Summary
Dit protocol beschrijft het gebruik van macromoleculaire verdringing om een in vitro menselijk hypertrofisch littekenweefselmodel te creëren dat lijkt op in vivo omstandigheden. Wanneer gecultiveerd in een drukke macromoleculaire omgeving, menselijke huid fibroblasten vertonen fenotypes, biochemie, fysiologie, en functionele kenmerken die lijken op littekenweefsel.
Abstract
Het is aangetoond dat in vivo weefsels zijn zeer druk door eiwitten, nucleïnezuren, ribonucleoproteïnen, polysachariden, enz. Het volgende protocol past een macromoleculaire crowding (MMC) techniek toe om deze fysiologische verdringing na te bootsen door de toevoeging van neutrale polymeren (crowders) aan celculturen in vitro. Eerdere studies met behulp van Ficoll of dextran als crowders tonen aan dat de expressie van collageen I en fibronectine in WI38 en WS-1 cellijnen aanzienlijk worden verbeterd met behulp van de MMC-techniek. Deze techniek is echter niet gevalideerd in primaire hypertrofische litteken-afgeleide menselijke huid fibroblasten (hHSFs). Aangezien hypertrofische littekens het gevolg zijn van de overmatige afzetting van collageen, is dit protocol bedoeld om een collageenrijk in vitro hypertrofisch littekenmodel te construeren door de MMC-techniek toe te passen met hHSFs. Dit geoptimaliseerde MMC-model vertoont meer overeenkomsten met in vivo littekenweefsel in vergelijking met traditionele 2-dimensionale (2D) celkweeksystemen. Bovendien is het kosteneffectief, tijdefficiënt en ethisch wenselijk in vergelijking met diermodellen. Daarom biedt het hier gerapporteerde geoptimaliseerde model een geavanceerd "in vivo-achtig" model voor hypertrofische littekengerelateerde studies.
Introduction
Littekenweefsel vertegenwoordigt het eindpunt van weefselherstel. Echter, bij veel individuen, vooral die lijden aan brandwonden of trauma1, littekens kan worden overdreven en ongewenste effecten op te leggen aan de morfologie en het functioneren van genezen huid. Hoewel de exacte mechanismen van pathologische (hypertrofische littekens en keloïden) littekenvorming niet volledig worden begrepen, is aangetoond dat overmatige afzetting van collageen tijdens wondgenezing een essentiële bijdrage is2.
Het is algemeen vastgesteld dat het transformeren van groeifactor bèta 1 (TGF-β1) en alfa gladde spieractine (αSMA) een belangrijke rol spelen bij de vorming van hypertrofische littekens. Er zijn aanwijzingen dat verhoogde TGF-β1 overmatige afzetting van collageen direct stimuleert via het reguleren van het SMAD-signaleringstraject3. Bovendien is αSMA gevonden om bij te dragen aan hypertrofische littekenvorming door het reguleren van celcontractie en reepithelialisatie in het wondgenezingsproces4. Het ontbreken van geschikte in vitro en in vivo modellen is een belangrijke belemmering voor het ontwikkelen en evalueren van interventies en therapieën voor littekensanering. Het doel van deze studie is om de bestaande MMC-techniek te gebruiken om een "in vivo-achtig" hypertrofisch littekenmodel te construeren dat geschikt is voor het evalueren van nieuwe en opkomende littekengerelateerde interventies.
Het reproduceren van levend weefsel buiten het lichaam is al jaren een doel in de wetenschappelijke gemeenschap. De ontwikkeling van in vitro technieken in het begin van de twintigste eeuw heeft dit doel gedeeltelijk bereikt. De huidige in vitro technieken zijn licht geëvolueerd uit roux's oorspronkelijke demonstratie dat embryonale cellen ex vivo meerdere dagen kunnen overleven in warme zoutlijn5. Echter, in vitro methodologieën zijn meestal beperkt tot eencellige types geteeld in 2-D en niet nauwkeurig recapituleren weefsels in vivo. Hoewel nuttig voor het onderzoeken van celbiochemie, fysiologie en genetica, inheemse weefsels zijn 3-D en bevatten meerdere celtypes. Eenvoudige 2-D in vitro systemen onderwerpen zoogdiercellen aan zeer kunstmatige omgevingen waarin native weefselspecifieke architectuur verloren gaat6. Op zijn beurt beïnvloedt dit intracellulaire en extracellulaire voorvallen, wat resulteert in abnormale celmorfologie, fysiologie en gedrag7.
De interesse achter dit protocol ligt in de ontwikkeling en het klinisch beheer van hypertrofische littekens en keloïden. Hoewel het algemeen bekend is dat huidfibroblasten grotendeels verantwoordelijk zijn voor de overvloedige productie van collageen aanwezig in littekenweefsel, het cultiveren van huidfibroblasten met behulp van 2-D in vitro systemen niet aan de omzet van collageen waargenomen in vivo8te reproduceren . Hedendaagse in vitro methoden nog steeds in wezen gebruik maken van "warme zoutwater", een omgeving die totaal verschilt van die in levende weefsels. Weefsels in vivo zijn extreem druk, met eiwitten, nucleïnezuren, ribonucleoproteïnen en polysachariden, die 5%-40% van het totale volume innemen. Aangezien geen twee moleculen tegelijkertijd dezelfde ruimte kunnen innemen, is er weinig vrije ruimte beschikbaar en een bijna volledige afwezigheid van vrij water9.
De MMC-techniek legt beperkingen op die de thermodynamische eigenschappen van cytosol en interstitiële vloeistoffen beïnvloeden. Moleculaire interacties, receptor-ligand signalering complexen, enzymen, en organellen zijn beperkt en beperkt van de interactie vrij9. Interacties binnen de pericellulaire omgeving (d.w.z. interstitium) zijn ook beperkt. Recent bewijs bevestigt dat hoge concentraties van inerte macromoleculen in overvolle oplossingen diffusie, fysieke associatie, viscositeit en hydrodynamische eigenschappen10.
Interessant is dat verschillende populaire crowding agenten (dat wil zeggen, Ficoll, dextran, polyvinylpyrrolidone [PVP], en natrium 4-styrenesulfonate [PSS]) zijn niet gelijkwaardig wanneer toegepast op verschillende celtypes en in verschillende instellingen. In een eerdere studie, Ficoll werd gemeld dat minder cytotoxische voor mesenchymale stamcellen in vergelijking met PVP. Deze resultaten werden geïnterpreteerd als het gevolg van de neutrale lading en de relatief kleine hydrodynamische straal11. In tegenstelling, een tweede studie bleek dat dextran is effectiever in het stimuleren van collageen I afzetting door menselijke longfibroblasten in vergelijking met Ficoll12. Gegevens uit onze eigen studie suggereert dat Ficoll verbetert collageen depositie door hypertrofische litteken-afgeleide fibroblasten, terwijl PVP is giftig voor deze cellen13.
Het is aangetoond dat de omzetting van procollageen naar collageen sneller is in een zeer drukke in vivo omgeving14, terwijl de snelheid van biologische reacties wordt vertraagd in een verdund 2D-cultuursysteem15. We hebben het in vitro protocol hier geoptimaliseerd, waarbij MMC is opgenomen om de teelt van dermale fibroblasten te laten zien die dienen als een meer "in vivo-achtig" model voor huidfibrose en littekenvorming. In tegenstelling tot het gemeenschappelijke 2D-kweeksysteem stimuleert het cultiveren van hHSFs met MMC de biosynthese en depositie van collageen aanzienlijk13. Met name andere kenmerken van fibrose (d.w.z. verhoogde expressie van matrixmetalloproteinases [MSP's] en ontstekingscytokines) zijn ook zichtbaar onder dit geoptimaliseerde MMC-protocol13. Wanneer ze met deze methode worden gekweekt, wordt aangetoond dat huidcellen de fysiologische, biochemische en functionele parameters recapituleren die in vivo worden gemeten.
De geoptimaliseerde MMC in vitro protocol is gebruikt om de expressie van collageen en andere ECM eiwitten te evalueren door dermale fibroblasten geïsoleerd van hypertrofische littekendermis en niet-betrokken aangrenzende dermis. Wanneer gekweekt in MMC-omgevingen in vitro, is geconstateerd dat hHSFs bepaalde kenmerken uitdrukken (d.w.z. mRNA, biochemie, fysiologie en fenotype) vergelijkbaar met huidhypertrofisch littekenweefsel in vivo. Het bewijs geeft aan dat fysische en chemische eigenschappen belangrijke overwegingen zijn bij het selecteren van crowders en het optimaliseren van MMC-omstandigheden voor teelt in vitro.
Voor proof-of-principle wordt het MMC-protocol hier toegepast om het vermogen van Shikonin en zijn analogen om apoptose te induceren kwalitatief en kwantitatief te evalueren. Dit maakt evaluatie van de potentiële toepassingen van deze natuurlijk afgeleide traditionele Chinese geneeskunde (TCM) verbindingen voor het beheer van dermale littekens13. Niettegenstaande voldoet de eenvoud, kosteneffectiviteit en actualiteit van dit in vitro MMC-protocol ook aan recente voorschriften om experimenten bij zoogdieren door de EU-richtlijn 2010/63/EU en het Amerikaanse Environmental Protection Agency (EPA) uit te bannen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celcultuur
- Handhaaf hHSF's en normale dermale fibroblasten afkomstig van niet-pathologisch weefsel (hNSFs) in dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) met 10% foetaal kalfsserum (FCS) en 1% v/v penicilline/streptomycineoplossing (P/S) bij 37°C in een couveuse met 5% CO2/95% lucht.
- Koop Ficoll 70, Ficoll 400 en ascorbinezuur van de juiste bedrijven.
2. Bouw van MMC hypertrofisch littekenmodel
- Zaad de hHSFs of hNSFs (50.000/well) in een 24 putplaat met 1 mL media in elke put.
- Plaats in een couveuse van 37°C bij 5% CO2 en laat 's nachts.
- Bereid de MMC-media voor. Op basis van het totale volume dat nodig is voor het experiment, produceren 10% FCS / DMEM media door het mengen van Ficoll 70 (18,75 mg/mL), Ficoll 400 (12,5 mg/mL), en ascorbinezuur (100 μM).
- Plaats het mengsel gedurende 1 uur in een waterbad van 37°C om de crowders in de oplossing te verspreiden en steriliseer vervolgens de MMC-media met een 0,2 μm-filter.
- Aanzuigen de gebruikte media en vervangen door de vers gemaakte MMC media.
- Incubeer de cellen gedurende 6 dagen bij 37°C en 5% CO2,waarbij de media om de 3 dagen veranderen.
3. Expressie van de totale hoeveelheid collageen
- Bereid Sirius rode oplossing (0,1% w / v). Los 0,2 g Direct Rood 80-poeder op in 200 mL gedeïoniseerd water (ddH2O) met 1 mL azijnzuur.
- Aangezogen de MMC media en voeg 300 μL van Sirius Red oplossing in elke put. Incubeer bij 37 °C gedurende 90 min.
- Spoel de Sirius Red oplossing voorzichtig af met kraanwater en laat de plaat 's nachts aan de lucht drogen.
- Haal de Sirius Red vlek door het toevoegen van 200 μL natriumhydroxide (0,1 M) in elke put. Plaats de plaat op een orbitale shaker voor 5-10 min om volledig te extraheren de Sirius Red vlek.
- Breng 100 μL van de geëxtraheerde Sirius Red-vlek over in een 96-puttransparante plaat en meet de absorptie op 620 nm met behulp van een microplaatlezer.
4. Expressie van collageen I (immunostaining)
- Was de putten met 200 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH = 7,35).
- Bevestig de cellen met methanol (500 μL/well) op 4 °C gedurende 10 min.
- Blokkeer niet-specifieke interacties met 3% runderserumalbumine gedurende 30 min bij kamertemperatuur (RT).
- Zuig de blokkeringsoplossing aan en incubeer met 200 μL anti-collageen I-antilichaam (10 μg/mL) gedurende 90 min bij RT.
- Aanzuig het primaire antilichaam en was 3x met PBS voor 5 min per stuk.
- Incubeer met 200 μL geit anti-Konijn-FITC secundair antilichaam (1:400 verdunning) en 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1: 2000 verdunning) voor 30 min bij RT. Bedek de plaat met aluminiumfolie.’
- Gooi zowel het secundaire antilichaam als de DAPI weg en was 3x met PBS voor 5 min per stuk.
- Visualiseer de fluorescentie vlekken direct onder een microscoop.
5.
- Was de cellen 2x met PBS.
- Voeg 40 μL lysisbuffer in elke put en schraap de cellaag met een pipetpunt. De lysisbuffer bevat RIPA buffer, proteaseremmercocktail (PIC), 2 mM natriumvanadate en 10 mM natriumfluoride.
- Breng het eiwitlysaat over in microcentrifugebuizen en meet de eiwitconcentratie met behulp van een eiwittest volgens de instructies van de fabrikant16.
- Laad 10 μg eiwit van elke groep in de putten van 4%–12% Bis-Tris eiwitgels. Voer natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegel elektroforese (SDS-PAGE) uit bij 200 V gedurende 30 min.
- Breng het eiwit over op het membraan van nitrocellulose door een westelijke vlek bij 90 V gedurende 90 min uit te voeren. Vermijd de vorming van luchtbellen tussen het gel- en nitrocellulosemembraan.
- Blokkeer het membraan met 10 mL blokkerende buffer.
- Incubeer met primaire antilichamen bij 4°C 's nachts. Primaire antilichamen zijn: anti-collageen I, anti-collageen III, anti-collageen IV, anti-αSMA, anti-MMP-1, anti-MMP-2, anti-MMP-9, anti-MMP-13 en anti-glyceaaldehyde 3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH).
- Was het membraan met 0,1% TBS-Tween 20 (5x voor 5 min per stuk). TBS/Tween 20 (1 L) bevat het volgende: 50 mL van 1 M Tris (pH = 7,4), 30 mL natriumchloride, 1 mL Tween 20 en 920 mL ddH2O.
- Incubeer met een soort geschikt secundair antilichaam bij RT gedurende 1 uur.
- Herhaal stap 5.8 en visualiseer fluorescentie met behulp van een beeldvormingssysteem.
6. RT-PCR
- Verzamel het totale RNA met behulp van de lysis buffer gemengd met 2-mercaptoethanol opgenomen in de RNA extractie test kit.
- Zuiver het RNA volgens de instructies van de fabrikant17.
- Meet de RNA-concentratie met behulp van een microvolume spectrofotometer.
- Voer de eerste streng cDNA synthese met behulp van een cDNA synthese kit volgens de instructies van de fabrikant.
- RT-PCR oligonucleotide primers zijn voorzien (voorgecoat) in aangepaste 96 putplaten. Meng 100 ng van de cDNA monsters met 10 μL SYBR groene supermix in de aangepaste plaat.
- Verhoog het totale volume tot 20 μL/well met ddH2O.
- Voer RT-PCR uit met behulp van een thermische cycler volgens de instructies van de fabrikant: 40 cycli van denaturering bij 98°C voor 15 s en annealing/extension bij 60 °C voor 60 s. De in RT-PCR geteste genen zijn: COL1A1, COL3A1, ACTA2, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD7, IL1A, IL1B, IL6, IL8, MMP1, MMP2, MMP3, TGFB1 en VEGF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Drievoud monsters werden uitgevoerd in elk experiment, en elk experiment werd herhaald 3x met behulp van cellen van drie individuele patiënten. Gegevens worden uitgedrukt als percentages van de controlegroep. One-way ANOVA en Tukey's post-hoc test werden toegepast om statistische verschillen te analyseren (*p , 0,05).
MMC met behulp van Ficoll op 9% VVB (fractionele volume bezetting) verbetert de totale hoeveelheid collageen en collageen I depositie in hHSF13. Zoals geïllustreerd in figuur 1A,steeg de celdichtheid van hHSF's aanzienlijk na het kweken met Ficoll met 9% en 18% FVO in vergelijking met de controle en MMC met PVP. Figuur 1B,C geeft aan dat Ficoll (bij 9% VVB) de afzetting van collageen (inclusief collageen I) aanzienlijk heeft verbeterd in vergelijking met andere MMC-formuleringen. Kwantitatieve analyse (Figuur 1D,E) toonde verder aan dat Ficoll (met 9% VVB) de depositie van collageen het meest effectief verbeterde.
hHSFs en hNSFs gekweekt in MMC omgevingen bleken te reguleren van de expressie van ECM soorten in aanvulling op collageen13. Gegevens die in figuur 2 worden gerapporteerd, geven aan dat wanneer hHSF's en hSF's met MMC werden gekweekt, de expressie van collageen IV ook aanzienlijk toenam. Matrix metalloproteinases (MSP's) spelen een belangrijke rol bij wondgenezing en littekenvorming, reguleren ecm assemblage, en hermodellering18. MSP's dragen ook bij aan celproliferatie, celmigratie, angiogenese en apoptose19. Met name bleek een verhoogde expressie van MSP's zich op te hopen in hypertrofische littekenweefsels in vergelijking met inheemse weefsels20. Er werd opgemerkt dat de expressie van MMP-2, -9 en -13 aanzienlijk werden upregulated in zowel hNSF en hHSF culturen gecultiveerd in MMC omgevingen.
We onderzochten ook de synthese van interleukine-6 (IL-6) en vasculaire endotheelgroeifactor (VEGF); echter, deze waren niet op te sporen in een westelijke vlek. De RT-PCR-analyse (figuur 3) toonde daarentegen aan dat de expressie van IL6 aanzienlijk was upregulated, terwijl de expressie van VEGF werd gedownreguleerd in hNSFs en hHSF's die onder MMC-omstandigheden werden geteeld. Een verhoogde expressie van IL-6 is aangetoond bij te dragen aan hypertrofische littekenvorming21. Paradoxaal genoeg wordt ook gemeld dat de vorming van hypertrofische littekens wordt geassocieerd met een verhoogde expressie van VEGF22. Uit de hier uitgevoerde RT-PCR-analyse bleek dat de expressie van VEGF sterk werd afgezwakt in hNSF's en hHSF's die onder MMC-omstandigheden werden geteeld.
Ten slotte toonden de resultaten zowel 1) verhoogde syntheses van collageen, collageen I, collageen IV, MMP-2, MMP-9 en MMP-13 de novo en 2) verhoogde expressie van IL6 mRNA in hHSFs en hNSFs. Samen geven deze gegevens aan dat de teelt van primaire hHSF's en hSSF's in mediaformuleringen die MMC bevatten, resulteert in het behoud van de karakteristieke genexpressie, biochemie en fenotypes die worden waargenomen in inheems hypertrofisch littekenweefsel in vivo, wat leidt tot een robuust "litteken-in-een-pot"-model.
Figuur 1: MMC verbetert de totale hoeveelheid collageen en collageen Ik depositie in hHSFs. (A) Celmorfologie, (B) totaal collageen, gekleurd met Sirius Red, (C) collageen I-expressie, aangetoond door immunofluorescentie, (D) kwantitatieve analyse van het totale collageen, en (E) kwantitatieve analyse van collageen I depositie. hHSF's werden gedurende 6 dagen gekweekt in media aangevuld met Ficoll (9% en 18% VVD), PVP40 (18% VVB), of PVP360 (54% en 72% VVB). Representatieve afbeeldingen zijn geselecteerd. Beeldkwantatie werd uitgevoerd met ImageJ en wordt uitgedrukt als het gemiddelde percentage van het besturingselement. Alle experimenten werden herhaald 3x met behulp van cellen geïsoleerd van drie niet-gerelateerde donoren. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van one-way ANOVA met Tukey's post-test (*p < 0,05 vs. controlegroep, foutbalken geven SEM). Schaalbalken = (A) 0,5 mm, (B) 2 mm en (C) 0,5 mm. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van een eerdere studie13. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Effecten van MMC op celeiwitexpressie. hHSFs en hNSFs werden gekweekt onder MMC voorwaarden voor 6 dagen. Hele cellysaten werden bereid met RIPA buffer met proteaseremmer cocktail, natrium vanadate, en natriumfluoride. Eiwitconcentratie werd gemeten met behulp van de eiwittest. Representatieve beelden worden gepresenteerd. Voor kwantitatieve analyse werden de intensiteiten van individuele eiwitbanden gemeten met densitometry, genormaliseerd naar GAPDH, en omgezet in percentage van de hNSF in normaal medium met behulp van ImageJ-software. Alle experimenten werden uitgevoerd 3x met behulp van cellen van drie niet-gerelateerde donoren. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van one-way ANOVA met Tukey's post-test (*p < 0,05, foutbalken geven SEM). Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van een eerdere studie13. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Effecten van MMC op celgenexpressie. hHSFs en hNSFs werden gedurende 6 dagen onder MMC-omstandigheden geteeld. Totaal RNA werd geoogst met behulp van een test kit, en de eerste streng cDNA werd gesynthetiseerd met behulp van de cDNA synthese kit. Doel genexpressie werd genormaliseerd naar GAPDH en omgezet in het percentage van de hNSF in normaal medium. Alle experimenten werden herhaald 3x met behulp van cellen van drie niet-gerelateerde donoren. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van one-way ANOVA met Tukey's post-test (*p < 0,05, foutbalken geven SEM). Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van een eerdere studie13. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol is gericht op het optimaliseren en verifiëren van een verbeterd :scar-in-a-jar" in vitro model voor menselijk huidlittekenweefsel. Eerdere studies hebben gemeld de toepassing van MMC techniek om menselijke longfibroblasten12, menselijke beenmerg mesenchymale stamcellen23, en menselijke dermale fibroblasten23 met behulp van dextran12, Ficoll12, en PVP23 als crowders. In de hier gerapporteerde studie werd het eerder gepubliceerde protocol voor hypertrofische litteken-afgeleide menselijke huidfibroblasten geoptimaliseerd met Ficoll of PVP als crowders.
De selectie en concentratie van macromoleculaire crowders zijn kritische parameters, omdat ze geen gelijkwaardige resultaten opleveren. Een eerdere studie heeft gemeld dat PVP40 (18% VVB) en PVP360 (54% VVB) de depositie van collageen en celproliferatie in huidfibroblasten23 aanzienlijk verbeteren (effecten van PVP bij FVOs >54% zijn niet getest). Deze twee voorwaarden werken echter niet consistent voor hHSF's die dit protocol gebruiken.
Zoals blijkt uit figuur 1,Ficoll aanzienlijk verbetert collageen I afzetting in vergelijking met de controle, terwijl PVP heeft geen significante effecten. Ficoll op 9% VVB aanzienlijk verhoogt de totale hoeveelheid collageen en collageen type I in vergelijking met Ficoll op 18% VVB. Bovendien is het van cruciaal belang om cellen van een lage passage te gebruiken, omdat primaire huidfibroblasten een beperkte levensduur hebben in cultuur24. Er werd gekozen om alleen vers geïsoleerde hHSF's te gebruiken om het in vivo fenotype te behouden. Na langdurige teelt vertonen primaire hSF's ongewone morfologie en atypische functionele reacties. Het wordt ook aanbevolen om het MMC-medium aan te vullen met ascorbinezuur, een belangrijke inducer van collageensynthese in hHSF25. Voorts wordt door andere onderzoekers voorgesteld om dezelfde antilichamen te gebruiken die in de materiaaltafel zijn opgenomen voor hHSF-gerelateerde studies; Antilichamen moeten echter worden gevalideerd als dit protocol op andere celtypen wordt toegepast.
Zoals gemeld in de representatieve resultaten, de opname van macromoleculaire crowders bleek te stimuleren de expressie van collageen (dat wil zeggen, collageen I, collageen IV, MSP's, en IL6) in hHSFs in vergelijking met hHSFs die werden geteeld met behulp van klassieke niet-MMC voorwaarden. Er wordt aangevoerd dat het geoptimaliseerde MMC-model aspecten van het in vivo fenotype van hHSFs behoudt en hun karakteristieke morfologie, biochemie, fysiologie en overvloedige extracellulaire matrix van cutane littekenweefsel in vivo recapituleert (in tegenstelling tot de bestaande 2D-cultuurbenaderingen). We zijn niet in staat om een vergelijkbaar in vitro model te identificeren dat in staat is om vergelijkbare "in vivo-achtige" eigenschappen te recapituleren. In vergelijking met bestaande diermodellen is dit MMC-protocol sneller en gebruiksvriendelijker, kosteneffectiever en tijdsefficiënter. Cuttle et al. vestigden een varkenshypertrofisch littekenmodel met behulp van thermische schade, die vergelijkbare kenmerken lijkt te hebben als die van menselijke hypertrofische littekens26. Naast de kosten en tijd die nodig zijn om de dieren te onderhouden, heeft het experiment echter meer dan 3 maanden nodig om26te voltooien . Dit geoptimaliseerde MMC-model vereist ongeveer 1 week voorbereiding voordat het klaar is voor gebruik.
Het protocol biedt een geavanceerd in vitro model voor het onderzoek van nieuwe anti-littekentherapieën. Het MMC-model is gebruikt om Shikonin te evalueren, een molecuul dat eerder werd gemeld om de novo-vorming van littekens te remmen, voor het herstel van volwassen hypertrofische littekens27,28. Een soortgelijke evaluatie van nieuwe verbindingen en interventies met behulp van klassieke benaderingen van de ontdekking van geneesmiddelen en proof-of-concept zou aanzienlijke middelen, middelen en tijd vereisen. Deze studie vereiste minimale financiën en kan binnen enkele maanden worden afgerond. Het protocol is flexibel en gemakkelijk aanpasbaar voor toepassingen bij de ontwikkeling en beoordeling van nieuwe hypertrofische littekenbehandelingen voorafgaand aan dierstudies.
Bovendien kan dit protocol verder worden aangepast om meer "in vivo-achtige" eigenschappen te ontwikkelen. Bijvoorbeeld, de aanwezigheid van overvloedige TGF-β1 is een consistente bevinding in hypertrofische littekenweefsels, bemiddelen littekenvorming door het stimuleren van collageen synthese en depositie28. TGF-β1 kan gemakkelijk in het MMC-protocol worden opgenomen en de recapitulatie van in vivo pathologie verder verbeteren. We hebben het volledige potentieel van het model nog niet onderzocht, wat nuttig kan zijn voor andere collageen- en ECM-gerelateerde pathologieën (d.w.z. sclerodermie, longfibrose, endomyocardiale fibrose, enz.). Bovendien zou het interessant zijn om de effecten van MMC op cellen te observeren over een langere kweekperiode, zoals 2 of 3 weken. Het is ook de moeite waard om de effecten van MMC op de hiërarchische architectuur en uitlijning van de ECM verder te evalueren, met name de oriëntatie van collageen, omdat deze karakteriseringen essentieel zijn voor in vivo littekenweefselvorming.
Een van de belangrijkste beperkingen van dit protocol is de beperking van celtypen. Hypertrofische littekenvorming omvat de deelname van verschillende celpopulaties, en de interacties tussen verschillende celtypen spelen een essentiële rol bij littekenvorming. Bijvoorbeeld, keratinocyten spelen ook een belangrijke rol in cutane wondgenezing en littekenvorming29. De integratie van extra celpopulaties in dit model zal de betekenis ervan in toekomstig onderzoek sterk verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door financiering van het Singaporese Agentschap voor Wetenschap, Technologie en Onderzoek "SPF 2013/004: Skin Biology Basic Research" en de "Wound Care Innovation for the Tropics" IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009. De auteurs dankbaar erkennen advies en hulp van Dr Paula Benny en Dr Michael Raghunath.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Sartorius | 16534 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | P36962 | |
| Alexa Fluor 680 | Thermo Fisher Scientific | A-21076 | |
| Alexa Fluor 800 | Thermo Fisher Scientific | A-11371 | |
| alpha smooth muscle actin (αSMA) primary antibody | Abcam | ab5694 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler ) | Thermo Fisher Scientific | 4351106 | |
| Ascorbic acid | Wako | #013-12061 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | #A2153 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Collagen I primary antibody (for immunostaining) | Abcam | 6308 | |
| Collagen I primary antibody (for western blot) | Abcam | ab21286 | |
| Collagen III primary antibody | Abcam | ab7778 | |
| Collagen IV primary antibody | Abcam | ab6586 | |
| Direct Red 80 | Sigma-Aldrich | 2610108 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11996-065 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 6000-044 | |
| Ficoll 400 | GE HealthCare | #17-0300-10 | |
| Ficoll 70 | GE HealthCare | #17-0310-10 | |
| GAPDH primary antibody | Sigma-Aldrich | G8795 | |
| Goat Anti-Rabbit secondary antibody | Abcam | ab97050 | |
| Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF) | Cell Research Corporation | 106, 107, 108 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | #1708890 | |
| MMP-1 primary antibody | Abcam | ab38929 | |
| MMP-13 primary antibody | Abcam | ab39012 | |
| MMP-2 primary antibody | Abcam | ab37150 | |
| MMP-9 primary antibody | Abcam | ab38898 | |
| NanoDrop Microvolume Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 10484060 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| Odyssey blocking buffer | LI-COR Biosciences | 927–40000 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A | |
| Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining) | Olympus | N/A | |
| Penicillin/streptomycin solution (P/S) | Life Technologies | 15140-122 | |
| PrimePCR Assays | Bio-Rad | Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| PVP 360 | Sigma | #PVP360 | |
| PVP 40 | Sigma | #PVP40 | |
| RIPA buffer | Merck | R0278 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | #74134 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450022 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader | Molecular Devices | N/A | |
| SsoAdvanced universal SYBR green supermix | Bio-Rad | #172-5270 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- vander Veer, W. M., et al. Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation. Burns. 35 (1), 15-29 (2009).
- Linge, C., et al. Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase. Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).
- Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review. International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).
- Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression. Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).
- Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. P. Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26373 (2015).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study. Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).
- Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
- Chen, C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 277-290 (2011).
- Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., Van Vliet, K. J. Macromolecular Crowding Directs Extracellular Matrix Organization and Mesenchymal Stem Cell Behavior. PloS one. 7 (5), 37904 (2012).
- Chen, C. Z., et al. The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).
- Fan, C., et al. Application of "macromolecular crowding" in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars. Chemico-Biological Interactions. 310, 108747 (2019).
- Canty, E. G., Kadler, K. E. Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis. Journal of Cell Science. 118, Pt 7 1341-1353 (2005).
- Minton, A. P. Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited. Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).
- Ernst, O., Zor, T.
- Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. M. Optimization of the RNeasy Mini Kit to obtain high-quality total RNA from sessile cells of Staphylococcus aureus. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 48 (12), 1071-1076 (2015).
- Xue, M., Jackson, C. J. Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring. Advances in wound care (New Rochelle). 4 (3), 119-136 (2015).
- Rohani, M. G., Parks, W. C. Matrix remodeling by MMPs during wound repair. Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).
- Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).
- Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis. Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).
- Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor. Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).
- Rashid, R., et al. Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).
- Lago, J. C., Puzzi, M. B. The effect of aging in primary human dermal fibroblasts. PloS one. 14 (7), 0219165 (2019).
- Cigognini, D., et al. Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture - A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis. Scientific Reports. 6, 30746 (2016).
- Cuttle, L., et al. A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring. Burns. 32 (7), 806-820 (2006).
- Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment. Journal of Biomedical Science. 22, 70 (2015).
- Fan, C., et al. Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts. International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).
- Werner, S., Krieg, T., Smola, H.
