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Immunology and Infection

फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके कॉममेंसल बैक्टीरिया के लिए बाध्यकारी मानव नोरोवायरस वायरस जैसे कणों की मात्रा

Published: April 29, 2020 doi: 10.3791/61048
Automatic Translation
1, 1
1Microbiology and Cell Science Department, University of Florida

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य बैक्टीरिया के लिए यूकेरियोटिक रोगजनक मानव नोरोवायरस के बाध्यकारी की मात्रा निर्धारित करना है। एक प्रारंभिक वायरस-जीवाणु लगाव परख प्रदर्शन करने के बाद, प्रवाह साइटोमेट्री आबादी के भीतर वायरल से बंधे बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है ।

Abstract

कॉममेंसल बैक्टीरिया अच्छी तरह से यूकेरियोटिक वायरस के संक्रमण को प्रभावित करने के लिए स्थापित किए जाते हैं। रोगजनक और मेजबान माइक्रोबायोम के बीच सीधा बाध्यकारी इनमें से कई वायरस के लिए संक्रमण में फेरबदल के लिए जिम्मेदार है। इस प्रकार, वायरस-बैक्टीरिया बाध्यकारी की प्रकृति की विशेषता तंत्र (ओं) को स्पष्ट करने के लिए आवश्यक एक मूलभूत कदम है जिसके द्वारा बैक्टीरिया वायरल संक्रमण को बदल देते हैं। ह्यूमन नोरोवायरस के लिए कॉममेंसल बैक्टीरिया बी सेल इंफेक्शन को बढ़ाते हैं। वायरस सीधे इन बैक्टीरिया से बांधता है, जो यह दर्शाता है कि यह सीधी बातचीत संक्रमण वृद्धि के तंत्र में शामिल है। रेडियोलेबल वायरस और पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) की प्रस्फुटन गिनती सहित बैक्टीरिया और वायरस के बीच बातचीत की मात्रा निर्धारित करने के लिए विभिन्न तकनीकों का उपयोग किया जा सकता है। दोनों तरीकों के लिए जीका वायरस के उपयोग की आवश्यकता होती है, जिसे प्रयोगशाला में उत्पन्न करने की आवश्यकता हो सकती है। वर्तमान में, मानव नोरोवायरस के लिए उपलब्ध स्थापित इन विट्रो संस्कृति प्रणालियों में से कोई भी अत्यधिक केंद्रित वायरल स्टॉक की पीढ़ी के लिए अनुमति देने के लिए पर्याप्त मजबूत नहीं है। जीका वायरस के बदले वायरस जैसे कणों (वीएलपी) का इस्तेमाल नोरोवायरस और बैक्टीरिया के बीच होने वाली बातचीत को चिह्नित करने के लिए किया गया है। इसके साथ एक प्रवाह साइटोमेट्री विधि का उपयोग करता है वायरस विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ वर्णित है जो ग्राम-नकारात्मक और ग्राम-सकारात्मक बैक्टीरिया के लिए वीएलपी बाध्यकारी है। परीक्षण किए गए बैक्टीरिया के लिए वीएलपी लगाव की पृष्ठभूमि एंटीबॉडी बाध्यकारी और सटीक मात्रा को कम करने के लिए परख के अनुकूलन के लिए केवल बैक्टीरिया और आइसोटाइप नियंत्रण दोनों को शामिल करना। उच्च वीएलपी: जीवाणु अनुपात में बैक्टीरियल आबादी के बड़े प्रतिशत के लिए बाध्यकारी वीएलपी में परिणाम है । हालांकि, जब वीएलपी की मात्रा में कमी आती है, तो बंधे बैक्टीरिया का प्रतिशत भी कम हो जाता है । अंततः, इस विधि को भविष्य के प्रयोगों में नियोजित किया जा सकता है जो विशिष्ट स्थितियों और संरचनात्मक घटकों को स्पष्ट करते हैं जो नोरोवायरस को विनियमित करते हैं: बैक्टीरियल इंटरैक्शन।

Introduction

मानव नोरोवायरस (HuNoVs) दुनिया भर में गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल बीमारी का प्रमुख कारण हैं, जो हरसाल685 मिलियन संक्रमणों और 200,000 से अधिक मौतों के लिए जिम्मेदार हैं। अन्य आंत्र वायरस के साथ, इस रोगजनक के संक्रमण के साथ-साथ इसके सरोगेट वायरस, मूत्र नोरोवायरस2,,3के संक्रमण को बढ़ाने के लिए कॉममेंसल बैक्टीरिया की उपस्थिति दिखाई गई है। ऐसी भी परस्पर विरोधी खबरें हैं कि बैक्टीरिया मानव नोरोवायरस4,5,,6द्वारा संक्रमण को बाधित कर सकते हैं । कई वायरसों के लिए, वायरस और बैक्टीरिया के बीच सीधी बातचीत वायरल संक्रमण,2,,,7,8,9,10को प्रभावित करने वाले तंत्रों को रेखांकित करती दिखाई देती है, और इसे इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के माध्यम से दिखाया गया है कि मानव नोरोवायरस सीधे बैक्टीरिया11,,12की सतहों से बांधते हैं।9 इसलिए, इन बातचीत की विशेषता तंत्र है जिसके द्वारा बैक्टीरिया वायरल संक्रमण प्रभाव का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण हो गया है । यह लक्षण वर्णन शास्त्रीय रूप से शुरू हो गया है , जो जीवाणु प्रजातियों की एक सरणी के लिए वायरल बाध्यकारी है जो मेजबान माइक्रोबायोम7,12,13के घटक हैं ।13 इन लगाव परख ों से न केवल बैक्टीरिया से बंधे वायरस की मात्रा का पता चलता है, बल्कि वायरल फिटनेस और अस्तित्व पर इस बातचीत के प्रभाव का निर्धारण करने में भी सहायता करते हैं ।

वायरल लगाव की मात्रा निर्धारित करने के लिए, पारंपरिक रूप से नियोजित तरीकों में पीसीआर आधारित परख शामिल हैं जो वायरल जीनोम12 या रेडियोलेबल वायरस की पीढ़ी और वायरल कणों7,88,99,13की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रस्फुटन गिनती का उपयोग निर्धारित करते हैं ।, इन तरीकों के उपयोग के लिए आम तौर पर उच्च टिटर वायरस स्टॉक और इन विट्रो खेती तकनीकों तक पहुंच की आवश्यकता होती है जिसके साथ उन्हें उत्पन्न करना होता है। जबकि मानव नोरोवायरस के लिए कई संस्कृति प्रणालियां अब2,,14,,15मौजूद हैं, कोई भी इन अत्यधिक केंद्रित स्टॉक उत्पन्न करने के लिए आवश्यक मजबूत प्रतिकृति का समर्थन नहीं करता है जो मानव नोरोवायरस/बैक्टीरियल इंटरैक्शन की मात्रा निर्धारित करने के लिए पीसीआर और प्रस्फुटन गिनती के उपयोग को प्रतिबंधित या समाप्त करता है ।

इस मुद्दे को दरकिनार करने के लिए, वायरस जैसे कणों (वीएलपी) का उपयोग मानव नोरोवायरस और बैक्टीरिया16,,17के बीच बातचीत की जांच करने के लिए जी वायरस के लिए सरोगेट के रूप में किया जा सकता है। वीएलपी गैर-संक्रामक कण हैं जो वायरस के समान होते हैं जिनसे वे प्राप्त होते हैं। मानव नोरोवायरस के मामले में, ये कण वीवीपी1 (और कुछ समय वी2) प्रोटीन की अभिव्यक्ति से उत्पन्न होते हैं, जो आनुवंशिक सामग्री की कमी वाले बरकरार वायरल कैपसिड (यानी, नोरोवायरस के लिए आरएनए) बनाने के लिए स्वयं इकट्ठा होते हैं। इन वीएलपी को अच्छी तरह से चिह्नित किया गया है, संरचनात्मक रूप से और एंटीजनरूप से जंगली प्रकार के वायरस के समान होते हैं जिनसे वे18,,19,,20,,21,22,,23प्राप्त होते हैं।, इसलिए, वीएलपी मानव नोरोवायरस और कॉममेंसल बैक्टीरिया के बीच सतह बातचीत की जांच के लिए एक आदर्श किराए के रूप में काम करते हैं। यह देखते हुए कि वीएलपी में आनुवंशिक सामग्री की कमी है, पीसीआर आधारित परखों का उपयोग वायरल बाध्यकारी की मात्रा निर्धारित करने के लिए नहीं किया जा सकता है । एक एंटीबॉडी आधारित प्रवाह साइटोमेट्री विधि पहले वर्णित थी और अर्ध-मात्रात्मक तरीकेसेबैक्टीरिया के लिए वीएलपी बाध्यकारी के निम्न स्तर का पता लगाने में सक्षम थी। इस विधि को ग्राम-नकारात्मक और ग्राम-सकारात्मक कॉमेसल बैक्टीरिया16दोनों के लिए बाध्यकारी मानव नोरोवायरस वीएलपी के सटीक मात्राकरण की अनुमति देने के लिए अनुकूलित किया गया था।

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Protocol

नोट: प्रोटोकॉल में उल्लिखित बैक्टीरियल विकास की स्थितियां एंटेरोबैक्टर क्लोके और लैक्टोबेसिलस गैससेरीके लिए मानक संस्कृति की स्थिति हैं । वायरस को करने के लिए: अन्य जीवाणु प्रजातियों के साथ बैक्टीरिया लगाव परख, चुने हुए बैक्टीरिया को जीवाणु के लिए उपयुक्त मानक शर्तों के तहत सुसंस्कृत किया जाना चाहिए।

1. बैक्टीरियल ग्रोथ मीडियम तैयार करना

  1. एंटेरोबेक्टर क्लोके ग्रोथ मीडिया
    1. डी-आयनीकृत (डीआई) पानी (सामग्रीकी तालिका देखें) के 1 एल में 10 ग्राम ट्राइप्टोन, 5 ग्राम खमीर निकालने और 10 ग्राम सोडियम क्लोराइड (एनसीएल) को भंग करके तरल माध्यम तैयार करें। सभी मीडिया को अच्छी तरह से मिलाएं और 30 मिन के लिए ऑटोक्लेविंग करके स्टरलाइज करें।
    2. 10 ग्राम ट्राइप्टोन, 5 ग्राम खमीर निकालने, नैकल के 10 ग्राम और डीआई पानी के 1 एल में 15 ग्राम एगर को भंग करके ठोस माध्यम तैयार करें। सभी मीडिया को अच्छी तरह से मिलाएं और 30 मिन के लिए ऑटोक्लेविंग करके स्टरलाइज करें।
  2. लैक्टोबेसिलस गैससेरी विकास मीडिया
    1. डी आई पानी के 1 एल में डी मैन, रोगोसा और शार्प (एमआरएस; टेबल ऑफ मैटेरियल्स)पाउडर को भंग करके तरल माध्यम तैयार करें। तैयारी के एक महीने के भीतर माध्यम का उपयोग करें। बंध्याकरण करने के लिए, 15 मिन के लिए गर्मी मध्यम जब तक उबलते 15 मिन के लिए ऑटोक्लेव के बाद ।
    2. डीआई पानी के 1 एल में 55 ग्राम एमआरएस पाउडर और 15 ग्राम एगर को घोलकर ठोस माध्यम तैयार करें। बंध्याकरण करने के लिए, 15 मिन के लिए गर्मी मध्यम जब तक उबलते 15 मिन के लिए ऑटोक्लेव के बाद ।

2. ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) और बैक्टीरिया एकाग्रता से संबंधित एक मानक वक्र सहसंबंधित स्थापित करना

  1. एक आगर प्लेट(ई क्लोके)से या सीधे जमे हुए ग्लाइसेरोल स्टॉक(एल गैसेरी)से एक एकल, अलग कॉलोनी के साथ उचित तरल माध्यम के 5 मिलील का टीका लगाया।
  2. जीवाणु रातोंरात बढ़ो, उचित वायुमंडलीय परिस्थितियों के तहत(आंत्रजीवाणु क्लोके:37 डिग्री सेल्सियस एरोबिक 200 आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ; एल गैसेरी:37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान एक एयरटाइट कंटेनर में कोई मिलाते हुए के साथ)।
  3. रात ोंरात की संस्कृति के 2 x 1.3 mL aliquots को दो अलग-अलग 1.5 मिलीग्राम अपकेंद्रित्र ट्यूबों और 5 मिन के लिए 10,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र बैक्टीरिया में स्थानांतरित करें।
  4. अलौकिक निकालें और बाँझ 1x फॉस्फेट बफर ्ड लवण (पीबीएस) के 1 mL के साथ नमूनों को धोएं। कुल 2 वॉश के लिए इस वॉश स्टेप को दोहराएं।
  5. 5 मिन के लिए 10,000 x ग्राम पर फिर से नमूने को अपकेंद्रित करें, सुपरनेटेंट को हटा दें और बाँझ 1x पीबीएस के 1.3 mL में फिर से सस्पेंड करें।
  6. धोया संस्कृति के 0.5 मिलील के साथ शुरुआत, 1x PBS में बैक्टीरिया को 10-1 से10-4तक क्रमिक रूप से पतला करें।
  7. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके, धोया, अपतला संस्कृति के ऑप्टिकल घनत्व और 600 एनएम (ओडी600)पर चार कमजोरियों में से प्रत्येक को मापें।
  8. चरण 2.6 से प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए 1x पीबीएस में 10 गुना धारावाहिक कमजोर प्रदर्शन करें। प्रत्येक नमूने के प्रति मिलीलीटर (सीएफयू/एमएल) कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों की संख्या निर्धारित करने के लिए उपयुक्त ठोस माध्यम पर प्रत्येक श्रृंखला के लिए पिछले 3 कमजोरियों की प्लेट 100 माइक्रोन फैलाएं। प्रत्येक कमजोर पड़ने की थाली त्रिपाली में।
  9. प्लेटों को 5 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर सूखने दें। उपयुक्त वायुमंडलीय परिस्थितियों के तहत प्लेटों और इनक्यूबेट को उलटदें(ई क्लॉके:37 डिग्री सेल्सियस पर एरोबिक, रात भर प्लेटें; एल गैसेरी:37 डिग्री सेल्सियस पर एनारोबिक, एरोबिक एयर पाउच (सामग्री की तालिकादेखें)) के साथ एक एयरटाइट कंटेनर में 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट प्लेटें।)
    नोट: प्रति 2.5 एल जार या 3 पाउच प्रति 7.0 एल जार (सामग्री की तालिकादेखें) प्रति 1 एनारोबिक एयर सैशे का उपयोग करें।
  10. 5 नमूनों में से प्रत्येक के लिए सीएफयू/एमएल निर्धारित करने के लिए प्लेट की गिनती का उपयोग करें (यानी, अनपतला,10-1,10-2,10-3,10-4)। ओडी600 बनाम सीएफयू/एमएल की तुलना में एक मानक वक्र उत्पन्न करें। इस लाइन के लिए समीकरण वीएलपी-बैक्टीरिया लगाव परखों में इस्तेमाल किया जाएगा CFU/mL OD६००के आधार पर निर्धारित करने के लिए ।

3. वीएलपी-बैक्टीरिया लगाव परख

सावधानी: मानव नोरोवायरस वीएलपी एक जैव सुरक्षा स्तर (बीएसएल) -2 खतरा है और वीएलपी से जुड़े सभी काम एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना चाहिए। अनुलग्नक परख से पहले बैक्टीरियल संस्कृतियों की तैयारी, जीव के लिए उपयुक्त सुरक्षा शर्तों का उपयोग करके किया जाना चाहिए।

  1. रिएजेंट तैयारी
    1. 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस)
      1. डीआई पानी के 1 एल में एक पूरा पैकेट घोलकर 10x पीबीएस के 1 एल तैयार करें।
      2. 30 मिन के लिए ऑटोक्लेव समाधान।
      3. डीआई पानी में उपरोक्त समाधान 1:10 को कमजोर करके 1x समाधान तैयार करें।
      4. फिल्टर इसे 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से गुजर कर समाधान को स्टरलाइज करता है और कमरे के तापमान पर स्टोर करता है।
    2. 5% बीएसए
      1. 5% (w/v) समाधान उत्पन्न करने के लिए पीबीएस के 100 मीटर में गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) पाउडर के 5 ग्राम जोड़ें।
      2. भंवर द्वारा समाधान मिश्रण या एक हलचल प्लेट पर एक धातु हलचल बार का उपयोग कर जब तक झुरमुट भंग कर दिया है ।
      3. 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर स्टरलाइज करें।
      4. समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. फ्लो साइटोमेट्री दाग बफर (FCSB)
      1. फ़िल्टर ने 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से एफसीएसबी (सामग्री की तालिकादेखें) खरीदी।
      2. 4 डिग्री सेल्सियस पर शेष समाधान स्टोर करें।
    4. 5% ब्लॉकिंग बफर (बीबी)
      नोट: हर बार ताजा तैयार करें।
      1. बाँझ FCSB के 10 मीटर के लिए बीएसए के 0.5 ग्राम जोड़ें।
      2. भंवर पूरी तरह से नमूना मिश्रण करने के लिए और उपयोग तक बर्फ पर छोड़ दें।
  2. एंटीबॉडी कंजुगन
    1. मानव नोरोवायरस GII एंटीबॉडी (सामग्री की तालिकादेखें) आर-फाइकोरिथ्रिन (पीई) के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार आर-पीई एंटीबॉडी लेबलिंग किट का उपयोग कर (सामग्री की तालिकादेखें) ।
    2. वीएलपी-जीवाणु लगाव परख विश्लेषण में भविष्य के उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में conjugated एंटीबॉडी स्टोर करें।
      नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी को प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए आवश्यक उचित एकाग्रता निर्धारित करने के लिए वीएलपी-बैक्टीरिया लगाव परख में उपयोग करने से पहले टिटकिया जाना चाहिए। एंटीबॉडी टिट्रेशन हर बार जब conjugation प्रतिक्रिया किया जाता है और प्रत्येक जीवाणु लगाव परख में इस्तेमाल के लिए किया जाना चाहिए ।
  3. एंटीबॉडी टिट्रेशन
    1. 1:100 के शुरुआती कमजोर पड़ने और 1:600 (कुल छह कमजोर पड़ने) के अंत में कमजोर पड़ने के साथ संयुग्मित एंटी-ह्यूमन नोरोवायरस जीआईआई एंटीबॉडी 100 गुना पतला करें।
    2. निम्नलिखित अपवाद के साथ नीचे वर्णित वायरस अटैचमेंट परख करें: चरण 3.5.7 में 5% बीबी के 350 माइक्रोन में बैक्टीरियल पेलेट को फिर से निलंबित करें।
    3. नमूने को सात 50 माइक्रोन एलिकोट में विभाजित करें।
    4. प्रत्येक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के 50 माइक्रोन को एक ट्यूब में जोड़ें।
    5. एक अनदाग नियंत्रण के रूप में सातवीं ट्यूब के लिए 5% बीबी के 50 μL जोड़ें।
    6. नीचे वर्णित सभी नमूनों पर प्रवाह साइटोमेट्री करें।
    7. पतला एंटीबॉडी नमूनों की तुलना अनदाग नियंत्रण और एक दूसरे से करें। सबसे कम एंटीबॉडी एकाग्रता जिसके परिणामस्वरूप सकारात्मक संकेत की कमी या हानि नहीं होती है, को बाद के परखों में उपयोग के लिए चुना जाना चाहिए।
  4. बैक्टीरिया की तैयारी
    1. बैक्टीरिया स्थिर चरण में होने तक उचित वायुमंडलीय परिस्थितियों में उचित तरल माध्यम के 40 मीटर में बैक्टीरिया बढ़ाएं।
      1. 37 डिग्री सेल्सियस पर लुरिया शोरबा में रात भर ई क्लोके संस्कृतियों को बढ़ाएं, स्थिर चरण तक पहुंचने के लिए 200 आरपीएम पर मिलाते हुए।
      2. 18 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट पानी स्नान में मिलाते हुए बिना काले पेंच टोपी ट्यूबों में श्रीमती शोरबा में एल गैसेरी संस्कृतियों को विकसित करने के लिए स्थिर चरण तक पहुंचने के लिए।
    2. बैक्टीरिया को गोली मारने के लिए 10 मिन के लिए 2,288 x ग्राम पर 50 मिलीग्राम शंकुट्यूब और सेंट्रलाइज नमूनों को साफ करने के लिए स्थिर चरण संस्कृतियों को स्थानांतरित करें।
    3. अलौकिक निकालें और बाँझ 1x PBS के 13 mL में फिर से निलंबित। कुल दो वॉश के लिए इस वॉश स्टेप को दोहराएं।
    4. नमूनों को फिर से अपकेंद्रित ्रित करें, 1x पीबीएस के 20 एमसीएल में सुपरनेटेंट को हटा दें और नमूनों को फिर से निलंबित करें।
      नोट: यदि सेल पैलेट छोटा है, तो पुनर्निलंबन की मात्रा को कम किया जा सकता है।
    5. संस्कृति के ओडी600 को मापें।
    6. पहले से तैयार मानक वक्र का उपयोग करते हुए, धोया संस्कृति के प्रति mL CFU निर्धारित करते हैं ।
    7. 1 x 108 CFU/mL के लिए संस्कृति एकाग्रता को समायोजित करने के लिए 1x PBS के साथ की जरूरत के रूप में बैक्टीरिया पतला ।
    8. 1 x 108 सीएफयू/एमएल बैक्टीरियल कल्चर का 1 एमएल 1.5 मिलीस सेंट्रलाइज ट्यूबकी जरूरी संख्या में ट्रांसफर करें।
    9. 5 मिन के लिए 10,000 x ग्राम पर ट्यूबों को अपकेंद्रित करें।
    10. बाँझ 5% बीएसए के 1 mL में बैक्टीरियल पैलेट को फिर से सस्पेंड करें।
    11. लगातार रोटेशन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
  5. वायरस लगाव
    1. एक बीएसएल-2 जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर काम करना, प्रत्येक ट्यूब में HuNoV VLPs के 10 μg जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें) प्रत्येक ट्यूब में बैक्टीरिया युक्त PBS में फिर से निलंबित और पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण ।
      नोट: वीएलपी एकाग्रता प्रत्येक वीएलपी तैयारी के साथ अलग है। इसलिए, बैक्टीरिया में जोड़ा गया मात्रा तैयारी बैचों के बीच भिन्न होगी और तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए ताकि प्रयोग में प्रत्येक ट्यूब में 10 μg जोड़ा जा सके। बैक्टीरिया के लिए केवल नियंत्रण (उदाहरण के लिए, वीएलपी के बिना नमूने), पीबीएस की मात्रा जोड़ें जो प्रायोगिक नमूनों में जोड़े गए वीएलपी की मात्रा के बराबर है।
    2. लगातार रोटेशन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट ट्यूब।
      नोट: एक ट्यूब रिवॉल्वर (सामग्री की तालिकादेखें) ४० आरपीएम के लिए सेट इनक्यूबेशन के दौरान प्रयोग किया जाता है ।
    3. इनक्यूबेशन बाद 5 मिन के लिए 10,000 एक्स जी पर सैंपल अपकेंद्रित कर ते हैं।
    4. अधिनायक को त्यागें और पीबीएस के 1 mL में बैक्टीरियल पैलेट को फिर से निलंबित करें।
    5. वॉश स्टेप्स 3.5.3 और 3.5.4 दोहराएं।
    6. 5 मिन के लिए 10,000 x ग्राम पर नमूने अपकेंद्रित्र।
    7. 5% बीबी के 150 माइक्रोन में बैक्टीरियल पैलेट को छोड़ें और फिर से निलंबित करें।
  6. एंटीबॉडी धुंधला
    1. नए सिरे से 5% बीबी तैयार करें।
      नोट: फ्लोरोसेंटी टैग एंटीबॉडी का उपयोग करके सभी काम अंधेरे में किया जाना चाहिए और एंटीबॉडी, बीबी और एफसीएसबी को बर्फ पर रखा जाना चाहिए।
    2. कमजोर मानव norovirus GII एंटीबॉडी 1:125 ई. क्लोके नमूनों के लिए और एल गैसेरी नमूनों के लिए 5% बीबी में 1:150, प्रति नमूना पतला एंटीबॉडी के ५० μL तैयार ।
    3. आइसोटाइप एंटीबॉडी को उसी तरह पतला करें जिस तरह मानव नोरोवायरस जीआईआई एंटीबॉडी को 5% बीबी में प्रत्येक जीवाणु के लिए पतला किया गया था, प्रति नमूना पतला आइसोटाइप नियंत्रण के 50 माइक्रोन तैयार किया गया था।
    4. प्रत्येक लगाव परख के नमूने को चरण 3.3.7 से तीन 50 माइक्रोन एलिकोट में विभाजित करें, उन्हें साफ 1.5 मिलीस सेंट्रलाइज ट्यूबों में स्थानांतरित करके।
    5. नमूनों के पहले सेट के लिए, बीबी के 50 माइक्रोन जोड़ें। यह सेट अनसदाग (यूएन) कंट्रोल होगा।
    6. दूसरे सेट के लिए, जीआईआई एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के 50 माइक्रोन जोड़ें। इसके परिणामस्वरूप ई क्लोके के लिए 1:250 और एल गैसेरीके लिए 1:300 की अंतिम एंटीबॉडी एकाग्रता होती है। यह सैंपल सेट दागदार (एबी) सैंपल होगा।
    7. तीसरे सेट के लिए, पतला आइसोटाइप एंटीबॉडी के 50 माइक्रोन जोड़ें। यह सेट आइसोटाइप कंट्रोल्स (आईसी) होगा। पाइपिंग करके अच्छी तरह मिलाएं। 30 मिन के लिए बर्फ और अंधेरे में नमूनों को इनक्यूबेट करते हैं।
    8. 5 मिन के लिए 10,000 x ग्राम पर सभी नमूने अपकेंद्रित्र।
    9. अधिष्णकको त्यागें और एफसीएसबी के 100 माइक्रोन में नमूनों को फिर से निलंबित करें।
    10. 5 मिन के लिए 10,000 x ग्राम पर सभी नमूनों को सेंट्रलाइज करें। सुपरनेटेंट को छोड़ दें और एफसीएसबी के 100 माइक्रोन में नमूनों को फिर से सस्पेंड करें।
    11. 5 मिन के लिए 10,000 x ग्राम पर सभी नमूने अपकेंद्रित्र।
    12. अधिष्णकता को त्यागें और एफसीएसबी के 150 माइक्रोन में नमूनों को फिर से निलंबित करें।
    13. प्रत्येक नमूने को एफसीएसबी ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें एफसीएसबी बफर का 400 माइक्रोन 550 माइक्रोन की कुल मात्रा के लिए हो।
    14. नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें जब तक कि उनका प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण न किया जाए।
      नोट: फ्लो साइटोमेट्री एंटीबॉडी धुंधला के 4 घंटे के भीतर किया जाता है।

4. फ्लो साइटोमेट्री

नोट: नीचे वर्णित वोल्टेज सेटिंग्स सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध प्रवाह साइटोमीटर और सॉफ्टवेयर पर आधारित हैं और संभावना अलग-अलग प्रवाह साइटोमीटर के साथ भिन्न होंगी। प्रत्येक जीवाणु के लिए सेटिंग्स को अनुकूलित किया जाना चाहिए। सुनिश्चित करें कि सभी रेखांकन ों के लिए कुल्हाड़ी द्विघातीय चरण में हैं।

  1. कार्यक्षेत्र की स्थापना
    नोट: कार्यक्षेत्र स्थापित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले भूखंडों के लिए सेट-अप गेटिंग और डेटा विश्लेषण में उपयोग किए जाने वाले लोगों से अलग है। कार्यक्षेत्र स्थापित करने का उद्देश्य कोशिका आबादी की कल्पना करना है, यह सुनिश्चित करना है कि बैक्टीरियल कोशिकाओं का कोई अत्यधिक झुरमुट नहीं है जो डाउनस्ट्रीम विश्लेषण को प्रभावित कर सकता है और डेटा एकत्र किए जाने के दौरान दाग और अनदाग कोशिकाओं के बीच अंतर कर सकता है।
    1. यह सुनिश्चित करने के लिए कि बैक्टीरिया एक साथ झुरमुट न हों, घनत्व भूखंडों की एक श्रृंखला स्थापित करें।
      1. कुल आबादी की कल्पना करने के लिए एक फॉरवर्ड स्कैटर एरिया (एफएससी-ए) बनाम साइड स्कैटर एरिया (एसएससी-ए) जेनरेट करें।
      2. दो रेखांकन है कि दोनों आगे (FSC-W) और साइड स्कैटर चौड़ाई (एसएससी-डब्ल्यू) की तुलना में दोनों आगे (FSC-एच) और साइड स्कैटर ऊंचाई (एसएससी-एच), क्रमशः बनाने के द्वारा एकल कोशिकाओं बनाम सेल झुरमुट का मूल्यांकन करने के लिए भूखंडों की स्थापना की ।
      3. एक प्लॉट बनाएं जो केवल पीई पॉजिटिव पॉपुलेशन (पीई-ए बनाम एसएससी-ए) दिखाता है।
    2. ई. क्लोके के लिए 500 और एल गैसेरीके लिए 340 के लिए बेसलाइन वोल्टेज सेट करें। इन्हें बाद में और समायोजित किया जाएगा।
    3. कुल घटनाओं को 10,000 घटनाओं में गिना सेट करें।
  2. रनिंग सैंपल
    1. एसएससी-ए, एफएससी-ए या पीई-ए के खिलाफ साजिश रचने वाले तीन अलग-अलग हिस्टोग्राम प्लॉट बनाएं।
    2. फ्लो साइटोमीटर पर एक अनदाग नमूना रखें और नमूना घटनाओं का अधिग्रहण करें, यह सुनिश्चित करना कि एसएससी-ए के लिए हिस्टोग्राम पर अधिकतम चोटी 102 से 103 के भीतर है और एफएससी-ए के लिए हिस्टोग्राम पर अधिकतम चोटी एक्स-एक्सिस पर 104 से 105 के बीच है। यदि नहीं, तो चोटियों निर्दिष्ट पर्वतमाला के भीतर नहीं आते हैं, एफएससी और एसएससी वोल्टेज तदनुसार समायोजित करें ।
    3. फ्लो साइटोमीटर पर एक दाग नमूना (एबी) रखें और एक्स-एक्सिस पर अधिकतम चोटी 103 बनाने के लिए वोल्टेज पीई को समायोजित करें।
    4. इन मापों के आधार पर, सकारात्मक पीई गेट सेट करें और पीई-ए बनाम एसएससी-ए घनत्व ग्राफ पर गेट सेट करें।
    5. निर्धारित सेटिंग्स के तहत सभी नमूने कम या मध्यम गति से चलाएं।

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Representative Results

मानव नोरोवायरस वीएलपी को कॉममेंसल बैक्टीरिया के लिए बाध्यकारी बताने के लिए उपयोग की जाने वाली गेटिंग रणनीतियों को चित्रा 1में दिखाया गया है । प्रतिनिधि घनत्व डॉट कैसे नमूने सेलुलर मलबे और सेल झुरमुट को खत्म करने के लिए gated थे तो VLP लगाव एकल आबादी पर निर्धारित किया गया था(चित्रा 1ए)का अवलोकन प्रदान करता है । प्रतिनिधि हिस्टोग्राम बैक्टीरिया में एंटी-नोरोवायरस एंटीबॉडी सिग्नल के निम्न स्तर को प्रदर्शित करता है केवल नोरोवायरस वीएलपी की कमी वाले नमूनों और आईसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी(चित्र ा 1बी)के साथ दाग वाले वीएलपी-बैक्टीरिया नमूनों के कम पृष्ठभूमि संकेत। आइसोटाइप नियंत्रण चोटियों भी अरंजित नमूनों के साथ ओवरलैप करते हुए एंटी ह्यूमन नोरोवायरस GII एंटीबॉडी के साथ एक ही नमूनों के धुंधला चरम में महत्वपूर्ण बदलाव में परिणाम है ।

हिस्टोग्राम घटाव की ओवरटन विधि का उपयोग एंटी-ह्यूमन नोरोवायरस जीआईआई एंटीबॉडी में पीई-पॉजिटिव सिग्नल की तुलना इसी आइसोटाइप नियंत्रण के पीई-पॉजिटिव सिग्नल के लिए किया गया था और मानव नोरोवायरस वीएलपी(चित्रा 1बी)से बंधे जीवाणु आबादी के प्रतिशत का निर्धारण किया गया था। वीएलपी के 10 μg के साथ इनक्यूबेशन के 1 घंटे के बाद, प्रवाह साइटोमेट्री दोनों ई क्लोके और एल gasseri (चित्रा 2)के लिए बाध्यकारी कण का पता चला । वास्तव में, दोनों बैक्टीरिया के लिए इन परिस्थितियों में बाध्यकारी का उच्च स्तर हुआ; एल गैसेरी के लिए बाध्यकारी थोड़ा अधिक है, लेकिन महत्वपूर्ण (पी एंड एलटी; ०.०००१), ई क्लोके की तुलना में स्तर पर हुआ । इन परखों से पता चलता है कि फ्लो साइटोमेट्री का इस्तेमाल ग्राम-पॉजिटिव और ग्राम-निगेटिव बैक्टीरिया दोनों के लिए बाध्यकारी मानव नोरोवायरस का पता लगाने के लिए किया जा सकता है ।

इस परख के लिए बाध्यकारी मात्रा की सीमा निर्धारित करने के लिए, बैक्टीरिया(चित्रा 3)के अलावा वीएलपी की एक कमजोर पड़ने की श्रृंखला उत्पन्न की गई थी। बैक्टीरिया के दोनों जेनेरा के लिए, वीएलपी की मात्रा में कटौती बैक्टीरियल संस्कृति में जोड़ा वीएलपी द्वारा बंधे बैक्टीरिया के प्रतिशत में इसी कटौती के परिणामस्वरूप । कण से बंधे ई. क्लोके के प्रतिशत में परिवर्तन एल गैसेरीकी तुलना में अधिक क्रमिक थे, लेकिन वीएलपी एकाग्रता में और कटौती के बावजूद दोनों बैक्टीरिया के लिए प्रतिशत लगाव। विशेष रूप से, बैक्टीरिया के 108 सीएफयू में वीएलपी के 0.1 μg या उससे कम (डेटा नहीं दिखाया गया) दोनों बैक्टीरिया के लिए 13-19% के बीच औसत प्रतिशत लगाव का एक पठार के परिणामस्वरूप, यह दर्शाता है कि यह प्रतिशत इस परख के लिए मात्राकरण की सीमा है।

Figure 1
चित्रा 1: मानव नोरोवायरस वीएलपी बाध्यकारी के प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण। (क)बैक्टीरिया के लिए वीएलपी बाध्यकारी मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री गेटिंग रणनीति। घनत्व भूखंडों का उपयोग सेलुलर मलबे को गेट करने के लिए किया गया था, जिसके बाद बाद में डॉट प्लॉट गेटिंग बैक्टीरियल डबल्स और सेलुलर झुरमुटको हटाने के लिए किया गया था। (ख)प्रतिनिधि हिस्टोग्राम केवल नमूनों में पीई संकेत की कमी और वीएलपी में पीई सिग्नल तीव्रता में बदलाव को प्रदर्शित करता है: जीवाणु नमूने अनदाग और आइसोटाइप नियंत्रण की तुलना में । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: ई. क्लोके और एल गैसेरीके लिए वीएलपी लगाव । ई क्लोके (एन = 6) और एल गैसेरी (एन = 6) की रातोंरात संस्कृतियों को पीबीएस में 1 x 108 सीएफयू/एमएल में पतला किया गया था । बैक्टीरिया 1 घंटे के लिए GII.4 VLPs के 10 μg के साथ इनक्यूबेटेड थे तो VLP लगाव प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग कर मापा गया था । एक प्रतिनिधि भूखंड चित्रा 1 Bमें पाया जा सकता है । प्रतिशत लगाव हिस्टोग्राम घटाव के ओवरटन विधि का उपयोग कर के लिए निर्धारित किया गया था जीआईआई मानव Norovirus के पीई सकारात्मक संकेत की तुलना इसी आइसोटाइप नियंत्रण के पीई सकारात्मक संकेत के लिए नमूनों दाग । सांख्यिकीय विश्लेषण एक अपेयर छात्र टी-टेस्ट (पी एंड एलटी; 0.0001) का उपयोग करके किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: ई. क्लोके और एल गैसेरीके लिए वीएलपी कमजोर पड़ने की श्रृंखला । GII.4 VLPs के 10 μg क्रमिक रूप से पतला किया गया था और VLP कमजोर करने के लिए प्रत्येक 1 mL (एन = 3 दोनों बैक्टीरिया के लिए) की एक अंतिम मात्रा में 1 x १०८ बैक्टीरिया के लिए जोड़ा गया । एक घंटे तक 37 डिग्री सेल्सियस पर सैंपल इनक्यूबेटेड किए गए। बैक्टीरिया के लिए वीएलपी लगाव प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग कर मापा गया था । प्रतिशत लगाव हिस्टोग्राम घटाव के ओवरटन विधि का उपयोग कर के लिए निर्धारित किया गया था जीआईआई मानव Norovirus के पीई सकारात्मक संकेत की तुलना इसी आइसोटाइप नियंत्रण के पीई सकारात्मक संकेत के लिए नमूनों दाग । वीएलपी की इनपुट मात्रा को कम करने के परिणामस्वरूप दोनों(ए) ई क्लोके और(बी) एल गैसेरीदोनों के लिए प्रतिशत लगाव में चरणबद्ध कटौती हुई । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

बैक्टीरिया के लिए आंत्र वायरस के बाध्यकारी मात्रा निर्धारित करने की क्षमता तंत्र है जिसके द्वारा इन बैक्टीरिया वायरल संक्रमण को बदलने को स्पष्ट करने के लिए एक महत्वपूर्ण पहला कदम है । यहां वर्णित तरीकों को ई क्लोके (ग्राम-नकारात्मक जीवाणु) और एल गैसेरी (ग्राम-सकारात्मक जीवाणु) दोनों के साथ मानव नोरोवायरस वीएलपी बातचीत को मापने के लिए अनुकूलित किया गया है, लेकिन किसी भी स्तनधारी वायरस और ब्याज के जीवाणु के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। जबकि वीएलपी लगाव परखमें उपयोग के लिए जीका वायरस का एक आदर्श विकल्प है और इन कणों को प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके आसानी से मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, पी कणों का उपयोग मानव नोरोवायरस और बैक्टीरिया24के बीच बातचीत की जांच करने के लिए भी किया गया है। इस अध्ययन में, बैक्टीरिया के लिए बाध्य वायरस की मात्रा बैक्टीरिया आबादी के विपरीत मात्रा में निर्धारित किया गया था, जैसा कि यहां बताया गया है । पी कण वीएलपी पर लाभ प्रदान करते हैं जिसमें वे वीएलपी और जंगली प्रकार के वायरस24,25दोनों को एंटीजेनिक समानता प्रदान करते समय उत्पादन करना आसान होता है । हालांकि, मानव नोरोवायरस वीएलपी वाणिज्यिक रूप से वीएलपी या पी कणों को उत्पन्न करने की क्षमता की कमी वाली प्रयोगशालाओं के लिए एक साधन प्रदान करते हैं। पी कण उस में वीएलपी से अलग होते हैं, जबकि वीएलपी एक जंगली प्रकार के वायरल कण के आकार को बनाए रखते हैं, पी कण छोटे होते हैं और icosahedral समरूपता25के बजाय टेट्राएड्रल होते हैं। बैक्टीरिया के साथ बातचीत पर इन विशेषताओं के प्रभाव का पता नहीं लगाया गया है और पी कण मानव नोरोवायरस और बैक्टीरिया के बीच सतह बातचीत की विशेषता में वीएलपी के लिए एक व्यवहार्य विकल्प के रूप में काम कर सकते हैं ।

जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, ऊपर वर्णित परख का उपयोग मानव नोरोवायरस वीएलपी और बैक्टीरिया के बीच बातचीत को और अधिक चित्रित करने के लिए किया जा सकता है। कैसे विकास की स्थिति और बैक्टीरियल सतह संरचना अभिव्यक्ति में परिवर्तन वायरल बाध्यकारी परिवर्तन इस तकनीक का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है में जांच । इसके अलावा, इस परख का उपयोग बैक्टीरियल प्रोटीन या ग्लाइकान, विशिष्ट सतह संरचनाओं को हटाने के लिए एंजाइमैटिक उपचार, या उत्परिवर्ती जीवाणु उपभेदों के साथ इनक्यूबेशन विशेष रूप से एक संरचना में कमी के साथ प्रतिस्पर्धी अवरोध परख ों के माध्यम से वायरस से बंधे विशिष्ट जीवाणु संरचनाओं का निर्धारण करने के लिए भी किया जा सकता है। इस परख को कॉमेसल बैक्टीरिया के साथ बातचीत करने के लिए अन्य नोरोवायरस उपभेदों की क्षमता की जांच करने के लिए भी नियोजित किया जा सकता है।

क्योंकि यह परख नोरोवायरस वीएलपी द्वारा बाध्य जीवाणु आबादी के अनुपात की मात्रा निर्धारित करता है, यह सही सीएफयू/mL और OD६०० के बीच संबंध निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है तो जीवाणु संस्कृति एकाग्रता मापा जा सकता है । वीएलपी में उतार-चढ़ाव: बैक्टीरिया अनुपात वीएलपी द्वारा बंधे बैक्टीरिया की आबादी के प्रतिशत को बदल देता है और परिणामों में परिवर्तनशीलता का कारण बन सकता है । देखभाल भी वायरल कणों की पर्याप्त मात्रा में जोड़ने के लिए लिया जाना चाहिए, के रूप में इस परख का पता लगाने की सीमा वीएलपी के ०.१ μg दृष्टिकोण/108 बैक्टीरिया के CFU । इस सीमा से नीचे अनुपात लगातार 13-19% के प्रतिशत लगाव मूल्यों मिले; इस प्रकार इन प्रतिशतों पर या उससे नीचे जनसंख्या लगाव मनाया वास्तविक नहीं हो सकता है ।

प्रत्येक नए संयुग्मित एंटीबॉडी के लिए और वीएलपी में उपयोग करने से पहले प्रत्येक जीवाणु तनाव के खिलाफ एंटीबॉडी टिट्रेशन किए गए थे: बैक्टीरिया अटैचमेंट प्रयोग। प्रत्येक जीवाणु के लिए आवश्यक एंटीबॉडी सांद्रता ई क्लॉके के लिए 1:250 और एल गैसेरीके लिए 1:300 से लेकर समान थी। बैक्टीरिया के छोटे आकार, यूकेरियोटिक कोशिकाओं के आकार के सापेक्ष, दोनों वोल्टेज समायोजन के साथ-साथ डेटा संग्रह के दौरान एक बिनोमियल वितरण के उपयोग के लिए पर्याप्त रूप से मलबे से बैक्टीरिया को अलग करने की आवश्यकता होती है जो नमूनों में पाया जा सकता है या उपकरण के भीतर घूम सकता है। डेटा संग्रह के बाद, उचित गेटिंग का उपयोग बड़े मलबे कणों और बैक्टीरियल झुरमुटों को हटाने के लिए किया जा सकता है ताकि केवल एकल कोशिका आबादी का विश्लेषण किया जा सके। यह भी प्रत्येक जीवाणु प्रजातियों के लिए अद्वितीय वोल्टेज सेटिंग्स स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है के रूप में इन व्यापक रूप से उतार चढ़ाव, विशेष रूप से ग्राम नकारात्मक और ग्राम सकारात्मक बैक्टीरिया के बीच ।

केवल बैक्टीरिया और आइसोटाइप नियंत्रण सहित उचित नियंत्रण को शामिल करना भी डेटा के सटीक विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है। दोनों प्रकार के नियंत्रण गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी बाध्यकारी के स्तर के बारे में सूचित करते हैं। हमारे परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि परीक्षण की गई जीवाणु प्रजातियों के लिए गैर-विशेष रूप से बाध्य नहीं करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी, लेकिन गैर-विशिष्ट बाध्यकारी बैक्टीरियल प्रजातियों या एंटीबॉडी में परिवर्तन के साथ बदल सकता है।

यहां प्रस्तुत विधि ग्राम-सकारात्मक और ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया दोनों के लिए बाध्यकारी मानव नोरोवायरस कण की मात्रा निर्धारित करती है और वायरस की विशेषता में उपयोगी है: जीवाणु इंटरैक्शन। इसके अलावा, इस आधार प्रोटोकॉल को मानव नोरोवायरस के अन्य जीनोटाइप के साथ उपयोग के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है, साथ ही अन्य स्तनधारी वायरस और बैक्टीरिया भी।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

हम सुटुका भर और चैनल मोस्बी-हंड्रप को लिखित पांडुलिपि की उनकी महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं, साथ ही अल्फोन्सो कैरिलो को बैक्टीरियल मानक घटता पैदा करने के साथ सहायता के लिए । यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R21AI140012) से अनुदान और फ्लोरिडा विश्वविद्यालय, खाद्य और कृषि विज्ञान संस्थान से एक बीज अनुदान द्वारा भाग में वित्त पोषित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap Corning 352235 After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis.
Agar Sigma A7002 Used for media preparation
AnaeroPack Thermo Scientific R681001 Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri
BD FacsDiva software
BD LSR Fortessa flow cytometer
Bovine Serum Albumin Fisher Bioreagents BP1605 Used for flow cytometry
Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB) BD Biosciences 554657 Used for flow cytometry
Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience Thermo Fisher Scientific 12473281 Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer.
MRS Powder BD Biosciences 288130 Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri.
Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D) Thermo Fisher Scientific MA5-18241 Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher.
Norovirus GII.4 VLP Creative Biostructure CBS-V700 human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays.
PBS 10X Fisher Bioreagents BP665 Dilute to 1X prior to use.
SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit Thermo Fisher Scientific S10467 Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody.
Sodium Chloride Fisher Scientific S271 Used for media preparation
Tryptone Oxoid LP0042 Used for media preparation
Tube Revolver ThermoFisher Scientific 88881001 Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm).
Yeast Extract BD Biosciences 212750 Used for media preparation

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References

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Madrigal, J. L., Jones, M. K. Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (158), e61048, doi:10.3791/61048 (2020).

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