Summary
여기서, 표준화된 프로토콜은 분자 수준에서 RT-qPCR을 이용하여, 세포 수준에서 형광 기자, 유기체 수준에서의 열회수를 사용하여 Caenorhabditis elegans에서 열 충격 반응(HSR)의 유도를 평가하기 위해 제시된다.
Abstract
열 충격 반응(HSR)은 단백질 접이식 항상성 또는 프로테오스타증을 복원하는 기능인 세포성 단백질 오도에 의해 유도된 세포 스트레스 반응이다. HsR은 분자, 세포 및 유기체 수준에서 평가될 수 있기 때문에 Caenorhabditis elegans는 HSR 연구를 위한 독특하고 강력한 틈새 시장을 차지합니다. 따라서 분자 수준에서의 변화는 세포 수준에서 시각화될 수 있으며 생리학에 미치는 영향은 유기체 수준에서 양수될 수 있다. HSR측정을 위한 소하는 것은 간단하지만, 문헌에 설명된 타이밍, 온도 및 방법론의 변화는 연구 전반에 걸쳐 결과를 비교하는 데 어려움을 겪고 있습니다. 또한, 이러한 문제는 그들의 연구에 HSR 분석을 통합 하고자 하는 사람에 대 한 장벽 역할을. 여기서, RT-qPCR, 형광 기자 및 유기체 열회수 분석과 견고하고 재현 가능한 방식으로 HSR의 유도를 측정하기 위한 일련의 프로토콜이 제시된다. 또한, 널리 사용되는 열성 편도 분석은 HSR, HSF-1의 잘 확립 된 마스터 레귤레이터에 의존하지 않으므로 HSR 연구에 사용되어서는 안된다는 것을 보여줍니다. 마지막으로, 문헌에서 찾아낸 이 사실학에 있는 변이는 토론되고 모범 사례는 궁극적으로 신경 퇴행성 질병, 노화 및 HSR 연구를 촉진하는 필드에 걸쳐 결과를 표준화하는 것을 돕기 위하여 제안됩니다.
Introduction
열 충격 반응(HSR)은 온도 상승 및 기타 프로테오독성 응력에 의한 세포자극 단백질 오폴딩에 의해 유도된 보편적인 세포 응력 반응이다. Caenorhabditis elegans에서 HSR의 활성화는 hsp-70 및 hsp-16.2와 같은 열 충격 유전자의 전사 업 규제로 이어집니다. 많은 열 충격 단백질 (HSP)은 잘못 접히거나 손상된 단백질과 직접 상호 작용하여 단백질 접이식 항상성 또는 프로테오스타증을 복원하는 분자 보호자로 기능합니다. HSR의 마스터 레귤레이터는 전사 인자 열 충격 계수 1 (HSF-1)이며, 그 활성화는 여러 메커니즘1을통해 우아하게 제어됩니다.
HSF-1의 역할은 스트레스에 국한되지 않습니다. HSF-1은 정상적인 성장과 발달을 위해 필요하며, hsf-1의 삭제는 애벌레 체포2로이어집니다. HSF-1은 또한 단백질 골재의 축적 및 프로테오스타증을 유지하는 무능력을 특징으로 하는 노화 및 노화 관련 신경 퇴행성 질환 중에 중요합니다. hsf-1의 녹다운은 단백질 응집체의 축적과 수명을 단축시키는 동시에 hsf-1의 과발현은 단백질 응집을 감소시키고 수명을3,,4로연장한다. 따라서 분자 수준에서 HSF-1의 조절은 유기체 생리학 및 질병에 광범위한 영향을 미칩니다.
C. elegans는 HSR이 분자, 세포 및 유기체 수준,4,,5,6에서측정될 수 있기 때문에 HSR 연구를 위한 강력한 모델 유기체이다. 이 모델의 힘을 강조하는 HSR 조절의 조직별 차이와 같은 HSR 통로를 델린팅하는 주요 발전은 C. elegans7,,8에서발견되었습니다. 또한, C. elegans는 노화 연구에 널리 사용되며 프로테오스타증 중단과 관련된 질병을 모델링하기위한 새로운 시스템입니다.
C. elegans와의 열 충격 실험은 빠르고 재현 할 수 있지만 시작하기 전에 고려해야 할 몇 가지 질문이 있습니다. 예를 들어 HSR 유도에 어떤 온도를 사용해야 하는지, 웜을 얼마나 오래 노출해야 합니까? 마른 인큐베이터 나 수조를 사용하는 것이 더 낫습니까? 어떤 발달 단계를 사용해야 합니까? 불행히도 HSR을 조사하는 데 사용되는 방법론은 실험실마다 크게 다르며 최상의 방법론을 선택하고 현장에서 결과를 비교하기가 어려울 때 혼란을 일으킵니다.
우리는 HSR을 측정하기 위해 RT-qPCR, 형광 기자 및 열회수를 사용하기위한 견고하고 표준화 된 프로토콜을 제시합니다. 이 세 가지 방법은 상호 보완적이지만 각각 고유한 장점과 단점이 있습니다. 예를 들어, RT-qPCR은 HSR의 가장 직접적이고 정량적 측정이며, 이러한 분석서는 많은 상이한 열 충격 유도 유전자를 포함하도록 쉽게 확장될 수 있다. 그러나 RT-qPCR은 가장 비싸고 기술적으로 어려울 수 있으며 특수 장비의 사용이 필요합니다. 대조적으로, 형광 기자는 HSR 유도에 있는 조직 특정 다름을 측정하는 이점이 있습니다. 그러나, 그(것)들은 정확하게 양수하기 어렵고, 특정 임계값 이상 유도를 측정할 수 있고, 형광 현미경의 사용을 요구합니다. 또한, 여기에 설명된 리포터 균주는 표준 N2 균주에 비해 개발지연된다. 단일 복사 전진을 포함하는 새로운 리포터 균주를 사용할 수 있지만 여기에서 테스트되지 않았습니다9. 세 번째 분석, 열회수는 유기체 수준에서 생리학적으로 관련된 판독을 제공하는 장점이 있다. 그러나,이 분석은 틀림없이 가장 민감하고 가장 간접적입니다. 마지막으로, 우리는 이 사실학에서 찾아낸 몇몇 일반적인 변이를 토론하고 이 필드에 있는 연구를 촉진하기 위하여 모범 사례의 세트를 제안합니다.
Protocol
1. C. 예인자의 유지 보수 및 동기화
- OP50 에슈리치아 대장균 균으로 시드된 선충 성장 매체(NGM) 플레이트에 20°C의 벌레를 유지하여 여러 성인을 주10주에약 2배씩 신선한 접시로 이송한다. 이 그들의 생리학에 영향을 미칠 수 있기 때문에 음식이 부족에서 벌레를 방지하기 위해 주의해야한다11.
- NGM 플레이트준비.
- NaCl 3 g, 바토 펩톤 2.5g, 한천 20g, 탈이온화(DI) H2O 최대 1L를 플라스크에 섞는다.
- 멸균을 위한 혼합물을 자동 클로브합니다.
- 혼합물을 ~50°C로 식힙니다.
- 1M KH2PO4 (pH = 6) 1 mL 의 25 mL을 추가, 1 M CaCl2의1 mL, 1 M MgSO4의1 mL, 콜레스테롤 1 mL (100 % 에탄올에서 5 mg / mL).
- 멸균 기술을 사용하여 혼합물을 6cm 플레이트에 부어 약 100 플레이트를 산출합니다. 혼합물이 먼저 300mL 멸균 비커로 전달되면 플레이트를 붓는 것이 더 쉽습니다.
- 박테리아로 파종하거나 4°C에서 저장하기 전에 실온(RT)에서 고형화할 수 있도록 1일을 허용하십시오.
- NGM 플레이트에 OP50 박테리아의 파종.
- 30°C 또는 37°C에서 LB에서 포화 하룻밤 OP50 세균 배양을 성장시다.
- 배양의 약 300 μL을 NGM 플레이트의 중앙에 놓습니다.
- 세균 잔디가 접시에 부착하는 데 필요한 대로 1-3 일 동안 RT에서 접시를 건조시키십시오. 그런 다음 플레이트를 4°C에서 사용하거나 저장할 수 있습니다.
- NGM 플레이트준비.
- 새로 낳은 계란(여기에 설명된)을 분리하거나 표백제로 벌레를 용해한 후 계란을 수집하여 벌레를 동기적으로 성장시키세요.
- 약 10개의 그레이드 성인용 웜을 백금 와이어 픽을 사용하여 신선한 접시에 옮기십시오. 어른이 성인의 첫날에 있는 경우에 계란 평신도 동기화는 가장 잘 작동합니다.
- 약 1 시간 후에 플레이트에서 웜을 제거합니다. 이 조건 및 변형에 따라 접시 당 40-60 계란 귀착되 야 한다.
2. HSR 기자의 형광 화상 진찰
- 웜(섹션 1.2)을 동기화하고 원하는 발달 단계까지 20°C에서 유지합니다. AM446(hsp-70p:gfp)과CL2070(hsp-16.2p::gfp)의경우, 아직 생식 성숙도에 도달하지 않은 젊은 성인 벌레가 달걀 누워 동기화 후 64h를 생성한다.
참고: 개발 타이밍은 각 변형과 웜이 발생하는 온도에 따라 다릅니다. 두 HSR 리포터 균주는 N2에 비해 약간의 발달 지연을 나타낸다. 중요한 것은, HSR 유도의 크기는 생식 성숙의 개시 후에 대략 2-4 배 감소합니다 (토론 참조). - 파라핀 필름으로 플레이트를 감싸고 순환 하는 수조에 1 h를 대 고 침수 하 여 벌레를 열 충격. 파라핀 필름의 얇은 스트립은 가장자리를 밀봉하기 위해 접시 주위에 2 배 포장해야합니다. 플레이트의 바닥을 덮지 않거나 열 전달을 방해할 수 있습니다. 테스트 튜브 랙과 리드 무게를 사용하여 플레이트를 거꾸로 잠급합니다. 필요한 경우 음수 제어 샘플(열 쇼크 없음)을 포함해야 합니다.
참고: 파라핀 필름이 안전하지 않으면 물이 플레이트에 들어가면 플레이트를 데이터 수집에 사용해서는 안 됩니다. - 수조에서 접시를 제거하고 종이 타월로 건조하여 벌레를 복구합니다. 파라핀 필름을 제거하고 6-24h동안 20°C에서 웜을 배양한다. 이 복구 기간은 이미징 전에 GFP 합성 및 접기에 충분한 시간을 허용합니다.
- 이미징을 위한 슬라이드를 준비합니다. 슬라이드는 사용마다 신선하게 준비해야 합니다.
- 아가로즈가 용해될 때까지 전자레인지를 사용하여 물과 열로 3% 아가로즈 용액을 만듭니다.
- 아가로즈 패드용 스페이서를 만들기 위해 실험실 테이프 스트립이 있는 두 개의 다른 현미경 슬라이드 사이에 이미징을 위한 현미경 슬라이드를 배치합니다.
- 1,000 μL 파이펫을 사용하여 가열된 3% 아가로즈의 드롭(~150 μL)을 현미경 슬라이드의 중앙에 놓습니다.
- 상단 슬라이드가 인접한 슬라이드의 실험실 테이프에 놓이도록 첫 번째 슬라이드에 수직으로 빈 현미경 슬라이드로 현미경 슬라이드를 즉시 덮습니다. 이것은 균일 한 폭의 패드를 만들기 위해 아가로즈의 방울을 확산.
- 조심스럽게 상단 슬라이드를 제거합니다.
- 200 μL 파이펫을 사용하여 M9 버퍼에 1mM 레바미솔의 작은 낙하(~5 μL)를 아가로즈 패드의 중앙에 추가하여 웜을 고정합니다. 그런 다음 백금 와이어 픽을 사용하여 10 개의 웜을 레바미솔 드롭으로 옮길 수 있습니다. 커버 슬립으로 덮습니다. 덮개 전표를 밀봉하는 것은 직립 현미경을 위해 필요하지 않습니다. 선택적으로, 벌레는 레바미솔을 벗겨내고, 아가로즈 패드의 바깥쪽으로 퍼지고, 벌레를 백금 와이어 픽으로 정렬하여 마비될 때 정렬될 수 있다. 또는, 레바미솔은 실험실 닦아를 사용하여 담글 수 있습니다.
참고: 레바미솔의 장기간 잠복이 형광을 바꿀 수 있기 때문에 가능한 한 빨리 이미지. - 형광 현미경을 사용하여 웜을 이미지합니다. 이미지 캡처의 세부 사항은 현미경 과 소프트웨어에 따라 다릅니다.
참고: 이미지 강도를 직접 비교하려면 한 이미징 세션에서 동일한 현미경 설정을 사용합니다. 이미지를 과도하게 사용하지 마십시오.
3. RT-qPCR을 이용한 HSR 유전자 발현 측정
- 웜(섹션 1.2)을 동기화하고 원하는 발달 단계까지 20°C에서 유지합니다. N2 벌레의 경우, 아직 생식 성숙도에 도달하지 않은 젊은 성인 벌레는 계란 누워 동기화 후 60 h를 생성합니다.
참고: 개발 타이밍은 각 변형과 웜이 발생하는 온도에 따라 다릅니다. 중요한 것은, HSR 유도의 크기는 생식 성숙의 개시 후에 대략 2-4 배 감소합니다 (토론 참조). - 단계 2.2에 설명된 열 충격 벌레.
- 수조에서 접시를 꺼내 파라핀 필름을 제거하고 즉시 벌레를 수집합니다. 벌레는 M9의 1mL로 부드럽게 판을 세척하고, 마이크로 원심 분리기 튜브에서 액체를 수집한 다음, 원심 분리 후 M9을 1 분 동안 400 x g에서 제거하여 수집 할 수 있습니다.
- 벌레를 lyse하고 유기 추출을 사용하여 RNA를 정화합니다.
- RNA 격리 시약250μL를 추가합니다(재료표참조).
- 30 초 동안 손으로 소용돌이 튜브.
- 마이크로센트심분리기 튜브 부착물을 사용하여 4°C에서 20분 동안 소용돌이 튜브(재료 표참조).
- 50 μL의 클로로폼을 추가합니다.
- 30 초 용 소용돌이.
- 3 분 동안 RT에서 샘플을 배양.
- 4°C에서 15분 동안 ≥14,000 x g의 원심분리기.
- 수성 층(즉, 위층, ~125 μL)을 새로운 미세원심분리기 튜브로 옮기습니다.
참고: 인터페이스의 유기 층과 재질을 피하십시오. - 50 μL의 클로로폼을 추가합니다.
- 30 초 용 소용돌이.
- 3 분 동안 RT에서 샘플을 배양.
- 4°C에서 5분 동안 ≥14,000 x g의 원심분리기.
- 수성 층(~100 μL)을 새로운 미세원심분리기 튜브로 옮기습니다.
참고: 인터페이스의 유기 층과 재질을 피하십시오. - 이소프로판올의 동일한 부피(즉, 100 μL)를 가진 RNA를 침전시한다.
- 적어도 30 분 동안 -20 °C에서 배양하지만 바람직하게는 하룻밤.
참고: 실험은 여기서 일시 중지될 수 있고 RNA는 -20°C에서 저장될 수 있다. - 4°C에서 ≥30 분동안 ≥14,000 x g에서 원심분리로 RNA를 펠렛.
- 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상체를 제거하십시오.
참고: 펠릿이 작아 보이지 않을 수 있습니다. 펠릿은 튜브의 측면에 단단히 부착되지 않을 수 있으므로 불고있는 것을 피하기 위해주의가 필요합니다. - RNase 프리 H2O로 만든 70 % 얼음 차가운 에탄올의 250 μL로 펠릿을 씻으십시오.
- 4°C에서 ≥5 분동안 ≥14,000 x g의 원심분리기.
- 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상체를 제거하십시오.
- RT에서 빠른 스핀을 수행하여 나머지 70%의 에탄올을 제거합니다.
- 필요에 따라 RT에서 튜브를 열어 두어 펠릿을 건조시키십시오. 일반적으로 적어도 20 분. 튜브는 오염을 방지하기 위해 보풀이없는 조직 또는 알루미늄 호일로 덮여 있을 수 있습니다.
- RNase 프리 H2O의 20 μL에서 펠릿을 다시 중단합니다.
- 소량 분광광계(2 μL)를 사용하여 RNA 농도를 결정한다.
참고: 실험은 여기에서 일시 중지될 수 있고 RNA는 -20°C 이하에서 일시적으로 저장될 수 있다.
- DNase I로 배양하여 잔류 DNA를 제거합니다. 시판되는 키트(재료 표 참조)를 사용하고 제조업체의지침을 따르는 것이 좋습니다.
- 이 키트를 사용하면 37°C 수조에서 RNA 500 ng 및 DNase I의 1 μL로 20 μL 반응을 30분 동안 준비합니다.
- 각 샘플에 DNase 비활성화 시약(키트에 포함)의 2.5μL을 추가하고 RT에서 5분 동안 비큐어를 가끔 깜박임/소용돌이로 배양합니다.
- 2 분 동안 14,000 x g에서 아래로 회전합니다.
- 흰색 펠릿을 방해하지 않고, cDNA 합성을 위한 신선한 마이크로튜브로 15 μL의 체퍼를 옮기.
- cDNA 합성을 실시합니다. 시판되는 키트(재료 표 참조)를 사용하고 제조업체의지침을 따르는 것이 좋습니다.
- 키트를 사용하면, 이전 단계에서 DNase I 처리 RNA의 15 μL 및 역 전사의 1 μL로 20 μL 반응을 준비한다.
- cDNA 합성을 위해 다음 프로그램을 사용하십시오: 5분 동안 25°C, 20분 동안 46°C, 1분 동안 95°C, 4°C 홀드.
- 샘플에 직접 RNase 가없는 H2O의 80 μL을 추가하여 cDNA를 희석시 희석시.
- 잠시 소용돌이를 한 다음 회전하여 필요할 때까지 -20 °C에 보관하십시오.
- qPCR을 수행합니다. 시판되는 키트(재료 표 참조)를 사용하고 제조업체의지침을 따르는 것이 좋습니다.
- 키트를 사용하면 2μL의 cDNA 와 200nM(각)의 전방 및 역 프라이머를 96웰 플레이트의 한 웰에 포함하는 25 μL 반응을 준비합니다.
- 열 충격 유전자, hsp-70 및 hsp-16.2및 18S rRNA(정규화 제어를 위한)를 측정하기 위한 프라이머 서열이 재료표에나열된다. 여러 정규화 컨트롤을 원하는 대로 사용할 수 있습니다.
- 분석이 선형 범위에 있는지 확인하기 위해 18S의 측정 전에 cDNA 샘플을 50배 희석합니다. 적절한 qPCR 조건은 사용되는 키트 및 프라이머에 따라 다릅니다(대표 결과 참조).
- 5s 데니션용 95°C의 40사이클, 30s 어닐링용 58°C, 30s 확장을 위한 72°C의 qPCR용 실시간 PCR 검출 시스템(재료 표참조)을 사용한다.
참고: 최적의 어닐링 온도는 프라이머와 조건에 따라 다를 수 있습니다. - ΔΔCt 또는 표준 곡선방법(12)을사용하여 정량화한다.
4. 유기 수준에서 HSR을 측정하기위한 열회수 분석
- 웜(섹션 1.2)을 동기화하고 원하는 발달 단계까지 20°C에서 유지합니다. N2 벌레의 경우, 아직 생식 성숙도에 도달하지 않은 젊은 성인 벌레는 계란 누워 동기화 후 60 h를 생성합니다.
참고: 개발 타이밍은 각 변형과 웜이 발생하는 온도에 따라 다릅니다. 중요한 것은, HSR 유도의 크기는 생식 성숙의 개시 후에 대략 2-4 배 감소합니다 (토론 참조). - 6h에 대해 2.2 단계에서 설명된 바와 같이 벌레를 열 충격.
- 수조에서 플레이트를 제거하고 파라핀 필름을 제거하고 웜이 48h에 대해 20°C에서 20°C에서 배양하여 회수할 수 있도록 합니다.
- 육포 운동이나 마비없이 기계적 자극 후 즉시 기어 갈 수있는 웜의 수를 계산합니다.
참고: 6h 인큐베이션은 열회수를 줄이는 조건을 검사하는 데 최적이지만 열회수를 향상시키는 조건을 찾기 위해 더 긴 노출 시간이 필요할 수 있습니다.
Representative Results
이 원고에 설명된 프로토콜을 사용하여 HSR 유도는 형광 기자, RT-qPCR 및 열회수 분석서를 사용하여 측정되었습니다. 각각의 경우에, 섹션 1.2의 절차는 생식 성숙에 도달하지 않은 동기화된, 젊은 성인 벌레를 생성하기 위하여 이용되었습니다.
세포 수준에서 HSR 유도를 시각화하기 위해AM446(hsp-70p:gfp)및 CL2070(hsp-16.2p::gfp) 형광 기자 균주는 프로토콜의 섹션 2에 따라 분석되었다.hsp-16.2p::gfp 열충격이 없는 음성대조군 시료에서 hsp-16.2 기자는 정상적인 자동형광만 보였지만, hsp-70 기자는 항문우울근내의 결산형 형광을 이전에보고한 4(도1A)였다.Figure 1 33°C에서 1h의 열 충격 후, 두 기자 모두에서 강력한 형광이 관찰되었다. 그러나, 표현의 패턴은 어떤 기자가 사용되었는지(그림1B)에따라 구별되었다. hsp-70 기자는 창자와 정자에서 가장 밝았고 hsp-16.2 기자는 인두에서 가장 밝습니다. 또한 hsp-16.2 기자는 이전에 설명한 대로 유도량이 높은 웜-투-웜 가변성을 보였지만 hsp-70 기자는13도되지 않았다.
섹션 2의 일반적으로 사용되는 변화는 순환 수조 대신 건조 인큐베이터에서 열 충격을 수행하는 것입니다. 따라서 두 방법론 간의 차이도 테스트되었습니다. 순환하는 수조가 모범 사례로 권장되지만 두 프로토콜 모두 우리의 조건을 사용하여 두 형광 기자의 강력한 유도를 초래한 것으로 나타났습니다 (토론 참조)(그림 1B).
전사 인자 HSF-1에 대한 기자들의 의존성을 테스트하기 위해, RNAi를 공급하는 것은 기자 유도를 측정하기 전에 hsf-1을 노크하는 데 사용되었다. 이 기자들이 문학4(도 2)에기재된 바와 같이 HSF-1 에 의존하는 것을 나타내는 HSF-1 녹다운시 두 균주의 형광이 심각하게 감소된 것으로 나타났다. 그러나, 또한 인두 형광이 hsf-1 녹다운시 두 기자모두에서 지속되는 것으로 관찰되었으며, 이는 인두 근육이14를공급하여 RNAi에 내성이 있다는 이전 보고서와 일치한다.
분자 수준에서 HSR의 전체 웜 유도를 양량화하기 위해, 2개의 내인성 HSP는 프로토콜의 섹션 3를 사용하여 RT-qPCR로 측정되었다. 샘플은 트리플리케이트로 측정되었고, 각 프라이머에 대해 표준 곡선이 생성되었고, 품질 관리를 위해 각 샘플에 대해 용융 곡선을 분석하였다. 1h에 대한 33°C 열 충격으로 2개의 열 충격 유전자, hsp-70 및 hsp-16.2(도 3)에대한 상대발현이 2,000배 이상 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 두 내인성 유전자가 HSR 유도를 측정하기에 적합하며 1h에 대한 33°C 열 충격이 상당한 반응을 생성하기에 충분하다는 것을 보여준다. 그러나 열 충격이 없는 mRNA 수준이 매우 낮기 때문에 절대 정도의 열 충격 유도를 해석하는 데 주의해야 한다.
열 충격에 대한 생리적 반응을 분석하기 위해, 유기체 열회수 분석은 프로토콜의 섹션 4를 사용하여 시험되었다. 33°C에서 6h 열 충격에 벌레의 노출이 48h 회복 후 정상적인 움직임을 가진 벌레의 20% 감소를 초래한 것으로나타났다(그림4A). HSF-1 전사 인자에 대한 이 분석법의 의존성은 스트레스에 벌레를 노출하기 전에 HSf-1을 노크하기 위해 RNAi를 먹이는 것으로 테스트되었습니다. hsf-1의 넉다운이 정상적인 움직임에 극적인 감소를 일으킨 것으로 나타났으며, 95%의 벌레가 백금 와이어 픽으로 튀어나온 후 육포 운동이나 마비를 보였습니다.
우리는 일반적으로 열성편성이라고 불리는 널리 사용되는 대체 유기체 분석과 이 열회수 분석체를 비교했습니다. 열편도 분석에서, 벌레는 건조한 인큐베이터를 사용하여 연속 35°C 온도에 노출되고, 살아있는 벌레의 백분율은 다양한 시점에서 측정된다. 이 분석기를 이용하여, 35°C에 지속적으로 노출된 제어 벌레가 약 8시간 노출 후 사망한 것으로나타났다(도 4B). 그러나, HSF-1에 대한 이 분석의 의존성이 RNAi 녹다운을 사용하여 시험되었을 때, hsf-1의 억제가 열성 편협의 감소를 일으키지 않는 것으로 나타났다. 유사한 결과는 이전에 HSF-1 돌연변이를 사용하여 표시되었습니다 (토론 참조). 따라서, HSR을 측정하기 위한 열편협의 분석법을 사용하는 것은 권장되지 않으며, 열회수는 유기체 수준에서 HSR을 검사하는 것이 바람직한 방법이다.
그림 1: 형광 기자로 측정된 HSR 유도. (A)기저 및(B) hsp-70p::gfp 및 hsp-16.2p::gfp 리포터균주는 수조 또는 인큐베이터에서 33°C에서 열 충격 1h 후 균주한다. 벌레는 OP50 박테리아에서 64h에 대해 제기되었고, 열은 충격을 받은 다음 이미징 전에 8 시간 동안 20 °C에서 회복되었습니다. 참고로, 열충격 웜(A)의 열충격 웜이(B)에서재정규화되지 않은 벌레는 열충격 웜의 범위 및 채도에 일치하도록 재정규화되었다.B 두 개의 실험 복제의 대표적인 이미지가 표시됩니다. 스케일 바 = 250 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
그림 2: 형광 기자로 측정된 HSR 유도는 HSF-1에 의존한다. hsp-70p:gfp 및 hsp-16.2p::gfp 기자는 64h에 대한 제어(L4440 빈 벡터) 또는 hsf-1 RNAi 플레이트에 올려진 후, 수조에서 33°C에서 1h 열 충격에 노출된 다음 이미징 전에 8h에 대해 20°C에서 회수하였다. 두 개의 실험 복제의 대표적인 이미지가 표시됩니다. 스케일 바 = 250 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
그림 3: RT-qPCR로 측정된 HSR 유도. N2 벌레는 HT115 박테리아에서 60h를 위해 제기한 다음 33°C 수조에서 1h로 충격을 받았다. hsp-70(C12C8.1) 및 hsp-16.2의 상대적인 mRNA 수준은 열 충격 제어 없이 정규화된 것으로 나타났다. 플롯된 값은 4개의 생물학적 복제및 오류 막대의 평균이 ±SEM을 나타냅니다. 통계적 유의성은 짝이 없는 학생의 t-테스트를 사용하여 계산하였다. **p & 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 열성 편협이 아닌 열회수는 HSF-1에 의존합니다. N2 웜은 60시간 동안 제어(L4440) 또는 hsf-1 RNAi 플레이트에 올려진 다음 중 하나에 이동하였다: (A) A 33°C 수조6h에 대한 20°C에서 48시간 동안 회수한 후 정상적인 운동(열회수) 또는 (B) A 35°C 건조 인큐베이터(열)를 채점하고 모든 hh를 제거하였다. 각 분석은 2 독립적 인 일에 n ≥ 30 개인으로 수행되었다. 평균이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
문학에서 다양한 온도, 시간 및 장비가 불필요한 주의 사항을 도입하고 실험실 간의 결과를 비교하는 데 어려움을 초래한 HSR을 분석하는 데 사용되었습니다. 예를 들어, 32-37°C에서 15분내지 몇 시간 까지의 온도가 HSR15를유도하는 데 사용되었다. 그러나, 치사성은 모든 단계에 대해 37°C에서 3h, 1일째 성인 15시에 1.5h로 일찍 발생하는 것으로보고된다. 더욱이, 우리는 35°C에 벌레의 노출이 HSF-1 의존적이지 않은 치사성을 야기한다는 것을 보여주며, 이러한 조건은 HSR의 분석에 적합하지 않다는 것을 보여줍니다. 대조적으로, 1h에 대한 33 °C의 열 충격은 열 충격 유전자의 강한 유도를 유도하기에 충분히 견고하지만 웜 생존가능성에 영향을 미치지 않을 정도로 온화합니다. 실제로, 6h의 한 동안 33°C에 노출하면 웜의 20%만이 비정상적인 움직임을 나타낸다. 따라서, 우리는 33 °C의 온도와 RT-qPCR 및 형광 기자 에세이에 대한 표준화 된 조건으로 1 h의 시간을 사용하여 제안한다.
최근 실험은 HSR 실험을 위한 벌레의 발달 준비가 특히 중요하다는 것을 밝혔습니다. 최근 C. 엘레간에서 헤르마프로디트가 달걀 을 낳기 시작할 때 HSR의 감소(즉, 붕괴)가 5.5% 감소한5것으로 나타났다. 벌레를 올바르게 준비하는 것은 돌연변이를 운반하는 균주의 발달 타이밍에 종종 차이가 있기 때문에 중요합니다. 온도에 민감한 돌연변이를 사용하는 경우 생식 연령에 따라 동기화되지 않은 경우 결과에도 영향을 미칩니다. 따라서, 붕괴가 발생하는 시기를 결정하기 위해 모든 변형에 대한 계란 누워의 발병을 신중하게 측정하는 것이 좋습니다. L4 용액 후 및 생식 성숙의 개시 전에 시간의 창은 좁습니다; 따라서 HSR 붕괴가 실수로 결과에 가변성을 일으키지 않도록 주의를 기울여야 합니다.
개발 타이밍 외에도 1°C에 불과한 온도의 놀라울 정도로 작은 변화는 HSR에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, C. elegans의 열감각 뉴런은 ±0.05°C16의작은 온도 변화에 민감하다. 따라서 온도를 정확하게 측정할 수 있는 온도계를 사용해야 합니다. 따라서, 우리는 ±0.1 °C 내의 온도를 측정하기에 충분히 정확한 온도 측정을위한 보정 된 장치의 사용을 모범 사례로 제안합니다. 또한 데이터 로깅 기능이 있는 온도계를 사용하여 시간 별 온도 변화를 측정해야 합니다. 많은 인큐베이터는 인큐베이터의 다른 부분과 시간이 지남에 따라 1 °C 이상의 열 변화를 가지도록 지정되어 HSR 실험에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 모범 사례로, 우리는 온도 변동을 최소화하기위해 충분한 절연 및 순환이인 인큐베이터를 사용하는 것이 좋습니다. 열 충격 실험을 수행하기 위해 순환 하는 수조의 모범 사례를 제안 합니다. 한천판이 원하는 온도에 도달하는 데 걸리는 시간은 수조에서 약 6-7 분이지만 건조 인큐베이터15,,17에서훨씬 더 길다. 그러나 순환 수조를 사용할 수없는 경우, 우리는 강력한 HSR 유도가 우리의 조건을 사용하여 건조 인큐베이터에서 발생하는 것을 보여 주었다. 마른 인큐베이터를 사용하는 경우 스트레스 기간 동안 인큐베이터의 개방을 최소화해야 합니다.
열 충격 유전자의 유도는 HSR, HSF-1의 마스터 레귤레이터에 의존한다는 것이 잘 확립되어 있습니다. 여기서, 우리는 두 개의 더 간접적인 assays, 형광 기자 및 열회수가 또한 HSF-1에 의존한다는 증거를 제시합니다. 유의하게도, 우리는 일반적으로 사용되는 대체 유기체 분석, 열성 편협이 hsf-1 RNAi(도 4)를사용하여 HSF-1 의존하지 않는다는 것을 발견했다. 유사한,결과는 이전에 HSR18,,19,20을차단하는 hsf-1 돌연변이 또는 ttx-3 돌연변이를 사용하여 보고되었습니다. 함께, 이러한 결과 열성 편도 분석 HSR 연구에 사용 하지 않아야 나타냅니다. 더욱이, 이것은 모범 사례가 HSR을 측정하는 데 사용되는 분석에 대한 HSF-1 의존성을 테스트하는 것임을 시사한다.
종합하면, 우리는 C. elegans에서HSR 유도의 강력하고 재현 가능한 측정을 위한 일련의 표준화된 프로토콜 및 모범 사례를 제시합니다. 우리는 이러한 방법론이 HSR 실험의 변동성을 감소시키고 재현성을 증가시킬 수 있기를 바랍니다. 실험실 간의 HSR 연구의 직접 비교를 촉진하는 것은 HSR 분야에서 연구를 가속화하는 역할을 할 것입니다. 또한, 표준화는 HSR이 밀접하게 연관되는 노화와 신경 퇴행성 질환에 대한 연구에 도움이 될 것입니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 프랭크 레슬리의 기부금에 의해 지원되었다. 일부 균주는 연구 인프라 프로그램의 NIH 사무소 (P40 OD010440)에 의해 투자되는 CGC에 의해 제공되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18S-forward primer | TTGCGTCAACTGTGGTCGTG | ||
| 18S-reverse primer | CCAACAAAAAGAACCGAAGT CCTG |
||
| AM446 rmIs223[phsp70::gfp; pRF4(rol-6(su1006))] | Morimoto lab | http://groups.molbiosci.northwestern.edu/morimoto/ | |
| C12C8.1-forward primer | GTACTACGTACTCATGTGTCG GTATTT |
||
| C12C8.1-reverse primer | ACGGGCTTTCCTTGTTTTCC | ||
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio Rad | 1855200 | |
| CL2070 dvIs70 [hsp-16.2p::GFP + rol-6(su1006)] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/ | |
| EasyLog Thermistor Probe Data Logger with LCD | Lascar | EL-USB-TP-LCD | |
| Greenough Stereo Microscope S9i Series | Leica | ||
| Hard Shell 96 Well PCR Plates | Bio Rad | HSS9601 | |
| hsp-16.2-forward primer | ACTTTACCACTATTTCCGTCC AGC |
||
| hsp-16.2-reverse primer | CCTTGAACCGCTTCTTTCTTTG | ||
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio Rad | 1708891 | |
| iTaq Universal Sybr Green Super Mix | Bio Rad | 1725121 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | Eclipse 90i | |
| MultiGene OptiMax Thermo Cycler | Labnet | TC9610 | |
| N2 (WT) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/ | |
| Nanodrop Lite Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-LITE | |
| Parafilm M Roll | Bemis | 5259-04LC | |
| RapidOut DNA Removal Kit | Thermo Scientific | K2981 | |
| Recirculating Heated Water Bath | Lauda Brinkmann | RE-206 | |
| Traceable Platinum Ultra-Accurate Digital Thermometer | Fisher Scientific | 15-081-103 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | RNA isolation reagent |
| TurboMix Attachment | Scientific Industries | SI-0564 | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 |
References
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