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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

विकासशील जेब्राफिश में रक्त निर्माण का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करना

Published: April 29, 2021 doi: 10.3791/61035
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, California State University, Chico

Summary

यह परख भ्रूण जेब्राफिश के विकास में हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं को मात्रा निर्धारित करने के लिए एक सरल तरीका है। अलग जेब्राफिश से रक्त कोशिकाओं प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के अधीन हैं। यह उत्परिवर्ती जानवरों में रक्त दोषों का पता लगाने और आनुवंशिक संशोधन के बाद की अनुमति देता है।

Abstract

कशेरुकी जानवरों में परिपक्व रक्त शामिल सेल वंश की विविधता हेमेटोपोइटिक स्टेम और जनक कोशिकाओं (एचएसपीसी) के भेदभाव से उत्पन्न होती है। यह एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है जो जीवों की उम्र के दौरान होती है, और भ्रूणजेनेसिस के दौरान शामिल आणविक मार्गों के व्यवधान के भयावह दीर्घकालिक परिणाम हो सकते हैं। कई कारणों से, ज़ेब्राफिश(डैनियो रेरियो)हेमेटोपोइसिस का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श जीव बन गया है। ज़ेब्राफ़िश भ्रूण बाहरी रूप से विकसित होते हैं, और 7 दिनों तक पोस्टफर्टिलाइजेशन (डीपीएफ) ने निश्चित रक्त कोशिकाओं के अधिकांश उपप्रकारों का उत्पादन किया है जो उनके जीवनकाल तक बने रहेंगे। हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं की संख्या का आकलन करने के लिए परख विकसित की गई है, मुख्य रूप से विशिष्ट हिस्टोलॉजिकल दाग का उपयोग, सीटू संकरण तकनीकों में, और ट्रांसजेनिक जानवरों की माइक्रोस्कोपी जो फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति को चलाने वाले रक्त कोशिका-विशिष्ट प्रमोटरों का उपयोग करते हैं। हालांकि, सबसे धुंधला परख और सीटू संकरण तकनीकों में मौजूद रक्त कोशिकाओं की संख्या को सही ढंग से निर्धारित नहीं करती है; सेल संख्या में केवल बड़े अंतर आसानी से कल्पना कर रहे हैं। ट्रांसजेनिक जानवरों का उपयोग करना और फ्लोरोसेंट या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी वाले व्यक्तियों का विश्लेषण करना किया जा सकता है, लेकिन इन परखों का मात्रा या तो मैन्युअल रूप से गिनती या महंगे इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करने पर निर्भर करता है, जिनमें से दोनों त्रुटियां कर सकते हैं। रक्त कोशिका संख्या का आकलन करने के लिए अतिरिक्त तरीकों का विकास किफायती, तेज होगा, और यहां तक कि CRISPR-मध्यस्थता आनुवंशिक संशोधन, मॉर्फोलिनो-मध्यस्थता प्रतिलिपि में कमी के प्रभाव का आकलन करने के लिए स्वचालित किया जा सकता है, और बड़े पैमाने पर हेमेटोपोइसिस को प्रभावित करने वाले दवा यौगिकों का प्रभाव। रक्त कोशिकाओं को मात्रा निर्धारित करने के लिए यह उपन्यास परख पूरे जेब्राफिश भ्रूण को अलग करके और फ्लोरोसेंट रूप से लेबल की गई रक्त कोशिकाओं की मात्रा का विश्लेषण करके किया जाता है। इन परखों को भ्रूणजेनेसिस के दौरान रक्त कोशिका उत्पादन, विस्तार और विनियमन के लिए जिम्मेदार आणविक रास्तों की स्पष्टता की अनुमति नुसार होनी चाहिए, जो शोधकर्ताओं को रक्त रोगों के दौरान बदले गए उपन्यास कारकों की खोज करने की अनुमति देगा, साथ ही कशेरुकी हेमेटोपोसिस के विकास के दौरान आवश्यक रास्ते भी।

Introduction

रक्त उत्पादन (हेमेटोपोइसिस) एक आवश्यक विकास प्रक्रिया है जो पहले शुरुआती भ्रूण में शुरू होती है। यह प्रक्रिया मेसोडर्म से सीधे आदिम लाल रक्त कोशिकाओं और मैक्रोफेज उत्पन्न करके शुरू होती है, और बाद में हेमेटोपोइटिक स्टेम और जनक कोशिकाओं (एचएसपीसी) के उत्पादन की ओर बदल जाती है। ये स्टेम सेल, जो मल्टीपॉटेंट होते हैं, जीव में परिपक्व रक्त कोशिकाओं की सभी किस्मों को उत्पन्न करते हैं। आत्म नवीकरण करने में सक्षम, प्रणाली लगातार इन HSPCs के माध्यम से मंगाया जाता है । हालांकि यह प्रक्रिया विकास में जल्दी शुरू होती है, फिर भी एनिमेटोपोस जानवर के जीवन के लिए जारी रहती है, शरीर के दूर के स्थलों तक ऑक्सीजन परिवहन करने की क्षमता प्रदान करती है, चोट के बाद रक्तस्राव को रोकने के लिए, और शरीर को संक्रमण से बचाने के लिए। इस जटिल प्रणाली का विकास विकास के दौरान अस्थायी और स्थानिक रूप से नियंत्रित किया जाता है और रक्त कोशिका उत्पादन में कोई भी क्षोभ जीव के लिए भयावह हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप एनीमिया, थ्रोम्बोसाइटोपेनिया, ल्यूकोपेनिया और ल्यूकेमिया हो सकता है।

हेमेटोपोइटिक अनुसंधान के लिए उपयोग किया जाने वाला एक लोकप्रिय पशु मॉडल जेब्राफिश(डैनियो रेरियो)है क्योंकि मनुष्यों की तुलना में उनका रक्त विकास समान है। वास्तव में, हेमेटोपॉइसिस के दौरान उपयोग किए जाने वाले कई जीन और आणविक मार्ग कशेरुकी विकास में संरक्षित होते हैं, जिससे हम जेब्राफिश का अध्ययन करके मानव जीन के बारे में जानने की अनुमति देते हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि जेब्राफिश भ्रूण शरीर के बाहर विकसित होते हैं और 7 दिनों के भीतर सबसे परिपक्व रक्त कोशिका प्रकार उत्पन्न होते हैं, जिससे कम समय में हेमेटोपोइटिक सिस्टम के प्रत्यक्ष दृश्य की अनुमति होती है। ज़ेब्राफ़िश भी बेहद फेकंड हैं, जो शोधकर्ताओं को कम समय सीमा में बड़ी संख्या में नमूनों का निरीक्षण करने की अनुमति देता है, जो प्रजनन योग्य डेटा उत्पन्न करने के लिए भी महत्वपूर्ण है। ज़ेब्राफ़िश के कम पीढ़ी के समय और बाहरी विकास में आसान हेरफेर और अवलोकन का प्रावधान है म्यूटेनेसिस अध्ययन 1 ,2,3,4,5 और दवा स्क्रीनिंग6, 7,8, 9,10केदौरान। यह मानव रक्त विकारों के लिए आशाजनक चिकित्सीय यौगिकों के एक पैनल को जल्दी और कुशलता से परीक्षण करने की अनुमति देता है।

महत्वपूर्ण बात यह है कि जेब्राफिश भी आनुवंशिक रूप से उत्तरदायी हैं, और जीनोम अनुक्रम और एनोटेट किया जाता है। यह ट्रैकेबिलिटी रिवर्स जेनेटिक्स तकनीकों जैसे कि मॉर्फोलिनो-(एमओ-) मध्यस्थता नॉकडाउन और CRISPR-मध्यस्थता आनुवंशिक एब्लेशन को करने की अनुमति देता है। ज़ेब्राफ़िश ने भी जेनेटिक स्क्रीन को आगे करने के लिए एक मॉडल के रूप में अपनी उपयोगिता साबित की है; कशेरुकी रक्त निर्माण में शामिल कई आवश्यक जीन और रास्तों की इस तरह से खोज की गई है । जेब्राफिश में रक्त कोशिकाओं को देखने के कई तरीके भी विकसित किए गए हैं। जबकि पारंपरिक हिस्टोलॉजिकल धुंधला तकनीक मौजूद है, रक्त-विशिष्ट प्रतिलिपियों के लिए सीटू संकरण में प्रदर्शन करना भी संभव है। महत्वपूर्ण बात यह है कि मछलियों की कई ट्रांसजेनिक लाइनें भी मौजूद हैं जिससे फ्लोरोसेंट प्रोटीन वंश-विशिष्ट प्रमोटरों द्वारा व्यक्त किए जाते हैं, जिससे फ्लोरोसेंट प्रोटीन11के साथ विशिष्ट रक्त कोशिकाओं की लेबलिंग की अनुमति होती है। यह शोधकर्ताओं को समय के साथ एक जीवित जीव में रक्त कोशिका उत्पत्ति, विस्तार और विनियमन के अप-टू-मिनट अवलोकन करने की अनुमति देता है।

कुल मिलाकर, हेमेटोपोइटिक सिस्टम का संरक्षण, ट्रांसजेनिक लाइनों की उपस्थिति और आसान विकास, आसान दृश्य, और कम पीढ़ी के समय ने जेब्राफिश को हेमेटोपोइसिस का एक किफायती, तेज और अनुकूलनीय मॉडल बना दिया है। जेब्राफिश शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध तकनीकों के टूलबॉक्स में सुधार करने के लिए, हमने भ्रूण में रक्त कोशिकाओं की संख्या को मजबूती से निर्धारित करने के लिए इस परख को विकसित किया। इस विधि में ट्रांसजेनिक जानवरों को पचाने और फ्लोरोसेंट रक्त कोशिकाओं के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का प्रदर्शन करना शामिल है। इस तरह, उत्परिवर्ती जानवरों से रक्त कोशिकाओं, एमओ और CRISPR संशोधन के प्रभाव, और छोटे अणुओं के प्रभाव को मात्रात्मक रूप से त्वरित और प्रजनन तरीके से विश्लेषण किया जा सकता है। ये परख रक्त कोशिकाओं की गणना करने के लिए उपयोगकर्ता के अनुकूल और किफायती तरीके हैं, जिससे समय के साथ उनकी पीढ़ी, प्रसार और रखरखाव की जांच की अनुमति होती है।

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Protocol

कैलिफोर्निया स्टेट यूनिवर्सिटी, चिको में इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (IACUC) एडवाइजरी बोर्ड ने नीचे वर्णित सभी तरीकों को मंजूरी दी ।

नोट: यह 1-फिनाइल 2-थिओरिया (पीटीयू) के साथ भ्रूण का इलाज करने की सलाह दी जाती है; तालिका 1) पिगमेंटेशन को रोकने के लिए 24 घंटे बाद पोस्टफर्टिलाइजेशन (एचपीएफ) जो प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा फ्लोरेसेंस भेदभाव को नकारात्मक रूप से प्रभावित करता है। नीचे सूचीबद्ध सभी प्रक्रियाएं प्रवाह साइटोमेट्री और फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई (FACS) के लिए स्वीकार्य हैं। हालांकि, यदि किसी का लक्ष्य FACS के बाद हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं को संस्कृति देना है, तो नमूनों को संसाधित करते समय बाँझ प्रथाओं का पालन करें। भ्रूण के नमूनों को बाँझ तरीके से ब्लीचिंग और तैयार करने का प्रोटोकॉल पहले12वर्णित किया गया है .

1. 48 एचपीएफ जेब्राफिश भ्रूण का डिकेरेशन

  1. भ्रूण के साथ (कम से कम 5, लेकिन कोई 200 से अधिक भ्रूण) एक 10 सेमी प्लास्टिक पेट्री पकवान में, पकवान झुकाव इतना है कि भ्रूण नीचे किनारे करने के लिए सिंक।
    नोट: इसके ढक्कन को हटाकर और पेट्री डिश के एक किनारे के नीचे ढक्कन रखकर डिश को झुकाना आसान है ।
  2. जितना संभव हो उतना E3 माध्यम(तालिका 1)निकालें और त्यागें और 500 माइक्रोन डालेंल ऑफ डेकोरियोनेशन प्रोटीज (10 मिलीग्राम/एमएल) जोड़ें। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
  3. 5 मिनट के बाद, पेट्री डिश (प्लेट के निचले किनारे पर सभी भ्रूण रखते हुए), और धीरे पेट्री पकवान के पक्ष नल, भ्रूण धीरे थाली के नीचे के खिलाफ रगड़ करने के लिए पूरी तरह से chorions हटाने की अनुमति उठाओ ।
  4. एक निचोड़ बोतल के साथ, प्रोटीज को पतला करने के लिए ई 3 माध्यम के ~ 20 एमएल जोड़ें। भ्रूण को व्यवस्थित करने और डिकंटिंग करके E3 माध्यम को हटाने की अनुमति दें।
  5. डेकोशन प्रोटीज के सभी निशानों को हटाने के लिए चरण 1.4 3x दोहराएं।
    नोट: प्रत्येक व्यक्ति के नमूने का विश्लेषण करने के लिए, कम से कम 5 भ्रूण की आवश्यकता होती है। यह डिकेरेशन प्रक्रिया पेट्री डिश प्रति 200 भ्रूण तक समायोजित कर सकती है। नमूनों को इस स्तर पर समूहित किया जा सकता है और यदि वांछित हो तो बाद में अलग किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, मैन्युअल डिकेरियोशन को वॉचमेकर के संदंश के साथ धीरे-धीरे फाड़कर किया जा सकता है। यह लाभप्रद है जब भ्रूण की छोटी संख्या होती है। आमतौर पर जेब्राफिश 72 एचपीएफ द्वारा अपने कोरियोन्स से निकल जाएगी। गंभीर रूप से विकृत भ्रूण, हालांकि, नहीं हो सकता है, और उस समय के बाद डिकोरियोनेशन (या तो मैनुअल या रासायनिक) की आवश्यकता होगी।

2. वियोजन के लिए भ्रूण के नमूने तैयार करना

  1. पी1000 पिपेट का उपयोग करके, 5−10 भ्रूणों को एक 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में रखें।
  2. एक पिपेट के साथ E3 माध्यम निकालें और त्यागें।
    सावधानी: भ्रूण के रूप में देखभाल के साथ पिपेट आसानी से निम्नलिखित चरणों के दौरान खारिज किया जा सकता है।
  3. भ्रूणीय जेब्राफिश 11 , 12, 13, 14 के आसपास बलगम कोटिंग को हटाने के लिए ई 3 माध्यम में10m m dithiothreitol (DTT)के 1ml जोड़ें । माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब को क्षैतिज रूप से बिछाएं, और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।

3. भ्रूण वियोजन

  1. डीटीटी के निशान को हटाने के लिए सीए 2 + और एमजी2 + के साथ दुलबेको के फॉस्फेट बफर खारा (डीपीबीएस) के1 एमएल के साथ भ्रूण 3x धोएं। अंतिम धोने के बाद सीए 2 + और एमजी2 + के साथ डीपीबीएस के500 माइक्रोन और 5 मिलीग्राम/एमएल (26 यू/एमएल) के 5 माइक्रोन जोड़ें।
    नोट: अन्य आइसोटोनिक बफर समाधानों का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन उनके पास सहीतरीके से काम करने के लिए वियोजन एंजाइम के लिए सीए 2 + और एमजी2 + होना चाहिए।
  2. 60 मिनट के लिए 185 आरपीएम पर एक क्षैतिज कक्षीय शेखर पर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट नमूने। एक P1000 पिपेट के साथ ट्रिटरेट भ्रूण जब तक नमूने पूरी तरह से अलग कर रहे हैं ।
    सावधानी: भ्रूण को अधिक नहीं करने का ध्यान रखें; कुछ ठोस ऊतक मौजूद होना चाहिए, और यह पूरी तरह से समरूप नहीं होना चाहिए। यह अतिडिगेस्ट करना संभव है, जो प्रवाह साइटोमीटर(पूरक चित्र 1)पर देखे जाने वाले लक्षित रक्त कोशिकाओं को नष्ट कर देगा।
    नोट: यह प्रक्रिया 48−72 एचपीएफ भ्रूण के लिए सबसे अच्छा काम करती है। बाद के चरणों में वियोजन प्रोटीज़ के साथ अधिक इनक्यूबेशन की आवश्यकता हो सकती है। विभिन्न चरणों के लिए समय अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए । भ्रूणीय ऊतक को अलग करने के लिए जल्दी वैकल्पिक तरीके हैं, लेकिन यह अनुभवजन्य रूप से पाया जाता है कि यह विधि, हालांकि इसमें 60 मिनट लगते हैं, कोमल और पूरी तरह से लाइव हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं के कुशल अलगाव की अनुमति देने के लिए पर्याप्त है।

4. प्रवाह साइटोमेट्री के लिए वियोजन भ्रूण की तैयारी

  1. एक 35 μmM सेल छलनी टोपी के साथ एक 5 एमएल पॉलीस्टीरिन गोल नीचे ट्यूब के शीर्ष जलाशय पर 5 अलग भ्रूण pipette।
  2. फ़िल्टर की कोशिकाओं वाले 5 एमएल पॉलीस्टीरिन ट्यूब के छलनी कैप में कोई सीए2 + या एमजी2 + के साथ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 4 एमएल जोड़कर कोशिकाओं को कुल्ला।
    नोट: अन्य आइसोटोनिक बफर समाधानों का भी उपयोग किया जा सकता है, लेकिन उन्हें वियोजन एंजाइम को कमजोर करने और अप्रभावी बनाने के लिए सीए 2+ या एमजी2 + की कमी होनी चाहिए।
  3. कोशिकाओं को गोली मारने के लिए 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और 300 x ग्राम पर सेंट्रलाइज ट्यूब। एक पिपेट के साथ, हटा दें और सुपरनैट्ट को छोड़ दें। पीबीएस के 500 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें (सीए2 + या एमजी2 +के साथ)।

5. फ्लो साइटोमेट्री

  1. धीरे-धीरे सेल निलंबन को भंवर में डालें और 1:1,000 लाल मृत कोशिका दाग(सामग्रियों की तालिका)जोड़ें।
    नोट: लाल मृत कोशिका दाग एक सेल-पारगरम डाई है जो लक्षित कोशिकाओं से मृत कोशिकाओं और मलबे के बहिष्कार की अनुमति देता है और मृत कोशिका भेदभाव के लिए डाई का एक उत्कृष्ट विकल्प है, क्योंकि यह 633 एनएम लेजर से उत्साहित है, जो 488 एनएम लेजर से अलग है जो आम फ्लोरोफोरस जैसे ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ग्एफपी) और डीरेड को उत्तेजित करने के लिए उपयोग किया जाता है। इस तरह मृत कोशिकाओं और ट्रांसजेनिक रक्त कोशिकाओं से कोई स्पेक्ट्रल ओवरलैप नहीं होता है। 1 मिलीग्राम/एमएल पर प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) लाल मृत कोशिका दाग के लिए एक सस्ता विकल्प है, लेकिन केवल पीआई के साथ-साथ केवल उपकरण मुआवजा निर्धारित करने के लिए ब्याज के फ्लोरोफोर के साथ नमूनों के साथ कुछ नमूनों को आरक्षित करना सुनिश्चित करें । अन्यथा, जीएफपी जैसे पीआई और फ्लोरोफोरस के संकेत ओवरलैप हो जाएंगे, जिसके परिणामस्वरूप झूठे-सकारात्मक परिणाम सामने आएंगे। अगर फ्लो साइटोमीटर में भी 405 एनएम लेजर है तो ब्लू डैड सेल दाग जैसे अन्य रंग भी एक बेहतरीन विकल्प हैं।
    सावधानी: रक्त कोशिकाओं का विश्लेषण करते समय, ध्यान दें कि 30 मिनट के बाद कुछ सेल प्रकार लाल मृत कोशिका दाग को फगोसाइटोज करना शुरू कर देंगे। कोशिकाओं को प्रकाश से और बर्फ पर विश्लेषण तक सुरक्षित रखें और डाई को जोड़ने के 30 मिनट के भीतर प्रवाह साइटोमेट्री करें।
  2. फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण
    नोट: हर प्रवाह साइटोमीटर थोड़ा अलग है, लेकिन निम्नलिखित कदम अधिकांश मशीनों पर विश्लेषण के लिए नमूने तैयार करने में सहायता करेंगे। साइटोमेट्री प्रवाह करने के लिए नए उपयोगकर्ताओं के लिए, किसी ऐसे व्यक्ति की सलाह लें जो उपकरणों के विशेष टुकड़े पर विशेषज्ञ है। निम्नलिखित निर्देश बीडी फेसरिया फ्यूजन फ्लो साइटोमीटर से संबंधित हैं।
    1. साइटोमीटर चालू करें और लेजर को 20 मिनट तक गर्म करने की अनुमति दें। खाली अपशिष्ट टैंक, उचित समाधान के साथ म्यान टैंक भरें (प्रवाह साइटोमीटर के आधार पर भिन्न होता है) और तरल पदार्थ प्रणाली शुरू करें।
      नोट: आमतौर पर प्रत्येक प्रकार के प्रवाह साइटोमीटर के लिए एक विशेष स्टार्टअप प्रक्रिया होती है; उस स्टार्टअप प्रक्रिया का सावधानीपूर्वक पालन करें।
    2. विश्लेषण सॉफ्टवेयर में, पांच भूखंडों(चित्रा 1A)ड्रा ।
      1. वाई एक्सिस पर एक्स एक्सिस और साइड स्कैटर (एसएससी) पर पहला डॉट प्लॉट स्कैंप फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी) रखें। लॉग के रूप में रैखिक और एसएससी के रूप में एफएससी सेट करें।
        नोट: एफएससी सेल आकार का एक माप है, और एसएससी दानेदारता का एक माप है; यह मलबे से कोशिकाओं के भेदभाव की अनुमति देगा । भ्रूणीय जेब्राफिश रक्त कोशिका आबादी आकार और दानेदारता से उसी तरह अलग नहीं होती, जैसे वयस्क जेब्राफिश रक्त कोशिकाओं को पहले वर्णितकिया गयाथा । इसके बजाय वे अन्य सभी पचा भ्रूण कोशिकाओं के साथ एक ही आबादी में दिखाई देगा।
      2. एफएससी ऊंचाई (एच) बनाम एफएससी चौड़ाई (डब्ल्यू) की जांच करने के लिए दूसरा प्लॉट सेट करें। एसएससी (एच) बनाम एसएससी (डब्ल्यू) को मापने के लिए तीसरी साजिश निर्धारित करें ।
        नोट: इस कदम का उपयोग डबल्स (कोशिकाओं को बाहर करने के लिए किया जाता है जो लेजर से गुजरने पर एक साथ अटक जाते हैं)।
      3. एक्स एक्सिस पर लाल मृत कोशिका दाग को मापने के लिए चौथी डॉट प्लॉट सेट करें (साइटोमीटर के आधार पर यह आमतौर पर एलोफिसियाइन [एपीसी]) और वाई एक्सिस पर एसएससी के लिए उपयोग किए जाने वाले फिल्टर के बराबर होता है। इससे मृत कोशिकाओं से जीवित कोशिकाओं के भेदभाव की अनुमति मिलेगी ।
        नोट: प्रत्येक साइटोमीटर के फ़िल्टर सेट अलग हो सकते हैं। मृत सेल भेदभाव डाई के लिए सही पहचान फिल्टर का उपयोग करना सुनिश्चित करें।
      4. पांचवां भूखंड पसंद के फ्लोरोफोर को मापता है। इसे फ्लोरोफोर(चित्रा 1)के हिस्टोग्राम के रूप में कल्पना करें या डॉट प्लॉट(पूरक चित्रा 2)का उपयोग करें।
        नोट: एक ही जानवर में एक से अधिक फ्लोरोफोर की जांच करते समय, एक ही समय में दोनों मापदंडों को देखने के लिए डॉट प्लॉट का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। यदि कोई मौका है कि फ्लोरोफोरस एक दूसरे के साथ स्पेक्ट्रल ओवरलैप है(पूरक चित्रा 2),एक डॉट प्लॉट की भी सिफारिश की जाती है। सभी मापदंडों के लिए साइटोमीटर की लेजर पल्स द्वारा उत्पन्न वक्र के तहत क्षेत्र की गणना करने के लिए क्षेत्र (ए) सेटिंग्स का उपयोग करें, क्योंकि वे अधिक सटीक हैं।
    3. नमूना लोड करें और प्रवाह दर को कम करें ताकि नमूना तेजी से बाहर न चल सके। एफएससी और एसएससी सेटिंग्स को समायोजित करें ताकि सेल की अधिकांश आबादी स्पष्ट रूप से देखी जा सके(चित्रा 1 ए)।
    4. सेल आबादी के चारों ओर एक गेट ड्रा और यह कोशिकाओं लेबल। यह सुनिश्चित करना कि दूसरा डॉट प्लॉट कोशिकाओं पर गेट किया गया है, एफएससी पर पहले गेटिंग करके डबल्स को बाहर करें और फिर एसएससी सिंगल्स पर।
    5. चौथे प्लॉट पर लाल मृत कोशिका दाग सेटिंग्स को समायोजित करें ताकि स्पष्ट रूप से एक नकारात्मक आबादी हो। इन कोशिकाओं के चारों ओर एक गेट ड्रा करें, और उन्हें लाइव कोशिकाओं को लेबल करें। पांचवें भूखंड पर, जीवित कोशिकाओं पर गेट और फ्लोरोफोर नकारात्मक और सकारात्मक कोशिकाओं की जांच करें। सकारात्मक कोशिकाओं के चारों ओर एक गेट खींचें।
      नोट: यह पदानुक्रमित गेटिंग रणनीति एकल फ्लोरोफोर+ कोशिकाओं की जांच करती है जो लाइव कोशिकाओं के गेट में रहते हैं, जो सेल गेट में भी रहते हैं। ठीक से गेट सेट करने का ध्यान रखें। प्रयोग के आधार पर इन द्वारों को अनुकूलित किया जा सकता है।
    6. प्रत्येक नमूना चलाएं, कम से कम 25,000 लाइव सेल घटनाओं का संग्रह करें।
    7. तरल पदार्थों को बंद करने के लिए शटडाउन प्रक्रिया का पालन करें। म्यान टैंक फिर से भरना और अपशिष्ट टैंक खाली।
      नोट: प्रोटीन अभिव्यक्ति कम होने पर फ्लोरोफोर+ कोशिकाओं की कल्पना करना अक्सर मुश्किल होता है, या कोशिका की आबादी दुर्लभ होती है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि पैरामीटर ठीक से सेट किए जाते हैं, फ्लोरोफोर- सहोदर भ्रूण को ठीक से फाटकों को आकर्षित करने और लेजर वोल्टेज(पूरक चित्रा 2)को समायोजित करने के लिए तैयार किया जाना चाहिए। यदि लक्ष्य सेल की आबादी दुर्लभ है, तो 25,000 से अधिक घटनाओं को इकट्ठा करें। 5−10 पचा जानवरों के साथ, किसी को लाखों घटनाओं को इकट्ठा करने में सक्षम होना चाहिए। इन आंकड़ों के साथ फ्लोरोफोर+ कोशिकाओं की कुल संख्या भी प्राप्त की जा सकती है। बस एक हीमोसाइटोमीटर के साथ नमूने में कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना करें और प्रति मछली फ्लोरोफोर+ कोशिकाओं की पूर्ण संख्या प्राप्त करने के लिए फ्लोरोफोर+ कोशिकाओं के प्रतिशत को गुणा करें।

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Representative Results

भ्रूण जेब्राफिश में लाल रक्त कोशिकाओं की गणना करने के लिए, lcr:GFP16 भ्रूण पीबीएस, ७.० एनजी/nL ism1 एमओ, या ७.० एनजी/nL ism1 एमओ के साथ एक सेल चरण में इंजेक्शन थे ७.० एनजी ism1 mRNA12। 48 एचपीएफ में वे पचा गए और प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के अधीन थे। प्रत्येक नमूने से जीएफपी+ लाल रक्त कोशिकाओं के प्रतिशत का विश्लेषण करने के बाद (प्रत्येक नमूना 5 बेतरतीब ढंग से चयनित भ्रूण है; चित्रा 1A),सभी नियंत्रण समूह के औसत की गणना की गई थी। यह औसत 1के रूप में निर्धारित किया गया था, और सभी प्रतिशत उस संदर्भ बिंदु से गणना की गई थी । इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि एक विशिष्ट एमओ के साथ ism1 ट्रांसक्रिप्ट को कम करने से ४८ एचपीएफ भ्रूण में मौजूद जीएफपी+ लाल रक्त कोशिकाओं की संख्या कम हो गई । इसके अतिरिक्त, बहिर्जात mRNA के साथ ism1 के स्तर में इस कमी को बचाने के सामांय करने के लिए लाल रक्त कोशिकाओं की संख्या वापस आ गया ।

Figure 1
चित्रा 1: ism1 एमओ भ्रूणजेनेसिस के दौरान उत्पादित लाल रक्त कोशिकाओं की संख्या को कम करता है । (ए) lcr:GFP16 भ्रूण पीबीएस के साथ इंजेक्शन और प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के अधीन थे । सबसे पहले, आकार और दानेदारता निर्धारित की गई थी, और ब्याज की सेल आबादी(कोशिकाओं,बाएं पैनल) के आसपास एक गेट खींचा गया था। फिर, एफएससी एच और एफएससी डब्ल्यू का मूल्यांकन एक साथ अटकी कोशिकाओं को खत्म करने के लिए किया गया(सिंगल्स एफएससी)। एसएससी एच और डब्ल्यू का मूल्यांकन भी किया गया था ताकि एक साथ अटकी कोशिकाओं(सिंगल्स एसएससी)का मूल्यांकन करने की संभावना को कम किया जा सके । तब जीवित कोशिकाओं(जीवितकोशिकाओं) को निर्धारित करने के लिए लाल फ्लोरेसेंस की जांच की गई थी। अंत में, जीएफपी फ्लोरेसेंस (राइट पैनल) के लिए लाइव कोशिकाओं की जांच की गई। (ख) एलसीआर:जीएफपी12 भ्रूणों को विकास के एक-सेल-चरण में पीबीएस (नियंत्रण, हलकों), ism1 MO(ism1 MO, चौकों), या ism1 MO + ism1 mRNA12 (बचाव, त्रिकोण) के साथ इंजेक्ट किया गया था । 48 घंटे के बाद, उन्हें एकत्र किया गया, पचाया गया, और पैनल ए में दिखाए गए प्रवाह साइटोमेट्री के अधीन किया गया। प्रत्येक बिंदु पांच बेतरतीब ढंग से चुना व्यक्तिगत भ्रूण का प्रतिनिधित्व करता है । गुना परिवर्तन की गणना नियंत्रण नमूने की जीएफपी+ कोशिकाओं के औसत प्रतिशत को लेने और 1 के रूप में स्थापितकरके की जाती है । अन्य सभी नमूने उस औसत की तुलना में हैं। * पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.005, और एन. एस. = महत्वपूर्ण नहीं है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

विलयन सामग्री नोट्स
E3 मध्यम (50x) 14.61 ग्राम एनएसीएल, 0.63 ग्राम केसीआई, 1.99 ग्राम एमजीएसओ4·7एच2ओ, 1.83 ग्राम सीएसीएल2· 2H2O एक 2 एल स्नातक सिलेंडर के लिए, सामग्री और पर्याप्त आसुत पानी जोड़ने के लिए 1 एल करने के लिए कुल मात्रा लाने के लिए ।
E3 मध्यम (1x) 50x E3 के 40 एमएल एक 2 एल स्नातक सिलेंडर के लिए, 2 एल करने के लिए कुल मात्रा लाने के लिए पर्याप्त आसुत पानी जोड़ें ।
1-फिनाइल-2-थिओरिया (पीटीयू) E3 माध्यम में 2 एल बोतल में 50x E3 का 40 एमएल, पीटीयू का 40 मिलीग्राम एक 2 एल स्नातक सिलेंडर के लिए, 2 एल करने के लिए कुल मात्रा लाने के लिए पर्याप्त आसुत पानी जोड़ें ।  पीटीयू को पूरी तरह से भंग करने के लिए कम से कम 2 दिनों तक हिलाएं।

तालिका 1: समाधान के लिए व्यंजनों।

पूरक चित्रा 1:वियोजन प्रोटीज के साथ भ्रूण का पाचन। 10 भ्रूणों की छवियां पर्याप्त पाचन (मध्य; पचाने) के बाद ठीक से पचा नहीं पाई गईं और अतिरिक्त पाचन के बाद (दाएं; अतिविभाजी) । इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 2: 5डीपीएफ भ्रूण में दो फ्लोरोफोरस का मूल्यांकन। गेट्स को एफएससी और एसएससी का मूल्यांकन करने के लिए तैयार किया गया थाताकि ब्याज की सेल आबादी(कोशिकाओं,बाएं कॉलम) का मूल्यांकन किया जा सके, लाइव कोशिकाओं(लाइव,मध्य कॉलम), और फ्लोरोफोर अभिव्यक्ति(एमपीएक्स:जीएफपी17 और gata1:D रेड15)का निर्धारण करने के लिए । सबसे पहले, गेट्स एक जानवर है कि कोई फ्लोरोफोरस (शीर्ष पंक्ति) है पर सेट किया गया । फिर एमपीएक्स:जीएफपी+ (कोई gata1:D sRed) जानवरों के लिए गेट और GFP (दूसरी पंक्ति) के लिए मुआवजा सेट मूल्यांकन किया गया । Gata1:D sRed+ (कोई mpx:GFP के साथ) जानवरों के फाटक और DsRed (तीसरी पंक्ति) के लिए मुआवजा निर्धारित करने के लिए मूल्यांकन किया गया । अंत में, दो रंगों का मूल्यांकन डबल पॉजिटिव जानवरों में किया जा सकता है जो एमपीएक्स:जीएफपी+ और gata1:D sRed+हैं। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

ज़ेब्राफ़िश आदिम और निश्चित कशेरुकी हेमेटोपोइस का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली है। पिछले कुछ दशकों में, कई परख विकसित और परिष्कृत किया गया है, जेब्राफिश दवाओं के परीक्षण के लिए एक त्वरित और किफायती मॉडल बनने के लिए अनुमति देता है, पैदा करने और आनुवंशिक म्यूटेंट का परीक्षण, और कुल मिलाकर शोधकर्ताओं को हेमेटोपोइसिस के लिए आवश्यक आणविक रास्ते का विश्लेषण करने की अनुमति । यह प्रोटोकॉल भ्रूणीय ज़ेब्राफ़िश का उपयोग करता है जो त्वरित डेटा संग्रह, वयस्क जानवरों की तुलना में कम भौतिक स्थान का उपयोग, और बड़े पैमाने पर रासायनिक स्क्रीन के लिए कम दवाओं का उपयोग करने की अनुमति देता है। यह एमआरएनए के अतिव्यवहार, CRISPR म्यूटेंट की पीढ़ी और मो-प्रेरित ट्रांसक्रिप्ट कमी के बाद प्रारंभिक भ्रूणीय विकास के दौरान होने वाले विशिष्ट आनुवंशिक मार्गों को बदलने के लिए क्वांटिटेशन की अनुमति भी देता है। महत्वपूर्ण बात, यह रक्त कोशिकाओं के संवेदनशील, मजबूत मात्रा की अनुमति देता है, जो सीटू संकरण या हिस्टोलॉजिकल धुंधला तकनीकों में करना मुश्किल है।

यह परख लचीला है और कई शोध सवालों के जवाब देने के लिए संशोधित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का एक संशोधन किया जा सकता है जिससे जानवर के विकास के चरण को विभिन्न रक्त कोशिका प्रकारों की मात्रा निर्धारित करने के लिए हेरफेर किया जाता है। उदाहरण के लिए, लाल रक्त कोशिकाएं जेब्राफिश विकास में जल्दी उत्पन्न होती हैं, और ट्रांसजेनिक जानवरों जैसे एलसीआर:जीएफपी16 ट्रांसजेनिक लाइन का पता 16-सोमाइट चरण के रूप में जल्दी लगाया जा सकता है। यदि कोई थ्रोम्बोसाइट्स का अध्ययन करने में रुचि रखता है, हालांकि, itga2b:GFP18 (जिसे सीडी 41:जीएफपीके रूप में भी जाना जाता है) ट्रांसजेनिक लाइन 48 एचपीएफ पर जीएफपी व्यक्त करना शुरू करती है, जिसमें परिपक्व परिसंचारी थ्रोम्बोसाइट्स 72 एचपीएफ में देखी जाती हैं। यदि कोई इस परख के साथ बी कोशिकाओं को निर्धारित करना चाहता है तो इसे आईजीएमके साथ किया जा सकता है: ईजीएफपी19 ट्रांसजेनिक जानवर 20 डीपीएफ के करीब। महत्वपूर्ण बात यह है कि इस परख का उपयोग समय के साथ रक्त कोशिकाओं का पालन करने के लिए भी किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, 24 एचपीएफ, 48 एचपीएफ, 72 एचपीएफ में एलसीआर:जीएफपी+ कोशिकाओं की संख्या का विश्लेषण करके, कोई भी यह निर्धारित कर सकता है कि आनुवंशिक संशोधन (या दवा) लाल रक्त कोशिकाओं के रखरखाव को विनियमित कर रहा है बनाम सिर्फ उनकी पीढ़ी।

ये परख शोधकर्ताओं को CRISPR या MOs के साथ जीन अभिव्यक्ति को कम करने या विकास के एक सेल चरण में mRNA इंजेक्शन द्वारा जीन अभिव्यक्ति overexpress और सही इन संशोधित भ्रूण में उत्पादित रक्त कोशिकाओं की संख्या की तुलना करने की अनुमति देते हैं । देखभाल हमेशा गैर विशिष्ट गाइड RNAs या बेमेल एमओ के साथ सहोदर जानवरों इंजेक्शन और प्रयोगात्मक समूहों के साथ उनके रक्त की जांच करके एक ही समय में इन प्रयोगों के लिए उचित नियंत्रण प्रदर्शन करने के लिए लिया जाना चाहिए । विकास का स्तर महत्वपूर्ण है; विकास के दौरान केवल कुछ घंटों के परिवर्तन एक भ्रूण में मौजूद रक्त कोशिकाओं की बेहद अलग संख्या दिखा सकता है । दूसरे शब्दों में, भ्रूण की तुलना करते समय विकास के घंटों की सावधानीपूर्वक निगरानी करना सुनिश्चित करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि भ्रूण उम्र के मिलान वाले हैं, रूपात्मक संकेतों का उपयोग किया जाना चाहिए। शुरुआती भ्रूणों में, उम्र-मैच के लिए सोमाइट्स की गिनती पर विचार करें। बाद में विकास में, अन्य मार्कर जैसे दिल की धड़कन की शुरुआत, ओटिक वेसिकल का आकार, या शरीर की लंबाई का उपयोग मछली को नियंत्रित करने के लिए संशोधित मछली के चरणों से मेल खाने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, कुल कोशिकाओं की संख्या पचा भ्रूण से गणना की जा सकती है सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं की एक ही संख्या प्रयोगात्मक और नियंत्रण जानवरों में मौजूद हैं । आनुवंशिक संशोधन की जांच करने के लिए इन परख का उपयोग करने के अलावा, इन परख को बड़े पैमाने पर दवा स्क्रीन करने के लिए भी संशोधित किया जा सकता है। भ्रूण विकास के दौरान अस्थायी यौगिकों की विभिन्न सांद्रता को उजागर किया जा सकता है देखने के लिए कि क्या प्रश्न में रसायनों हेमेटोपोइसिस पर कोई प्रभाव पड़ता है। यदि प्रयोग किसी विशेष दवा के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, तो वाहन के साथ इलाज किए गए जानवरों को केवल नियंत्रण के रूप में भी शामिल किया जाना चाहिए। इन तरीकों से, शोधकर्ता यह निर्धारित कर सकते हैं कि विशिष्ट जीन या सिग्नलिंग रास्ते के लाभ या हानि-कार्य हेमेटोपोइसिस में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं या नहीं ।

यह आवश्यक है कि विभिन्न ट्रांसजीन की जांच करते समय कि प्रति नमूने पचाए गए जानवरों की संख्या अनुकूलित है; बहुत कम जानवर कम या कोई फ्लोरेसेंस उत्पन्न कर सकते हैं। यह विशेष रूप से सच है जब एचएसपीसी की जांच जो एक विशेष समय बिंदु पर प्रचुर मात्रा में नहीं हैं । यह भी महत्वपूर्ण है जब ट्रांसजेनिक्स कि कमजोर प्रमोटरों फ्लोरेसेंस ड्राइविंग की जांच । इन मुद्दों का प्रतिकार करने के लिए अधिक जानवरों (और इसलिए, अधिक कोशिकाओं) सटीक गिनती के लिए आवश्यक हैं । विकास के चरणों में फेरबदल करते समय, पाचन समय को अनुकूलित करना भी महत्वपूर्ण है। यह प्रोटोकॉल प्रति ट्यूब 5 व्यक्तिगत 48 एचपीएफ भ्रूण के लिए अनुकूलित है। अधिक परिपक्व भ्रूण पचाने की संभावना लंबे समय की आवश्यकता होगी ।

प्रक्रिया के दौरान कुछ संभावित समस्याएं उत्पन्न हो सकती हैं। यदि कोई फ्लोरेसेंस नहीं देखा जाता है, तो साइटोमीटर के साथ एक तकनीकी मुद्दा हो सकता है जिसे हल करने की आवश्यकता है। इस कारण से, यह सत्यापित करना आवश्यक है कि भ्रूण माइक्रोस्कोप के नीचे जल्दी से जांच करके प्रक्रिया शुरू करने से पहले फ्लोरोसेंट हैं। एक और आम मुद्दा भ्रूण को अधिक पचा रहा है, जो कोशिकाओं को नष्ट कर देता है। पाचन चरण पर ध्यान रखें और यदि बहुत अधिक मृत कोशिकाओं को देखा जाता है तो समय को बदल दें।

इन परख की कुछ सीमाएं हैं । सबसे बड़ा मुद्दा यह है कि ये परख ट्रांसजेनिक मार्कर की अभिव्यक्ति पर निर्भर हैं । संभवतः ट्रांसजेनिक मार्कर की अभिव्यक्ति के परिवर्तन क्या भ्रूण में होने वाली है के जीव विज्ञान को प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है । इसके अतिरिक्त, यदि लक्ष्य कोशिका आबादी बहुत कम है तो कोशिकाओं को निर्धारित करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री सबसे अच्छी विधि नहीं हो सकती है। इन संभावनाओं से निपटने के लिए, सीटू या हिस्टोलॉजिकल धुंधला तकनीकों जैसे अन्य परख का उपयोग किया जा सकता है। यदि विशिष्ट एंटीबॉडी रुचि इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के सेल प्रकार के लिए मौजूद हैं, तो भी किया जा सकता है। भ्रूण भी वंश विशिष्ट जीन को मापने के लिए qRT-पीसीआर के अधीन किया जा सकता है, और अगर इन परख एक FACS मशीन पर प्रदर्शन कर रहे हैं, कोशिकाओं को अलग किया जा सकता है और भी अधिक संवेदनशील तरीकों के साथ व्यक्तिगत रूप से अध्ययन किया । इन मुद्दों को छोड़कर, यह मात्रात्मक प्रवाह साइटोमेट्री परख शोधकर्ताओं के लिए बहुत उपयोगी जानकारी उत्पन्न कर सकता है।

इन परखों के साथ, शोधकर्ताओं ने आसानी से कशेरुकी जानवरों में हेमेटोपोइटिक दोषों का पालन कर सकते हैं । एमओ या CRISPR के साथ आनुवंशिक रास्तों को संशोधित करने और फिर स्पष्ट करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री प्रदर्शन अगर जीन हेमेटोपोसिस में एक भूमिका निभाता है जल्दी किया जा सकता है और मात्रात्मक है । इसके अतिरिक्त, फॉरवर्ड जेनेटिक स्क्रीन (जब तक जानवरों में फ्लोरोसेंट टैग होता है) किया जा सकता है और दोषों का आकलन किया जा सकता है। जेब्राफिश भी बड़े पैमाने परदवा स्क्रीन6, 7, 8,9,10के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल बन गया है, कुशल दवा स्क्रीनिंग की अनुमति जीवित जीवों पर परख करने के लिए अगर दवाओं प्रभावोत्पादक है और अगर वे विकास/अस्तित्व पर नकारात्मक प्रभाव पड़ता है । रोबोटिक्स द्वारा बढ़ाए गए स्वचालित प्रवाह साइटोमेट्री तकनीक के साथ इस परख को युग्मित करने से यह और भी अधिक कुशल हो जाएगा20,21,22,वास्तव में बड़े पैमाने पर विश्लेषण और रक्त कोशिका उत्पत्ति, विकास और विनियमन में महत्वपूर्ण रास्तों की स्क्रीनिंग की अनुमति देता है जो अस्पष्ट रहते हैं।

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Disclosures

D.L.S. एक वैज्ञानिक सलाहकार है और फिनलेस फूड्स, इंक और जाइटोजेन बायोटेक, इंक K.F.R. से मुआवजा प्राप्त हुआ है कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा की ।

Acknowledgments

वित्त पोषण स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा प्रदान किया गया था (NIH: R15 DK114732-01 D.L.S.), राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (NSF: एमआरआई १६२६४०६ से D.L.S.), और कैलिफोर्निया राज्य विश्वविद्यालय चिको में संमान कार्यक्रम से (K.F.R.) । लेखकों प्रयोगशाला प्रबंधन और प्रशासनिक सहायता के लिए कैथी जॉन्स के लिए Betsey Tamietti शुक्रिया अदा करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml MCF tube FisherBrand 05-408-129
10 mm Polystyrene easygrip Petri dish Corning Falcon 351008
5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap Corning Falcon 352235
BD FACSAria Fusion flow cytometer BD Biosciences
Dithiolthreitol (DTT) Sigma-Aldrich 646563
DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+ Life Technologies 14080-055
FBS 500 mL Gemini Bio-Products 100-108
HyClone PBS (1x) GE Healthcare Life Sciences sh30256.01
Librease Roche Sigma-Aldrich 5401119001 dissociation protease
Pronase Roche Sigma-Aldrich 11459643001 dechorionation protease
SYTOX Red Dead Cell Stain Invitrogen  S34859

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 170 रक्त कोशिकाएं जेब्राफिश मॉर्फिनोस CRISPR हेमेटोपोइसिस विकास स्टेम सेल प्रवाह साइटोमेट्री FACS
विकासशील जेब्राफिश में रक्त निर्माण का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करना
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Rueb, K. F., Stachura, D. L. Using… More

Rueb, K. F., Stachura, D. L. Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish. J. Vis. Exp. (170), e61035, doi:10.3791/61035 (2021).

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