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Bioengineering

मैक्रोमॉलिक्यूलर क्राउडिंग का उपयोग करके मानव क्यूटिनियस हाइपरट्रोफिक स्कैरिंग के विट्रो मॉडल में

Published: May 1, 2020 doi: 10.3791/61037
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2, 1, 1,3, 1
1Skin Research Institute of Singapore, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 2School of Chemical and Life Sciences, Singapore Polytechnic, 3Institute of Medical Biology, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR)

Summary

यह प्रोटोकॉल एक इन विट्रो ह्यूमन हाइपरट्रोफिक निशान ऊतक मॉडल बनाने के लिए मैक्रोमॉलिक्यूलर क्राउडिंग के उपयोग का वर्णन करता है जो वीवो स्थितियों में जैसा दिखता है। जब भीड़ भाड़ वाले मैक्रोमॉलिक्यूलर वातावरण में खेती की जाती है, तो मानव त्वचा फाइब्रोब्लास्ट फेनोटाइप, बायोकेमिस्ट्री, फिजियोलॉजी और निशान ऊतक जैसी कार्यात्मक विशेषताओं को प्रदर्शित करते हैं।

Abstract

यह दिखाया गया है कि वीवो ऊतकों में प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड, राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन, पॉलीसैकराइडआदि आदि की अत्यधिक भीड़ होती है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल विट्रो में सेल संस्कृतियों के लिए तटस्थ बहुलक (क्राउडर्स) के अलावा के माध्यम से इस शारीरिक भीड़ की नकल करने के लिए एक मैक्रोमॉलिक्यूलर क्राउजिंग (एमएमसी) तकनीक लागू करता है। क्राउडर्स के रूप में फिकॉल या डीएक्सटीन का उपयोग करने वाले पिछले अध्ययनों से पता चलता है कि WI38 और WS-1 सेल लाइनों में कोलेजन I और फाइब्रोनेक्टिन की अभिव्यक्ति को एमएमसी तकनीक का उपयोग करके काफी बढ़ाया जाता है। हालांकि, इस तकनीक को प्राथमिक हाइपरट्रोफिक निशान-व्युत्पन्न मानव त्वचा फाइब्रोब्लास्ट (एचएचएसएफ) में मान्य नहीं किया गया है। चूंकि हाइपरट्रोफिक निशान कोलेजन के अत्यधिक जमाव से उत्पन्न होता है, इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एचएचएसएफ के साथ एमएमसी तकनीक लागू करके विट्रो हाइपरट्रोफिक निशान मॉडल में कोलेजन से भरपूर का निर्माण करना है। इस अनुकूलित एमएमसी मॉडल को पारंपरिक 2-आयामी (2-डी) सेल संस्कृति प्रणालियों की तुलना में वीवो निशान ऊतक में अधिक समानताएं रखने के लिए दिखाया गया है। इसके अलावा, यह पशु मॉडल की तुलना में लागत प्रभावी, समय कुशल और नैतिकता की दृष्टि से वांछनीय है। इसलिए, यहां रिपोर्ट किए गए अनुकूलित मॉडल हाइपरट्रोफिक निशान से संबंधित अध्ययनों के लिए एक उन्नत "वीवो-लाइक" मॉडल प्रदान करता है।

Introduction

निशान ऊतक ऊतक की मरम्मत के अंतिम बिंदु का प्रतिनिधित्व करता है। हालांकि, कई व्यक्तियों में, विशेष रूप से जलने या आघात1से पीड़ित लोग, जख्म अत्यधिक हो सकते हैं और चंगा त्वचा की आकृति विज्ञान और कामकाज पर अवांछनीय प्रभाव डाल सकते हैं। यद्यपि रोग (हाइपरट्रोफिक निशान और केलोइड) निशान गठन के सटीक तंत्र को पूरी तरह से समझ में नहीं आता है, घाव भरने के दौरान कोलेजन के अत्यधिक जमाव को एक आवश्यक योगदान2होने का प्रदर्शन किया गया है।

यह अच्छी तरह से स्थापित है कि विकास कारक बीटा 1 (टीजीएफ-1) और अल्फा चिकनी मांसपेशी ऐक्टिन (αSMA) को बदलने से हाइपरट्रोफिक निशान के गठन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। सबूत से पता चलता है कि ऊंचा TGF-1 सीधे SMAD सिग्नलिंग पाथवे3को विनियमित करने के माध्यम से कोलेजन के अत्यधिक जमाव को उत्तेजित करता है । इसके अलावा, αSMA घाव चिकित्सा प्रक्रिया4में सेल संकुचन और reepithelialization को विनियमित करके हाइपरट्रोफिक निशान गठन में योगदान करने के लिए पाया गया है । विट्रो में उपयुक्त की कमी और वीवो मॉडल में निशान उपचारण के लिए हस्तक्षेप और उपचार ों के विकास और मूल्यांकन की दिशा में एक बड़ी बाधा है। इस अध्ययन का उद्देश्य मौजूदा एमएमसी तकनीक का उपयोग "वीवो-जैसे" हाइपरट्रोफिक निशान मॉडल का निर्माण करने के लिए करना है जो उपन्यास और उभरते निशान से संबंधित हस्तक्षेपों के मूल्यांकन के लिए उपयुक्त है।

शरीर के बाहर रहने वाले ऊतकों को पुन: उत्पन्न करना वैज्ञानिक समुदाय में वर्षों से एक लक्ष्य रहा है। बीसवीं शताब्दी की शुरुआत में इन विट्रो तकनीकों के विकास ने आंशिक रूप से इस लक्ष्य को हासिल किया। वर्तमान इन विट्रो तकनीकों थोड़ा है रॉक्स मूल प्रदर्शन से विकसित किया है कि भ्रूण कोशिकाओं गर्म खारा5में कई दिनों के लिए पूर्व वीवो जीवित रह सकते हैं । हालांकि, इन विट्रो पद्धतियों ज्यादातर 2-डी में खेती एकल सेल प्रकार तक ही सीमित हैं और वीवो में ऊतकों को सही ढंग से संक्षिप्त नहीं करते हैं। जबकि सेल बायोकेमिस्ट्री, फिजियोलॉजी और जेनेटिक्स की जांच के लिए उपयोगी, देशी ऊतक 3-डी हैं और कई सेल प्रकारों को शामिल करते हैं। सरल 2-डी इन विट्रो सिस्टम स्तनधारी कोशिकाओं को अत्यधिक कृत्रिम वातावरण के अधीन करता है जिसमें देशी ऊतक-विशिष्ट वास्तुकला6खो जाती है। बदले में, यह इंट्रासेलर और बाह्य घटनाओं को प्रभावित करता है, जिसके परिणामस्वरूप असामान्य कोशिका आकृति विज्ञान, शरीर विज्ञान और व्यवहार7होते हैं।

इस प्रोटोकॉल के पीछे की रुचि हाइपरट्रोफिक निशान और केलॉयड के विकास और नैदानिक प्रबंधन में निहित है। हालांकि यह अच्छी तरह से स्थापित है कि डर्मल फाइब्रोब्लास्ट निशान ऊतक में मौजूद कोलेजन के प्रचुर उत्पादन के लिए काफी हद तक जिम्मेदार हैं, 2-डी इन विट्रो सिस्टम का उपयोग करके डर्मल फाइब्रोब्लास्ट की खेती वीवो8में देखी गई कोलेजन के कारोबार को पुन: पेश करने में विफल रहता है। समकालीन इन विट्रो विधियां अभी भी अनिवार्य रूप से "गर्म खारा" का उपयोग करती हैं, जो जीवित ऊतकों में उससे पूरी तरह से अलग वातावरण है। वीवो में ऊतक बेहद भीड़ भरे होते हैं, जिसमें प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड, रिबोन्यूक्लियोप्रोटीन और पॉलीसैकराइड्स होते हैं, जो कुल मात्रा का 5%-40% पर कब्जा करते हैं। चूंकि कोई भी दो अणु एक ही समय में एक ही स्थान पर कब्जा नहीं कर सकते हैं, इसलिए थोड़ा खाली स्थान उपलब्ध है और मुफ्त पानी का लगभग पूरा अभाव9है।

एमएमसी तकनीक साइटोसोल और इंटरस्टिशियल तरल पदार्थ के थर्मोडायनामिक गुणों को प्रभावित करने वाली बाधाओं को लगाती है। आणविक बातचीत, रिसेप्टर-लिगामेंट सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स, एंजाइम और ऑर्गेनेल्स स्वतंत्र रूप से बातचीत करने से सीमित हैं और9। पेरिसेलुलर वातावरण (यानी, इंटरस्टिटियम) के भीतर बातचीत भी विवश है। हाल के सबूत इस बात की पुष्टि करते हैं कि भीड़ भरे समाधानों में निष्क्रिय मैक्रोअणुओं की उच्च सांद्रता प्रसार, भौतिक संघ, चिपचिपाहट और हाइड्रोडायनामिक गुणों10को परेशान करती है।

दिलचस्प बात यह है कि कई लोकप्रिय क्राउडिंग एजेंट (यानी, फिकॉल, डीएक्सटीएन, पॉलीविनाइलपाइरोलिडोन [पीवीपी], और सोडियम 4-स्टायरनेसल्फोनेट [पीएसएस]) विभिन्न सेल प्रकारों और विभिन्न सेटिंग्स में लागू होने पर समकक्ष नहीं हैं। पिछले एक अध्ययन में, Ficoll पीवीपी की तुलना में मेसेंचिमल स्टेम सेल के लिए कम साइटोटॉक्सिक होने की सूचना मिली थी । इन परिणामों की व्याख्या इसके तटस्थ आवेश और अपेक्षाकृत छोटे हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या11के परिणाम के रूप में की गई थी । इसके विपरीत, एक दूसरे अध्ययन में पाया गया कि dextran Ficoll12की तुलना में मानव फेफड़ों फाइब्रोब्लास्ट द्वारा कोलेजन मैं बयान उत्तेजक में अधिक प्रभावी है । हमारे अपने अध्ययन से डेटा से पता चलता है कि Ficoll हाइपरट्रोफिक निशान-व्युत्पन्न फाइब्रोब्लास्ट द्वारा कोलेजन बयान को बढ़ाता है, जबकि PVP इन कोशिकाओं13के लिए विषाक्त है ।

यह दर्शाया गया है कि वीवो पर्यावरण14में अत्यधिक भीड़ में प्रोकोलेजन को कोलेजन का रूपांतरण तेज होता है, जबकि जैविक प्रतिक्रियाओं की दर में पतला 2-डी संस्कृति प्रणाली15में देरी होती है । हमने यहां इन विट्रो प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया है, जिसमें एमएमसी को शामिल किया गया है ताकि डर्मल फाइब्रोसिस और निशान गठन के लिए अधिक "वीवो-जैसे" मॉडल के रूप में सेवारत डर्मल फाइब्रोब्लास्ट की खेती को दिखाया जा सके। आम 2-डी संस्कृति प्रणाली के विपरीत, एमएमसी के साथ एचएचएसएफ की खेती बायोसिंथेसिस और कोलेजन के जमाव को काफी13उत्तेजित करती है। विशेष रूप से, फाइब्रोसिस (यानी, मैट्रिक्स मेटलोप्रोटीनाज़ [एमएमपी] और भड़काऊ साइटोकिन्स की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति की अन्य विशेषताएं भी इस अनुकूलित एमएमसी प्रोटोकॉल13के तहत स्पष्ट हैं। जब इस विधि का उपयोग करखेती की जाती है, तो यह दिखाया जाता है कि डर्मल कोशिकाएं वीवो में मापा गया शारीरिक, जैव रासायनिक और कार्यात्मक मापदंडों को फिर से तैयार करती हैं।

ऑप्टिमाइज्ड एमएमसी इन विट्रो प्रोटोकॉल का उपयोग हाइपरट्रोफिक निशान डर्मिस और अशामिल आसन्न डर्मिस से अलग डर्मल फाइब्रोब्लास्ट द्वारा कोलेजन और अन्य ईसीएम प्रोटीन की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए किया गया है। जब वीट्रो में एमएमसी वातावरण में खेती की जाती है, तो यह देखा गया है कि एचएचएसएफ वीवो में डर्मल हाइपरट्रोफिक निशान ऊतक के समान कुछ विशेषताओं (यानी, एमआरएनए, बायोकेमिस्ट्री, फिजियोलॉजी और फेनोटाइप) को व्यक्त करता है। सबूत इंगित करता है कि क्राउडर्स का चयन करते समय भौतिक और रासायनिक गुण महत्वपूर्ण विचार हैं और विट्रो में खेती के लिए एमएमसी की स्थिति का अनुकूलन करते हैं।

सबूत के सिद्धांत के लिए, एमएमसी प्रोटोकॉल गुणात्मक और मात्रात्मक शिकोनिन और उसके अनुरूप apoptosis प्रेरित करने की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए यहां लागू किया जाता है । यह13डर्मल जख्म के प्रबंधन के लिए इन स्वाभाविक रूप से व्युत्पन्न पारंपरिक चीनी चिकित्सा (TCM) यौगिकों के संभावित अनुप्रयोगों के मूल्यांकन की अनुमति देता है । बावजूद, सादगी, लागत प्रभावशीलता, और इस में विट्रो एमएमसी प्रोटोकॉल की समयबद्धता भी यूरोपीय संघ के निर्देश 2010/63/EU और अमेरिका के पर्यावरण संरक्षण एजेंसी (EPA) द्वारा स्तनधारियों में प्रयोग को खत्म करने के लिए हाल के नियमों को संतुष्ट करता है ।

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Protocol

1. सेल संस्कृति

  1. 5% सीओ 2/95% हवा के साथ एक इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) और 1% v/v पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान (पी/एस) युक्त दुलबेकको के संशोधित ईगल के2माध्यम (डीएमईएम) में गैर-पैथोलॉजिकल ऊतक (एचएनएसएफ) से प्राप्त एचएचएसएफ और सामान्य डर्मल फाइब्रोब्लास्ट बनाए रखें।
  2. उपयुक्त कंपनियों से Ficoll 70, Ficoll 400, और ascorbic एसिड खरीदें।

2. एमएमसी हाइपरट्रोफिक निशान मॉडल का निर्माण

  1. एचएचएसएफ या एचएनएसएफ (50,000/वेल) को 24 अच्छी तरह से प्लेट में बीज करें जिसमें प्रत्येक कुएं में मीडिया का 1 किलोल हो।
  2. 5% सीओ2 पर 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें और रात भर छोड़ दें।
  3. एमएमसी मीडिया तैयार करें। प्रयोग के लिए आवश्यक कुल मात्रा के आधार पर, Ficoll ७० (१८.७५ मिलीग्राम/mL), Ficoll ४०० (१२.५ मिलीग्राम/mL), और ascorbic एसिड (१०० μM) मिश्रण द्वारा 10% FCS/DMEM मीडिया का उत्पादन ।
  4. इस मिश्रण को समाधान में भीड़ को तितर-बितर करने के लिए 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में रखें, फिर 0.2 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके एमएमसी मीडिया को स्टरलाइज करें।
  5. खर्च मीडिया Aspirate और हौसले से बनाया एमएमसी मीडिया के साथ बदलें ।
  6. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर 6 दिनों के लिए इनक्यूबेट करें, हर 3 दिनों में मीडिया को बदलते हैं।

3. कोलेजन की कुल राशि की अभिव्यक्ति

  1. सीरियस रेड सॉल्यूशन (0.1% w/v) तैयार करें। 200 मिलीग्राम में आसुत डिओनाइज्ड पानी (डीडीएच2ओ) के 0.2 ग्राम प्रत्यक्ष लाल 80 पाउडर को 1 मिलीग्राम एसिटिक एसिड के साथ भंग करें।
  2. एमएमसी मीडिया को एस्पिरेट करें और प्रत्येक कुएं में सीरियस रेड सॉल्यूशन के 300 माइक्रोन जोड़ें। 90 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  3. धीरे-धीरे सीरियस रेड सॉल्यूशन को नल के पानी से कुल्ला करें और प्लेट को रात भर हवा-सूखने दें।
  4. प्रत्येक कुएं में सोडियम हाइड्रोक्साइड (0.1 एम) के 200 माइक्रोन जोड़कर सीरियस लाल दाग निकालें। सीरियस लाल दाग को पूरी तरह निकालने के लिए प्लेट को 5-10 मिन के लिए ऑर्बिटल शेकर पर रखें।
  5. निकाले गए सीरियस लाल दाग के 100 माइक्रोन को 96 अच्छी तरह से पारदर्शी प्लेट में स्थानांतरित करें और माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके 620 एनएम पर अवशोषण को मापें।

4. कोलेजन की अभिव्यक्ति मैं (इम्यूनोस्टेनिंग)

  1. फॉस्फेट-बफर्ड लवइन (पीबीएस, पीएच = 7.35) के 200 माइक्रोन का उपयोग करके कुओं को धोएं।
  2. 10 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मेथनॉल (500 μL/well) का उपयोग कर कोशिकाओं को ठीक करें।
  3. कमरे के तापमान (आरटी) पर 30 न्यूनतम के लिए 3% गोजातीय सीरम एल्बुमिन के साथ गैर-विशिष्ट बातचीत को ब्लॉक करें।
  4. एस्पिरेट ब्लॉकिंग समाधान और एंटी-कोलेजन आई एंटीबॉडी (10 μg/mL) के २०० μL के साथ इनक्यूबेट आरटी में ९० मिन के लिए ।
  5. प्राथमिक एंटीबॉडी को एस्पिरेट करें और प्रत्येक 5 मिन के लिए पीबीएस के साथ 3x धोएं।
  6. बकरी विरोधी खरगोश-FITC माध्यमिक एंटीबॉडी (1:400 कमजोर पड़ने) और 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1: 2000 कमजोर पड़ने) के 200 μL के साथ इनक्यूबेट आरटी में 30 min के लिए प्लेट को कवर करें।
  7. माध्यमिक एंटीबॉडी और डीपीआई दोनों को त्यागें और प्रत्येक 5 मिन के लिए पीबीएस के साथ 3x धोएं।
  8. एक माइक्रोस्कोप के नीचे सीधे फ्लोरेसेंस धुंधला कल्पना करें।

5. वेस्टर्न ब्लॉटिंग

  1. कोशिकाओं 2x को पीबीएस से धोएं।
  2. प्रत्येक कुएं में लिसिस बफर के 40 माइक्रोन जोड़ें और एक पिपेट टिप के साथ सेल परत को कुरेदलें। लिस् ट बफर में रिपा बफर, प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल (पीआईसी), 2 एमएम सोडियम वैनडेट और 10 एमएम सोडियम फ्लोराइड होता है।
  3. प्रोटीन लाइसेट को माइक्रोसेंट्रोफ्यूज ट्यूबमें स्थानांतरित करें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रोटीन परख का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता को मापें16।
  4. प्रत्येक समूह के 10 माइक्रोन प्रोटीन को 4%-12% बीआईएस-ट्रिस प्रोटीन जैल के कुओं में लोड करें। 30 मिन के लिए 200 वी पर सोडियम डोडेसिल सल्फेट पॉलीएक्रिलैमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (एसडीएस-पेज) करें।
  5. 90 मीटर के लिए 90 वी पर पश्चिमी दाग चलाकर प्रोटीन को नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में स्थानांतरित करें। जेल और नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली के बीच हवा के बुलबुले के गठन से बचें।
  6. झिल्ली को ब्लॉक करने वाले बफर के 10 मीटर के साथ ब्लॉक कर दें।
  7. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट। प्राथमिक एंटीबॉडी हैं: एंटी-कोलेजन I, एंटी-कोलेजन III, एंटी-कोलेजन चतुर्थ, एंटी-αSMA, एंटी-एमएमपी-1, एंटी-एमएमपी-2, एंटी एमएमपी-9, एंटी-एमएमपी-13, और एंटी-ग्लिसरल्डडिहाइड 3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (GAPDH)।
  8. झिल्ली को 0.1% टीबीएस-ट्वीन 20 (5x के लिए 5x प्रत्येक) से धोएं। टीबीएस/ट्वीन 20 (1 एल) में निम्नलिखित शामिल हैं: 1 एम ट्रिस (पीएच = 7.4), 5 एम सोडियम क्लोराइड का 30 एमएल, ट्वीन 20 का 1 एमएल और डीडीएच2ओ का 920 एमएल।
  9. 1 घंटे के लिए आरटी में उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी प्रजातियों के साथ इनक्यूबेट।
  10. चरण 5.8 दोहराएं और इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके फ्लोरेसेंस की कल्पना करें।

6. आरटी-पीसीआर

  1. आरएनए निष्कर्षण परख किट में शामिल 2-मर्काप्टोथेनॉथेनॉल के साथ मिश्रित lysis बफर का उपयोग करकुल आरएनए ले लीजिए।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार आरएनए शुद्धकरें 17.
  3. माइक्रोवॉल्यूम स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके आरएनए एकाग्रता को मापें।
  4. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक सीडीएनए संश्लेषण किट का उपयोग करके पहले स्ट्रैंड सीडीएनए संश्लेषण करें।
  5. आरटी-पीसीआर ओलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमर कस्टम 96 वेल प्लेट्स में (प्रीकोटेड) प्रदान किए जाते हैं। कस्टमाइज्ड प्लेट में एसवाईबीआर ग्रीन सुपरमिक्स के 10 माइक्रोन के साथ सीडीएनए नमूनों के 100 एनजी को मिलाएं।
  6. डीडीएच2ओ का उपयोग करके कुल मात्रा को 20 माइक्रोन/अच्छी तरह से बढ़ाएं।
  7. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए थर्मल साइकिलर का उपयोग करके आरटी-पीसीआर चलाएं: 15 एस के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर denaturing के ४० चक्र और ६० एस के लिए ६० डिग्री सेल्सियस पर annealing/विस्तार । आरटी-पीसीआर में परीक्षण किए गए जीनमें शामिल हैं: COL1A1, COL3A1, ACTA2, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD7, IL1A, IL1B, IL6, IL8, MMP1, MMP2, MMP3, TGFB1, और VEGF।

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Representative Results

प्रत्येक प्रयोग में ट्रिपलकेट नमूने किए गए थे, और प्रत्येक प्रयोग तीन व्यक्तिगत रोगियों से कोशिकाओं का उपयोग कर3x दोहराया गया था । डेटा नियंत्रण समूह के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किए जाते हैं। सांख्यिकीय मतभेदों का विश्लेषण करने के लिए एक तरह से ANOVA और Tukey के बाद तदर्थ परीक्षण लागू किया गया था (*pa 0.05)।

9% एफवीओ (आंशिक मात्रा अधिभोग) पर फिकॉल का उपयोग करने वाली एमएमसी एचएचएसएफ13में कोलेजन और कोलेजन I बयान की कुल मात्रा को बढ़ाती है। जैसा कि चित्र 1एमें सचित्र है, पीवीपी का उपयोग करके नियंत्रण और एमएमसी की तुलना में 9% और 18% एफवीओ पर फिकॉल के साथ काम करने के बाद एचएचएसएफ की सेल घनत्व में काफी वृद्धि हुई है। चित्रा 1बी, सी इंगित करता है कि Ficoll (9% FVO पर) काफी अन्य एमएमसी योगों की तुलना में कोलेजन (कोलेजन I सहित) के बयान को बढ़ाया. मात्रात्मक विश्लेषण(चित्रा 1डी, ई)ने आगे दिखाया कि फिकॉल (9% एफवीओ पर) ने कोलेजन के जमाव में सबसे प्रभावी रूप से सुधार किया।

एमएमसी वातावरण में खेती की गई एचएचएसएफ और एचएनएसएफ कोलेजन13के अलावा ईसीएम प्रजातियों की अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए पाया गया । चित्रा 2 में रिपोर्ट किए गए आंकड़ों से पता चलता है कि जब एचएमसी के साथ एचएचएसएफ और एचएनएसएफ की खेती की गई थी, तो कोलेजन IV की अभिव्यक्ति में भी काफी वृद्धि हुई थी। मैट्रिक्स धातुप्रोटीन (एमएमपी) घाव भरने और निशान गठन, ईसीएम असेंबली को विनियमित करने और18को फिर से तैयार करने के दौरान एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। एमएमपी सेल प्रसार, सेल माइग्रेशन, एंजियोजेनेसिस और एपोप्टोसिस19में भी योगदान देते हैं । विशेष रूप से, एमएमपी की एक ऊंची अभिव्यक्ति देशी ऊतकों की तुलना में हाइपरट्रोफिक निशान ऊतकों में जमा पाई गईथी। यह देखा गया कि एमएमसी वातावरण में खेती की गई एचएनएसएफ और एचएचएसएफ संस्कृतियों दोनों में एमएमपी-2, -9 और-13 की अभिव्यक्ति को काफी हद तक बढ़ा दिया गया था ।

हमने इंटरल्यूकिन-6 (आईएल-6) और वैस्कुलर एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (VEGF) के संश्लेषण की भी जांच की; हालांकि, ये एक पश्चिमी दाग में अज्ञेय थे। इसके विपरीत, आरटी-पीसीआर विश्लेषण(चित्रा 3)से पता चला है कि आईएल 6 की अभिव्यक्ति काफी बढ़ गई थी, जबकि एमएमसी स्थितियों में खेती किए गए एचएनएसएफ और एचएचएसएफ में वीजीएफ की अभिव्यक्ति को घटाया गया था। हाइपरट्रोफिक निशान गठन21में योगदान करने के लिए आईएल-6 की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया गया है । विडंबना यह भी है कि यह भी बताया गया है कि हाइपरट्रोफिक निशान का गठन VEGF22की एक ऊंचा अभिव्यक्ति से जुड़ा हुआ है। यहां किए गए आरटी-पीसीआर विश्लेषण से संकेत मिला कि एमएमसी स्थितियों के तहत खेती किए गए एचएनएसएफ और एचएचएसएफ में VEGF की अभिव्यक्ति बहुत क्षीण हो गई थी ।

अंत में, परिणाम ों ने दोनों 1 का प्रदर्शन किया) कोलेजन, कोलेजन I, कोलेजन चतुर्थ, एमएमपी-2, एमएमपी-9 और IL6 एमएमपी-13 डी नोवो और 2) के संश्लेषण में वृद्धि हुई। एक साथ लिया, इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि मीडिया योगों में प्राथमिक एचएचएसएफ और एचएनएसएफ की खेती जिसमें एमएमसी के परिणामस्वरूप वीवो में देशी हाइपरट्रोफिक निशान ऊतक में देखी गई विशेषता जीन अभिव्यक्ति, जैव रसायन और फिनोटाइप को बनाए रखने में शामिल है, जिससे एक मजबूत "निशान-इन-ए-जार" मॉडल होता है।

Figure 1
चित्रा 1: एमएमसी एचएचएसएफ में कोलेजन और कोलेजन मैं बयान की कुल राशि को बढ़ाता है। (क) सेल आकृति विज्ञान, (ख) कुल कोलेजन, सीरियस रेड के साथ दाग, (सी) कोलेजन मैं अभिव्यक्ति, इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा प्रदर्शित, (डी) कुल कोलेजन के मात्रात्मक विश्लेषण, और (ई) कोलेजन मैं बयान के मात्रात्मक विश्लेषण । एचएचएसएफ को 6 दिनों के लिए फिकॉल (9% और 18% एफवीओ), पीवीपी40 (18% एफवीओ), या PVP360 (54% और 72% एफवीओ) के साथ पूरक मीडिया में सुसंस्कृत किया गया था। प्रतिनिधि छवियों का चयन किया गया। इमेज क्वैशन इमेजजे का उपयोग करके किया गया था और इसे नियंत्रण के औसत प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया जाता है। सभी प्रयोगों को तीन असंबंधित दाताओं से अलग कोशिकाओं का उपयोग कर 3x दोहराया गया । तुकी के पोस्ट-टेस्ट (*पी एंड एलटी; 0.05 बनाम कंट्रोल ग्रुप, त्रुटि बार एसईएम से संकेत मिलता है) के साथ एक-तरफा एनोवा का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया था। स्केल बार = (ए) 0.5 मिमी, (बी) 2 मिमी, और (सी) 0.5 मिमी। इस आंकड़े को पिछलेअध्ययन 13से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: सेल प्रोटीन अभिव्यक्ति पर एमएमसी का प्रभाव। एचएचएसएफ और एचएनएसएफ को 6 दिनों के लिए एमएमसी की शर्तों के तहत सुसंस्कृत किया गया था। पूरे सेल lysates रिपा बफर के साथ तैयार किए गए थे जिसमें प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल, सोडियम वैनडेट और सोडियम फ्लोराइड शामिल थे। प्रोटीन परख का उपयोग कर प्रोटीन एकाग्रता मापा गया था। प्रतिनिधि छवियों को प्रस्तुत कर रहे हैं। मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, व्यक्तिगत प्रोटीन बैंड की तीव्रता को घनत्व के साथ मापा गया, जिसे गैपडीएच में सामान्य बनाया गया, और इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सामान्य माध्यम में एचएनएसएफ के प्रतिशत में परिवर्तित किया गया। सभी प्रयोगों तीन असंबंधित दाताओं से कोशिकाओं का उपयोग कर 3x प्रदर्शन किया गया । तुकी के पोस्ट-टेस्ट (*पी एंड एलटी; 0.05, त्रुटि बार एसईएम से संकेत मिलता है) के साथ एक-तरफा एनोवा का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया था। इस आंकड़े को पिछलेअध्ययन 13से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: सेल जीन अभिव्यक्ति पर एमएमसी के प्रभाव। 6 दिनों तक एमएमसी शर्तों के तहत एचएचएसएफ और एचएनएसएफ की खेती की गई। कुल आरएनए एक परख किट का उपयोग कर काटा गया था, और पहले कतरा cDNA cDNA संश्लेषण सीडीएनए संश्लेषण किट का उपयोग कर संश्लेषित किया गया था । लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति को GAPDH में सामान्यीकृत किया गया और सामान्य माध्यम में एचएनएसएफ के प्रतिशत में परिवर्तित कर दिया गया । सभी प्रयोगों को तीन असंबंधित दाताओं से कोशिकाओं का उपयोग कर 3x दोहराया गया । तुकी के पोस्ट-टेस्ट (*पी एंड एलटी; 0.05, त्रुटि बार एसईएम से संकेत मिलता है) के साथ एक-तरफा एनोवा का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया था। इस आंकड़े को पिछलेअध्ययन 13से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य मानव cutaneous निशान ऊतक के लिए विट्रो मॉडल में एक बेहतर: निशान-इन-ए-जार को अनुकूलित और प्रमाणित करना है। पिछले अध्ययनों ने मानव फेफड़े फाइब्रोब्लास्ट12,मानव अस्थि मज्जा मेसेंचिमल स्टेम सेल23,और मानव डर्मल फाइब्रोब्लास्ट23 को ड्रैडरके के रूप में dextran12,Ficoll12और PVP23 का उपयोग करके एमएमसी तकनीक के आवेदन की सूचना दी है। यहां रिपोर्ट किए गए अध्ययन में, हाइपरट्रोफिक निशान-व्युत्पन्न मानव त्वचा फाइब्रोब्लास्ट के लिए पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल को विकॉल या पीवीपी के साथ क्राउडर के रूप में अनुकूलित किया गया था।

मैक्रोमॉलिक्यूलर क्राउडर्स का चयन और एकाग्रता महत्वपूर्ण पैरामीटर हैं, क्योंकि वे समकक्ष परिणाम नहीं देते हैं। पिछले अध्ययन में बताया गया है कि पीवीपी40 (18% एफवीओ) और पीवीपी360 (54% एफवीओ) डर्मल फाइब्रोब्लास्ट23 (एफवीओ में पीवीपी के प्रभाव (एफवीओ में पीवीपी के प्रभाव (एफवीओ में पीवीपी के प्रभाव (जीटी54% अपरीक्षित हैं) में कोलेजन बयान और सेल प्रसार को काफी बढ़ाते हैं। हालांकि, ये दोनों स्थितियां इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके एचएचएसएफ के लिए लगातार काम नहीं करती हैं।

जैसा कि चित्र ा 1में दिखाया गया है, फिकॉल नियंत्रण की तुलना में कोलेजन को काफी बढ़ाता है, जबकि पीवीपी का कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं है। 9% FVO पर Ficoll काफी 18% FVO पर Ficoll की तुलना में कोलेजन और कोलेजन प्रकार मैं की कुल राशि बढ़ जाती है । इसके अलावा, कम मार्ग की कोशिकाओं का उपयोग करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि प्राथमिक डर्मल फाइब्रोब्लास्ट की संस्कृति24में सीमित उम्र होती है। यह केवल हौसले से अलग hHSFs का उपयोग करने के लिए वीवो फेनोटाइप में बनाए रखने के लिए चुना गया था । लंबे समय तक खेती के बाद, प्राथमिक एचएचएसएफ असामान्य आकृति विज्ञान और असामान्य कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन करते हैं। यह भी सिफारिश की जाती है कि एमएमसी माध्यम को एस्कोम्बिक एसिड के साथ पूरक किया जाए, जो एचएचएसएफ25में कोलेजन संश्लेषण का एक प्रमुख प्रेरक है। इसके अलावा, अन्य शोधकर्ताओं द्वारा एचएचएसएफ से संबंधित अध्ययनों के लिए सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध एक ही एंटीबॉडी का उपयोग करने का सुझाव दिया गया है; हालांकि, इस प्रोटोकॉल को अन्य सेल प्रकारों पर लागू करने पर एंटीबॉडी को मान्य करने की आवश्यकता है।

जैसा कि प्रतिनिधि परिणामों में बताया गया है, शास्त्रीय गैर-एमएमसी स्थितियों का उपयोग करके खेती किए गए एचएचएसएफ की तुलना में एचएचएसएफ में कोलेजन (यानी, कोलेजन I, कोलेजन आई, कोलेजन चतुर्थ, एमएमपी और आईएल6) की अभिव्यक्ति को प्रोत्साहित करने के लिए मैक्रोमॉलिक्यूलर क्राउडर्स को शामिल किया गया था। यह तर्क दिया जाता है कि अनुकूलित एमएमसी मॉडल वीवो फेनोटाइप में एचएचएसएफ के पहलुओं को बरकरार रखता है, उनकी विशेषता आकृति विज्ञान, जैव रसायन विज्ञान, फिजियोलॉजी, और वीवो में cutaneous निशान ऊतक के प्रचुर मात्रा में अतिरिक्त कोशिकीय मैट्रिक्स (मौजूदा 2-डी संस्कृति दृष्टिकोण के विपरीत) को फिर से तैयार करता है। हम किसी भी समान इन विट्रो मॉडल की पहचान करने में सक्षम नहीं हैं जो "वीवो-जैसे" गुणों में समान को फिर से दोहराने में सक्षम है। मौजूदा पशु मॉडलों की तुलना में, यह एमएमसी प्रोटोकॉल तेज होने के साथ-साथ अधिक उपयोगकर्ता के अनुकूल, लागत प्रभावी और समय-कुशल है। कटल एट अल थर्मल इंजरी का उपयोग करके एक पोर्सिन हाइपरट्रोफिक निशान मॉडल की स्थापना की, जिसमें मानव हाइपरट्रोफिक निशान26के समान विशेषताएं प्रतीत होती हैं। हालांकि, जानवरों को बनाए रखने के लिए आवश्यक लागत और समय के अलावा, प्रयोगको 26को पूरा करने के लिए 3 महीने से अधिक की आवश्यकता होती है। इस अनुकूलित एमएमसी मॉडल के उपयोग के लिए तैयार होने से पहले लगभग 1 सप्ताह की तैयारी की आवश्यकता होती है।

प्रोटोकॉल उपन्यास विरोधी जख्म चिकित्सा की परीक्षा के लिए एक उन्नत इन विट्रो मॉडल प्रदान करता है। एमएमसी मॉडल का उपयोग शिकोनिन का मूल्यांकन करने के लिए किया गया है, जो पहले से ही परिपक्व हाइपरट्रोफिक निशान27,,28के उपचारण के लिए निशान के डी नोवो गठन को बाधित करने के लिए सूचित किया गया था। दवा की खोज और सबूत की अवधारणा के लिए शास्त्रीय दृष्टिकोण का उपयोग कर उपन्यास यौगिकों और हस्तक्षेप ों के इसी तरह के मूल्यांकन के लिए काफी संसाधनों, धन और समय की आवश्यकता होगी । इस अध्ययन के लिए न्यूनतम वित्त की आवश्यकता होती है और इसे कई महीनों के भीतर पूरा किया जा सकता है। प्रोटोकॉल पशु अध्ययन से पहले उपन्यास हाइपरट्रोफिक निशान उपचार के विकास और मूल्यांकन में अनुप्रयोगों के लिए लचीला और आसानी से अनुकूलनीय है।

इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को और अधिक "वीवो-जैसे" गुणों को विकसित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, अतिप्रचुर मात्रा में TGF-1 की उपस्थिति हाइपरट्रोफिक निशान ऊतकों में एक सुसंगत खोज है, कोलेजन संश्लेषण और बयान28उत्तेजक द्वारा निशान गठन मध्यस्थता । टीजीएफ-ए1 को एमएमसी प्रोटोकॉल में आसानी से शामिल किया जा सकता है और वीवो पैथोलॉजी में पुनर्काशिन को और बेहतर बनाया जा सकता है। हमने अभी तक मॉडल की पूरी क्षमता का पता नहीं लगाया है, जो अन्य कोलेजन और ईसीएम से संबंधित विकृतियों (यानी, स्क्लेरोडर्मा, पल्मोनरी फाइब्रोसिस, एंडोमोकार्डियल फाइब्रोसिस आदि) के लिए उपयोगी हो सकता है। इसके अलावा, 2 या 3 सप्ताह जैसे लंबी संस्कृति अवधि में कोशिकाओं पर एमएमसी के प्रभावों का निरीक्षण करना दिलचस्प होगा। सेल और ईसीएम पदानुक्रमित वास्तुकला और संरेखण, विशेष रूप से कोलेजन के अभिविन्यास पर एमएमसी के प्रभावों का मूल्यांकन करना भी सार्थक है, क्योंकि ये लक्षण वीवो निशान ऊतक गठन में आवश्यक हैं।

इस प्रोटोकॉल की प्रमुख सीमाओं में से एक सेल प्रकार का प्रतिबंध है। हाइपरट्रोफिक निशान गठन में विभिन्न सेल आबादी की भागीदारी शामिल है, और विभिन्न सेल प्रकारों के बीच बातचीत निशान गठन में एक आवश्यक भूमिका निभाती है। उदाहरण के लिए, केराटिनोसाइट्स भी cutaneous घाव चिकित्सा और निशान गठन29में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । इस मॉडल में अतिरिक्त सेल आबादी को शामिल करने से भविष्य के अनुसंधान में इसके महत्व में काफी सुधार होगा।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को विज्ञान, प्रौद्योगिकी और अनुसंधान के लिए सिंगापुर की एजेंसी से धन द्वारा समर्थित किया गया था "एसपीएफ 2013/004: त्वचा जीव विज्ञान बुनियादी अनुसंधान" और "उष्णकटिबंधीय के लिए घाव देखभाल नवाचार" भारतीय वायु सेना-पीपी/2017 (HBMS) H17/01/a0/009 । लेखक कृतज्ञता से डॉ पाउला बेनी और डॉ माइकल रघुनाथ से सलाह और सहायता स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 μm filter Sartorius 16534
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific P36962
Alexa Fluor 680 Thermo Fisher Scientific A-21076
Alexa Fluor 800 Thermo Fisher Scientific A-11371
alpha smooth muscle actin (αSMA) primary antibody Abcam ab5694
Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler ) Thermo Fisher Scientific 4351106
Ascorbic acid Wako #013-12061
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich #A2153
Bradford protein assay Bio-Rad 500-0006
Collagen I primary antibody (for immunostaining) Abcam 6308
Collagen I primary antibody (for western blot) Abcam ab21286
Collagen III primary antibody Abcam ab7778
Collagen IV primary antibody Abcam ab6586
Direct Red 80 Sigma-Aldrich 2610108
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Life Technologies 11996-065
Fetal calf serum (FCS) Life Technologies 6000-044
Ficoll 400 GE HealthCare #17-0300-10
Ficoll 70 GE HealthCare #17-0310-10
GAPDH primary antibody Sigma-Aldrich G8795
Goat Anti-Rabbit secondary antibody Abcam ab97050
Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF) Cell Research Corporation 106, 107, 108
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad #1708890
MMP-1 primary antibody Abcam ab38929
MMP-13 primary antibody Abcam ab39012
MMP-2 primary antibody Abcam ab37150
MMP-9 primary antibody Abcam ab38898
NanoDrop Microvolume Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific N/A
Nitrocellulose membrane Bio-Rad 10484060
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Thermo Fisher Scientific NP0321BOX
Odyssey blocking buffer LI-COR Biosciences 927–40000
Odyssey Fc Imaging System LI-COR Biosciences N/A
Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining) Olympus N/A
Penicillin/streptomycin solution (P/S) Life Technologies 15140-122
PrimePCR Assays Bio-Rad Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement
Protease inhibitor cocktail (PIC) Sigma-Aldrich 11697498001
PVP 360 Sigma #PVP360
PVP 40 Sigma #PVP40
RIPA buffer Merck R0278
RNeasy Plus Mini Kit QIAGEN #74134
Sodium vanadate Sigma-Aldrich 450022
Sodium vanadate Sigma-Aldrich 450243
SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader Molecular Devices N/A
SsoAdvanced universal SYBR green supermix Bio-Rad #172-5270
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416

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References

  1. vander Veer, W. M., et al. Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation. Burns. 35 (1), 15-29 (2009).
  2. Linge, C., et al. Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase. Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).
  3. Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review. International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).
  4. Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression. Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).
  5. Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. P. Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26373 (2015).
  6. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  7. Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  8. Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study. Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).
  9. Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
  10. Chen, C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 277-290 (2011).
  11. Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., Van Vliet, K. J. Macromolecular Crowding Directs Extracellular Matrix Organization and Mesenchymal Stem Cell Behavior. PloS one. 7 (5), 37904 (2012).
  12. Chen, C. Z., et al. The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).
  13. Fan, C., et al. Application of "macromolecular crowding" in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars. Chemico-Biological Interactions. 310, 108747 (2019).
  14. Canty, E. G., Kadler, K. E. Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis. Journal of Cell Science. 118, Pt 7 1341-1353 (2005).
  15. Minton, A. P. Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited. Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).
  16. Ernst, O., Zor, T. Linearization of the bradford protein assay. Journal of Visualized Experiments. (38), e1918 (2010).
  17. Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. M. Optimization of the RNeasy Mini Kit to obtain high-quality total RNA from sessile cells of Staphylococcus aureus. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 48 (12), 1071-1076 (2015).
  18. Xue, M., Jackson, C. J. Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring. Advances in wound care (New Rochelle). 4 (3), 119-136 (2015).
  19. Rohani, M. G., Parks, W. C. Matrix remodeling by MMPs during wound repair. Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).
  20. Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).
  21. Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis. Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).
  22. Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor. Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).
  23. Rashid, R., et al. Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).
  24. Lago, J. C., Puzzi, M. B. The effect of aging in primary human dermal fibroblasts. PloS one. 14 (7), 0219165 (2019).
  25. Cigognini, D., et al. Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture - A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis. Scientific Reports. 6, 30746 (2016).
  26. Cuttle, L., et al. A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring. Burns. 32 (7), 806-820 (2006).
  27. Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment. Journal of Biomedical Science. 22, 70 (2015).
  28. Fan, C., et al. Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts. International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).
  29. Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-Fibroblast Interactions in Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 127 (5), 998-1008 (2007).

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मैक्रोमॉलिक्यूलर क्राउडिंग का उपयोग करके मानव क्यूटिनियस हाइपरट्रोफिक स्कैरिंग के विट्रो मॉडल में
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Fan, C., Lim, L. K. P., Wu, Z., Sharma, B., Gan, S. Q., Liang, K., Upton, Z., Leavesley, D. In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding. J. Vis. Exp. (159), e61037, doi:10.3791/61037 (2020).

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