HSR ברמה המולקולרית, שני Hsr אנדוגניים נמדדו עם RT-qPCR באמצעות סעיף 3 של הפרוטוקול. דגימות נמדדו בטרילקאט, העקומה הסטנדרטית נוצרה עבור כל אחד התחל, ו עקומת להמיס נותחו עבור כל מדגם עבור בקרת איכות. נמצא כי ההלם החום 33 ° צ' עבור 1 h הביא יותר מ 2, 000x להגדיל ביטוי יחסי עבור שני גנים זעזועים חום, hsp-70 ו hsp-16.2 (איור 3). תוצאות אלה מראות כי הגנים האנדוגניים מתאימים למדידת HSR אינדוקציה וכי הלם חום 33 ° צ' עבור 1 h הוא מספיק כדי ליצור תגובה משמעותית. עם זאת, יש להשתמש בזהירות בפענוח מידת האינדוקציה המוחלטת של הלם חום, מכיוון שרמות ה-mRNA בהיעדר הלם החום נמוכות מאוד.

באמצעות סעיף 4 של הפרוטוקול נבדק מענה פיזיולוגי לזעזוע החום. נמצא כי חשיפה של תולעים להלם חום 6 h ב 33 ° c הוביל 20% ירידה בתולעים עם תנועה נורמלית לאחר התאוששות 48 h (איור 4א). התלות של השיקול הזה על מקדם התמלול HSF-1 נבדק באמצעות האכלה RNAi כדי להיפטר hsf-1 לפני חשיפת תולעים ללחץ. זה נמצא כי הנוק-אין -1 גרם לירידה דרמטית בתנועה נורמלית, עם > 95% של תולעים מראה תנועה משומר או שיתוק לאחר שהוא הגזים עם בוחר חוט פלטינה.

השוונו את היכולת התרמומורבית הזאת לשימוש נרחב ביכולת הארגון הנפוצה ביותר, המכונה בדרך כלל התרמוסובלנות. בשיטת העמידות התרמוטרבית, תולעים חשופות לטמפרטורה 35 ° c רציפה באמצעות אינקובטור יבש, ואחוז התולעים החיים נמדד בנקודות זמן שונות. בעזרת השיטה הזאת, נמצאה שליטה בתולעים שנחשפו ברציפות ל-35 ° c מתים לאחר כ -8 שעות חשיפה (איור 4ב). עם זאת, כאשר התלות של בדיקה זו על HSF-1 נבדק באמצעות הסתרה RNAi, זה נמצא כי עיכוב של hsf-1 לא גרם לירידה בחום. תוצאות דומות הוצגו בעבר באמצעות מוטציות HSF-1 (ראה דיון). לפיכך, השימוש במידת הרגישות התרמוטרפית למדידת ה-HSR אינו מומלץ, והשיטה המועדפת לבדיקת ה-HSR היא ברמת האורגאממל.

Figure 1
איור 1: אינדוקציה HSR נמדד עם כתבים פלורסנט. (א) ביטוי החוםBוהinducible של hsp-70p:: gfp ו hsp-16.2 p:: כתבת gfp לאחר 1 h של הלם חום ב-33 ° c באמבט מים או בחממה. תולעים גדלו על OP50 חיידקים עבור 64 h, חום הלם, ולאחר מכן התאושש 20 ° צ' עבור 8 h לפני הדמיה. לצורך התייחסות, התולעים בהלם חום (א) לא היו ממואמים ב (ב) כדי להתאים את הטווח והרוויה של תולעים בהלם חום. תמונות מייצגות של שתי שכפול נסיוניות מוצגות. סרגל בקנה מידה = 250 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: האינדוקציה HSR נמדד עם כתבים פלורסנט תלוי hsr-1. זנים המכילים hsp-70p:: gfp ו hsp-16.2 p:: כתבים gfp הועלו על השליטה (L4440 ריק וקטור) או hsp-1 rnai לוחות עבור 64 h, נחשף 1 הלם חום ב 33 ° צ' באמבט מים, ולאחר מכן התאושש 20 ° צ' עבור 8 h לפני הדמיה. תמונות מייצגות של שתי שכפול נסיוניות מוצגות. סרגל בקנה מידה = 250 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: אינדוקציה HSR נמדד עם RT-qPCR. תולעים N2 הועלו על HT115 בקטריה עבור 60 h ולאחר מכן חום הלם עבור 1 h באמבטיה 33 ° c מים. רמות ה-mRNA היחסיות של hsp-70 (c12c 8.1) ו -hsp-16.2 מוצגות כשהן מנורמלות לבקרת ההלם התרמי. ערכים שמותווים הם הממוצע של ארבעה משכפל ביולוגי וסרגלי שגיאות מייצגים ± SEM. משמעות סטטיסטית חושבה באמצעות מבחן t שאינו משויך לסטודנט. * * p < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: Thermorecovery אוד, אבל לא התרמוסבולת, תלויה HSF-1. תולעים N2 הועלו על השליטה (L4440) או לוחות hsf-1 rnai עבור 60 h ולאחר מכן השתנה גם: (א) מרחץ המים 33 ° c עבור 6 h והתאושש ב 20 ° c עבור 48 h לפני הבקיע עבור התנועה הרגילה (thermorecovery אוד), או (ב) החממה היבשה 35 ° כל שיטת העבודה נעשתה עם n ≥ 30 אנשים ב 2 ימים עצמאיים. הממוצע מוצג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

בספרות מגוון רחב של טמפרטורות, שעות וציוד שימשו לצורך שיטת ה-HSR, אשר הציגה אזהרות מיותרות והובילה לקושי בהשוואת התוצאות בין מעבדות. לדוגמה, הטמפרטורות הנעות ממקום העולה מ-32-37 ° צ' ושעות מ-15 דקות עד מספר מעלות שימשו לזירוז ה-HSR15. עם זאת, הוא דיווח כי המאליות מתרחשת מוקדם ככל 3 h ב 37 ° c עבור כל השלבים ו 1.5 h עבור יום 1 מבוגרים15. יתר על כן, אנו מראים כי חשיפה של תולעים כדי 35 ° צ' צלזיוס גורם הלליות כי הוא לא HSF-1 תלוי, מה שהופך את התנאים האלה מתאים בצורה גרועה עבור ניתוח של HSF. לעומת זאת, הלם חום של 33 ° c עבור 1 h הוא חזק מספיק כדי לעורר אינדוקציה חזקה של גנים זעזועים חום, עדיין מתון מספיק כדי לא להשפיע על הכדאיות תולעת. אכן, חשיפה 33 ° c עבור כל עוד 6 h גורם רק 20% של תולעים להציג תנועה נורמלית. לכן, אנו מציעים באמצעות טמפרטורה של 33 ° c וזמן של 1 h כתנאי מתוקננת עבור RT-qPCR וכתבת פלורסנט.

ניסויים אחרונים חשפו כי היערכות התפתחותית של תולעים עבור ניסויים HSR חשוב במיוחד. לאחרונה הוכח כי ב -C. אלגיה התעשייה של ירידות hsr (כלומר, קורסת) על-ידי > 50% כאשר הדו הדו מתחיל הטלת ביצה5. היערכות נכונה של התולעים היא קריטית משום שלעתים קרובות יש הבדלים בעיתוי התפתחותי בזנים הנושאים מוטציות. אם נעשה שימוש במוטציות רגישות לטמפרטורה, זה ישפיע גם על התוצאות אם הם אינם מסונכרנים על ידי גיל הרבייה שלהם. לכן, מומלץ למדוד בזהירות את התחלתה של ביצים הטלת על כל זן כדי לקבוע מתי ההתמוטטות מתרחשת. חלון הזמן לאחר L4 נשירה ולפני החניכה של בגרות הרבייה הוא צר; לכן, יש לנקוט בטיפול כך שקריסת HSR לא תגרום לשינויים בשוגג בתוצאות.

בנוסף לתזמון התפתחותי, שינויים קטנים באופן מפתיע בטמפרטורה, מעט כמו 1 ° c, יכולים להיות השפעות משמעותיות על HSR. לדוגמה, הנוירונים התרמוחושיים בג הם רגישים לשינויי טמפרטורה קטנים כמו ± 0.05 ° c16. לכן, זה הכרחי להשתמש במדחום שיכול למדוד במדויק את הטמפרטורה. לכן, אנו מציעים בצורה הטובה ביותר את השימוש במכשיר מכויל עבור מדידת טמפרטורה כי הוא מדויק מספיק כדי למדוד טמפרטורות בתוך ± 0.1 ° c. יתר על כן, מד חום עם פונקציונליות של רישום נתונים יש להשתמש כדי למדוד וריאציות טמפרטורה לאורך זמן. חממות רבות מצוינות יש וריאציות תרמית של יותר מ 1 ° c בחלקים שונים של החממה ועל פני הזמן, אשר יכול להיות השפעות משמעותיות על ניסויים HSR. כפרקטיקה הטובה ביותר, אנו מציעים באמצעות אינקובטורים בעלי בידוד ומחזור מספיקים כדי למזער תנודות בטמפרטורה. לביצוע ניסויים בהלם חום, אנו מציעים את השיטה הטובה ביותר של אמבט מים מחזורי. הזמן שלוקח לצלחת אגר להגיע לטמפרטורה הרצויה הוא כ 6-7 דקות באמבט מים, אך עוד הרבה יותר בחממה יבשה15,17. עם זאת, אם מקלחת מים מחזורי אינו זמין, הראינו כי אינדוקציה HSR חזקה גם מתרחשת בחממה יבש באמצעות התנאים שלנו. אם נעשה שימוש בחממה יבשה, יש למזער את פתיחת החממה למשך זמן הלחץ.

הוא מבוסס היטב כי אינדוקציה גנים הלם חום תלויה הרגולטור הראשי של HSR, HSR-1. כאן, אנו מציגים ראיות כי שתי היתר עקיף יותר, כתבים פלורסנט ו thermorecovery אוד, תלויים גם ב-HSF-1. באופן משמעותי, מצאנו כי שימוש נפוץ אורגנטימאל בשימוש, התרמוסובלנות, הוא לא HSF-1 תלוי באמצעות hsf-1 Rnai (איור 4). תוצאות דומות דווחו בעבר באמצעות המוטציה hsf-1 או המוטציה ttx-3 , אשר חוסם את hsf18,19,20. ביחד, התוצאות הללו מעידות על כך שאין להשתמש בהצריכה התרמוסבילות עבור מחקר HSR. יתר על כן, זה מרמז כי השיטה הטובה ביותר היא לבחון את התלות HSF-1 עבור כל שיטה המשמשת למדידת HSF.

יחד, אנו מציגים סדרה של פרוטוקולים סטנדרטיים השיטות הטובות ביותר עבור מדידה חזקה ומתוכלת של HSR אינדוקציה C. אלגיה. אנו מקווים כי מתודולוגיות אלה תפחית את השונות בניסויים HSR ולהגדיל את התוכסות. הקלה על השוואות ישירות של מחקר HSR בין מעבדות תשמש להאצת מחקר בשדה HSR. יתר על כן, סטנדרטיזציה יהיה להועיל מחקר להזדקנות מחלות ניווניות שבהם HSR קשורה באופן אינטימי.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו תמכה בתרומה מפרנק לסלי. זנים מסוימים סופקו על ידי CGC, אשר ממומן על ידי משרד NIH תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18S-forward primer TTGCGTCAACTGTGGTCGTG
18S-reverse primer CCAACAAAAAGAACCGAAGT
CCTG
AM446 rmIs223[phsp70::gfp; pRF4(rol-6(su1006))] Morimoto lab http://groups.molbiosci.northwestern.edu/morimoto/
C12C8.1-forward primer GTACTACGTACTCATGTGTCG
GTATTT
C12C8.1-reverse primer ACGGGCTTTCCTTGTTTTCC
CFX Connect Real-Time PCR Detection System Bio Rad 1855200
CL2070 dvIs70 [hsp-16.2p::GFP + rol-6(su1006)] Caenorhabditis Genetics Center (CGC) https://cgc.umn.edu/
EasyLog Thermistor Probe Data Logger with LCD Lascar EL-USB-TP-LCD
Greenough Stereo Microscope S9i Series Leica
Hard Shell 96 Well PCR Plates Bio Rad HSS9601
hsp-16.2-forward primer ACTTTACCACTATTTCCGTCC
AGC
hsp-16.2-reverse primer CCTTGAACCGCTTCTTTCTTTG
iScript cDNA Synthesis Kit Bio Rad 1708891
iTaq Universal Sybr Green Super Mix Bio Rad 1725121
Laser Scanning Confocal Microscope Nikon Eclipse 90i
MultiGene OptiMax Thermo Cycler Labnet TC9610
N2 (WT) Caenorhabditis Genetics Center (CGC) https://cgc.umn.edu/
Nanodrop Lite Spectrophotometer Thermo Scientific ND-LITE
Parafilm M Roll Bemis 5259-04LC
RapidOut DNA Removal Kit Thermo Scientific K2981
Recirculating Heated Water Bath Lauda Brinkmann RE-206
Traceable Platinum Ultra-Accurate Digital Thermometer Fisher Scientific 15-081-103
TRIzol Reagent Invitrogen 15596026 RNA isolation reagent
TurboMix Attachment Scientific Industries SI-0564
Vortex-Genie 2 Scientific Industries SI-0236

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guisbert, E., Morimoto, R. I. The regulation and function of the heat shock response. Protein Quality Control in Neurodegenerative Diseases. , 1-18 (2013).
  2. Li, J., Chauve, L., Phelps, G., Brielmann, R. M., Morimoto, R. I. E2F coregulates an essential HSF developmental program that is distinct from the heat-shock response. Genes and Development. 30 (18), 2062-2075 (2016).
  3. Hsu, A. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor. Science. 300 (5622), 1142-1145 (2003).
  4. Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 657-664 (2004).
  5. Labbadia, J., Morimoto, R. I. Repression of the Heat Shock Response Is a Programmed Event at the Onset of Reproduction. Molecular Cell. 59 (4), 639-650 (2015).
  6. Link, C. D., Cypser, J. R., Johnson, C. J., Johnson, T. E. Direct observation of stress response in Caenorhabditis elegans using a reporter transgene. Cell Stress & Chaperones. 4 (4), 235 (1999).
  7. Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. Identification of a Tissue-Selective Heat Shock Response Regulatory Network. PLoS Genetics. 9 (4), 1-12 (2013).
  8. Ma, J., et al. Cellular Proteomes Drive Tissue-Specific Regulation of the Heat Shock Response. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (3), 1011-1018 (2017).
  9. Mendenhall, A. R., et al. Expression of a single-copy hsp-16.2 reporter predicts life span. Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (7), 726-733 (2012).
  10. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. (1999), 1-11 (2006).
  11. Avery, L., You, Y. J. C. elegans feeding. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-23 (2012).
  12. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  13. Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
  14. Shiu, P. K., Hunter, C. P. Early Developmental Exposure to dsRNA Is Critical for Initiating Efficient Nuclear RNAi in C. elegans. Cell Reports. 18 (12), 2969-2978 (2017).
  15. Zevian, S. C., Yanowitz, J. L. Methodological considerations for heat shock of the nematode Caenorhabditis elegans. Methods. 68 (3), 450-457 (2014).
  16. Clark, D. A., Biron, D., Sengupta, P., Samuel, A. D. T. The AFD sensory neurons encode multiple functions underlying thermotactic behavior in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 26 (28), 7444-7451 (2006).
  17. Prahlad, V., Cornelius, T., Morimoto, R. I. Regulation of the cellular heat shock response in Caenorhabditis elegans by thermosensory neurons. Science. 320 (5877), 811-814 (2008).
  18. McColl, G., et al. Insulin-like signaling determines survival during stress via posttranscriptional mechanisms in C. elegans. Cell Metabolism. 12 (3), 260-272 (2010).
  19. Douglas, P. M., et al. Heterotypic Signals from Neural HSF-1 Separate Thermotolerance from Longevity. Cell Reports. 12 (7), 1196-1204 (2015).
  20. Kourtis, N., Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Small heat-shock proteins protect from heat-stroke-associated neurodegeneration. Nature. 490 (7419), 213-218 (2012).

Tags

מדעי הסביבה סוגיה 161 הלם חום תגובה להלם חום HSF-1 C. אלגיה hsf-16.2 hsf-70 מלווים תרמותרמיה תרמוראקו מאוד
שיטות מתוקננת למדידת אינדוקציה של תגובת הלם חום <em>באלבורבדיוטיס</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Golden, N. L., Plagens, R. N., Kim… More

Golden, N. L., Plagens, R. N., Kim Guisbert, K. S., Guisbert, E. Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (161), e61030, doi:10.3791/61030 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter