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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

In Vitro Modell der menschlichen kutanen hypertrophen Narbenbildung mit makromolekularer Crowding

Published: May 1, 2020 doi: 10.3791/61037
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2, 1, 1,3, 1
1Skin Research Institute of Singapore, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 2School of Chemical and Life Sciences, Singapore Polytechnic, 3Institute of Medical Biology, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR)

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von makromolekularem Crowding, um ein in vitro menschliches hypertrophes Narbengewebemodell zu erstellen, das in vivo-Bedingungen ähnelt. Wenn sie in einer überfüllten makromolekularen Umgebung kultiviert werden, weisen menschliche Hautfibroblasten Phänotypen, Biochemie, Physiologie und funktionelle Eigenschaften auf, die Narbengewebe ähneln.

Abstract

Es hat sich gezeigt, dass In-vivo-Gewebe stark von Proteinen, Nukleinsäuren, Ribonukleoproteinen, Polysacchariden usw. überfüllt sind. Das folgende Protokoll wendet eine makromolekulare Crowding-Technik (MMC) an, um diese physiologische Verdrängung durch die Zugabe von neutralen Polymeren (Crowdern) zu Zellkulturen in vitro nachzuahmen. Frühere Studien mit Ficoll oder Dextran als Crowder zeigen, dass die Expression von Kollagen I und Fibronectin in WI38 und WS-1 Zelllinien mit der MMC-Technik deutlich verbessert werden. Diese Technik wurde jedoch nicht bei primären hypertrophen Narben-abgeleiteten menschlichen Hautfibroblasten (hHSFs) validiert. Da hypertrophe Narbenbildung aus der übermäßigen Ablagerung von Kollagen entsteht, zielt dieses Protokoll darauf ab, ein kollagenreiches in vitro hypertrophes Narbenmodell zu konstruieren, indem die MMC-Technik mit hHSFs angewendet wird. Dieses optimierte MMC-Modell hat nachweislich mehr Ähnlichkeiten mit in vivo Narbengewebe als herkömmliche 2-dimensionale (2-D) Zellkultursysteme. Darüber hinaus ist es im Vergleich zu Tiermodellen kostengünstig, zeiteffizient und ethisch wünschenswert. Daher bietet das hier beschriebene optimierte Modell ein fortschrittliches "in vivo-ähnliches" Modell für hypertrophe Narbenstudien.

Introduction

Narbengewebe stellt den Endpunkt der Gewebereparatur dar. Jedoch, bei vielen Personen, vor allem diejenigen, die an Verbrennungen oder Trauma1leiden, Narbenbildung kann übermäßig sein und unerwünschte Auswirkungen auf die Morphologie und Funktion der geheilten Haut. Obwohl die genauen Mechanismen der pathologischen (hypertrophen Narben und Keloide) Narbenbildung nicht vollständig verstanden werden, hat sich gezeigt, dass übermäßige Ablagerung von Kollagen während der Wundheilung ein wesentlicher Beitrag2ist.

Es ist allgemein bekannt, dass die Transformation des Wachstumsfaktors Beta 1 (TGF-1) und alpha-glatter Muskelaktin (SMA) eine Schlüsselrolle bei der Bildung von hypertrophen Narben spielen. Es gibt Hinweise darauf, dass erhöhte TGF-Nr. 1 direkt die übermäßige Ablagerung von Kollagen durch Regulierung des SMAD-Signalwegs3stimuliert. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass SMA zur hypertrophen Narbenbildung beiträgt, indem die Zellkontraktion und Reepithelisierung im Wundheilungsprozess reguliertwird 4. Das Fehlen geeigneter In-vitro- und In-vivo-Modelle ist ein großes Hindernis für die Entwicklung und Bewertung von Interventionen und Therapien zur Narbensanierung. Ziel dieser Studie ist es, die bestehende MMC-Technik zu nutzen, um ein "in vivo-ähnliches" hypertrophes Narbenmodell zu konstruieren, das sich für die Bewertung neuartiger und aufkommender Narbeninterventionen eignet.

Die Reproduktion von lebendem Gewebe außerhalb des Körpers ist seit Jahren ein Ziel in der wissenschaftlichen Gemeinschaft. Mit der Entwicklung von In-vitro-Techniken im frühen 20. Jahrhundert wurde dieses Ziel teilweise erreicht. Aktuelle In-vitro-Techniken haben sich leicht aus Roux' ursprünglicher Demonstration entwickelt, dass embryonale Zellen ex vivo für mehrere Tage in warmer Saline überleben können5. In-vitro-Methoden sind jedoch meist auf Einzelzelltypen beschränkt, die in 2D kultiviert werden, und rekapitulieren Gewebe in vivo nicht genau. Während nützlich für die Untersuchung der Zellbiochemie, Physiologie, und Genetik, native Gewebe sind 3-D und enthalten mehrere Zelltypen. Einfache 2-D-In-vitro-Systeme unterwerfen Säugetierzellen hochgradig künstlichen Umgebungen, in denen die native gewebespezifische Architektur verloren geht6. Dies wiederum wirkt sich auf intrazelluläre und extrazelluläre Ereignisse aus, was zu abnormaler Zellmorphologie, Physiologie undVerhalten7 führt.

Das Interesse hinter diesem Protokoll liegt in der Entwicklung und dem klinischen Management von hypertrophen Narben und Keloiden. Während es allgemein bekannt ist, dass dermale Fibroblasten in hohem Maße für die reichliche Produktion von Kollagen enden, die im Narbengewebe vorhanden sind, gelingt es bei der Kultivierung dermaler Fibroblasten mit 2-D-In-vitro-Systemen nicht, den Umsatz von Kollagen zu reproduzieren, das in vivo8beobachtet wurde. Zeitgenössische In-vitro-Methoden verwenden nach wie vor im Wesentlichen "warme Saline", eine Umgebung, die sich völlig von der in lebenden Geweben unterscheidet. Gewebe in vivo sind extrem überfüllt, mit Proteinen, Nukleinsäuren, Ribonukleoproteinen und Polysacchariden, die 5% –40% des Gesamtvolumens einnehmen. Da keine zwei Moleküle den gleichen Raum gleichzeitig einnehmen können, gibt es wenig freien Raum und eine fast vollständige Abwesenheit von freiem Wasser9.

Die MMC-Technik setzt Einschränkungen auf, die die thermodynamischen Eigenschaften von Zytosol und interstitiellen Flüssigkeiten beeinflussen. Molekulare Wechselwirkungen, Rezeptor-Ligand-Signalkomplexe, Enzyme und Organellen sind beschränkt und von der freien Interaktion eingeschränkt9. Wechselwirkungen innerhalb der perizellulären Umgebung (d. h. Interstitium) sind ebenfalls eingeschränkt. Jüngste Erkenntnisse bestätigen, dass hohe Konzentrationen von inerten Makromolekülen in überfüllten Lösungen Diffusion, physikalische Assoziation, Viskosität und hydrodynamische Eigenschaften stören10.

Interessanterweise sind mehrere beliebte Crowding-Agenten (z.B. Ficoll, Dextran, Polyvinylpyrrolidon [PVP] und Natrium 4-Styrenesulfonat [PSS]) nicht gleichwertig, wenn sie auf verschiedene Zelltypen und in unterschiedlichen Einstellungen angewendet werden. In einer früheren Studie, Ficoll wurde berichtet, dass weniger zytotoxisch für mesenchymale Stammzellen im Vergleich zu PVP. Diese Ergebnisse wurden als Folge ihrer neutralen Ladung und des relativ kleinen hydrodynamischen Radius11interpretiert. Im Gegensatz dazu ergab eine zweite Studie, dass Dextran effektiver bei der Stimulierung der Kollagen-I-Abscheidung durch menschliche Lungenfibroblasten im Vergleich zu Ficoll12ist. Daten aus unserer eigenen Studie deuten darauf hin, dass Ficoll die Kollagenablagerung durch hypertrophe Narbe-abgeleitete Fibroblasten verbessert, während PVP für diese Zellen toxisch ist13.

Es wurde gezeigt, dass die Umwandlung von Prokollagen zu Kollagen in einer stark überfüllten in vivo Umgebung14schneller ist, während die Rate der biologischen Reaktionen in einem verdünnten 2D-Kultursystem verzögert wird15. Wir haben hier das In-vitro-Protokoll optimiert und MMC integriert, um die Kultivierung von dermalen Fibroblasten zu zeigen, die als "in vivo-ähnliches" Modell für dermale Fibrose und Narbenbildung dienen. Im Gegensatz zum gemeinsamen 2-D-Kultursystem stimuliert die Kultivierung von hHSFs mit MMC die Biosynthese und Ablagerung von Kollagen signifikant13. Insbesondere sind unter diesem optimierten MMC-Protokoll13auch andere Merkmale der Fibrose (d.h. erhöhte Expression von Matrixmetalloproteinasen [MMPs] und proinflammatorischen Zytokinen) zu erkennen. Bei der Kultivieren mit dieser Methode wird gezeigt, dass dermale Zellen die physiologischen, biochemischen und funktionellen Parameter rekapitulieren, die in vivo gemessen werden.

Das optimierte MMC-In-vitro-Protokoll wurde verwendet, um die Expression von Kollagen und anderen ECM-Proteinen durch dermale Fibroblasten zu bewerten, die aus hypertrophen Narbendermisen und unbeteiligten angrenzenden Dermis isoliert wurden. Bei der Kultiviertheit in MMC-Umgebungen in vitro wurde beobachtet, dass hHSFs bestimmte Eigenschaften (z. B. mRNA, Biochemie, Physiologie und Phänotyp) ähnlich wie dermale hypertrophe Narbengewebe in vivo exprimieren. Die Beweise deuten darauf hin, dass physikalische und chemische Eigenschaften wichtige Überlegungen bei der Auswahl von Crowdern und der Optimierung der MMC-Bedingungen für den Anbau in vitro sind.

Zum Proof-of-Prinzip wird hier das MMC-Protokoll angewendet, um die Fähigkeit von Shikonin und seinen Analoga, Apoptose zu induzieren, qualitativ und quantitativ zu bewerten. Dies ermöglicht die Bewertung der möglichen Anwendungen dieser natürlich abgeleiteten traditionellen chinesischen Medizin (TCM) Verbindungen für die Verwaltung dermal Narben13. Ungeachtet der Einfachheit, Kostenwirksamkeit und Aktualität dieses In-vitro-MMC-Protokolls erfüllt es auch die jüngsten Vorschriften zur Beseitigung von Säugetierexperimenten durch die EU-Richtlinie 2010/63/EU und die US-Umweltbehörde EPA.

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Protocol

1. Zellkultur

  1. Bewahren Sie hHSFs und normale dermale Fibroblasten aus nichtpathologischem Gewebe (hNSFs) in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) auf, das 10% fetales Kalbsserum (FCS) und 1% v/v Penicillin/Streptomycin-Lösung (P/S) bei 37°C in einem Inkubator mit 5%CO2/95%Luft enthält.
  2. Kaufen Sie Ficoll 70, Ficoll 400 und Ascorbinsäure von den entsprechenden Unternehmen.

2. Konstruktion des hypertrophen Narbenmodells MMC

  1. Säen Sie die hHSFs oder hNSFs (50.000/well) in eine 24 Wellplatte, die 1 ml Medien in jedem Brunnen enthält.
  2. In einem 37°C-Inkubator bei 5%CO2 platzieren und über Nacht verlassen.
  3. Bereiten Sie die MMC-Medien vor. Basierend auf dem für das Experiment erforderlichen Gesamtvolumen erzeugen Sie 10% FCS/DMEM-Medien durch Mischen von Ficoll 70 (18,75 mg/ml), Ficoll 400 (12,5 mg/ml) und Ascorbinsäure (100 m).
  4. Legen Sie das Gemisch 1 h in ein 37°C-Wasserbad, um die Crowder in die Lösung zu zerstreuen, und sterilisieren Sie dann die MMC-Medien mit einem 0,2 m-Filter.
  5. Aspirieren Sie die verbrauchten Medien und ersetzen Sie durch die frisch gemachten MMC-Medien.
  6. Inkubieren Sie die Zellen für 6 Tage bei 37°C und 5%CO2, und wechseln Sie alle 3 Tage die Medien.

3. Ausdruck der Gesamtmenge an Kollagen

  1. Bereiten Sie Sirius rote Lösung (0,1% w/v). 0,2 g Direct Red 80 Pulver in 200 ml destilliertem entionisiertem Wasser (ddH2O) mit 1 ml Essigsäure auflösen.
  2. Aspirieren Sie die MMC-Medien und fügen Sie 300 L Sirius Red Lösung in jedem Brunnen. Bei 37 °C 90 min inkubieren.
  3. Spülen Sie die Sirius Red-Lösung vorsichtig mit Leitungswasser ab und lassen Sie die Platte über Nacht lufttrocknen.
  4. Extrahieren Sie den Sirius Red Fleck, indem Sie jedem Brunnen 200 l Natriumhydroxid (0,1 M) hinzufügen. Legen Sie die Platte für 5–10 min auf einen Orbital-Shaker, um den Sirius Red-Fleck vollständig zu extrahieren.
  5. Übertragen Sie 100 l des extrahierten Sirius Red Flecks in eine gut transparente 96-Platte und messen Sie die Absorption bei 620 nm mit einem Mikroplattenleser.

4. Expression von Kollagen I (Immunostainierung)

  1. Waschen Sie die Brunnen mit 200 l Phosphat-gepufferter Saline (PBS, pH = 7,35).
  2. Fixieren Sie die Zellen mit Methanol (500 l/Well) bei 4 °C für 10 min.
  3. Blockieren Sie unspezifische Wechselwirkungen mit 3% Rinderserumalbumin für 30 min bei Raumtemperatur (RT).
  4. Aspirieren Sie die Blockierlösung und inkubieren Sie mit 200 l Anti-Kollagen-I-Antikörper (10 g/ml) für 90 min bei RT.
  5. Den primären Antikörper ansaugen und 3x mit PBS für jeweils 5 min waschen.
  6. Inkubieren Sie mit 200 l Ziegenanti-Rabbit-FITC-Sekundärantikörper (1:400 Verdünnung) und 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI; 1: 2000 Verdünnung) für 30 min bei RT. Bedecken Sie die Platte mit Aluminiumfolie.
  7. Entsorgen Sie sowohl den sekundären Antikörper als auch DAPI und waschen Sie 3x mit PBS für jeweils 5 min.
  8. Visualisieren Sie die Fluoreszenzfärbung direkt unter dem Mikroskop.

5. WestlicheS Blotting

  1. Waschen Sie die Zellen 2x mit PBS.
  2. Fügen Sie in jedem Brunnen 40 L Lysepuffer hinzu und kratzen Sie die Zellschicht mit einer Pipettenspitze. Der Lysepuffer enthält RIPA-Puffer, Protease-Inhibitor-Cocktail (PIC), 2 mM Natriumvanadate und 10 mM Natriumfluorid.
  3. Übertragen Sie das Proteinlysat in Mikrozentrifugenröhrchen und messen Sie die Proteinkonzentration anhand eines Protein-Assays gemäß den Anweisungen des Herstellers16.
  4. Laden Sie 10 g Protein jeder Gruppe in die Brunnen von 4%–12% Bis-Tris Proteingelen. Führen Sie Die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) bei 200 V 30 min durchführen.
  5. Übertragen Sie das Protein auf die Nitrocellulosemembran, indem Sie 90 min einen westlichen Blot bei 90 V laufen lassen. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen zwischen Gel und Nitrocellulosemembran.
  6. Blockieren Sie die Membran mit 10 ml Sperrpuffer.
  7. Mit primärer Antikörper n 4°C über Nacht inkubieren. Primäre Antikörper sind: Antikollagen I, Antikollagen III, Antikollagen IV, Anti-SMA, Anti-MMP-1, Anti-MMP-2, Anti-MMP-9, Anti-MMP-13 und Anti-Glyceraldehyd 3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH).
  8. Waschen Sie die Membran mit 0,1% TBS-Tween 20 (5x für je 5 min). TBS/Tween 20 (1 L) enthält folgendes: 50 ml von 1 M Tris (pH = 7,4), 30 ml 5 M Natriumchlorid, 1 ml Tween 20 und 920 ml ddH2O.
  9. Mit einer artgeeigneten Sekundärantikörper bei RT für 1 h inkubieren.
  10. Wiederholen Sie Schritt 5.8 und visualisieren Sie die Fluoreszenz mit einem Bildgebungssystem.

6. RT-PCR

  1. Sammeln Sie die gesamte RNA mit dem Lysepuffer gemischt mit 2-Mercaptoethanol, die im RNA-Extraktions-Assay-Kit enthalten sind.
  2. Reinigen Sie die RNA gemäß den Anweisungen des Herstellers17.
  3. Messen Sie die RNA-Konzentration mit einem Mikrovolumenspektrophotometer.
  4. Führen Sie die cDNA-Synthese des ersten Strangs mit einem cDNA-Synthesekit gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
  5. RT-PCR Oligonukleotid-Primer sind in kundenspezifischen 96 Wellplatten erhältlich (vorbeschichtet). Mischen Sie 100 ng der cDNA-Proben mit 10 l SYBR-Grün-Supermix in die kundenspezifische Platte.
  6. Erhöhen Sie das Gesamtvolumen mit ddH2O auf 20 l/well.
  7. Führen Sie RT-PCR mit einem Thermocycler nach den Anweisungen des Herstellers: 40 Zyklen Denaturierung bei 98°C für 15 s und Glühen/Verlängerung bei 60 °C für 60 s. Zu den in RT-PCR getesteten Genen gehören: COL1A1, COL3A1, ACTA2, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD7, IL1A, IL1B, IL6, IL8, MMP1, MMP2, MMP3, TGFB1 und VEGF.

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Representative Results

In jedem Experiment wurden dreifache Proben durchgeführt, und jedes Experiment wurde 3x mit Zellen von drei einzelnen Patienten wiederholt. Die Daten werden als Prozentsätze der Kontrollgruppe ausgedrückt. Einweg-ANOVA und Tukeys Post-hoc-Test wurden zur Analyse statistischer Unterschiede (*p n 0,05) angewendet.

MMC mit Ficoll bei 9% FVO (Fractional Volume Occupancy) erhöht die Gesamtmenge an Kollagen und Kollagen I Ablagerung in hHSF13. Wie in Abbildung 1Adargestellt, erhöhte sich die Zelldichte von hHSFs nach der Kultivierung mit Ficoll signifikant mit 9% und 18% FVO im Vergleich zu der Steuerung und MMC mit PVP. Abbildung 1B,C zeigt, dass Ficoll (bei 9% FVO) die Ablagerung von Kollagen (einschließlich Kollagen I) im Vergleich zu anderen MMC-Formulierungen signifikant verbessert hat. Die quantitative Analyse (Abbildung 1D,E) zeigte ferner, dass Ficoll (bei 9% FVO) die Ablagerung von Kollagen am effektivsten verbesserte.

hHSFs und hNSFs, die in MMC-Umgebungen angebaut werden, regulierten zusätzlich zu Kollagen13die Expression von ECM-Arten. Die in Abbildung 2 dargestellten Daten zeigen, dass bei der Kultivierung von hHSFs und hNSFs mit MMC auch die Expression von Kollagen IV signifikant zunahm. Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) spielen eine wichtige Rolle bei der Wundheilung und Narbenbildung, der Regulierung der ECM-Montage und der Umgestaltung18. MMPs tragen auch zur Zellproliferation, Zellmigration, Angiogenese und Apoptose19bei. Insbesondere wurde eine erhöhte Expression von MMPs gefunden, um in hypertrophen Narbengeweben im Vergleich zu nativenGeweben anzusammeln 20. Es wurde beobachtet, dass die Expression von MMP-2, -9 und -13 sowohl in hNSF- als auch in hHSF-Kulturen, die in MMC-Umgebungen angebaut werden, signifikant hochreguliert wurde.

Wir untersuchten auch die Synthese von Interleukin-6 (IL-6) und vaskulären endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF); diese waren jedoch in einem westlichen Fleck nicht nachweisbar. Im Gegensatz dazu ergab die RT-PCR-Analyse (Abbildung 3), dass die Expression von IL6 signifikant hochreguliert war, während die Expression von VEGF in hNSFs und hHSFs, die unter MMC-Bedingungen kultiviert wurden, herunterreguliert wurde. Eine erhöhte Expression von IL-6 hat gezeigt, dass sie zur hypertrophen Narbenbildung beiträgt21. Paradoxerweise wird auch berichtet, dass die Bildung von hypertrophen Narben mit einer erhöhten Expression von VEGF22verbunden ist. Die hier durchgeführte RT-PCR-Analyse zeigte, dass die Expression von VEGF in hNSFs und hHSFs, die unter MMC-Bedingungen angebaut wurden, stark abgeschwächt wurde.

Schließlich zeigten die Ergebnisse sowohl 1) erhöhte Synthesen von Kollagenen, Kollagen I, Kollagen IV, MMP-2, MMP-9 und MMP-13 de novo und 2) erhöhte Expression von IL6 mRNA in hHSFs und hNSFs. Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass die Kultivierung von primären hHSFs und hNSFs in Medienformulierungen, die MMC enthalten, zur Beibehaltung der charakteristischen Genexpression, Biochemie und Phänotypen führt, die in nativem hypertrophen Narbengewebe in vivo beobachtet wurden, was zu einem robusten "Scar-in-a-jar"-Modell führt.

Figure 1
Abbildung 1: MMC erhöht die Gesamtmenge an Kollagen und Kollagen I Ablagerung in hHSFs. (A) Zellmorphologie, (B) Kollageninsgesamt, mit Sirius Red, (C) Kollagen-I-Expression gefärbt, nachgewiesen durch Immunfluoreszenz, (D) quantitative Analyse des gesamten Kollagens und (E) quantitative Analyse der Kollagen-I-Ablagerung. hHSFs wurden in Medien kultiviert, die mit Ficoll (9% und 18% FVO), PVP40 (18% FVO) oder PVP360 (54% und 72% FVO) für 6 Tage ergänzt wurden. Repräsentative Bilder wurden ausgewählt. Die Bildquantifizierung wurde mit ImageJ durchgeführt und wird als durchschnittlicher Prozentsatz des Steuerelements ausgedrückt. Alle Experimente wurden dreimal mit Zellen wiederholt, die von drei nicht verwandten Spendern isoliert wurden. Die statistische Analyse wurde mit einseitiger ANOVA mit Tukeys Post-Test durchgeführt (*p < 0,05 vs. Kontrollgruppe, Fehlerbalken zeigen SEM an). Skalenbalken = (A) 0,5 mm, (B) 2 mm und (C) 0,5 mm. Diese Zahl wurde gegenüber einer früheren Studie13geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Auswirkungen von MMC auf die Zellproteinexpression. hHSFs und hNSFs wurden 6 Tage lang unter MMC-Bedingungen kultiviert. Ganze Zelllysate wurden mit RIPA-Puffer hergestellt, der Protease-Hemmer-Cocktail, Natriumvanadate und Natriumfluorid enthält. Die Proteinkonzentration wurde mit dem Proteintest gemessen. Repräsentative Bilder werden präsentiert. Für die quantitative Analyse wurden die Intensitäten einzelner Proteinbänder mit Densitometrie gemessen, in GAPDH normalisiert und mit DerImageJ-Software in einen Prozentsatz des hNSF im normalen Medium konvertiert. Alle Experimente wurden 3x mit Zellen von drei nicht verwandten Spendern durchgeführt. Die statistische Analyse wurde mit einseitiger ANOVA mit Tukeys Post-Test durchgeführt (*p < 0,05, Fehlerbalken zeigen SEM an). Diese Zahl wurde gegenüber einer früheren Studie13geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Auswirkungen von MMC auf die Zellgenexpression. hHSFs und hNSFs wurden 6 Tage lang unter MMC-Bedingungen angebaut. Total RNA wurde mit einem Assay-Kit geerntet, und der erste Strang cDNA wurde mit dem cDNA-Synthese-Kit synthetisiert. Die Zielgenexpression wurde in GAPDH normalisiert und in den Prozentsatz des hNSF im normalen Medium umgewandelt. Alle Experimente wurden dreimal mit Zellen von drei nicht verwandten Spendern wiederholt. Die statistische Analyse wurde mit einseitiger ANOVA mit Tukeys Post-Test durchgeführt (*p < 0,05, Fehlerbalken zeigen SEM an). Diese Zahl wurde gegenüber einer früheren Studie13geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Dieses Protokoll zielt darauf ab, ein verbessertes In-vitro-Modell von :scar-in-a-jar für menschliches Kutanennarbengewebe zu optimieren und zu authentifizieren. Frühere Studien haben die Anwendung der MMC-Technik auf menschliche Lungen-Fibroblasten12, menschliche Knochenmark mesenchymale Stammzellen23und menschliche dermale Fibroblasten23 mit Dextran12, Ficoll12und PVP23 als Crowder berichtet. In der hier berichteten Studie wurde das zuvor veröffentlichte Protokoll für hypertrophe Narben-abgeleitete menschliche Hautfibroblasten mit Ficoll oder PVP als Crowder optimiert.

Die Auswahl und Konzentration makromolekularer Crowder sind kritische Parameter, da sie keine gleichwertigen Ergebnisse liefern. Eine frühere Studie hat berichtet, dass PVP40 (18% FVO) und PVP360 (54% FVO) die Kollagenablagerung und Zellproliferation bei dermalen Fibroblasten23 signifikant verbessern (Wirkungen von PVP bei FVOs >54% sind ungetestet). Diese beiden Bedingungen funktionieren jedoch nicht konsistent für hHSFs, die dieses Protokoll verwenden.

Wie in Abbildung 1dargestellt, verbessert Ficoll die Ablagerung von Kollagen I im Vergleich zur Kontrolle signifikant, während PVP keine signifikanten Auswirkungen hat. Ficoll mit 9% FVO erhöht signifikant die Gesamtmenge an Kollagen und Kollagen Typ I im Vergleich zu Ficoll bei 18% FVO. Darüber hinaus ist es wichtig, Zellen eines niedrigen Durchgangs zu verwenden, da primäre dermale Fibroblasten eine begrenzte Lebensdauer in Kultur24haben. Es wurde gewählt, nur frisch isolierte hHSFs zu verwenden, um den in vivo Phänotyp beizubehalten. Nach längerer Kultivierung weisen primäre hHSFs eine ungewöhnliche Morphologie und atypische funktionelle Reaktionen auf. Es wird auch empfohlen, das MMC-Medium mit Ascorbinsäure, einem Schlüsselinduktor der Kollagensynthese in hHSF25,zu ergänzen. Darüber hinaus wird von anderen Forschern vorgeschlagen, dieselben Antikörper zu verwenden, die in der Tabelle der Materialien für hHSF-bezogene Studien aufgeführt sind; Antikörper müssen jedoch validiert werden, wenn dieses Protokoll auf andere Zelltypen angewendet wird.

Wie in den repräsentativen Ergebnissen berichtet, wurde die Einbeziehung von makromolekularen Crowdern gefunden, um die Expression von Kollagen (d. h. Kollagen I, Kollagen IV, MMPs und IL6) in hHSFs im Vergleich zu hHSFs zu stimulieren, die unter klassischen Nicht-MMC-Bedingungen kultiviert wurden. Es wird argumentiert, dass das optimierte MMC-Modell Aspekte des in vivo Phänotyps von hHSFs beibehält und ihre charakteristische Morphologie, Biochemie, Physiologie und reichlich extrazelluläre Matrix des kutanen Narbengewebes in vivo rekapituliert (im Gegensatz zu bestehenden 2-D-Kulturansätzen). Wir sind nicht in der Lage, ein ähnliches In-vitro-Modell zu identifizieren, das in der Lage ist, ähnliche "in vivo-ähnliche" Eigenschaften zu rekapitulieren. Im Vergleich zu bestehenden Tiermodellen ist dieses MMC-Protokoll schneller und benutzerfreundlicher, kostengünstiger und zeiteffizienter. Cuttle et al. etablierten ein hypertrophes Narbenmodell des Schweins mit thermischen Verletzungen, das ähnliche Eigenschaften wie menschliche hypertrophe Narben zu haben scheint26. Zusätzlich zu den Kosten und der Zeit, die für die Erhaltung der Tiere erforderlich sind, benötigt das Experiment jedoch mehr als 3 Monate, um26abzuschließen. Dieses optimierte MMC-Modell benötigt ca. 1 Woche Vorbereitung, bevor es einsatzbereit ist.

Das Protokoll bietet ein fortschrittliches In-vitro-Modell für die Untersuchung neuartiger Anti-Scarring-Therapien. Das MMC-Modell wurde verwendet, um Shikonin zu bewerten, ein Molekül, das zuvor berichtet wurde, um die De-Novo-Bildung von Narben zu hemmen, zur Sanierung von reifen hypertrophen Narben27,28. Eine ähnliche Bewertung neuartiger Verbindungen und Interventionen mit klassischen Ansätzen zur Entdeckung von Arzneimitteln und zum Proof-of-Concept würde beträchtliche Ressourcen, Mittel und Zeit erfordern. Diese Studie erforderte minimale Finanzmittel und kann innerhalb von mehreren Monaten abgeschlossen werden. Das Protokoll ist flexibel und leicht anpassungsfähig für Anwendungen bei der Entwicklung und Bewertung neuartiger hypertropher Narbenbehandlungen vor Tierstudien.

Darüber hinaus kann dieses Protokoll weiter modifiziert werden, um mehr "in vivo-ähnliche" Eigenschaften zu entwickeln. Zum Beispiel ist das Vorhandensein von überreichlichen TGF-Nr. 1 ein konsistenter Befund in hypertrophen Narbengeweben, die Narbenbildung durch Stimulierung der Kollagensynthese und Ablagerung28vermitteln. TGF-Nr. 1 könnte leicht in das MMC-Protokoll integriert werden und die Rekapitulation der In-vivo-Pathologie weiter verbessern. Wir haben noch nicht das volle Potenzial des Modells untersucht, das für andere Kollagen- und ECM-bezogene Pathologien (z.B. Sklerodermie, Lungenfibrose, Endomyokardialfibrose usw.) nützlich sein kann. Darüber hinaus wäre es interessant, die Auswirkungen von MMC auf Zellen über einen längeren Kulturzeitraum zu beobachten, wie z. B. 2 oder 3 Wochen. Es lohnt sich auch, die Auswirkungen von MMC auf die hierarchische Zell- und ECM-Architektur und -Ausrichtung, insbesondere die Ausrichtung von Kollagen, weiter zu bewerten, da diese Charakterisierungen für die In-vivo-Narbengewebebildung unerlässlich sind.

Eine der Haupteinschränkungen dieses Protokolls ist die Einschränkung von Zelltypen. Hypertrophe Narbenbildung beinhaltet die Beteiligung verschiedener Zellpopulationen, und die Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen spielen eine wesentliche Rolle bei der Narbenbildung. Zum Beispiel spielen Keratinozyten auch eine wichtige Rolle bei der Hautwundheilung und Narbenbildung29. Die Einbeziehung zusätzlicher Zellpopulationen in dieses Modell wird seine Bedeutung in der zukünftigen Forschung erheblich verbessern.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der Singapurer Agentur für Wissenschaft, Technologie und Forschung "SPF 2013/004: Skin Biology Basic Research" und der "Wound Care Innovation for the Tropics" IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009 unterstützt. Die Autoren danken Ihnen bei Dr. Paula Benny und Dr. Michael Raghunath.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 μm filter Sartorius 16534
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific P36962
Alexa Fluor 680 Thermo Fisher Scientific A-21076
Alexa Fluor 800 Thermo Fisher Scientific A-11371
alpha smooth muscle actin (αSMA) primary antibody Abcam ab5694
Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler ) Thermo Fisher Scientific 4351106
Ascorbic acid Wako #013-12061
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich #A2153
Bradford protein assay Bio-Rad 500-0006
Collagen I primary antibody (for immunostaining) Abcam 6308
Collagen I primary antibody (for western blot) Abcam ab21286
Collagen III primary antibody Abcam ab7778
Collagen IV primary antibody Abcam ab6586
Direct Red 80 Sigma-Aldrich 2610108
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Life Technologies 11996-065
Fetal calf serum (FCS) Life Technologies 6000-044
Ficoll 400 GE HealthCare #17-0300-10
Ficoll 70 GE HealthCare #17-0310-10
GAPDH primary antibody Sigma-Aldrich G8795
Goat Anti-Rabbit secondary antibody Abcam ab97050
Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF) Cell Research Corporation 106, 107, 108
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad #1708890
MMP-1 primary antibody Abcam ab38929
MMP-13 primary antibody Abcam ab39012
MMP-2 primary antibody Abcam ab37150
MMP-9 primary antibody Abcam ab38898
NanoDrop Microvolume Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific N/A
Nitrocellulose membrane Bio-Rad 10484060
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Thermo Fisher Scientific NP0321BOX
Odyssey blocking buffer LI-COR Biosciences 927–40000
Odyssey Fc Imaging System LI-COR Biosciences N/A
Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining) Olympus N/A
Penicillin/streptomycin solution (P/S) Life Technologies 15140-122
PrimePCR Assays Bio-Rad Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement
Protease inhibitor cocktail (PIC) Sigma-Aldrich 11697498001
PVP 360 Sigma #PVP360
PVP 40 Sigma #PVP40
RIPA buffer Merck R0278
RNeasy Plus Mini Kit QIAGEN #74134
Sodium vanadate Sigma-Aldrich 450022
Sodium vanadate Sigma-Aldrich 450243
SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader Molecular Devices N/A
SsoAdvanced universal SYBR green supermix Bio-Rad #172-5270
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416

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References

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Bioengineering Ausgabe 159 hypertrophe Narbe Fibroblasten makromolekulare Überfüllung Kollagen extrazelluläre Matrix Dichtegradientenmedium Polyvinylpyrrolidon
In Vitro Modell der menschlichen kutanen hypertrophen Narbenbildung mit makromolekularer Crowding
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Fan, C., Lim, L. K. P., Wu, Z.,… More

Fan, C., Lim, L. K. P., Wu, Z., Sharma, B., Gan, S. Q., Liang, K., Upton, Z., Leavesley, D. In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding. J. Vis. Exp. (159), e61037, doi:10.3791/61037 (2020).

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