Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Количественная оценка норовируса человека, как частицы, связывающиеся с commensal бактерий использованием потока цитометрии

Published: April 29, 2020 doi: 10.3791/61048
Automatic Translation
1, 1
1Microbiology and Cell Science Department, University of Florida

Summary

Целью этого протокола является количественная оценка связывания эукариотического патогена норовируса человека к бактериям. После выполнения первоначального вирусно-бактериальных вложений асссее, цитометрия потока используется для обнаружения вирусно связанных бактерий в популяции.

Abstract

Комменсальные бактерии хорошо известны для воздействия инфекции эукариотических вирусов. Прямая связывание между патогеном и микробиомом хозяина отвечает за изменение инфекции для многих из этих вирусов. Таким образом, характеристика природы связывания вирусов-бактерий является основополагающим шагом, необходимым для выяснения механизма (ы), с помощью которого бактерии изменяют вирусную инфекцию. Для человека норовирус, комменсальные бактерии повышения B-клеточной инфекции. Вирус непосредственно связывается с этими бактериями, указывая, что это прямое взаимодействие участвует в механизме повышения инфекции. Различные методы могут быть использованы для количественной оценки взаимодействия между бактериями и вирусами, включая сцинтилляционный подсчет радиомаркированных вирусов и полимеразы цепной реакции (ПЦР). Оба метода требуют использования живого вируса, который, возможно, потребуется сгенерировать в лаборатории. В настоящее время ни одна из установленных систем культуры in vitro, доступных для норовируса человека, не является достаточно надежной, чтобы обеспечить генерацию высококонцентрированных вирусных запасов. Вместо живого вируса, вирусоподобные частицы (VLPs) были использованы для характеристики взаимодействия между норовирусом и бактериями. В этом методциометрии потока описан с использованием вируса специфические антитела для количественной оценки Связывания VLP к грамотрицательным и грамотрицательным бактериям. Включение как бактерий только и изотип контроля позволило для оптимизации асссы, чтобы уменьшить связывание фоновых антител и точной количественной vLP привязанности к бактериям испытания. Высокое соотношение VLP:бактерии приводит к связыванию VLPs к большому проценту бактериальной популяции. Однако, когда количество VLP уменьшается, процент бактерий связаны также уменьшается. В конечном счете, этот метод может быть использован в будущих экспериментах выяснение конкретных условий и структурных компонентов, которые регулируют норовирус: бактериальные взаимодействия.

Introduction

Норовирусы человека (HuNoVs) являются ведущей причиной желудочно-кишечных заболеваний во всем мире, ответственных за 685 миллионов инфекций и более 200000 смертей каждый год1. Как и в случае с другими кишечными вирусами, присутствие комменсальных бактерий было показано для повышения инфекции этого патогена, а также его суррогатного вируса, норовирус минына2,3. Есть также противоречивые сообщения о том, что бактерии могут ингибировать инфекцию человека норовирус4,5,6. Для нескольких вирусов, прямое взаимодействие между вирусом и бактериями, как представляется, лежат в основе механизмов, которые влияют на вирусную инфекцию2,7,8,9,10, и было показано с помощью электронной микроскопии, что норовирусы человека связываются непосредственно на поверхности бактерий11,12. Таким образом, характеристика этих взаимодействий стала критической для определения механизмов, с помощью которых бактерии воздействия вирусной инфекции. Эта характеристика классически началась с количественной вирусной привязки к массиву бактериальных видов, которые являются компонентами микробиома-хозяина7,12,13. Эти исследования привязанности не только выявить количество вируса связаны с бактериями, но и помочь в определении воздействия этого взаимодействия на вирусные фитнес и выживание.

Для количественной оценки вирусного вложения, традиционно используемые методы включают ПЦР-анализы, которые количественно вирусных геномов12 или поколения радиоlabeled вируса и использование сцинтилляции подсчета для количественной оценки вирусных частиц7,8,9,13. Использование этих методов, как правило, требует доступа к высоким запасам вируса и методам культивирования in vitro, с помощью которых они генерируются. Хотя несколько систем культуры для человека норовирус в настоящее время существуют2,14,15, ни одна поддержка надежной репликации, необходимой для создания этих высококонцентрированных запасов, который ограничивает или исключает использование ПЦР и сцинтилляции подсчета для количественной оценки человека норовирус / бактериальные взаимодействия.

Чтобы обойти эту проблему, вирусоподобные частицы (VLPs) могут быть использованы в качестве суррогата живого вируса для исследования взаимодействий между норовирусом человека и бактериями16,17. ВЛП являются неинфекционными частицами, которые очень похожи на вирус, из которого они получены. В случае норовируса человека эти частицы генерируются из экспрессии белка VP1 (и когда-то VP2), который самостоятельно собирается для создания нетронутых вирусных капсидов, не обладающих генетическим материалом (т.е. РНК для норовирусов). Эти VLPs были хорошо охарактеризованы, структурно и антигенно похожи на вирусы дикого типа, из которых они выведены18,19,20,21,22,23. Таким образом, VLPs служить в качестве идеального суррогата для исследования поверхностных взаимодействий между норовирусом человека и commensal бактерий. Учитывая, что VLPs не хватает генетического материала, ПЦР-анализы не могут быть использованы для количественной оценки вирусной связывания. Метод цитометрии на основе антител был описан ранее и способен обнаружить низкие уровни связывания VLP с бактериями в полуколичественной манере16. Этот метод был оптимизирован для обеспечения точной количественной оценки связывания норовируса человека VLP как для грамотрицательных, так и для грамотрицательных комменсальных бактерий16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Условия роста бактерий, изложенные в протоколе, являются стандартными условиями культуры для Enterobacter cloacae и Lactobacillus gasseri. Для выполнения вируса: бактерии привязанности асссе с другими бактериальными видами, выбранные бактерии должны быть культивированы в стандартных условиях, подходящих для бактерии.

1. Подготовка Бактериального роста Средний

  1. Enterobacter cloacae рост средств массовой информации
    1. Подготовка жидкой среды путем растворения 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта и 10 г хлорида натрия (NaCl) в 1 л деионизированной (DI) воды (см. Таблица материалов). Тщательно смешайте все носители и стерилизуйте путем автоклавирования в течение 30 мин.
    2. Подготовка твердой среде, растворяя 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl и 15 г агара в 1 l воды DI. Тщательно смешайте все носители и стерилизуйте путем автоклавирования в течение 30 мин.
  2. Lactobacillus gasseri рост сми
    1. Подготовка жидкой среды путем растворения 55 г Де Ман, Rogosa и Шарп (MRS; см. Таблица материалов) порошок в 1 L воды DI. Используйте среду в течение одного месяца после приготовления. Для стерилизации, тепла среды в течение 15 минут до кипения с последующим autoclaving в течение 15 мин.
    2. Подготовка твердой среде путем растворения 55 г порошка MRS и 15 г агара в 1 л воды DI. Для стерилизации, тепла среды в течение 15 минут до кипения с последующим autoclaving в течение 15 мин.

2. Создание стандартной кривой, коррелирующих оптической плотности (OD) и концентрации бактерий

  1. Прививать 5 мл соответствующей жидкой среды с одной изолированной колонией из агаровой пластины(E. cloacae)или непосредственно из замороженного бульона глицерола(L. gasseri).
  2. Выращивайте бактерию на ночь, при надлежащих атмосферных условиях(Enterobacter cloacae: 37 градусов по Цельсию с аэробной тряской при 200 об/мин; L. gasseri: водяная ванна 37 градусов без тряски в герметичном контейнере).
  3. Передача 2 х 1,3 мл aliquots ночной культуры в две отдельные 1,5 мл центрифуговых труб и центрифуг бактерий на 10000 х г в течение 5 мин.
  4. Удалите супернатант и промыть образцы с 1 мл стерильного 1x фосфата буферного солей (PBS). Повторите этот шаг мытья в общей сложности 2 моет.
  5. Centrifuge образцы снова на 10000 х г в течение 5 мин, удалить супернатант и resuspend в 1,3 мл стерильных 1x PBS.
  6. Начиная с 0,5 мл промытой культуры, последовательно разбавляют бактерии в 1x PBS от 10-1 до 10-4 .
  7. Используя спектрофотометр, измерьте оптическую плотность промытой, неразбавленной культуры и каждого из четырех разбавлений на уровне 600 нм (OD600).
  8. Выполните 10-кратное серийное разбавление в 1x PBS для каждого разбавления от шага 2.6. Распространение пластины 100 л последних 3 разбавлений для каждой серии на соответствующую твердую среду, чтобы определить количество колоний формирования единиц на миллилитр (CFU/mL) каждого образца. Плита каждого разбавления в тройной.
  9. Разрешить пластины высохнуть при комнатной температуре в течение 5 мин. Инвертировать пластины и инкубировать в соответствующих атмосферных условиях (E. cloacae: аэробные при температуре 37 градусов по Цельсию, инкубировать пластины на ночь; L. gasseri: анаэробные при 37 градусах Цельсия, инкубируют пластины на 48 ч в герметичном контейнере с анеробными воздушными пакетиками (см. Таблица Материалов).).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 1 анаэробный воздушный пакетик на 2,5 л банку или 3 пакетика на 7,0 л банку (см. Таблица материалов).
  10. Используйте количество пластин для определения CFU/mL для каждого из 5 образцов (т.е. неразбавленных, 10-1,10-2,10-3, 10-4). Создайте стандартную кривую, сравнивая OD600 против CFU/mL. Уравнение для этой линии будет использоваться в VLP-бактерий вложения анализы для определения CFU / mL на основе OD600.

3. VLP-бактерии Присоединения Ассай

ВНИМАНИЕ: Норовирусные VLPs человека являются биобезопасности уровня (BSL)-2 опасности и все работы с участием VLPs должны быть выполнены в кабинете биобезопасности. Подготовка бактериальных культур, до проведения асссея, должна осуществляться с использованием условий безопасности, подходящих для организма.

  1. Подготовка реагента
    1. 1x фосфат буферного солья (PBS)
      1. Подготовьте 1 l 10x PBS путем растворять весь пакет в 1 L воды DI.
      2. Раствор автоклава на 30 мин.
      3. Подготовьте раствор 1x, разбавив вышеуказанный раствор 1:10 в воде DI.
      4. Фильтр стерилизовать раствор, пройдя его через фильтр 0,22 мкм и хранить при комнатной температуре.
    2. 5% BSA
      1. Добавьте 5 г крупного сыворотоки(BSA) порошка в 100 мл PBS для создания 5% (w/v) раствора.
      2. Смешайте раствор путем вихря или на тарелке перемешать с помощью металлического перемешать бар, пока сгустки не растворяются.
      3. Фильтр стерилизовать с помощью фильтра 0,22 мкм.
      4. Храните раствор при 4 градусах По Цельсию.
    3. Буфер цитометрии потока (FCSB)
      1. Фильтр приобрел FCSB (см. Таблица материалов) через фильтр 0,22 мкм.
      2. Храните оставшийся раствор при 4 градусах По Цельсию.
    4. 5% Блокирующий буфер (BB)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте свежие каждый раз.
      1. Добавьте 0,5 г BSA к 10 мл стерильного FCSB.
      2. Вихрь полностью смешать образец и оставить на льду до использования.
  2. Спряжение антител
    1. Спрягать человеческие норовирусные антитела GII (см. Таблица материалов)с r-phycoerythrin (PE) с помощью комплекта маркировки антител R-PE в инструкции производителя (см. Таблица материалов).
    2. Храните конъюгированные антитела в темноте при 4 градусах по Цельсию для дальнейшего использования в анализе анализа анализа вложений VLP-бактерии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Первичное антитело должно быть titrated до использования в VLP-бактерий вложения анализа для определения надлежащей концентрации, необходимой для анализа цитометрии потока. Титрование антител должно выполняться каждый раз, когда выполняется реакция спряжения и для каждой бактерии, используемой в обзоре привязанности.
  3. Титрование антител
    1. Разбавить конъюгированный античеловеческий норовирус ГИИ антитела 100 раз, с началом разбавления 1:100 и окончание разбавления 1:600 (шесть разбавлений в общей сложности).
    2. Выполните вирус вложения асссея, как описано ниже, за следующим исключением: в шаге 3.5.7 resuspend бактериальных гранул в 350 зл/ 5% BB.
    3. Разделите образец на семь айквотов на 50 qL.
    4. Добавьте 50 зл каждого разбавления антител в одну трубку.
    5. Добавьте 50 кЛ 5% BB к седьмой трубке в качестве неокрашенного контроля.
    6. Выполните цитометрию потока на всех образцах, как описано ниже.
    7. Сравните разбавленные образцы антител с неокрашенными элементами управления и друг с другом. Самая низкая концентрация антител, которая не приводит к снижению или потере положительного сигнала, должна быть выбрана для использования в последующих анализах.
  4. Подготовка бактерий
    1. Выращивайте бактерии в 40 мл соответствующей жидкой среды при соответствующих атмосферных условиях до тех пор, пока бактерии не находятся в стационарной фазе.
      1. Расти E. cloacae культур аэробно ночь в Лурия Бульон при 37 градусов по Цельсию, встряхивая на 200 об/ ч для достижения стационарной фазы.
      2. Выращивайте культуры L. gasseri в бульоне MRS в черных трубках крышки винта без тряски в водяной бане, установленной до 37 градусов по Цельсию в течение 18 ч, чтобы достичь стационарной фазы.
    2. Передача стационарных культур фазы для очистки 50 мл конических труб и центрифуг образцов на 2288 х г в течение 10 минут, чтобы гранулы бактерий.
    3. Удалите супернатант и повторно в 13 мл стерильных 1x PBS. Повторите этот шаг стирки в общей сложности два моет.
    4. Центрифуг образцы снова, удалить супернатант и resuspend образцов в 20 мл 1x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если клеточные гранулы небольшие, объем повторного действия может быть уменьшен.
    5. Измерьте OD600 культуры.
    6. Используя ранее подготовленную стандартную кривую, определите CFU на мл вымытой культуры.
    7. Разбавить бактерии по мере необходимости с 1x PBS, чтобы настроить концентрацию культуры до 1 х 108 CFU/mL.
    8. Передача 1 мл бактериальной культуры 1 x 108 CFU/mL на требуемое количество центрифуг ных труб 1,5 мл.
    9. Центрифуга труб на 10000 х г в течение 5 мин.
    10. Приостановить бактериальные гранулы в 1 мл стерильных 5% BSA.
    11. Инкубировать трубки в течение 1 ч при 37 градусах Цельсия при постоянном вращении.
  5. Вирусное вложение
    1. Работая внутри BSL-2 биобезопасности шкаф, добавить 10 мкг HuNoV VLPs (см. Таблица материалов) к каждой трубке, содержащей бактерии resuspended в PBS и тщательно перемешать путем пипеттинг.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация VLP отличается с каждым препаратом VLP. Таким образом, объем, добавленный в бактерии будет варьироваться между пакетами подготовки и должны быть скорректированы соответствующим образом, так что 10 мкг добавляется к каждой трубке в эксперименте. Для бактерий только контроль (например, образцы без VLP), добавить объем PBS, что равняется объему VLP добавил к экспериментальным образцам.
    2. Инкубировать трубки на 1 ч при 37 градусах Цельсия при постоянном вращении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Трубчатый револьвер (см. Таблица Материалов)установлен до 40 об/мин используется во время инкубации.
    3. После инкубации центрифуги образцы на 10000 х г в течение 5 мин.
    4. Откажитесь от супернатанта и отдохните бактериальные гранулы в 1 мл PBS.
    5. Повторите шаги мытья 3.5.3 и 3.5.4.
    6. Центрифуг и образцы при 10 000 х г в течение 5 мин.
    7. Откажитесь от супернатанта и отдохните бактериальные гранулы в 150 зл от 5% BB.
  6. Окрашивание антител
    1. Приготовьте свежий 5% BB.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все работы с использованием флуоресцентно помеченных антитела должны быть выполнены в темноте и антитела, BB и FCSB должны быть сохранены на льду.
    2. Разбавить антитела человека норовирусом ГИИ 1:125 для образцов E. cloacae и 1:150 для образцов L. gasseri в 5% BB, готовя 50 л разбавленных антител в образец.
    3. Разбавить антитела изотипа так же, как антитела человека норовирус ГИИ был разбавлен для каждой бактерии в 5% BB, готовя 50 зл разбавленного контроля изоттипа в образе.
    4. Разделите каждый образец анализа вложений с шага 3.3.7 на три 50 аликотов, передавая их в чистые 1,5 мл центрифуговых труб.
    5. К первому набору образцов добавьте 50 кЛ BB. Этот набор будет неокрашенным (Uns) управления.
    6. Ко второму набору добавьте 50 зл антител ГИИ. Это приводит к окончательной концентрации антител 1:250 для E. cloacae и 1:300 для L. gasseri. Этот набор образцов будет окрашенных (AB) образцов.
    7. К третьему набору добавьте 50 зл разбавленных изотипов антитела. Этот набор будет изотип управления (IC). Хорошо перемешать путем пипетки. Инкубировать образцы на льду и в темноте в течение 30 мин.
    8. Центрифуга все образцы на 10000 х г в течение 5 мин.
    9. Откажитесь от супернатанта и приостановите пробы в 100 кЛ FCSB.
    10. Centrifuge все образцы на 10000 х г в течение 5 мин. Отбросить супернатант и resuspend образцы в 100 Зл FCSB.
    11. Центрифуга все образцы на 10000 х г в течение 5 мин.
    12. Откажитесь от супернатанта и приостановите работу образцов в 150 кЛ FCSB.
    13. Перенесите каждый образец в трубку FCSB, содержащую 400 qL буфера FCSB общим объемом 550 зл.
    14. Храните образцы при 4 градусах Цельсия, пока они не будут проанализированы цитометрией потока.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поток цитометрии выполняется в течение 4 ч антител окрашивания.

4. Цитометрия потока

ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры напряжения, описанные ниже, основаны на цитометре потока и программном обеспечении, перечисленных в таблице материалов, и, скорее всего, будут варьироваться с различными цитометрами потока. Настройки должны быть оптимизированы для каждой бактерии. Убедитесь, что оси для всех графиков находятся в двухэкспопонциальной фазе.

  1. Настройка рабочего пространства
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка для участков, используемых для создания рабочей области, отличается от тех, которые используются при анализе гатинга и данных. Цель создания рабочего пространства состоит в том, чтобы визуализировать популяцию клеток, обеспечить отсутствие чрезмерного слипания бактериальных клеток, которые могут повлиять на анализ вниз по течению, и различать окрашенные и неокрашенные клетки во время сбора данных.
    1. Для того, чтобы бактерии не слипаются вместе, создать ряд плоти участков.
      1. Создание области переднего рассеяния (FSC-A) по сравнению с областью бокового рассеяния (SSC-A) для визуализации общей популяции.
      2. Настройка участков для оценки одиночных ячеек по сравнению с ячейками, создав два графика, которые сравнивают как вперед (FSC-W), так и ширину бокового рассеяния (SSC-W) для переадресова (FSC-H) и высоты бокового рассеяния (SSC-H), соответственно.
      3. Создайте участок, который показывает только положительную популяцию PE (PE-A против SSC-A).
    2. Установите базовое напряжение до 500 для E. cloacae и 340 для L. gasseri. Они будут дополнительно скорректированы позже.
    3. Установите общее количество событий, подсчитанных до 10 000 событий.
  2. Запуск образцов
    1. Создайте три отдельных гистограммы, которые показывают количество, построенное против SSC-A, FSC-A или PE-A.
    2. Поместите неокрашенный образец на цитометр потока и приобретете образец событий, гарантируя, что максимальный пик на гистограмме для SSC-A находится в пределах 102 до 103, а максимальный пик на гистограмме для FSC-A составляет от 104 до 105 на оси x. Если нет, пики не подпадают под указанные диапазоны, соответствующим образом отрегулируйте напряжение FSC и SSC.
    3. Поместите окрашенные образца (AB) на цитометр потока и настроить напряжение PE, чтобы сделать максимальный пик последние 103 на оси x.
    4. На основе этих измерений установите положительные ворота PE и установите ворота на графике плотности PE-A.
    5. Выполнить все образцы в определенных настройках на низкой или средней скорости.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Стратегии gating, используемые для количественной оценки связывания норовируса человека VLP для комменсальных бактерий, показаны на рисунке 1. Представитель плотности точка обеспечивает обзор того, как образцы были закрыты для устранения клеточного мусора и клеточных скоплений так VLP вложение было определено на синглетных популяций (Рисунок 1A). Представитель гистограммы демонстрируют низкий уровень антиновирусного сигнала антител в бактериях только образцы не хватает норовируса VLP и низкий фоновый сигнал VLP-бактерий образцов окрашенных антителами контроля изотипа(Рисунок 1B). Пики контроля изотипа также перекрываются с неокрашенными образцами, в то время как окрашивание одних и тех же образцов античеловеческими норовирусами GII приводит к значительному сдвигу в пике.

Метод вычитания гистограммы Овертона был использован для сравнения PE-положительного сигнала в античеловеческом норовирусе GII антител окрашенных образцов pe-положительный сигнал соответствующего контроля изотитипа и определить процент бактериальной популяции связаны человека норовирус VLPs(Рисунок 1B). После 1 ч инкубации с 10 мкг VLP, поток цитометрии обнаружены частицы связывания как E. cloacae и L. gasseri (Рисунок 2). В самом деле, высокий уровень связывания произошло в этих условиях для обеих бактерий; связывание с L. gasseri произошло при несколько более высоких, но значительных (p qlt; 0.0001), уровнях по сравнению с E. cloacae. Эти анализы показывают, что цитометрия потока может быть использована для обнаружения норовируса человека, связывающего как с грамположительных, так и с грамотрицательных бактерий.

Для определения предела обязательной количественной оценки для этого исследования, разбавления серии VLPs был создан до добавления к бактериям (Рисунок 3). Для обоих родов бактерий, сокращение количества VLP добавил к бактериальной культуры привело к соответствующим сокращениям в процентах бактерий, связанных VLP. Изменения в процентах E. cloacae связаны частицей были более постепенными по сравнению с L. gasseri, но процент вложения для обеих бактерий выровняли, несмотря на дальнейшее снижение концентрации VLP. В частности, 0,1 мкг или менее (данные не показаны) VLP в 108 CFU бактерий привело к плато процентов вложения в среднем между 13-19% для обеих бактерий, указывая, что этот процент является пределом количественной оценки для этого анализа.

Figure 1
Рисунок 1: Представитель потока цитометрического анализа человека норовирус VLP связывания. (A) Представитель потока цитометрии gating стратегии количественно VLP связывания с бактериями. Плотность участков были использованы для выхода из клеточного мусора, а затем последующие точки сюжет gating для удаления бактериальных дублетов и клеточных сгустков. (B) Представитель гистограммы демонстрируют отсутствие сигнала PE в бактериальных только образцы и сдвиг в интенсивности сигнала PE в VLP: бактерии образцов по сравнению с неокрашенными и изотип контроля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Вложение VLP к E. cloacae и L. gasseri. Ночные культуры E. cloacae (n No 6) и L. gasseri (n no 6) были разбавлены до 1 х 108 CFU/mL в PBS. Бактерии были инкубированы с 10 мкг GII.4 VLPs для 1 ч, то Вложение VLP был измерен с помощью цитометрии потока. Представительный участок можно найти на рисунке 1B. Процентное вложение было определено с помощью метода вычитания гистограммы Овертона, сравнивая PE-положительный сигнал норовирусных образцов ГИИ человека с PE-положительным сигналом соответствующего контроля изотипа. Статистический анализ был выполнен с помощью непарного студенческая t-test (p qlt; 0.0001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Серия разбавления VLP для E. cloacae и L. gasseri. 10 мкг GiI.4 VLPs был последовательно разбавлен и VLP разбавления были добавлены к 1 х 108 бактерий в окончательном объеме 1 мл (n no 3 для обеих бактерий). Образцы инкубировали в течение одного часа при 37 градусах Цельсия. VLP привязанность к бактериям была измерена с помощью цитометрии потока. Процентное вложение было определено с помощью метода вычитания гистограммы Овертона, сравнивая PE-положительный сигнал норовирусных образцов ГИИ человека с PE-положительным сигналом соответствующего контроля изотипа. Сокращение входных количеств VLP привело к поэтапному сокращению процентных вложений для обоих (A) E. cloacae и (B) L. gasseri. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Способность количественно связывать энтерические вирусы с бактериями является важным первым шагом для выяснения механизмов, с помощью которых эти бактерии изменяют вирусную инфекцию. Методы, описанные в настоящем случае, были оптимизированы для измерения взаимодействия норовируса VLP человека как с E. cloacae (грам-отрицательная бактерия) и L. gasseri (грамположительные бактерии), но могут быть адаптированы для использования с любым млекопитающим вирусом и бактерией, представляющих интерес. Хотя VLPs являются идеальной альтернативой живой вирус для использования в приложения хассы и эти частицы могут быть легко количественно с помощью цитометрии потока, P частицы также были использованы для изучения взаимодействия между человеческими норовирусами и бактериями24. В этом исследовании, количество вируса, связанного с бактериями была количественно, в отличие от бактериальной популяции, как сообщается здесь. Частицы P обеспечивают преимущество перед VLPs в том, что они легче производить, обеспечивая антигенное сходство как для VLPs, так и с вирусом дикого типа24,25. Тем не менее, норовирусные VLPs человека являются коммерчески доступными, предоставляя средства для лабораторий, не обладающих возможностями для генерации VLPs или P частиц. Частицы P отличаются от VLPs тем, что, в то время как VLPs поддерживают размер вирусной частицы дикого типа, частицы P меньше и имеют тетраэдрал, а не icosahedral симметрии25. Влияние этих характеристик на взаимодействие с бактериями не были изучены и P частиц может служить в качестве жизнеспособной альтернативы VLPs в характеристике поверхностных взаимодействий между норовирусом человека и бактериями.

Как упоминалось ранее, освоенное выше, может быть использовано для дальнейшей характеристики взаимодействия между норовирусами человека VLPs и бактериями. Исследования того, как условия роста и изменения в бактериальной поверхностной структуры экспрессии изменить вирусной связывания могут быть изучены с помощью этого метода. Кроме того, этот анализ может также использоваться для определения конкретных бактериальных структур, связанных вирусом через конкурентные ингибирующие анализы с использованием бактериальных белков или гликанов, ферментативное лечение для удаления конкретных поверхностных структур, или инкубации с мутантными бактериальными штаммами, дефицитными, в частности, структурой. Этот ассс также может быть использован для исследования способности других штаммов норовируса взаимодействовать с сопутствующими бактериями.

Поскольку этот опрос определяет долю бактериальной популяции, связанной норовирусом VLP, очень важно точно определить корреляцию между CFU/mL и OD600, чтобы можно было измерить концентрацию бактериальной культуры. Колебания в vLP: бактерии соотношение изменяет процент популяции бактерий связаны VLPs и может привести к изменчивости в результатах. Следует также позаботиться о добавлении достаточного количества вирусных частиц, так как предел обнаружения этого исследования приближается к 0,1 мкг VLP/108 CFU бактерий. Коэффициенты ниже этого предела стабильно давали процентные значения вложения 13-19%; таким образом наблюдаемая привязанность населения на уровне или ниже этих процентных ставок может быть нереальной.

Антитела титрования были выполнены для каждого вновь конъюгированных антител и против каждого бактериального штамма до использования в VLP: бактерии вложения экспериментов. Концентрации антител, необходимые для каждой бактерии были похожи, начиная от 1:250 для E. cloacae и 1:300 для L. gasseri. Небольшой размер бактерий, относительно размера эукариотических клеток, требует как корректировки напряжения, так и использования биномиального распределения во время сбора данных, чтобы адекватно отделить бактерии от мусора, которые могут быть найдены в образцах или циркулирующих в инструменте. После сбора данных, надлежащее gating может быть использован для дальнейшего удаления крупных частиц мусора и бактериальных скоплений, так что только отдельные популяции клеток анализируются. Также важно установить уникальные настройки напряжения для каждого проверенного бактериального вида, поскольку они сильно колеблются, особенно между грамотрицательными и грамотрицательными бактериями.

Включение надлежащего контроля, включая только бактерии и изотипные элементы управления, также имеет решающее значение для точного анализа данных. Оба типа контроля информируют об уровнях неспецифической связывания антител. Наши результаты показывают, что антитела, используемые для не связывают не специально для бактериальных видов испытания, но неспецифические связывания может измениться с изменениями в бактериальных видов или антител.

Представленный здесь метод количественно определяет связывание частиц норовируса человека как с грамотрицательными, так и с грамотрицательными бактериями и полезен для характеристики вируса: бактериальных взаимодействий. Кроме того, этот базовый протокол может быть легко оптимизирован для использования с другими генотипами норовируса человека, а также другими вирусами и бактериями млекопитающих.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить Сутонуку Бхар и Шанель Мосби-Хаундруп за критический обзор письменной рукописи, а также Альфонсо Каррильо за помощь в создании кривых бактериальных стандартов. Эта работа частично финансируется за счет гранта Национального института здравоохранения (R21AI140012) и гранта на семена от Университета Флориды, Института пищевых и сельскохозяйственных наук.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap Corning 352235 After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis.
Agar Sigma A7002 Used for media preparation
AnaeroPack Thermo Scientific R681001 Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri
BD FacsDiva software
BD LSR Fortessa flow cytometer
Bovine Serum Albumin Fisher Bioreagents BP1605 Used for flow cytometry
Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB) BD Biosciences 554657 Used for flow cytometry
Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience Thermo Fisher Scientific 12473281 Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer.
MRS Powder BD Biosciences 288130 Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri.
Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D) Thermo Fisher Scientific MA5-18241 Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher.
Norovirus GII.4 VLP Creative Biostructure CBS-V700 human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays.
PBS 10X Fisher Bioreagents BP665 Dilute to 1X prior to use.
SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit Thermo Fisher Scientific S10467 Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody.
Sodium Chloride Fisher Scientific S271 Used for media preparation
Tryptone Oxoid LP0042 Used for media preparation
Tube Revolver ThermoFisher Scientific 88881001 Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm).
Yeast Extract BD Biosciences 212750 Used for media preparation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention. Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).
  2. Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346 (6210), 755-759 (2014).
  3. Baldridge, M. T., et al. Commensal microbes and interferon-lambda determine persistence of enteric murine norovirus infection. Science. 347 (6219), 266-269 (2015).
  4. Lei, S., et al. Enterobacter cloacae inhibits human norovirus infectivity in gnotobiotic pigs. Scientific reports. 6, 25017 (2016).
  5. Lei, S., et al. High Protective Efficacy of Probiotics and Rice Bran against Human Norovirus Infection and Diarrhea in Gnotobiotic Pigs. Frontiers in Microbiology. 7, 1699 (2016).
  6. Rodríguez-Díaz, J., et al. Relevance of secretor status genotype and microbiota composition in susceptibility to rotavirus and norovirus infections in humans. Scientific Reports. 7, 45559 (2017).
  7. Erickson, A. K., et al. Bacteria Facilitate Enteric Virus Co-infection of Mammalian Cells and Promote Genetic Recombination. Cell Host Microbe. 23 (1), 77-88 (2018).
  8. Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. Science. 334 (6053), 249-252 (2011).
  9. Robinson, C. M., Jesudhasan, P. R., Pfeiffer, J. K. Bacterial lipopolysaccharide binding enhances virion stability and promotes environmental fitness of an enteric virus. Cell Host Microbe. 15 (1), 36-46 (2014).
  10. Berger, A. K., Yi, H., Kearns, D. B., Mainou, B. A. Bacteria and bacterial envelope components enhance mammalian reovirus thermostability. PLOS Pathogens. 13 (12), 1006768 (2017).
  11. Miura, T., et al. Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses. Journal of Virology. 87 (17), 9441-9451 (2013).
  12. Almand, E. A., Moore, M. D., Outlaw, J., Jaykus, L. A. Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota. PLOS One. 12 (3), (2017).
  13. Robinson, C. M., Woods Acevedo, M. A., McCune, B. T., Pfeiffer, J. K. Related enteric viruses have different requirements for host microbiota in mice. Journal of Virology. , (2019).
  14. Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
  15. Van Dycke, J., et al. A robust human norovirus replication model in zebrafish larvae. PLOS Pathogens. 15 (9), 1008009 (2019).
  16. Li, D., Breiman, A., le Pendu, J., Uyttendaele, M. Binding to histo-blood group antigen-expressing bacteria protects human norovirus from acute heat stress. Frontiers in Microbiology. 6, 659 (2015).
  17. Almand, E. A., Moore, M. D., Jaykus, L. -A. Characterization of human norovirus binding to gut-associated bacterial ligands. BMC Research Notes. 12 (1), 607 (2019).
  18. Debbink, K., et al. Within-host evolution results in antigenically distinct GII.4 noroviruses. Journal of Virology. 88 (13), 7244-7255 (2014).
  19. Harrington, P. R., Lindesmith, L., Yount, B., Moe, C. L., Baric, R. S. Binding of Norwalk virus-like particles to ABH histo-blood group antigens is blocked by antisera from infected human volunteers or experimentally vaccinated mice. Journal of Virology. 76 (23), 12335-12343 (2002).
  20. Harrington, P. R., Vinje, J., Moe, C. L., Baric, R. S. Norovirus capture with histo-blood group antigens reveals novel virus-ligand interactions. Journal of Virology. 78 (6), 3035-3045 (2004).
  21. Mallory, M. L., Lindesmith, L. C., Graham, R. L., Baric, R. S. GII.4 Human Norovirus: Surveying the Antigenic Landscape. Viruses. 11 (2), (2019).
  22. Prasad, B. V., et al. X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid. Science. 286 (5438), New York, N.Y. 287-290 (1999).
  23. Baric, R. S., et al. Expression and self-assembly of norwalk virus capsid protein from venezuelan equine encephalitis virus replicons. Journal of Virology. 76 (6), 3023-3030 (2002).
  24. Rubio-del-Campo, A., et al. Noroviral p-particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics. PLOS One. 9 (2), 89586 (2014).
  25. Tan, M., et al. Terminal modifications of norovirus P domain resulted in a new type of subviral particles, the small P particles. Virology. 410 (2), 345-352 (2011).

Tags

Иммунология и инфекция Выпуск 158 Норовирус человека кишечные вирусно-бактериальные взаимодействия сопутствующие бактерии количественная оценка норовируса человека обнаружение норовируса человека привязанность вирусов-бактерий
Количественная оценка норовируса человека, как частицы, связывающиеся с commensal бактерий использованием потока цитометрии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Madrigal, J. L., Jones, M. K.… More

Madrigal, J. L., Jones, M. K. Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (158), e61048, doi:10.3791/61048 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter