Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Akış Sitometrikullanarak Commensal Bakterilere Bağlanan İnsan Norovirüs Benzeri Partiküllerin Ölçülmesi

Published: April 29, 2020 doi: 10.3791/61048
Automatic Translation
1, 1
1Microbiology and Cell Science Department, University of Florida

Summary

Bu protokolün amacı ökaryotik patojen insan norovirüsünün bakterilere bağlanmasını ölçmektir. İlk virüs-bakteri eki testi yaptıktan sonra, akış sitometrisi popülasyon içinde viral bağlı bakterileri tespit etmek için kullanılır.

Abstract

Kommensal bakteriler ökaryotik virüslerin enfeksiyonunu etkilemek için iyi kurulmuştur. Patojen ve konak mikrobiyom arasında doğrudan bağlanma bu virüslerin çoğu için enfeksiyon değiştirme sorumludur. Bu nedenle, virüs-bakteri bağlanmasının doğası nın karakterize ilerlediği, bakterilerin viral enfeksiyonu değiştirdiği mekanizmanın (lar) aydınlatılabilmek için gerekli temel bir adımdır. Insan norovirüs için, kommensal bakteriler B hücre enfeksiyonu geliştirmek. Virüs doğrudan bu bakterilere bağlanır, bu doğrudan etkileşim enfeksiyon geliştirme mekanizması nda yer aldığını gösteren. Radyoetiketli virüslerin sinilasyon sayımı ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) dahil olmak üzere bakteri ve virüsler arasındaki etkileşimleri ölçmek için çeşitli teknikler kullanılabilir. Her iki yöntem de laboratuvarda oluşturulması gerekebilir canlı virüs, kullanımını gerektirir. Şu anda, insan norovirüs için mevcut kurulan in vitro kültür sistemlerinin hiçbiri son derece konsantre viral stokların üretimi için izin vermek için yeterince sağlam. Canlı virüs yerine, virüs benzeri parçacıklar (VLPs) norovirüs ve bakteri arasındaki etkileşimleri karakterize etmek için kullanılmıştır. Burada bir akış sitometri yöntemi gram-negatif ve gram-pozitif bakterilere VLP bağlayıcı ölçmek için virüs özgü antikorlar kullanır ile açıklanmıştır. Sadece bakterilerin ve izotip kontrollerinin dahil edilmesi, arka plan antikor bağlanmasını ve TEST EDILEN bakterilere VLP ekinin doğru nicelemeyi azaltmak için tahminin optimizasyonuna izin ver. Yüksek VLP:bakteri oranları VLP'lerin bakteri popülasyonunun büyük yüzdelerine bağlanmasına neden olur. Ancak, VLP miktarları azaldığında, bakterilerin yüzde bağlı da azalır. Sonuç olarak, bu yöntem norovirüs düzenleyen belirli koşulları ve yapısal bileşenleri açıklığa kavuşturan gelecekteki deneylerde kullanılabilir: bakteri etkileşimleri.

Introduction

İnsan norovirüsler (HuNoVs) gastrointestinal hastalığın dünya çapında önde gelen nedeni, 685 milyon enfeksiyonlar ve 200.000 üzerinde ölümher yıl1sorumlu. Diğer enterik virüsler gibi, kommensal bakterilerin varlığı bu patojen enfeksiyonu geliştirmek için gösterilmiştir yanı sıra onun vekil virüs, murine norovirus2,3. Ayrıca bakterilerin insan norovirüs4,5,5,6tarafından enfeksiyonu inhibe edebilir çelişkili raporlar vardır. Çeşitli virüsler için, virüs ve bakteriler arasındaki doğrudan etkileşim viral enfeksiyon etkileyen mekanizmaların altında yatan görünür2,7,8,9,10, ve insan norovirüsler bakterilerin yüzeylerine doğrudan bağlamak elektron mikroskopisi ile gösterilmiştir11,12. Bu nedenle, bu etkileşimleri karakterize hangi bakteri viral enfeksiyon etkisi mekanizmaları belirlemek için kritik hale gelmiştir. Bu karakterizasyon klasik konak mikrobiyombileşenleriolan bakteri türlerinin bir dizi viral bağlayıcı niceleme ile başladı7 ,12,13. Bu eki tahliller sadece bakteri bağlı virüs miktarını ortaya çıkarmak değil, aynı zamanda viral fitness ve hayatta kalma bu etkileşimin etkisini belirlemede yardımcı.

Viral eki ölçmek için, geleneksel olarak kullanılan yöntemler viral genomlar ölçmek PCR tabanlı tahliller içerir12 veya radyoetiketli virüs üretimi ve viral parçacıklar ölçmek için sintillation sayma kullanımı7,8,9,13. Bu yöntemlerin kullanımı genellikle yüksek titer virüs stokları ve bunları oluşturmak için in vitro ekim teknikleri erişim gerektirir. İnsan norovirüs için çeşitli kültür sistemleri şimdi var iken2,14,15, hiçbiri kısıtlar veya pcr ve sintillation kullanımını ortadan kaldırır bu son derece konsantre stokları oluşturmak için gerekli sağlam çoğaltma desteği insan norovirüs / bakteriyel etkileşimleri ölçmek için sayma.

Bu sorunu aşmak için, virüs benzeri parçacıklar (VLPs) insan norovirüs ve bakteri arasındaki etkileşimleri araştırmak için virüs yaşamak için bir vekil olarak kullanılabilir16,17. VLP'ler, türetildiği virüse yakından benzeyen enfeksiyöz olmayan parçacıklardır. İnsan norovirüs durumunda, bu parçacıklar VP1 (ve bazen VP2) protein, kendi kendine genetik malzeme (yani, Noroviruses için RNA) eksik bozulmamış viral kapsidler oluşturmak için monte ifadesi oluşturulur. Bu VLP'ler iyi karakterize edilmiştir, yapısal ve antijektolojik olarak onlar türetilmiştir hangi vahşi tip virüsler benzer18,19,20,21,22,23. Bu nedenle, VLPs insan norovirüs ve kommensal bakteriler arasındaki yüzey etkileşimleri araştırmak için ideal bir vekil olarak hizmet vermektedir. VLP'lerin genetik materyalden yoksun olduğu göz önüne alındığında, PCR tabanlı testler viral bağlanmayı ölçmek için kullanılamaz. Antikor bazlı akış sitometri yöntemi daha önce tanımlanmış ve yarı-nicel bir şekilde bakterilere bağlama VLP bağlama düşük seviyelerde tespit edebiliyoruz16. Bu yöntem, hem gram-negatif hem de gram-pozitif kommensal bakterilere bağlanan insan norovirüs VLP'nin doğru nicelemesi için optimize edilerek optimize edildi16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: Protokolde belirtilen bakteriyel büyüme koşulları Enterobacter cloacae ve Lactobacillus gasseriiçin standart kültür koşullarıdır. Virüsün diğer bakteri türleri ile bakteri eki testi gerçekleştirmek için, seçilen bakteriler bakteri için uygun standart koşullar altında kültürlü olmalıdır.

1. Bakteriyel Büyüme Ortamının Hazırlanması

  1. Enterobacter cloacae büyüme ortamı
    1. 10 g tripton, 5 g maya ekstresi ve 10 g sodyum klorür (NaCl) 1 L'lik de-iyonize (DI) suda eriterek sıvı ortamı hazırlayın (bkz. Malzemeler Tablosu). Tüm ortamları iyice karıştırın ve 30 dakika boyunca otoklavlayarak sterilize edin.
    2. 10 g tripton, 5 g maya özü, 10 g NaCl ve 1L DI suda 15 g agar eriterek katı ortam hazırlayın. Tüm ortamları iyice karıştırın ve 30 dakika boyunca otoklavlayarak sterilize edin.
  2. Lactobacillus gasseri büyüme ortamı
    1. De Man, Rogosa ve Sharpe 55 g eriterek sıvı orta hazırlayın (MRS; Malzeme Tablosubakınız) 1 L DI su tozu. Hazırlıktan sonraki bir ay içinde orta kullanın. Sterilize etmek için, kaynama ya da 15 dk otoklavlama kadar 15 dk için ısı orta.
    2. 55 g MRS tozu ve 1 L DI suda 15 g agar eriterek katı orta hazırlayın. Sterilize etmek için, kaynama ya da 15 dk otoklavlama kadar 15 dk için ısı orta.

2. Optik Yoğunluk (OD) ve Bakteri Konsantrasyonu Ile İlgili Standart Bir Eğri Oluşturulması

  1. Bir agar plaka(E. cloacae)veya doğrudan dondurulmuş gliserol stok(L. gasseri)tek, izole koloni ile uygun sıvı orta 5 mL aşılamak.
  2. Uygun atmosferik koşullar altında, bir gecede bakteri büyümek (Enterobacter cloacae: 37 °C aerobik sallayarak 200 rpm; L. gasseri: Hava geçirmez bir kapta titremeden 37 °C su banyosu).
  3. 2 x 1.3 mL gecelik kültürü iki ayrı 1.5 mL santrifüj tüpüne ve santrifüj bakterisine 10.000 x g 5 dakika aktarın.
  4. Supernatant'ı çıkarın ve 1 mL steril 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. Toplam 2 yıkama için bu yıkama adımını tekrarlayın.
  5. 5 dakika boyunca 10.000 x g'de numuneleri tekrar santrifüj edin, süpernatantı çıkarın ve 1,3 mL steril 1x PBS'de yeniden askıya alın.
  6. Yıkanmış kültürün 0,5 mL ile başlayarak, 10-1 ila 10 -4arasında 1x PBS bakteri seyreltmek.
  7. Bir spektrofotometre kullanarak, yıkanmış, seyreltilmemiş kültürün optik yoğunluğunu ve 600 nm 'deki dört seyreltmenin her birini ölçün (OD600).
  8. Adım 2.6 her seyreltme için 1x PBS 10 kat seri seyreltme gerçekleştirin. Her numunenin mililitre başına koloni oluşturan birim sayısını (CFU/mL) belirlemek için her seri için son 3 seyreltmenin 100°L'sini uygun katı ortama yayın. Plaka her seyreltme triplicate içinde.
  9. Plakaların oda sıcaklığında 5 dk. Uygun atmosferik koşullarda(E. cloacae: aerobik 37 °C, bir gecede inkübül plakaları) ters ve kuluçka yada kurumasını bekleyin; L. gasseri: 37 °C'de anaerobik, hava geçirmez bir kapta 48 saat boyunca anerobik hava poşetleri ile inkübasa plakaları (Bkz. Malzeme Tablosu).).
    NOT: 2,5 L kavanoz başına 1 anaerobik hava poşeti veya 7,0 L kavanoz başına 3 poşet kullanın (bkz. Malzemeler Tablosu).
  10. 5 numunenin her biri için CFU/mL'yi belirlemek için plaka sayılarını kullanın (yani, seyreltilmemiş, 10-1,10-2, 10-3, 10-4). OD600 ile CFU/mL karşılaştırması için standart bir eğri oluşturun. Bu çizginin denklemi VlP-bakteri eki tahlillerinde OD600'edayalı CFU/mL'yi belirlemek için kullanılacaktır.

3. VLP-bakteri Ek Teşp

DİkKAT: İnsan norovirüs VLP'leri biyogüvenlik seviyesidir (BSL)-2 tehlikesi vardır ve VLP'leri içeren tüm çalışmalar bir biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır. Ek tetkiklerinden önce bakteri kültürlerinin hazırlanması organizmaya uygun güvenlik koşulları kullanılarak yapılmalıdır.

  1. Reaktif hazırlama
    1. 1x fosfat tamponlu salin (PBS)
      1. 1 L DI suda bir paketin tamamını eriterek 1 L 10x PBS hazırlayın.
      2. 30 dk için otoklav çözeltisi.
      3. Yukarıdaki çözeltiyi 1:10'u DI suyunda seyrelterek 1x çözeltihazırlayın.
      4. Filtre, çözeltiyi 0,22 μm'lik bir filtreden geçirerek sterilize edin ve oda sıcaklığında saklayın.
    2. %5 BSA
      1. %5 (w/v) çözeltisi oluşturmak için 100 mL PBS'ye 5 g büyükbaş serum albumin (BSA) tozu ekleyin.
      2. Çözeltiyi girdap yaparak veya bir karıştırma plakası üzerinde metal bir karıştırma çubuğu kullanarak kümeler eriyene kadar karıştırın.
      3. Filtre 0,22 μm filtre kullanarak sterilize.
      4. Çözeltiyi 4 °C'de saklayın.
    3. Akış sitometri leke tampon (FCSB)
      1. Filtre 0,22 μm filtre ile fcsb satın aldı (Bkz. Malzeme Tablosu).
      2. Kalan çözeltiyi 4 °C'de saklayın.
    4. %5 Engelleme Tamponu (BB)
      NOT: Her seferinde taze hazırlayın.
      1. 10 mL steril FCSB'ye 0,5 g BSA ekleyin.
      2. Girdap tamamen örnek karıştırmak ve kullanıma kadar buz üzerinde bırakın.
  2. Antikor çekimi
    1. Konjuge insan norovirüs GII antikor (Malzeme Tablosubakınız) r-phycoerythrin ile (PE) üreticinin talimatlarına göre bir R-PE antikor etiketleme kiti kullanarak (Malzeme Tablosubakınız).
    2. VLP-bakteri eki tahlil analizinde ileride kullanılmak üzere konjuge antikorları karanlıkta 4 °C'de saklayın.
      NOT: Primer antikor, akış sitometrisi analizi için gerekli konsantrasyonu belirlemek için VLP-bakteri ek tahlillerinde kullanılmadan önce titre edilmelidir. Konjugasyon reaksiyonu her yapıldığında ve ek tahmında kullanılan her bakteri için antikor titrasyonu yapılmalıdır.
  3. Antikor titrasyonu
    1. Konjuge anti-insan norovirüs GII antikor 100 kat seyreltmek, 1:100 bir başlangıç seyreltme ve 1:600 bir bitiş seyreltme (toplam altı seyreltme).
    2. Aşağıdaki istisna dışında açıklandığı gibi bir virüs eki testi yapın: adım 3.5.7% 5 BB 350 μL bakteriyel pelet resuspend.
    3. Örneği yedi 50 μL aliquots'a bölün.
    4. Bir tüpe her antikor seyreltme 50 μL ekleyin.
    5. Lekesiz bir kontrol olarak yedinci tüpe %5 BB 50 μL ekleyin.
    6. Aşağıda açıklandığı gibi tüm örneklerüzerinde akış sitometrisi gerçekleştirin.
    7. Seyreltilmiş antikor örneklerini lekesiz kontrollerle ve birbirleriyle karşılaştırın. Daha sonraki tahlillerde kullanılmak üzere pozitif sinyalin azalmasına veya kaybına yol açan en düşük antikor konsantrasyonu seçilmelidir.
  4. Bakterilerin hazırlanması
    1. Bakteriler sabit fazda olana kadar uygun atmosferik koşullar altında uygun sıvı ortamda 40 mL bakteri büyümek.
      1. 37 °C'de Luria Broth'ta bir gecede Aerobik E. cloacae kültürleri büyümek, sabit fazulaşmak için 200 rpm sallayarak.
      2. Sabit faza ulaşmak için 37 °C'ye kadar 37 °C'ye ayarlanmış bir su banyosunda sallayarak siyah vidalı kapak tüplerinde MRS suyu yla L. gasseri kültürleri yetiştirin.
    2. Bakterileri peletlemek için 10 dk için 2.288 x g'de 50 mL konik tüpleri ve santrifüj örneklerini temizlemek için sabit faz kültürleri aktarın.
    3. 13 mL steril 1x PBS'de süpernatantı çıkarın ve yeniden askıya alın. Toplam iki yıkama için bu yıkama adımını tekrarlayın.
    4. Numuneleri tekrar santrifüj edin, süpernatant'ı çıkarın ve 1x PBS'nin 20 mL'inde yeniden askıya alın.
      NOT: Hücre peleti küçükse, geri süspansiyon hacmi azaltılabilir.
    5. Kültürün OD600'ü ölçün.
    6. Daha önce hazırlanmış standart eğriyi kullanarak, yıkanan kültürün mL başına CFU'yu belirleyin.
    7. Kültür konsantrasyonu 1 x 108 CFU/mL'ye ayarlamak için bakterileri gerektiği gibi 1x PBS ile seyreltin.
    8. 1 x 108 CFU/mL bakteri kültürünün 1 mL'sini gerekli sayıda 1,5 mL santrifüj tüpe aktarın.
    9. Tüpleri 10.000 x g'de 5 dk santrifüj edin.
    10. Steril 1 mL%5 BSA'da bakteriyel peleti yeniden askıya alın.
    11. Tüpleri 37 °C'de sabit bir dönüşle 1 saat kuluçkaya yatırın.
  5. Virüs eki
    1. Bir BSL-2 biyogüvenlik kabini içinde çalışırken, PBS'de yeniden asılı bakteri içeren her tüpe 10 μg HuNoV VLPs (Bkz. Malzeme Tablosu)ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın.
      NOT: VLP konsantrasyonu her VLP hazırlığıile farklılık gösterir. Bu nedenle, bakterilere eklenen hacim hazırlama gruplar arasında değişir ve deneydeki her tüpe 10°G eklenecek şekilde buna göre ayarlanmalıdır. Bakteriler in yalnızca kontrolleri için (örneğin, VLP içermeyen numuneler), deneysel numunelere eklenen VLP hacmine eşit bir PBS hacmi ekleyin.
    2. 37 °C'de 1 saat boyunca sürekli dönüşlü tüplerin kuluçkaya yatırın.
      NOT: Kuluçka sırasında 40 rpm'ye ayarlanmış bir tüp tabancası (bkz. Malzemeler Tablosu)kullanılır.
    3. Kuluçkadan sonra numuneleri 10.000 x g'de 5 dk santrifüj edin.
    4. Supernatant atın ve PBS 1 mL bakteriyel pelet resuspend.
    5. Yıkama adımlarını 3.5.3 ve 3.5.4 olarak tekrarlayın.
    6. 5 dakika için 10.000 x g de santrifüj örnekleri.
    7. Supernatant atın ve% 5 BB 150 μL bakteriyel pelet resuspend.
  6. Antikor boyama
    1. Taze %5 BB hazırlayın.
      NOT: Floresan etiketli antikor kullanılarak yapılan tüm çalışmalar karanlıkta yapılmalı ve antikor, BB ve FCSB buzüzerinde tutulmalıdır.
    2. Seyreltilmiş insan norovirüs GII antikor 1:125 E. cloacae örnekleri için ve 1:150 L. gasseri örnekleri için 5% BB, numune başına seyreltilmiş antikor 50 μL hazırlanması.
    3. İzotip antikoru, insan norovirüs GII antikorunun her bakteri için %5 BB oranında seyreltilmiş olması gibi seyreltin ve numune başına 50 μL seyreltilmiş isotip kontrolü hazırlanın.
    4. Her ek test numunesini 3,3.7 adımdan temiz 1,5 mL santrifüj tüplere aktararak üç 50°L'lik aliquots'a bölün.
    5. İlk örnek kümesine 50°L BB ekleyin. Bu küme lekesiz (Uns) denetimleri olacaktır.
    6. İkinci sete, GII antikor seyreltme 50 μL ekleyin. Bu e. cloacae için 1:250 ve L. gasseriiçin 1:300 son antikor konsantrasyonu ile sonuçlanır. Bu örnek kümesi lekeli (AB) numuneler olacaktır.
    7. Üçüncü sete seyreltilmiş isotip antikordan 50 μL ekleyin. Bu küme, İzotip denetimleri (IC) olacaktır. Pipetleme ile iyice karıştırın. 30 dakika boyunca buz ve karanlıkta örnekleri kuluçka.
    8. 5 dk için 10.000 x g tüm örnekleri santrifüj.
    9. Supernatant'ı atın ve 100 μL FCSB'de numuneleri yeniden askıya alın.
    10. Tüm numuneleri 10.000 x g'de 5 dk. Süpernatant'ı atın ve 100 μL FCSB'de numuneleri yeniden askıya alın.
    11. 5 dk için 10.000 x g tüm örnekleri santrifüj.
    12. Supernatant'ı atın ve 150 μL FCSB'de numuneleri yeniden askıya alın.
    13. Her numuneyi toplam 550 μL hacim için 400 μL FCSB tampon içeren bir FCSB tüpüne aktarın.
    14. Numuneleri akış sitometrisi tarafından analiz edilene kadar 4 °C'de tutun.
      NOT: Akış sitometrisi antikor boyama 4 saat içinde yapılır.

4. Akış Sitometri

NOT: Aşağıda açıklanan gerilim ayarları, Malzeme Tablosu'nda listelenen akış sitometresine ve yazılıma dayanmaktadır ve büyük olasılıkla farklı akış sitometrelerine göre değişiklik gösterir. Ayarlar her bakteri için optimize edilmelidir. Tüm grafikler için eksenlerin biexponential fazda olduğundan emin olun.

  1. Çalışma alanını ayarlama
    NOT: Çalışma alanını oluşturmak için kullanılan çizimleriçin kurulum, gating ve veri analizinde kullanılanlardan farklıdır. Çalışma alanını ayarlamanın amacı hücre popülasyonunu görselleştirmek, akış analizini etkileyebilecek bakteri hücrelerinin aşırı kümelenmesini sağlamak ve veriler toplanırken lekeli ve lekesiz hücreleri ayırt etmektir.
    1. Bakterilerin bir araya kümelenmediğinden emin olmak için bir dizi yoğunluk alanı ayarlayın.
      1. Toplam popülasyonu görselleştirmek için bir ileri dağılım alanı (FSC-A) ve yan dağılım alanı (SSC-A) oluşturun.
      2. Hem ileri (FSC-W) hem de yan dağılım genişliğini (SSC-W) ile iletme (FSC-H) ve yan dağılım yüksekliği (SSC-H) ile karşılaştıran iki grafik oluşturarak tek hücre ve hücre kümelerini değerlendirmek için çizimler ayarlayın.
      3. Yalnızca PE pozitif popülasyonu (PE-A vs. SSC-A) gösteren bir çizim oluşturun.
    2. Temel gerilimi E. cloacae için 500'e, L. gasseriiçin 340'a ayarlayın. Bunlar daha sonra düzeltilecektir.
    3. Sayılan toplam olayları 10.000 olaya ayarlayın.
  2. Örnekleri çalıştırma
    1. SSC-A, FSC-A veya PE-A'ya karşı çizilmiş sayıyı gösteren üç ayrı histogram çizimi oluşturun.
    2. Akış sitometresine lekesiz bir örnek yerleştirin ve SSC-A için histogramdaki maksimum tepenin 102 ila 103'te, FSC-A histogramındaki maksimum tepenin ise x ekseninde 104 ila 105 arasında olmasını sağlayarak örnek olaylarını elde edin. Değilse, zirveler belirtilen aralıklara düşmez, FSC ve SSC gerilimlerini buna göre ayarlayın.
    3. Akış sitometresine lekeli bir örnek (AB) yerleştirin ve x ekseninde maksimum tepe noktası olan 103'ü geçmek için PE gerilimini ayarlayın.
    4. Bu ölçümlere dayanarak, pozitif PE kapısını ayarlayın ve geçidi PE-A ile SSC-A yoğunluk grafiğine ayarlayın.
    5. Tüm örnekleri belirlenen ayarların altında düşük veya orta hızda çalıştırın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kommensal bakterilere bağlanan insan norovirüs VLP'yi ölçmek için kullanılan gating stratejileri Şekil 1'degösterilmiştir. Temsili yoğunluk nokta, hücresel enkaz ve hücre kümelerini ortadan kaldırmak için numunelerin nasıl geçitlendiğine genel bir bakış sağlar, böylece VLP eki tekli popülasyonlarda belirlenir(Şekil 1A). Temsili histogramlar, sadece norovirüs VLP'si olmayan bakterilerde düşük anti-norovirüs antikor sinyali düzeyleri nin ve isotip kontrol antikoru ile boyanmış VLP-bakteri örneklerinin düşük arka plan sinyalini göstermektedir(Şekil 1B). İzotip kontrol zirveleri de lekesiz örneklerle örtüşmezken, aynı numunelerin anti-insan norovirüs GII antikorile boyanması da önemli bir değişime yol açarak zirveye ulaşır.

Histogram çıkarma Overton yöntemi, anti-insan norovirüs GII antikor lekeli örneklerdeki PE-pozitif sinyali karşılık gelen izotip kontrolünün PE-pozitif sinyaliile karşılaştırmak ve insan norovirüs VLP'leri ile bağlı bakteri popülasyonunun yüzdesini belirlemek için kullanılmıştır(Şekil 1B). 1 0g VLP ile 1 saat kuluçkadan sonra, akış sitometrisi hem E. cloacae hem de L. gasseri'ye bağlanan parçacık tespit etti (Şekil 2). Aslında, her iki bakteri için bu koşullar altında yüksek düzeyde bağlayıcılık meydana geldi; L. gasseri'ye bağlanma biraz daha yüksek, ancak anlamlı (p < 0.0001), E. cloacae düzeylerine göre oluştu. Bu tahliller akış sitometrisi hem Gram-pozitif hem de Gram-negatif bakterilere bağlanan insan norovirüslerini tespit etmek için kullanılabileceğini göstermektedir.

Bu titretiçin bağlayıcı nicelik sınırını belirlemek için, bakterilere ilave edilmeden önce VLP'lerin seyreltme serisi oluşturulmuştur(Şekil 3). Her iki bakteri cinsi için de bakteri kültürüne eklenen VLP miktarındaki azalmalar, VLP ile bağlı bakterilerin yüzdesinde karşılık gelen azalmalara yol açmıştır. Parçacık la bağlı E. cloacae yüzdesi değişiklikleri L. gasserigöre daha kademeli idi , ama her iki bakteri için yüzde eki VLP konsantrasyonunda daha fazla azalmarağmen kapalı tesviye. Özellikle, 0.1 μg veya daha az (veri gösterilmez) 108 CFU bakteri VLP her iki bakteri için% 13-19 arasında ortalama yüzde eki bir plato sonuçlandı, bu yüzde bu titreşme için nicelik sınırı olduğunu gösteren.

Figure 1
Şekil 1: İnsan norovirüs VLP bağlanmasının temsili akış sitometrik analizi. (A) Bakterilere VLP bağlanmasını ölçmek için temsili akış sitometri gating stratejisi. Yoğunluk arazileri hücresel enkaz dışarı kapı için kullanılan, bakteriyel doublets ve hücresel kümeleri kaldırmak için sonraki nokta arsa gating izledi. (B) Temsili histogramlar, sadece bakteri örneklerinde PE sinyali eksikliği ni ve VLP:bakteri örneklerinde lekesiz ve isotip kontrollerine göre PE sinyal yoğunluğunda bir kayma olduğunu göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: E. cloacae ve L. gasseri'yeVLP eki. PBS'de E. cloacae (n = 6) ve L. gasseri (n = 6) gece kültürleri 1 x 108 CFU/mL'ye seyreltildi. Bakteriler 1 00 g GII.4 VLP ile 1 saat kuluçkaya yatırıldı ve vlp eki akış sitometrisi kullanılarak ölçüldü. Temsili bir çizim Şekil 1B'debulunabilir. Yüzde eki, GII Human Norovirus lekeli örneklerin PE-pozitif sinyalini karşılık gelen isotip kontrolünün PE-pozitif sinyaliile karşılaştırarak histogram çıkarmanın Overton yöntemi kullanılarak belirlendi. İstatistiksel analiz, eşleşmemiş öğrencinin t-testi (p < 0.0001) kullanılarak yapıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: E. cloacae ve L. gasseriiçin VLP seyreltme serisi. 10 μg GII.4 VLP seri seyreltilmiş ve VLP seyreltmeleri 1 mL (n = 3 her iki bakteri için) son hacminde 1 x 108 bakteri ye eklendi. Numuneler 37 °C'de bir saat kuluçkaya yatırıldı. Bakterilere VLP eki akış sitometrisi kullanılarak ölçüldü. Yüzde eki, GII Human Norovirus lekeli örneklerin PE-pozitif sinyalini karşılık gelen isotip kontrolünün PE-pozitif sinyaliile karşılaştırarak histogram çıkarmanın Overton yöntemi kullanılarak belirlendi. VLP giriş miktarlarının azaltılması her ikisi için de yüzde eki(A) E. cloacae ve (B) L. gasseriiçin adım adım azalmalara yol açtı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Enterik virüslerin bakterilere bağlanmasını ölçebilme yeteneği, bu bakterilerin viral enfeksiyonu değiştirme mekanizmalarını açıklamak için kritik bir ilk adımdır. Burada açıklanan yöntemler hem E. cloacae (gram-negatif bakteri) hem de L. gasseri (gram-pozitif bakteri) ile insan norovirüs VLP etkileşimlerini ölçmek için optimize edilmiştir, ancak herhangi bir memeli virüsü ve ilgi bakterisi ile kullanılmak üzere uyarlanabilir. VLPs ek tahlillerde kullanılmak üzere virüs canlı için ideal bir alternatif ve bu parçacıklar kolayca akış sitometri kullanılarak ölçülebilir iken, P parçacıkları da insan norovirüsler ve bakteriler arasındaki etkileşimleri incelemek için kullanılmıştır24. Bu çalışmada, bakteriye bağlı virüs miktarı, burada rapor edildiği gibi, bakteri popülasyonunun aksine ölçüldü. P partikülleri hem VLPs ve vahşi tip virüs24,,25antijenik benzerlik sağlarken üretmek daha kolay olduğu VLPs üzerinde bir avantaj sağlar. Ancak, insan norovirüs VLPs vlps veya P parçacıkları oluşturmak için kapasitesi eksik laboratuvarlar için bir araç sağlayan ticari olarak mevcuttur. P parçacıkları vlps farklıdır, VLPs bir yabani tip viral parçacık boyutunu korumak ise, P parçacıkları daha küçük ve icosahedral simetri25yerine tetrahedral var. Bu özelliklerin bakterilerle etkileşimleri üzerindeki etkisi araştırılanmamıştır ve P parçacıkları insan norovirüs ve bakteriler arasındaki yüzey etkileşimlerini karakterize etmede VLP'lere uygun bir alternatif olarak hizmet verebilir.

Daha önce de belirtildiği gibi, yukarıda açıklanan araştırma daha fazla insan norovirüs VLPs ve bakteri arasındaki etkileşimleri karakterize etmek için kullanılabilir. Bakteri yüzey yapısı ekspresyonundaki büyüme koşullarının ve değişikliklerin viral bağlayıcılığı nasıl değiştirdiği ne kadar araştırılabilen bu teknik kullanılarak incelenebilir. Buna ek olarak, bu tahlil aynı zamanda bakteriyel proteinler veya glikanlar kullanarak rekabetçi inhibisyon testleri ile virüs tarafından bağlı belirli bakteriyel yapıları belirlemek için kullanılabilir, belirli yüzey yapıları kaldırmak için enzimatik tedavi, ya da mutant bakteriyel suşları ile kuluçka özellikle bir yapı eksik. Bu tsay da diğer norovirüs suşlarının commensal bakteriler ile etkileşim yeteneğini araştırmak için istihdam edilebilir.

Bu tetkik norovirüs VLP ile bağlı bakteri popülasyonunun oranını ölçtüğünden, bakteri kültürü konsantrasyonunun ölçülebilmeleri için CFU/mL ve OD600 arasındaki korelasyonun doğru bir şekilde belirlenmesi önemlidir. VLP dalgalanmaları: bakteri oranı VLPs ile bağlı bakteri popülasyonunun yüzdesini değiştirir ve sonuçlarda değişkenliğe yol açabilir. Bu tazbitespit sınırı 0.1 μg VLP/108 CFU bakterilere yaklaştıkça, yeterli miktarda viral partikül eklenmesine de özen gösterilmelidir. Bu sınırın altındaki oranlar sürekli olarak %13-19 oranında ek değerler vermiştir; bu nedenle bu yüzdelerde veya altında gözlenen popülasyon eki gerçek olmayabilir.

VlP:bakteri eki deneylerinde kullanılmadan önce her yeni konjuge antikor için ve her bakteri türüne karşı antikor titrasyonları yapıldı. Her bakteri için gerekli antikor konsantrasyonları E. cloacae için 1:250 ve L. gasseriiçin 1:300 arasında değişen benzerdi. Ökaryotik hücrelerin büyüklüğüne göre bakterilerin küçük boyutu, hem voltaj ayarı hem de veri toplama sırasında bir binom dağılımının kullanılması, bakterileri numunelerde bulunan veya cihaz içinde dolaşan enkazlardan yeterince ayırmak için gerektirir. Veri toplama sonra, uygun gating daha büyük enkaz parçacıkları ve bakteri kümeleri kaldırmak için kullanılabilir böylece sadece tek hücre popülasyonları analiz edilir. Ayrıca, özellikle gram-negatif ve gram-pozitif bakteriler arasında, özellikle de geniş bir dalgalanma olarak test edilen her bakteri türü için benzersiz voltaj ayarları kurmak önemlidir.

Sadece bakteriler ve isotip kontrolleri de dahil olmak üzere uygun kontrollerin dahil edilmesi de verilerin doğru analizi için önemlidir. Her iki kontrol türü de spesifik olmayan antikor bağlama düzeyleri ne kadar önemli olduğu konusunda bilgi verilmiştir. Sonuçlarımız, kullanılan antikorların özellikle test edilen bakteri türlerine bağlı olmadığını, ancak spesifik olmayan bağlanmanın bakteri türleri veya antikordaki değişikliklerle değişebileceğini göstermektedir.

Burada sunulan yöntem, insan norovirüs partiküllerinin hem gram-pozitif hem de gram-negatif bakterilere bağlanmasını ölçer ve virüsün karakterize inde yararlıdır: bakteri etkileşimleri. Ayrıca, bu temel protokol kolayca insan norovirüs diğer genotipler ile kullanılmak üzere optimize edilebilir, yanı sıra diğer memeli virüs ve bakteriler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların herhangi bir çıkar çatışması yok.

Acknowledgments

Sutonuka Bhar ve Chanel Mosby-Haundrup'a yazılı el yazmasının eleştirel incelemesi için teşekkür etmek istiyoruz, ayrıca Alfonso Carrillo'ya bakteriyel standart eğriler üretme konusunda yardımcı olmaları için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüsü'nün (R21AI140012) bir hibesi ve Florida Üniversitesi, Gıda ve Tarım Bilimleri Enstitüsü'nden bir tohum hibesi ile finanse edilmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap Corning 352235 After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis.
Agar Sigma A7002 Used for media preparation
AnaeroPack Thermo Scientific R681001 Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri
BD FacsDiva software
BD LSR Fortessa flow cytometer
Bovine Serum Albumin Fisher Bioreagents BP1605 Used for flow cytometry
Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB) BD Biosciences 554657 Used for flow cytometry
Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience Thermo Fisher Scientific 12473281 Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer.
MRS Powder BD Biosciences 288130 Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri.
Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D) Thermo Fisher Scientific MA5-18241 Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher.
Norovirus GII.4 VLP Creative Biostructure CBS-V700 human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays.
PBS 10X Fisher Bioreagents BP665 Dilute to 1X prior to use.
SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit Thermo Fisher Scientific S10467 Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody.
Sodium Chloride Fisher Scientific S271 Used for media preparation
Tryptone Oxoid LP0042 Used for media preparation
Tube Revolver ThermoFisher Scientific 88881001 Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm).
Yeast Extract BD Biosciences 212750 Used for media preparation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention. Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).
  2. Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346 (6210), 755-759 (2014).
  3. Baldridge, M. T., et al. Commensal microbes and interferon-lambda determine persistence of enteric murine norovirus infection. Science. 347 (6219), 266-269 (2015).
  4. Lei, S., et al. Enterobacter cloacae inhibits human norovirus infectivity in gnotobiotic pigs. Scientific reports. 6, 25017 (2016).
  5. Lei, S., et al. High Protective Efficacy of Probiotics and Rice Bran against Human Norovirus Infection and Diarrhea in Gnotobiotic Pigs. Frontiers in Microbiology. 7, 1699 (2016).
  6. Rodríguez-Díaz, J., et al. Relevance of secretor status genotype and microbiota composition in susceptibility to rotavirus and norovirus infections in humans. Scientific Reports. 7, 45559 (2017).
  7. Erickson, A. K., et al. Bacteria Facilitate Enteric Virus Co-infection of Mammalian Cells and Promote Genetic Recombination. Cell Host Microbe. 23 (1), 77-88 (2018).
  8. Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. Science. 334 (6053), 249-252 (2011).
  9. Robinson, C. M., Jesudhasan, P. R., Pfeiffer, J. K. Bacterial lipopolysaccharide binding enhances virion stability and promotes environmental fitness of an enteric virus. Cell Host Microbe. 15 (1), 36-46 (2014).
  10. Berger, A. K., Yi, H., Kearns, D. B., Mainou, B. A. Bacteria and bacterial envelope components enhance mammalian reovirus thermostability. PLOS Pathogens. 13 (12), 1006768 (2017).
  11. Miura, T., et al. Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses. Journal of Virology. 87 (17), 9441-9451 (2013).
  12. Almand, E. A., Moore, M. D., Outlaw, J., Jaykus, L. A. Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota. PLOS One. 12 (3), (2017).
  13. Robinson, C. M., Woods Acevedo, M. A., McCune, B. T., Pfeiffer, J. K. Related enteric viruses have different requirements for host microbiota in mice. Journal of Virology. , (2019).
  14. Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
  15. Van Dycke, J., et al. A robust human norovirus replication model in zebrafish larvae. PLOS Pathogens. 15 (9), 1008009 (2019).
  16. Li, D., Breiman, A., le Pendu, J., Uyttendaele, M. Binding to histo-blood group antigen-expressing bacteria protects human norovirus from acute heat stress. Frontiers in Microbiology. 6, 659 (2015).
  17. Almand, E. A., Moore, M. D., Jaykus, L. -A. Characterization of human norovirus binding to gut-associated bacterial ligands. BMC Research Notes. 12 (1), 607 (2019).
  18. Debbink, K., et al. Within-host evolution results in antigenically distinct GII.4 noroviruses. Journal of Virology. 88 (13), 7244-7255 (2014).
  19. Harrington, P. R., Lindesmith, L., Yount, B., Moe, C. L., Baric, R. S. Binding of Norwalk virus-like particles to ABH histo-blood group antigens is blocked by antisera from infected human volunteers or experimentally vaccinated mice. Journal of Virology. 76 (23), 12335-12343 (2002).
  20. Harrington, P. R., Vinje, J., Moe, C. L., Baric, R. S. Norovirus capture with histo-blood group antigens reveals novel virus-ligand interactions. Journal of Virology. 78 (6), 3035-3045 (2004).
  21. Mallory, M. L., Lindesmith, L. C., Graham, R. L., Baric, R. S. GII.4 Human Norovirus: Surveying the Antigenic Landscape. Viruses. 11 (2), (2019).
  22. Prasad, B. V., et al. X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid. Science. 286 (5438), New York, N.Y. 287-290 (1999).
  23. Baric, R. S., et al. Expression and self-assembly of norwalk virus capsid protein from venezuelan equine encephalitis virus replicons. Journal of Virology. 76 (6), 3023-3030 (2002).
  24. Rubio-del-Campo, A., et al. Noroviral p-particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics. PLOS One. 9 (2), 89586 (2014).
  25. Tan, M., et al. Terminal modifications of norovirus P domain resulted in a new type of subviral particles, the small P particles. Virology. 410 (2), 345-352 (2011).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 158 İnsan norovirüs enterik virüs-bakteriyel etkileşimler kommensal bakteriler insan norovirüs nicelleştirme insan norovirüs tespiti virüs-bakteri eki
Akış Sitometrikullanarak Commensal Bakterilere Bağlanan İnsan Norovirüs Benzeri Partiküllerin Ölçülmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Madrigal, J. L., Jones, M. K.… More

Madrigal, J. L., Jones, M. K. Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (158), e61048, doi:10.3791/61048 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter