Summary
Este protocolo describe el uso de aglomeración macromolecular para crear un modelo de tejido cicatricial humano in vitro que se asemeja a condiciones in vivo. Cuando se cultivan en un ambiente macromolecular lleno de gente, los fibroblastos de la piel humana exhiben fenotipos, bioquímica, fisiología y características funcionales que se asemejan al tejido cicatricial.
Abstract
Se ha demostrado que los tejidos in vivo están muy llenos de proteínas, ácidos nucleicos, ribonucleoproteínas, polisacáridos, etc. El siguiente protocolo aplica una técnica de aglomeración macromolecular (MMC) para imitar este hacinamiento fisiológico mediante la adición de polímeros neutros (crowders) a cultivos celulares in vitro. Estudios previos con Ficoll o dextran como crowders demuestran que la expresión de colágeno I y fibronectina en las líneas celulares WI38 y WS-1 se mejoran significativamente mediante la técnica MMC. Sin embargo, esta técnica no ha sido validada en fibroblastos primarios de piel humana derivados de cicatrices hipertróficas (hHSF). A medida que la cicatrización hipertrófica surge de la excesiva deposición de colágeno, este protocolo tiene como objetivo construir un modelo de cicatriz hipertrófica in vitro rico en colágeno mediante la aplicación de la técnica MMC con hHSFs. Se ha demostrado que este modelo MMC optimizado posee más similitudes con el tejido cicatricial in vivo en comparación con los sistemas tradicionales de cultivo celular de 2 dimensiones (2-D). Además, es rentable, eficiente en el tiempo y éticamente deseable en comparación con los modelos animales. Por lo tanto, el modelo optimizado reportado aquí ofrece un modelo avanzado "in vivo-como" para estudios hipertróficos relacionados con la cicatriz.
Introduction
El tejido cicatricial representa la variable de reparación del tejido. Sin embargo, en muchos individuos, especialmente aquellos que sufren de quemaduras o trauma1, las cicatrices pueden ser excesivas e imponer efectos indeseables en la morfología y el funcionamiento de la piel curada. Aunque no se entienden completamente los mecanismos exactos de la formación patológica (cicatrices hipertróficas y queloides), la deposición excesiva de colágeno durante la cicatrización de heridas ha demostrado ser una contribución esencial2.
Está bien establecido que la transformación del factor de crecimiento beta 1 (TGF--1) y la actina muscular alfa suave (SMA) desempeñan un papel clave en la formación de cicatrices hipertróficas. La evidencia sugiere que el TGF-1 elevado estimula directamente la deposición excesiva de colágeno a través de la regulación de la vía de señalización SMAD3. Además, se ha encontrado que la ASMA contribuye a la formación de cicatrices hipertróficas mediante la regulación de la contracción celular y la reepitelización en el proceso de cicatrización de heridas4. La falta de modelos in vitro e in vivo adecuados es un impedimento importante para desarrollar y evaluar intervenciones y terapias para la remediación de cicatrices. El objetivo de este estudio es utilizar la técnica MMC existente para construir un modelo de cicatrices hipertróficas "in vivo-like" que sea adecuado para evaluar intervenciones novedosas y emergentes relacionadas con las cicatrices.
Reproducir tejido vivo fuera del cuerpo ha sido un objetivo durante años en la comunidad científica. El desarrollo de técnicas in vitro a principios del siglo XX logró en parte este objetivo. Las técnicas in vitro actuales han evolucionado ligeramente a partir de la demostración original de Roux de que las células embrionarias pueden sobrevivir ex vivo durante varios días en la salina caliente5. Sin embargo, las metodologías in vitro se limitan principalmente a los tipos de células simples cultivadas en 2-D y no recapitulan con precisión los tejidos in vivo. Si bien son útiles para examinar la bioquímica celular, la fisiología y la genética, los tejidos nativos son tridimensionales e incorporan múltiples tipos de células. Los sistemas in vitro 2D simples someten las células de mamíferos a entornos altamente artificiales en los que se pierde la arquitectura específica del tejido nativo6. A su vez, esto afecta a los eventos intracelulares y extracelulares, lo que resulta en morfología celular anormal, fisiología y comportamiento7.
El interés de este protocolo radica en el desarrollo y manejo clínico de cicatrices y queloides hipertróficos. Si bien está bien establecido que los fibroblastos dérmicos son en gran parte responsables de la abundante producción de colágenos presentes en el tejido cicatricial, el cultivo de fibroblastos dérmicos utilizando sistemas in vitro 2-D no reproduce la rotación de colágeno observada in vivo8. Los métodos in vitro contemporáneos todavía utilizan esencialmente "salina caliente", un ambiente completamente diferente al de los tejidos vivos. Los tejidos in vivo están extremadamente concurridos, con proteínas, ácidos nucleicos, ribonucleoproteínas y polisacáridos, ocupando entre el 5% y el 40% del volumen total. Como no hay dos moléculas pueden ocupar el mismo espacio al mismo tiempo, hay poco espacio libre disponible y una ausencia casi completa de agua libre9.
La técnica MMC impone restricciones que afectan a las propiedades termodinámicas del citosol y los fluidos intersticiales. Las interacciones moleculares, los complejos de señalización receptor-ligand, las enzimas y los orgánulos están confinados y restringidos a interactuar libremente9. Las interacciones dentro del entorno pericelular (es decir, intersticio) también están limitadas. La evidencia reciente confirma que las altas concentraciones de macromoléculas inertes en soluciones abarrotadas perturban la difusión, asociación física, viscosidad y propiedades hidrodinámicas10.
Curiosamente, varios agentes de aglomeración populares (es decir, Ficoll, dextran, polivinilpirrolidona [PVP] y sodio 4-estirenosulfonato [PSS]) no son equivalentes cuando se aplican a diferentes tipos de células y en diferentes configuraciones. En un estudio anterior, Se informó que Ficoll era menos citotóxico para las células madre mesenquimales en comparación con la PVP. Estos resultados fueron interpretados como la consecuencia de su carga neutra y el radio hidrodinámico relativamente pequeño11. Por el contrario, un segundo estudio encontró que el deextran es más eficaz en la estimulación de la deposición de colágeno I por fibroblastos pulmonares humanos en comparación con Ficoll12. Los datos de nuestro propio estudio sugieren que Ficoll mejora la deposición de colágeno por fibroblastos derivados de cicatrices hipertróficas, mientras que la PVP es tóxica para estas células13.
Se ha demostrado que la conversión de procolágeno a colágeno es más rápida en un ambiente in vivo altamente concurrido14,mientras que la tasa de reacciones biológicas se retrasa en un sistema de cultivo 2D diluido15. Hemos optimizado el protocolo in vitro aquí, incorporando MMC para mostrar el cultivo de fibroblastos dérmicos sirviendo como un modelo más "in vivo-como" para fibrosis dérmica y formación de cicatrices. En contraste con el sistema de cultivo 2D común, el cultivo de hHSFcon MMC estimula significativamente la biosíntesis y la deposición de colágeno13. En particular, otras características de la fibrosis (es decir, el aumento de la expresión de la matriz de metaloproteinasas [MMP] y citoquinas proinflamatorias) también son evidentes bajo este protocolo MMC optimizado13. Cuando se cultiva utilizando este método, se muestra que las células dérmicas recapitulan los parámetros fisiológicos, bioquímicos y funcionales medidos in vivo.
El protocolo MMC in vitro optimizado se ha utilizado para evaluar la expresión de colágeno y otras proteínas ECM por fibroblastos dérmicos aislados de la dermis de cicatrices hipertróficas y la dermis adyacente no implicada. Cuando se cultiva en entornos MMC in vitro, se ha observado que los hHSF expresan ciertas características (es decir, ARNm, bioquímica, fisiología y fenotipo) similares al tejido cicatricial hipertrófico dérmico in vivo. La evidencia indica que las propiedades físicas y químicas son consideraciones importantes a la hora de seleccionar crowders y optimizar las condiciones MMC para el cultivo in vitro.
Para la prueba de principio, el protocolo MMC se aplica aquí para evaluar cualitativa y cuantitativamente la capacidad de Shikonin y sus análogos para inducir la apoptosis. Esto permite evaluar las posibles aplicaciones de estos compuestos de medicina tradicional china (TCM) de origen natural para la gestión de cicatrices dérmicas13. No obstante, la simplicidad, la rentabilidad y la puntualidad de este protocolo MMC in vitro también satisfacen las regulaciones recientes para eliminar la experimentación en mamíferos por la Directiva 2010/63/UE y la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (EPA) de la UE.
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Protocol
1. Cultivo celular
- Mantener los hHSF y los fibroblastos dérmicos normales derivados del tejido no patológico (hNSF) en el medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco que contiene un 10% de suero fetal (FCS) y una solución de 1% v/v de penicilina/estreptomicina (P/S) a 37oC en una incubadora con un 5% de CO 2/95% de aire.2
- Compra Ficoll 70, Ficoll 400 y ácido ascórbico de las empresas apropiadas.
2. Construcción del modelo de cicatrices hipertróficas MMC
- Sembrar los hHSF o hNSF (50.000/pozo) en una placa de 24 pocillos que contiene 1 ml de medios en cada pocal.
- Colocar en una incubadora de 37oC a 5% de CO2 y dejar durante la noche.
- Prepare los medios MMC. Sobre la base del volumen total requerido para el experimento, producir un 10% de medios FCS/DMEM mezclando Ficoll 70 (18,75 mg/ml), Ficoll 400 (12,5 mg/ml) y ácido ascórbico (100 oM).
- Coloque la mezcla en un baño de agua de 37oC durante 1 h para dispersar los habachos en la solución y, a continuación, esterilizar el soporte MMC con un filtro de 0,2 m.
- Aspirar los medios gastados y reemplazarcon el medio MMC recién hecho.
- Incubar las células durante 6 días a 37oC y 5% deCO2,cambiando el medio cada 3 días.
3. Expresión de la cantidad total de colágeno
- Preparar la solución roja Sirius (0,1% p/v). Disolver 0,2 g de polvo rojo directo 80 en 200 ml de agua destilada desionizada (ddH2O) con 1 ml de ácido acético.
- Aspirar los medios MMC y añadir 300 solución De Sirio Rojo en cada pozo. Incubar a 37oC durante 90 min.
- Enjuague suavemente la solución Sirius Red con agua del grifo y deje que la placa se seque al aire durante la noche.
- Extraiga la mancha roja de Sirio añadiendo 200 ml de hidróxido de sodio (0,1 M) en cada poca. Coloque la placa en un agitador orbital durante 5-10 minutos para extraer completamente la mancha roja de Sirio.
- Transfiera 100 l de la mancha Roja Sirius extraída en una placa transparente de 96 pocillos y mida la absorbancia a 620 nm utilizando un lector de microplacas.
4. Expresión de colágeno I (inmunomancha)
- Lavar los pozos con 200 ml de solución salina con fosfato (PBS, pH a 7,35).
- Fijar las células usando metanol (500 l/pozo) a 4 oC durante 10 min.
- Bloquear interacciones inespecíficas con 3% de albúmina sérica bovina durante 30 min a temperatura ambiente (RT).
- Aspirar la solución de bloqueo e incubar con 200 l de anticuerpo anti-colágeno I (10 g/ml) durante 90 min a RT.
- Aspirar el anticuerpo primario y lavar 3 veces con PBS durante 5 min cada uno.
- Incubar con 200 ol de anticuerpo secundario anticonejo-FITC de cabra (1:400 dilución) y 4 ',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI; 1: 2000 dilución) durante 30 min en RT. Cubra la placa con papel de aluminio.’
- Deseche el anticuerpo secundario y el DAPI y lave 3 veces con PBS durante 5 min cada uno.
- Visualice la mancha de fluorescencia directamente bajo un microscopio.
5. Hincha occidental
- Lave las células 2veces con PBS.
- Añadir 40 l de tampón de lisis en cada pocal y raspar la capa celular con una punta de pipeta. El tampón de lisis contiene tampón de PIRA, cóctel inhibidor de proteasa (PIC), vanadate sódico de 2 mM y fluoruro de sodio de 10 mM.
- Transfiera el lisado proteico a tubos de microcentrífuga y mida la concentración de proteínas utilizando un ensayo proteico según las instrucciones del fabricante16.
- Carga 10 g de proteína de cada grupo en los pozos de 4%-12% geles de proteína Bis-Tris. Realizar electroforesis de gel de poliacrilamida de dodecilo sulfato de sodio (SDS-PAGE) a 200 V durante 30 min.
- Transfiera la proteína a la membrana de nitrocelulosa ejecutando una mancha occidental a 90 V durante 90 min. Evitar la formación de burbujas de aire entre el gel y la membrana de nitrocelulosa.
- Bloquee la membrana con 10 ml de tampón de bloqueo.
- Incubar con anticuerpos primarios a 4oC durante la noche. Los anticuerpos primarios son: anticolágeno I, anticolágeno III, anti-colágeno IV, anti-SMA, anti-MMP-1, anti-MMP-2, anti-MMP-9, anti-MMP-13, y anti-gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH).
- Lavar la membrana con 0,1% TBS-Tween 20 (5x para 5 min cada uno). TBS/Tween 20 (1 L) contiene lo siguiente: 50 mL de 1 M Tris (pH a 7,4), 30 ml de cloruro sódico de 5 M, 1 ml de Tween 20 y 920 ml de ddH2O.
- Incubar con un anticuerpo secundario apropiado para RT durante 1 h.
- Repita el paso 5.8 y visualice la fluorescencia utilizando un sistema de imágenes.
6. RT-PCR
- Recoger el ARN total utilizando el tampón de lisis mezclado con 2-mercaptoetanol incluido en el kit de ensayo de extracción de ARN.
- Purificar el ARN según las instrucciones del fabricante17.
- Mida la concentración de ARN utilizando un espectrofotómetro de microvolúmenes.
- Realizar la síntesis de ADNc de primera hebra utilizando un kit de síntesis de ADNc según las instrucciones del fabricante.
- Las imprimaciones de oligonucleótidos RT-PCR se proporcionan (precoatadas) en placas de pozo sin formato de 96 personalizadas. Mezclar 100 ng de las muestras de ADNc con 10 l de supermezcla verde SYBR en la placa personalizada.
- Aumente el volumen total a 20 l/bien utilizando ddH2O.
- Ejecutar RT-PCR utilizando un ciclor térmico siguiendo las instrucciones del fabricante: 40 ciclos de desnaturalización a 98 oC para 15 s y recocido/extensión a 60oC para 60 s. Los genes probados en RT-PCR incluyen: COL1A1, COL3A1, ACTA2, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD7, IL1A, IL1B, IL6, IL8, MMP1, MMP2, MMP3 , TGFB1 y VEGF.
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Representative Results
En cada experimento se realizaron muestras de triplicado, y cada experimento se repitió 3 veces utilizando células de tres pacientes individuales. Los datos se expresan como porcentajes del grupo de control. Se aplicaron la prueba post-hoc de ANOVA unidireccional y Tukey para analizar las diferencias estadísticas (*p . 0,05).
MMC utilizando Ficoll al 9% FVO (ocupación de volumen fraccionario) mejora la cantidad total de colágeno y colágeno I deposición en hHSF13. Como se ilustra en la Figura 1A,la densidad celular de los hHSF aumentó significativamente después de cultivar con Ficoll al 9% y 18% de FVO en comparación con el control y MMC usando PVP. La Figura 1B,C indica que Ficoll (con 9% de FVO) mejoró significativamente la deposición de colágeno (incluido el colágeno I) en comparación con otras formulaciones de MMC. El análisis cuantitativo(Figura 1D,E)demostró además que Ficoll (con 9% de FVO) mejoró más eficazmente la deposición de colágeno.
se encontró que los hHSF y los hNSF cultivados en entornos MMC regulaban la expresión de especies de ECM además del colágeno13. Los datos reportados en la Figura 2 indican que cuando los hHSF y los hNSF se cultivaron con MMC, la expresión de colágeno IV también aumentó significativamente. Las metaloproteinasas matriciales (MMP) desempeñan un papel importante durante la cicatrización de heridas y la formación de cicatrices, la regulación del ensamblaje de ECM y la remodelación18. Los MMP también contribuyen a la proliferación celular, migración celular, angiogénesis y apoptosis19. En particular, se encontró una expresión elevada de MMP para acumular se acumula en los tejidos cicatriciales hipertróficos en comparación con los tejidos nativos20. Se observó que la expresión de MMP-2, -9 y -13 fueron significativamente reguladas en los cultivos hNSF y hHSF cultivados en entornos MMC.
También sondeamos para la síntesis de interleucina-6 (IL-6) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); sin embargo, estos eran indetectables en una mancha occidental. En cambio, el análisis RT-PCR(Figura 3) reveló que la expresión de IL6 estaba significativamente regulada, mientras que la expresión de VEGF estaba regulada en hNSF y hHSF s cultivadas en condiciones MMC. Se ha demostrado que un aumento de la expresión de IL-6 contribuye a la formación de cicatrices hipertróficas21. Paradójicamente, también se informa que la formación de cicatrices hipertróficas se asocia con una expresión elevada de VEGF22. El análisis RT-PCR realizado aquí indicó que la expresión de VEGF se atenuó en gran medida en hNSF y hHSFs cultivados en condiciones MMC.
Finalmente, los resultados demostraron tanto 1) aumento de las síntesis de colágenos, colágeno I, colágeno IV, MMP-2, MMP-9, y MMP-13 de novo y 2) aumento de la expresión de MRNA IL6 en hHSFs y hNSFs. En conjunto, estos datos indican que el cultivo de hHSF primarios y hNSF en formulaciones de medios que incluyen resultados de MMC en la retención de la expresión génica característica, bioquímica y fenotipos observados en el tejido cicatricial hipertrófico nativo in vivo, lo que conduce a un modelo robusto "scar-in-a-jar".
Figura 1: MMC mejora la cantidad total de colágeno y la deposición de colágeno I en hHSFs. (A) Morfología celular, (B) colágenos totales, manchados con Sirius Red, (C) expresión de colágeno I, demostrado por inmunofluorescencia, (D) análisis cuantitativo del colágeno total, y (E) análisis cuantitativo de la deposición de colágeno I. los hHSF se cultivaron en medios complementados con Ficoll (9% y 18% FVO), PVP40 (18% FVO), o PVP360 (54% y 72% FVO), durante 6 días. Se seleccionaron imágenes representativas. La cuantificación de imágenes se realizó utilizando ImageJ y se expresa como el porcentaje medio del control. Todos los experimentos se repitieron 3 veces utilizando células aisladas de tres donantes no relacionados. El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA unidireccional con la prueba posterior de Tukey (*p < 0.05 frente al grupo de control, las barras de error indican SEM). Barras de escala: (A) 0,5 mm, (B) 2 mm y (C) 0,5 mm. Esta cifra ha sido modificada de un estudio anterior13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Efectos de la MMC en la expresión de proteína celular. hHSFs y hNSFs fueron cultivados bajo condiciones MMC durante 6 días. Se prepararon lisatos de células enteras con tampón de RIPA que contiene cóctel inhibidor de proteasa, vanato de sodio y fluoruro de sodio. La concentración de proteínas se midió utilizando el ensayo de proteínas. Se presentan imágenes representativas. Para el análisis cuantitativo, las intensidades de las bandas proteicas individuales se midieron con densitometría, se normalizaron a GAPDH y se convirtieron en porcentaje del hNSF en medio normal utilizando el software ImageJ. Todos los experimentos se realizaron 3 veces utilizando células de tres donantes no relacionados. El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA unidireccional con la prueba posterior de Tukey (*p < 0.05, las barras de error indican SEM). Esta cifra ha sido modificada de un estudio anterior13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Efectos de la MMC en la expresión génica celular. hHSFs y hNSFs se cultivaron en condiciones MMC durante 6 días. El ARN total fue cosechado usando un kit de ensayo, y el ADNC de la primera hebra fue sintetizado usando el kit de síntesis de ADNc. La expresión génica objetivo se normalizó a GAPDH y se convirtió al porcentaje del hNSF en un medio normal. Todos los experimentos se repitieron 3 veces utilizando células de tres donantes no relacionados. El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA unidireccional con la prueba posterior de Tukey (*p < 0.05, las barras de error indican SEM). Esta cifra ha sido modificada de un estudio anterior13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo tiene como objetivo optimizar y autenticar un modelo in vitro mejorado :scar-in-a-jar" para el tejido cicatricial cutáneo humano. Estudios anteriores han informado de la aplicación de la técnica MMC a los fibroblastos pulmonares humanos12, células madre mesenquimales de médula ósea humana23,y fibroblastos dérmicos humanos23 utilizando dextran12,Ficoll12y PVP23 como crowders. En el estudio reportado aquí, el protocolo previamente publicado para los fibroblastos de piel humana derivados de cicatrices hipertróficas fue optimizado con Ficoll o PVP como multitudes.
La selección y concentración de crowders macromoleculares son parámetros críticos, ya que no producen resultados equivalentes. Un estudio anterior ha informado de que PVP40 (18% FVO) y PVP360 (54% FVO) mejoran significativamente la deposición de colágeno y la proliferación celular en fibroblastos dérmicos23 (los efectos de PVP en los FVO >54% no se han probado). Sin embargo, estas dos condiciones no funcionan consistentemente para los hHSF que utilizan este protocolo.
Como se muestra en la Figura 1, Ficoll mejora significativamente la deposición de colágeno I en comparación con el control, mientras que PVP no tiene efectos significativos. Ficoll en 9% FVO aumenta significativamente la cantidad total de colágeno y colágeno tipo I en comparación con Ficoll en 18% FVO. Además, es fundamental utilizar células de un pasaje bajo, ya que los fibroblastos dérmicos primarios tienen una vida útil limitada en el cultivo24. Fue elegido para utilizar sólo hHSFs recién aislados para retener el fenotipo in vivo. Después de un cultivo prolongado, los hHSF primarios exhiben morfología inusual y respuestas funcionales atípicas. También se recomienda que el medio MMC se complemente con ácido ascórbico, un inductor clave de la síntesis de colágeno en hHSF25. Además, otros investigadores sugieren utilizar los mismos anticuerpos enumerados en la Tabla de Materiales para estudios relacionados con el HHSF; sin embargo, los anticuerpos deben ser validados si se aplica este protocolo a otros tipos de células.
Como se informó en los resultados representativos, se encontró que la inclusión de crowders macromoleculares estimulaba la expresión de colágeno (es decir, colágeno I, colágeno IV, MMP e IL6) en hHSF en comparación con los hHSF que se cultivaban utilizando condiciones clásicas no MMC. Se argumenta que el modelo MMC optimizado conserva aspectos del fenotipo in vivo de los hHSF, recapitulando su morfología característica, bioquímica, fisiología y abundante matriz extracelular de tejido cicatricial cutáneo in vivo (en contraste con los enfoques de cultivo 2D existentes). No podemos identificar ningún modelo in vitro similar que sea capaz de recapitular propiedades similares "in vivo-like". En comparación con los modelos animales existentes, este protocolo MMC es más rápido, así como más fácil de usar, rentable y eficiente en el tiempo. Cuttle et al. establecieron un modelo de cicatriz hipertrófica porcina utilizando lesión térmica, que parece tener características similares a la de las cicatrices hipertróficas humanas26. Sin embargo, además de los costos y el tiempo necesario para mantener los animales, el experimento requiere más de 3 meses para completar26. Este modelo MMC optimizado requiere aproximadamente 1 semana de preparación antes de listo para su uso.
El protocolo ofrece un modelo avanzado in vitro para el examen de nuevas terapias anticicatrices. El modelo MMC se ha utilizado para evaluar Shikonin, una molécula previamente reportada para inhibir la formación de novo de cicatrices, para la remediación de cicatrices hipertróficas maduras27,28. Una evaluación similar de nuevos compuestos e intervenciones utilizando enfoques clásicos para el descubrimiento y la prueba de concepto de fármacos requeriría considerables recursos, fondos y tiempo. Este estudio requirió finanzas mínimas y se puede completar dentro de varios meses. El protocolo es flexible y fácilmente adaptable para aplicaciones en el desarrollo y evaluación de nuevos tratamientos de cicatrices hipertróficas antes de estudios en animales.
Además, este protocolo se puede modificar aún más para desarrollar propiedades más "in vivo-like". Por ejemplo, la presencia de exceso de TGF-1 es un hallazgo consistente en los tejidos cicatriciales hipertróficos, mediando la formación de cicatrices estimulando la síntesis de colágeno y la deposición28. El TGF-1 podría incorporarse fácilmente al protocolo MMC y mejorar aún más la recapitulación de la patología in vivo. Todavía no hemos explorado todo el potencial del modelo, lo que puede ser útil para otras patologías relacionadas con colágeno y ECM (es decir, esclerodermia, fibrosis pulmonar, fibrosis endomiocárdica, etc.). Además, sería interesante observar los efectos de la MMC en las células durante un período de cultivo más largo, como 2 o 3 semanas. También vale la pena evaluar aún más los efectos de la MMC en la arquitectura jerárquica celular y ECM y la alineación, particularmente la orientación del colágeno, ya que estas caracterizaciones son esenciales para la formación in vivo de tejido scar.
Una de las principales limitaciones de este protocolo es la restricción de los tipos de celda. La formación de cicatrices hipertróficas implica la participación de varias poblaciones celulares, y las interacciones entre diferentes tipos de células juegaun un papel esencial en la formación de cicatrices. Por ejemplo, los queratinocitos también desempeñan un papel importante en la cicatrización de heridas cutáneas y la formación de cicatrices29. La incorporación de poblaciones celulares adicionales en este modelo mejorará en gran medida su importancia en futuras investigaciones.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la financiación de la Agencia de Ciencia, Tecnología e Investigación de Singapur "SPF 2013/004: Investigación Básica de La Biología de la Piel" y la "Innovación para el Cuidado de la Herida para los Trópicos" IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009. Los autores agradecen el asesoramiento y la asistencia de la Dra. Paula Benny y la Dra. Michael Raghunath.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Sartorius | 16534 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | P36962 | |
| Alexa Fluor 680 | Thermo Fisher Scientific | A-21076 | |
| Alexa Fluor 800 | Thermo Fisher Scientific | A-11371 | |
| alpha smooth muscle actin (αSMA) primary antibody | Abcam | ab5694 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler ) | Thermo Fisher Scientific | 4351106 | |
| Ascorbic acid | Wako | #013-12061 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | #A2153 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Collagen I primary antibody (for immunostaining) | Abcam | 6308 | |
| Collagen I primary antibody (for western blot) | Abcam | ab21286 | |
| Collagen III primary antibody | Abcam | ab7778 | |
| Collagen IV primary antibody | Abcam | ab6586 | |
| Direct Red 80 | Sigma-Aldrich | 2610108 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11996-065 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 6000-044 | |
| Ficoll 400 | GE HealthCare | #17-0300-10 | |
| Ficoll 70 | GE HealthCare | #17-0310-10 | |
| GAPDH primary antibody | Sigma-Aldrich | G8795 | |
| Goat Anti-Rabbit secondary antibody | Abcam | ab97050 | |
| Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF) | Cell Research Corporation | 106, 107, 108 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | #1708890 | |
| MMP-1 primary antibody | Abcam | ab38929 | |
| MMP-13 primary antibody | Abcam | ab39012 | |
| MMP-2 primary antibody | Abcam | ab37150 | |
| MMP-9 primary antibody | Abcam | ab38898 | |
| NanoDrop Microvolume Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 10484060 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| Odyssey blocking buffer | LI-COR Biosciences | 927–40000 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A | |
| Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining) | Olympus | N/A | |
| Penicillin/streptomycin solution (P/S) | Life Technologies | 15140-122 | |
| PrimePCR Assays | Bio-Rad | Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| PVP 360 | Sigma | #PVP360 | |
| PVP 40 | Sigma | #PVP40 | |
| RIPA buffer | Merck | R0278 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | #74134 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450022 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader | Molecular Devices | N/A | |
| SsoAdvanced universal SYBR green supermix | Bio-Rad | #172-5270 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- vander Veer, W. M., et al. Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation. Burns. 35 (1), 15-29 (2009).
- Linge, C., et al. Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase. Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).
- Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review. International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).
- Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression. Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).
- Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. P. Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26373 (2015).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study. Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).
- Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
- Chen, C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 277-290 (2011).
- Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., Van Vliet, K. J. Macromolecular Crowding Directs Extracellular Matrix Organization and Mesenchymal Stem Cell Behavior. PloS one. 7 (5), 37904 (2012).
- Chen, C. Z., et al. The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).
- Fan, C., et al. Application of "macromolecular crowding" in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars. Chemico-Biological Interactions. 310, 108747 (2019).
- Canty, E. G., Kadler, K. E. Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis. Journal of Cell Science. 118, Pt 7 1341-1353 (2005).
- Minton, A. P. Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited. Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).
- Ernst, O., Zor, T. Linearization of the bradford protein assay. Journal of Visualized Experiments. (38), e1918 (2010).
- Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. M. Optimization of the RNeasy Mini Kit to obtain high-quality total RNA from sessile cells of Staphylococcus aureus. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 48 (12), 1071-1076 (2015).
- Xue, M., Jackson, C. J. Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring. Advances in wound care (New Rochelle). 4 (3), 119-136 (2015).
- Rohani, M. G., Parks, W. C. Matrix remodeling by MMPs during wound repair. Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).
- Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).
- Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis. Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).
- Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor. Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).
- Rashid, R., et al. Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).
- Lago, J. C., Puzzi, M. B. The effect of aging in primary human dermal fibroblasts. PloS one. 14 (7), 0219165 (2019).
- Cigognini, D., et al. Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture - A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis. Scientific Reports. 6, 30746 (2016).
- Cuttle, L., et al. A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring. Burns. 32 (7), 806-820 (2006).
- Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment. Journal of Biomedical Science. 22, 70 (2015).
- Fan, C., et al. Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts. International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).
- Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-Fibroblast Interactions in Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 127 (5), 998-1008 (2007).
