Summary
Denne protokol beskriver brugen af makromolekylær fortrængning til at skabe en in vitro human hypertrofisk arvæv model, der ligner in vivo betingelser. Når de dyrkes i et overfyldt makromolekylært miljø, udviser hudfibroblaster fænotyper, biokemi, fysiologi og funktionelle egenskaber, der ligner arvæv.
Abstract
Det har vist sig, at in vivo væv er meget overfyldt af proteiner, nukleinsyrer, ribonukleoproteiner, polysaccharider, osv. Følgende protokol anvender en makromolekylær fortrængning (MMC) teknik til at efterligne denne fysiologiske fortrængning gennem tilsætning af neutrale polymerer (crowders) til cellekulturer in vitro. Tidligere undersøgelser ved hjælp af Ficoll eller dextran som crowders viser, at udtrykket af kollagen I og fibronectin i WI38 og WS-1 cellelinjer er væsentligt forbedret ved hjælp af MMC teknik. Men, denne teknik er ikke blevet valideret i primære hypertrofiske ar-afledte menneskelige hud fibroblaster (hHSFs). Som hypertrofisk ardannelse opstår fra overdreven aflejring af kollagen, denne protokol har til formål at konstruere en kollagen-rige i vitro hypertrofisk ar model ved at anvende MMC teknik med hHSFs. Denne optimerede MMC model har vist sig at have flere ligheder med in vivo arvæv sammenlignet med traditionelle 2-dimensionelle (2-D) cellekultur systemer. Desuden er det omkostningseffektivt, tidseffektivt og etisk ønskeligt i forhold til dyremodeller. Derfor, den optimerede model rapporteret her tilbyder en avanceret "in vivo-lignende" model for hypertrofisk ar-relaterede undersøgelser.
Introduction
Arvæv repræsenterer slutpunktet for vævreparation. Men, i mange individer, især dem, der lider af forbrændinger eller traumer1, ardannelse kan være overdreven og pålægge uønskede virkninger på morfologi og funktion af helbredt hud. Selv om de nøjagtige mekanismer for patologiske (hypertrofiske ar og keloids) ardannelse ikke er fuldt forstået, overdreven aflejring af kollagen under sårheling har vist sig at være et væsentligt bidrag2.
Det er veletableret, at omdanne vækstfaktor beta 1 (TGF-β1) og alpha glat muskel actin (αSMA) spiller centrale roller i dannelsen af hypertrofiske ar. Tyder på, at forhøjet TGF-β1 direkte stimulerer overdreven aflejring af kollagen via regulering af SMAD signalering vej3. Desuden har αSMA vist sig at bidrage til hypertrofisk ardannelse ved at regulere cellesammentrækning og reepithelialisering i sårhelingsprocessen4. Manglen på egnede in vitro- og in vivo-modeller er en væsentlig hindring for at udvikle og evaluere interventioner og behandlingsformer for aroprydning. Formålet med denne undersøgelse er at udnytte den eksisterende MMC teknik til at konstruere en "in vivo-lignende" hypertrofisk ar model, der er egnet til evaluering af nye og nye ar-relaterede interventioner.
Gengivelse levende væv uden for kroppen har været et mål i årevis i det videnskabelige samfund. Udviklingen af in vitro-teknikker i begyndelsen af det tyvende århundrede nåede til dels dette mål. Nuværende in vitro teknikker har lidt udviklet sig fra Roux oprindelige demonstration af, at embryonale celler kan overleve ex vivo i flere dage i varmt saltvand5. In vitro-metoder er dog for det meste begrænset til enkeltcelletyper, der dyrkes i 2D, og desammenfatter ikke nøjagtigt væv in vivo. Mens nyttige for at undersøge celle biokemi, fysiologi, og genetik, indfødte væv er 3-D og indarbejde flere celletyper. Simple 2D in vitro-systemer udsætter pattedyrceller for meget kunstige miljøer, hvor den oprindelige vævsspecifikke arkitektur går tabt6. Til gengæld påvirker dette intracellulære og ekstracellulære hændelser, hvilket resulterer i unormal cellemorfologi, fysiologi og adfærd7.
Interessen bag denne protokol ligger i udvikling og klinisk forvaltning af hypertrofiske ar og keloider. Selv om det er veletableret, at dermal fibroblaster er i vid udstrækning ansvarlig for den rigelige produktion af kollagener til stede i arvæv, dyrke dermal fibroblaster ved hjælp af 2-D in vitro-systemer undlader at reproducere omsætningen af kollagen observeret i vivo8. Moderne in vitro metoder stadig hovedsagelig bruge "varm saltvand", et miljø helt forskellig fra det i levende væv. Væv in vivo er ekstremt overfyldt, med proteiner, nukleinsyrer, ribonukleoproteiner, og polysaccharider, besætter 5%-40% af den samlede volumen. Da der ikke er to molekyler, der kan besætte den samme plads på samme tid, er der ikke meget ledig plads til rådighed og en næsten fuldstændig mangel på frit vand9.
MMC-teknikken pålægger begrænsninger, der påvirker cytosol- og interstitielle væskers termodynamiske egenskaber. Molekylære interaktioner, receptor-ligand signalering komplekser, enzymer, og organeller er begrænset fra at interagere frit9. Interaktioner inden for det pericellulære miljø (dvs. interstitium) er også begrænset. Nylige beviser bekræfter, at høje koncentrationer af inerte makromolekyler i overfyldte opløsninger perturb diffusion, fysisk association, viskositet og hydrodynamiske egenskaber10.
Interessant, flere populære fortrængning agenter (dvs. Ficoll, dextran, polyvinylpyrrolidon [PVP], og natrium 4-styrensulfonat [PSS]) er ikke ækvivalente, når de anvendes på forskellige celletyper og i forskellige indstillinger. I en tidligere undersøgelse blev Ficoll rapporteret at være mindre cytotoksisk for mesenkymale stamceller sammenlignet med PVP. Disse resultater blev fortolket som en følge af denneutrale ladning og den relativt lille hydrodynamiske radius11. I modsætning hertil viste en anden undersøgelse, at dextran er mere effektiv til at stimulere kollagen jeg aflejring er aflejring af menneskerlungefibroblaster i forhold til Ficoll12. Data fra vores egen undersøgelse tyder på, at Ficoll forbedrer kollagen aflejring af hypertrofisk ar-afledte fibroblaster, mens PVP er giftigt for disse celler13.
Det er blevet påvist , at omdannelsen af procollagen til kollagen er hurtigere i et meget overfyldt in vivo-miljø14, mens antallet af biologiske reaktioner er forsinket i et fortyndet 2D-kultursystem15. Vi har optimeret in vitro-protokollen her, der omfatter MMC at vise dyrkning af dermal fibroblaster tjener som en mere "in vivo-lignende" model for dermal fibrose og ar dannelse. I modsætning til den fælles 2-D kultur system, dyrke hHSFs med MMC stimulerer biosyntese og aflejring af kollagen betydeligt13. Især andre karakteristika ved fibrose (dvs. øget ekspression af matrix metalloproteinaser [MMPs] og proinflammatoriske cytokiner) er også tydelige under denne optimerede MMC protokol13. Når det dyrkes ved hjælp af denne metode, er det påvist, at dermale celler opsummerer de fysiologiske, biokemiske og funktionelle parametre målt in vivo.
Den optimerede MMC in vitro protokol er blevet brugt til at evaluere ekspressionen af kollagen og andre ECM proteiner ved dermal fibroblaster isoleret fra hypertrofisk ar dermis og uinvolveret tilstødende dermis. Når det dyrkes i MMC miljøer in vitro, er det blevet observeret, at hHSFs udtrykke visse egenskaber (dvs. mRNA, biokemi, fysiologi, og fænotype) svarende til dermal hypertrofisk arvæv i vivo. Beviserne tyder på, at fysiske og kemiske egenskaber er vigtige overvejelser, når man vælger crowdere og optimereMMC betingelser for dyrkning in vitro.
For proof-of-princip, MMC protokollen anvendes her til kvalitativt og kvantitativt vurdere evne Shikonin og dens analoger til at fremkalde apoptose. Dette gør det muligt at vurdere de potentielle anvendelser af disse naturligt afledte traditionel kinesisk medicin (TCM) forbindelser til forvaltning af dermal ardannelse13. Uanset, at enkelheden, omkostningseffektiviteten og aktualiteten af denne in vitro MMC-protokol også opfylder de seneste regler for at eliminere forsøg med pattedyr i HENHOLD til EU-direktiv 2010/63/EU og DET Amerikanske Miljøbeskyttelsesagentur (EPA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellekultur
- HHSFs og normale dermal fibroblaster, der stammer fra ikke-patologisk væv (hNSFs) i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM), der indeholder 10% føtal kalveserum (FCS) og 1% v/v penicillin/streptomycinopløsning (P/S) ved 37°C i en kuvøse med 5% CO2/95% luft.
- Køb Ficoll 70, Ficoll 400, og ascorbinsyre fra de relevante virksomheder.
2. Opførelse af MMC hypertrofisk ar model
- HHSF'er eller hNSF'er (50.000/brønd) frøs i en 24 brøndplade, der indeholder 1 ml medier i hver brønd.
- Placer i en 37 °C inkubator ved 5% CO2 og lad natten over.
- Forbered MMC-mediet. Baseret på den samlede mængde, der kræves til forsøget, fremstilles 10 % FCS/DMEM-medier ved at blande Ficoll 70 (18,75 mg/ml), Ficoll 400 (12,5 mg/ml) og ascorbinsyre (100 μM).
- Anbring blandingen i et 37°C vandbad i 1 time for at sprede forbrænderne i opløsningen, og steriliser derefter MMC-mediet ved hjælp af et filter på 0,2 μm.
- Aspirere de brugte medier og erstatte med den frisklavede MMC medier.
- Cellerne inkuberes i 6 dage ved 37°C og 5 % CO2, og mediet ændres hver 3.
3. Udtryk for den samlede mængde kollagen
- Forbered Sirius rød opløsning (0,1% w/v). 0,2 g direkte rødt 80 pulver opløses i 200 ml destilleret deioniseret vand (ddH2O) med 1 ml eddikesyre.
- Aspirer MMC-mediet og tilsæt 300 μL Sirius Red-opløsning i hver brønd. Inkuber ved 37 °C i 90 min.
- Skyl forsigtigt Sirius Red-opløsningen med vand fra hanen, og lad pladen lufttørre natten over.
- Sirius Red-pletten udvindes ved at tilsætte 200 μL natriumhydroxid (0,1 M) i hver brønd. Placer pladen på en orbital shaker i 5-10 min til fuldt ud at udtrække Sirius Red pletten.
- 100 μL af den ekstraherede Sirius Red-plet overføres til en 96 brøndgennemsigtig plade, og absorbansen måles ved 620 nm ved hjælp af en mikropladelæser.
4. Udtryk for kollagen I (immunfarvning)
- Brøndene vaskes med 200 μL fosfat-bufferet saltvand (PBS, pH = 7,35).
- Cellerne med methanol (500 μL/brønd) anfindes ved 4 °C i 10 min.
- Bloker uspecifikke interaktioner med 3% kvægserumalbumin i 30 min ved stuetemperatur (RT).
- Aspirer er blokeret for den blokerende opløsning, og inkuber med 200 μL anti-kollagen I antistof (10 μg/ml) i 90 min.
- Aspirer det primære antistof og vask 3x med PBS i 5 min. hver.
- Inkuber med 200 μL gedeanti-Rabbit-FITC sekundært antistof (1:400 fortynding) og 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1: 2000 fortynding) i 30 min på RT. Dæk pladen med aluminiumsfolie.
- Der kasseres både det sekundære antistof og DAPI og vaskes 3x med PBS i 5 min. hver.
- Visualiser fluorescensfarvningen direkte under et mikroskop.
5. Vestlige blotting
- Cellerne vaskes 2x med PBS.
- Der tilsættes 40 μL lysisbuffer i hver brønd, og cellelaget skrabes med en pipettespids. Lysisbufferen indeholder RIPA buffer, proteaseinhibitorcocktail (PIC), 2 mM natriumvanadat og 10 mM natriumfluorid.
- Proteinlysatet overføres til mikrocentrifugerør, og proteinkoncentrationen måles ved hjælp af en proteinanalyse i henhold til producentens anvisninger16.
- Der indlæsser 10 μg protein i hver gruppe i brøndene på 4%-12% Bis-Tris proteingeler. Udfør natriumdodesulfatpolyacrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE) ved 200 V i 30 min.
- Proteinet overføres til nitrocellulosemembranen ved at køre en vestlig skamplet ved 90 V i 90 min. Undgå dannelse af luftbobler mellem gelen og nitrocellulosemembranen.
- Bloker membranen med 10 ml blokerende buffer.
- Inkuber med primære antistoffer ved 4°C natten over. Primære antistoffer er: anti-kollagen I, anti-kollagen III, anti-kollagen IV, anti-αSMA, anti-MMP-1, anti-MMP-2, anti-MMP-9, anti-MMP-13, og anti-glyceraldehyd 3-phosphat dehydrogenase (GAPDH).
- Membranen vaskes med 0,1% TBS-Tween 20 (5x i 5 min. hver). TBS/Tween 20 (1 L) indeholder følgende: 50 ml 1 M Tris (pH = 7,4), 30 ml 5 M natriumchlorid, 1 ml Tween 20 og 920 ml ddH2O.
- Inkuber med en art passende sekundært antistof ved RT i 1 time.
- Gentag trin 5.8, og visualiser fluorescens ved hjælp af et billedbehandlingssystem.
6. RT-PCR
- Det samlede RNA opsamles ved hjælp af lysisbufferen blandet med 2-mercaptoethanol, der indgår i RNA-ekstraktionsanalysesættet.
- Rens RNA'et i henhold til producentens anvisninger17.
- RNA-koncentrationen måles ved hjælp af et mikrovolumenspektrofotometer.
- Udfør første streng cDNA syntese ved hjælp af en cDNA syntese kit som pr producentens anvisninger.
- RT-PCR oligonukleotid primere leveres (precoated) i brugerdefinerede 96 brøndplader. 100 ng af cDNA-prøverne blandes med 10 μL SYBR grøn supermix i den tilpassede plade.
- Forøg det samlede volumen til 20 μL/brønd ved hjælp af ddH2O.
- Kør RT-PCR ved hjælp af en termisk cycler efter producentens anvisninger: 40 cyklusser af denaturering ved 98 °C for 15 s og glødning / udvidelse ved 60 °C for 60 s. De gener, der testes i RT-PCR, omfatter: COL1A1, COL3A1, ACTA2, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD7, IL1A, IL1B, IL6, IL8, MMP1, MMP2, MMP3, TGFB1 og VEGF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Der blev udført treeksemplarer af prøver i hvert forsøg, og hvert eksperiment blev gentaget 3x ved hjælp af celler fra tre individuelle patienter. Data udtrykkes som procenter af kontrolgruppen. Envejs ANOVA og Tukey's post-hoc test blev anvendt til at analysere statistiske forskelle (*p ; 0,05).
MMC ved hjælp af Ficoll på 9% FVO (fraktioneret volumen belægning) øger den samlede mængde af kollagen og kollagen jeg deposition i hHSF13. Som illustreret i figur 1Asteg celletætheden af hHSF'er betydeligt efter dyrkning med Ficoll ved 9% og 18% FVO sammenlignet med styringen og MMC ved hjælp af PVP. Figur 1B,C angiver, at Ficoll (ved 9% FVO) væsentligt forbedret aflejring af kollagen (herunder kollagen I) i forhold til andre MMC formuleringer. Kvantitativ analyse (figur 1D,E) viste endvidere, at Ficoll (ved 9% FVO) mest effektivt forbedrede aflejringen af kollagen.
hHSFs og hNSFs dyrket i MMC miljøer blev fundet at regulere udtrykket af ECM arter ud over kollagen13. Data rapporteret i figur 2 viser, at når hHSFs og hNSFs blev dyrket med MMC, udtrykket af kollagen IV også steget betydeligt. Matrix metalloproteinaser (MMPs) spiller en vigtig rolle under sårheling og ar dannelse, regulering ecm samling, og ombygning18. MMPs bidrager også til celleproliferation, cellemigration, angiogenese og apoptose19. Især, en forhøjet udtryk for MMPs blev fundet at akkumulere i hypertrofisk arvæv i forhold til indfødte væv20. Det blev bemærket, at udtrykket af MMP-2, -9, og -13 var betydeligt upregulated i både hNSF og hHSF kulturer dyrket i MMC miljøer.
Vi har også undersøgt for syntesen af interleukin-6 (IL-6) og vaskulære endotel vækstfaktor (VEGF); disse var dog ikke målbart i en vestlig skamplet. I modsætning hertil viste RT-PCR-analysen (figur 3), at udtrykket il6 blev væsentligt opreguleret, mens vegf's udtryk blev nedreguleret i hNSF'er og hHSF'er dyrket under MMC-betingelser. Et øget udtryk for IL-6 har vist sig at bidrage til hypertrofisk ardannelse21. Paradoksalt nok, Det er også rapporteret, at dannelsen af hypertrofiske ar er forbundet med en forhøjet udtryk for VEGF22. Den RT-PCR-analyse, der blev udført her, viste, at ekspressionen af VEGF var stærkt svækket i hNSF'er og hHSF'er dyrket under MMC-betingelser.
Endelig viste resultaterne både 1) øget synteser af kollagen, kollagen I, kollagen IV, MMP-2, MMP-9, og MMP-13 de novo og 2) øget udtryk for IL6 mRNA i hHSFs og hNSFs. Samlet set tyder disse data på, at dyrkning af primære HHSFs og hNSF'er i medieformuleringer, der omfatter MMC, resulterer i fastholdelse af det karakteristiske genekspression, biokemi og fænotyper observeret i naturligt hypertrofisk arvæv in vivo, hvilket fører til en robust "ar-i-en-krukke"-model.
Figur 1: MMC øger den samlede mængde kollagen og kollagen jeg deposition i hHSFs. (A) Celle morfologi, (B) total kollagen, plettet med Sirius Red, (C) kollagen I udtryk, påvist ved immunfluorescens, (D) kvantitativ analyse af den samlede kollagen, og (E) kvantitativ analyse af kollagen Jeg deposition. HHSFs blev dyrket i medier suppleret med Ficoll (9% og 18% FVO), PVP40 (18% FVO), eller PVP360 (54% og 72% FVO), i 6 dage. Repræsentative billeder blev valgt. Billedkvtificering blev udført ved hjælp af ImageJ og udtrykkes som den gennemsnitlige procentdel af kontrolelementet. Alle forsøg blev gentaget 3x ved hjælp af celler isoleret fra tre uafhængige donorer. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af envejs ANOVA med Tukey's post-test (*p < 0,05 vs kontrolgruppe, fejllinjer angiver SEM). Skalastænger = (A) 0,5 mm, (B) 2 mm og (C) 0,5 mm. Dette tal er blevet ændret fra et tidligere studie13. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: MMC's virkninger på celleproteinekspressionen. hHSFs og hNSFs blev dyrket under MMC betingelser i 6 dage. Hele cellelysater blev fremstillet med RIPA buffer indeholdende proteasehæmmercocktail, natriumvanadat og natriumfluorid. Proteinkoncentrationen blev målt ved hjælp af proteinanalysen. Repræsentative billeder præsenteres. Til kvantitativ analyse blev intensiteten af de enkelte proteinbånd målt med densitometri, normaliseret til GAPDH og konverteret til procentdelen af hNSF i normalt medium ved hjælp af ImageJ-software. Alle forsøg blev udført 3x ved hjælp af celler fra tre uafhængige donorer. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af envejs ANOVA med Tukey's post-test (*p < 0,05, fejlbarer indikerer SEM). Dette tal er blevet ændret fra et tidligere studie13. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: MMC's virkninger på cellegenekspressionen. hHSF'er og hNSF'er blev dyrket under MMC-betingelser i 6 dage. Total RNA blev høstet ved hjælp af et analysesæt, og første streng cDNA blev syntetiseret ved hjælp af cDNA syntesesættet. Target-genekspression enblev normaliseret til GAPDH og konverteret til procentdelen af hNSF i normalt medium. Alle forsøg blev gentaget 3x ved hjælp af celler fra tre uafhængige donorer. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af envejs ANOVA med Tukey's post-test (*p < 0,05, fejlbarer indikerer SEM). Dette tal er blevet ændret fra et tidligere studie13. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol har til formål at optimere og godkende en forbedret : ar-i-en-krukke "in vitro model for menneskelige kutanarvæv. Tidligere undersøgelser har rapporteret anvendelsen af MMC teknik til mennesker lunge fibroblaster12, menneskelige knoglemarv mesenkymale stamceller23, og menneskelige dermal fibroblaster23 ved hjælp af dextran12, Ficoll12, og PVP23 som crowders. I undersøgelsen rapporteret her, den tidligere offentliggjorte protokol for hypertrofisk ar-afledte menneskelige hud fibroblaster blev optimeret med Ficoll eller PVP som crowders.
Udvælgelsen og koncentrationen af makromolekylære crowdre er kritiske parametre, da de ikke giver tilsvarende resultater. En tidligere undersøgelse har rapporteret, at PVP40 (18% FVO) og PVP360 (54% FVO) væsentligt øge kollagen aflejring og celleproliferation i dermal fibroblaster23 (virkningerne af PVP på FVOs > 54% er uprøvede). Disse to betingelser fungerer dog ikke konsekvent for hHSF'er ved hjælp af denne protokol.
Som vist i figur 1, Ficoll væsentligt øger kollagen jeg aflejring i forhold til kontrol, mens PVP har ingen væsentlige virkninger. Ficoll på 9% FVO øger den samlede mængde kollagen og kollagen type I i forhold til Ficoll på 18% FVO. Desuden er det afgørende at bruge celler af en lav passage, som primære dermal fibroblaster har en begrænset levetid i kultur24. Det blev valgt kun at bruge friskisolerede HHSFs til at bevare in vivo fænotype. Efter langvarig dyrkning udviser primære hHSF'er usædvanlige morfologi og atypiske funktionelle reaktioner. Det anbefales også, at MMC-mediet suppleres med ascorbinsyre, en vigtig inducer af kollagensyntese i hHSF25. Endvidere foreslås det af andre forskere at anvende de samme antistoffer, der er anført i materialetabellen, til hHSF-relaterede undersøgelser; Antistoffer skal dog valideres, hvis denne protokol anvendes på andre celletyper.
Som rapporteret i de repræsentative resultater, inddragelse af makromolekylære crowders blev fundet at stimulere udtrykket af kollagen (dvs. kollagen I, kollagen IV, MMPs, og IL6) i hHSFs sammenlignet med hHSFs, der blev dyrket ved hjælp af klassiske ikke-MMC betingelser. Det hævdes, at den optimerede MMC-model bevarer aspekter af hHSF'ers in vivo fænotype og opsummerer deres karakteristiske morfologi, biokemi, fysiologi og rigelige ekstracellulære matrix af kutanarvæv in vivo (i modsætning til eksisterende 2D-kulturmetoder). Vi er ikke i stand til at identificere nogen lignende in vitro model, der er i stand til at opsummere lignende "in vivo-lignende" egenskaber. Sammenlignet med eksisterende dyremodeller er denne MMC-protokol hurtigere såvel som mere brugervenlig, omkostningseffektiv og tidseffektiv. Cuttle et al. etableret en svin hypertrofisk ar model ved hjælp af termisk skade, som synes at have lignende egenskaber som for menneskelige hypertrofiske ar26. Men ud over de omkostninger og den tid, der er nødvendig for at vedligeholde dyrene, kræver forsøget mere end 3 måneder at gennemføre26. Denne optimerede MMC-model kræver ca. 1 uges forberedelse, før den er klar til brug.
Protokollen tilbyder en avanceret in vitro model til undersøgelse af nye anti-ardannelse behandlingsformer. MMC-modellen er blevet brugt til at evaluere Shikonin, et molekyle, der tidligere er rapporteret til at hæmme de novo-dannelsen af ar, til rensning af modne hypertrofiske ar27,28. En lignende evaluering af nye forbindelser og interventioner ved hjælp af klassiske tilgange til opdagelse af lægemidler og proof-of-concept ville kræve betydelige ressourcer, midler og tid. Denne undersøgelse krævede minimal økonomi og kan afsluttes inden for flere måneder. Protokollen er fleksibel og let at tilpasse til anvendelser i udvikling og vurdering af nye hypertrofiske ar behandlinger forud for dyreforsøg.
Desuden kan denne protokol ændres yderligere for at udvikle mere "in vivo-lignende" egenskaber. For eksempel, tilstedeværelsen af overabundant TGF-β1 er en konsekvent konstatering i hypertrofisk arvæv, mægle ar dannelse ved at stimulere kollagen syntese og aflejring28. TGF-β1 kunne let indarbejdes i MMC-protokollen og yderligere forbedre rekapitulation af in vivo patologi. Vi har endnu ikke udforsket modellens fulde potentiale, som kan være nyttige for andre kollagen- og ECM-relaterede patologier (dvs. sklerodermi, lungefibrose, endomyocardial fibrose, osv.). Desuden ville det være interessant at observere virkningerne af MMC på celler over en længere kulturperiode, såsom 2 eller 3 uger. Det er også værd at yderligere vurdere virkningerne af MMC på celle og ECM hierarkisk arkitektur og tilpasning, især orienteringen af kollagen, da disse karakteriseringer er afgørende for in vivo arvæv dannelse.
En af de største begrænsninger i denne protokol er begrænsningen af celletyper. Hypertrofisk ardannelse indebærer deltagelse af forskellige cellepopulationer, og samspillet mellem forskellige celletyper spiller en væsentlig rolle i ardannelse. For eksempel spiller keratinancytter også en vigtig rolle i kutan sårheling og ardannelse29. Indarbejde yderligere cellepopulationer i denne model vil i høj grad forbedre dens betydning i fremtidig forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af midler fra Singapores Agentur for Videnskab, Teknologi og Forskning "SPF 2013/004: Skin Biology Basic Research" og "Wound Care Innovation for tropics" IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009. Forfatterne taknemmeligt anerkende råd og bistand fra Dr. Paula Benny og Dr. Michael Raghunath.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Sartorius | 16534 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | P36962 | |
| Alexa Fluor 680 | Thermo Fisher Scientific | A-21076 | |
| Alexa Fluor 800 | Thermo Fisher Scientific | A-11371 | |
| alpha smooth muscle actin (αSMA) primary antibody | Abcam | ab5694 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler ) | Thermo Fisher Scientific | 4351106 | |
| Ascorbic acid | Wako | #013-12061 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | #A2153 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Collagen I primary antibody (for immunostaining) | Abcam | 6308 | |
| Collagen I primary antibody (for western blot) | Abcam | ab21286 | |
| Collagen III primary antibody | Abcam | ab7778 | |
| Collagen IV primary antibody | Abcam | ab6586 | |
| Direct Red 80 | Sigma-Aldrich | 2610108 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11996-065 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 6000-044 | |
| Ficoll 400 | GE HealthCare | #17-0300-10 | |
| Ficoll 70 | GE HealthCare | #17-0310-10 | |
| GAPDH primary antibody | Sigma-Aldrich | G8795 | |
| Goat Anti-Rabbit secondary antibody | Abcam | ab97050 | |
| Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF) | Cell Research Corporation | 106, 107, 108 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | #1708890 | |
| MMP-1 primary antibody | Abcam | ab38929 | |
| MMP-13 primary antibody | Abcam | ab39012 | |
| MMP-2 primary antibody | Abcam | ab37150 | |
| MMP-9 primary antibody | Abcam | ab38898 | |
| NanoDrop Microvolume Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 10484060 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| Odyssey blocking buffer | LI-COR Biosciences | 927–40000 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A | |
| Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining) | Olympus | N/A | |
| Penicillin/streptomycin solution (P/S) | Life Technologies | 15140-122 | |
| PrimePCR Assays | Bio-Rad | Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| PVP 360 | Sigma | #PVP360 | |
| PVP 40 | Sigma | #PVP40 | |
| RIPA buffer | Merck | R0278 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | #74134 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450022 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader | Molecular Devices | N/A | |
| SsoAdvanced universal SYBR green supermix | Bio-Rad | #172-5270 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- vander Veer, W. M., et al. Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation. Burns. 35 (1), 15-29 (2009).
- Linge, C., et al. Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase. Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).
- Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review. International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).
- Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression. Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).
- Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. P. Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26373 (2015).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study. Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).
- Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
- Chen, C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 277-290 (2011).
- Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., Van Vliet, K. J. Macromolecular Crowding Directs Extracellular Matrix Organization and Mesenchymal Stem Cell Behavior. PloS one. 7 (5), 37904 (2012).
- Chen, C. Z., et al. The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).
- Fan, C., et al. Application of "macromolecular crowding" in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars. Chemico-Biological Interactions. 310, 108747 (2019).
- Canty, E. G., Kadler, K. E. Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis. Journal of Cell Science. 118, Pt 7 1341-1353 (2005).
- Minton, A. P. Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited. Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).
- Ernst, O., Zor, T. Linearization of the bradford protein assay. Journal of Visualized Experiments. (38), e1918 (2010).
- Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. M. Optimization of the RNeasy Mini Kit to obtain high-quality total RNA from sessile cells of Staphylococcus aureus. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 48 (12), 1071-1076 (2015).
- Xue, M., Jackson, C. J. Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring. Advances in wound care (New Rochelle). 4 (3), 119-136 (2015).
- Rohani, M. G., Parks, W. C. Matrix remodeling by MMPs during wound repair. Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).
- Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).
- Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis. Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).
- Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor. Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).
- Rashid, R., et al. Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).
- Lago, J. C., Puzzi, M. B. The effect of aging in primary human dermal fibroblasts. PloS one. 14 (7), 0219165 (2019).
- Cigognini, D., et al. Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture - A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis. Scientific Reports. 6, 30746 (2016).
- Cuttle, L., et al. A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring. Burns. 32 (7), 806-820 (2006).
- Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment. Journal of Biomedical Science. 22, 70 (2015).
- Fan, C., et al. Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts. International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).
- Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-Fibroblast Interactions in Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 127 (5), 998-1008 (2007).
