Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kvantificering human norovirus virus-lignende partikler bindende for commensal bakterier ved hjælp af Flow cytometri

Published: April 29, 2020 doi: 10.3791/61048
Automatic Translation
1, 1
1Microbiology and Cell Science Department, University of Florida

Summary

Målet med denne protokol er at kvantificere bindingen af det eukaryote patogenhumane norovirus til bakterier. Efter at have udført en indledende virus-bakterie vedhæftet fil assay, flow cytometri bruges til at opdage viralt-bundet bakterier i befolkningen.

Abstract

Commensal bakterier er veletableret til at påvirke infektion af eukaryote vira. Direkte binding mellem patogenet og værtsmikrobiomet er ansvarlig for at ændre infektion for mange af disse vira. Således, karakterisere karakteren af virus-bakterier bindende er et grundlæggende skridt er nødvendig for at belyse den mekanisme (r), som bakterier ændrer virusinfektion. For humannorovirus, tilsvarende bakterier øge B celle infektion. Virussen direkte binder sig til disse bakterier, hvilket indikerer, at denne direkte interaktion er involveret i mekanismen for infektion ekstraudstyr. En række teknikker kan anvendes til at kvantificere interaktioner mellem bakterier og vira, herunder scintillation stælling af radioaktivt mærkede vira og polymerase kædereaktion (PCR). Begge metoder kræver brug af levende virus, som kan være nødvendigt at generere i laboratoriet. I øjeblikket er ingen af de etablerede in vitro-kultursystemer til rådighed for humant norovirus robuste nok til at give mulighed for generering af stærkt koncentrerede viruslagre. I stedet for levende virus, virus-lignende partikler (VLPs) er blevet brugt til at karakterisere samspillet mellem norovirus og bakterier. Heri en flow cytometri metode er beskrevet med anvendelser virus specifikke antistoffer til at kvantificere VLP binding til gram-negative og gram-positive bakterier. Inddragelse af både bakterier kun og isotype kontrol tilladt for optimering af analysen for at reducere baggrunden antistof bindende og nøjagtig kvantificering af VLP vedhæftet fil til de testede bakterier. Høje VLP:bakterieforhold resulterer i, at VLPs binder sig til store procentdele af bakteriepopulationen. Men når VLP mængder er faldet, procent af bakterier bundet også falder. I sidste ende, denne metode kan anvendes i fremtidige eksperimenter belyse de specifikke betingelser og strukturelle komponenter, der regulerer norovirus: bakterielle interaktioner.

Introduction

Human noroviruses (HuNoVs) er den hyppigste årsag til gastrointestinal sygdom på verdensplan, ansvarlig for 685 millioner infektioner og over 200.000 dødsfald hvert år1. Som med andre enteriske vira, tilstedeværelsen af kommensal bakterier har vist sig at øge infektion af dette patogen samt dens surrogat virus, murine norovirus2,3. Der er også modstridende rapporter om, at bakterier kan hæmme infektion med humannorovirus4,5,6. For flere vira synes den direkte interaktion mellem virus og bakterier at ligge til grund for de mekanismer, der påvirker virusinfektion2,7,8,9,10, og det er blevet vist gennem elektronmikroskopi, at humane norovira binder sig direkte til overfladen af bakterier ne11,12. Derfor, karakterisere disse interaktioner er blevet afgørende for at bestemme de mekanismer, som bakterier indvirkning virusinfektion. Denne karakteristik er klassisk begyndt med kvantificering af viral binding til en række bakteriearter , der er komponenter i værtsmikrobiomet7,12,13. Disse vedhæftede analyser ikke kun afsløre mængden af virus bundet til bakterier, men også støtte til bestemmelse af virkningen af denne interaktion på viral fitness og overlevelse.

For at kvantificere viral fastgørelse omfatter traditionelt anvendte metoder PCR-baserede analyser , som kvantificerer virale genomer12 eller genereringen af radioaktivt mærket virus og brugen af scintillationstælling til kvantificering af viruspartikler7,8,9,13. Anvendelsen af disse metoder kræver generelt adgang til lagre af virus med høj titer og in vitro-dyrkningsmetoder, som de kan anvendes til. Mens flere kultursystemer for humant norovirus nu findes2,14,15, ingen understøtter den robuste replikation kræves for at generere disse stærkt koncentrerede bestande, som begrænser eller eliminerer brugen af PCR og scintillation tælle at kvantificere menneskelige norovirus / bakterielle interaktioner.

For at omgå dette problem, virus-lignende partikler (VLPs) kan bruges som et surrogat til levende virus til at undersøge interaktioner mellem humannorovirus og bakterier16,17. VlPs er ikke-infektiøse partikler, der ligner den virus, som de er afledt af. I tilfælde af humannorovirus dannes disse partikler fra ekspressionen af VP1-proteinet (og engang VP2-proteinet), som selv samler for at skabe intakte virale kapeller, der mangler genetisk materiale (dvs. RNA for norovira). Disse VLP'er har været velkarakteriserede, er strukturelt og antigent magen til de vira af vildtypen , som de stammer fra18,19,20,21,22,23. Derfor, VLPs tjene som en ideel surrogat for at undersøge overfladen interaktioner mellem human norovirus og commensal bakterier. Da VLPs mangler genetisk materiale, kan PCR-baserede analyser ikke anvendes til kvantificering af viral binding. En antistofbaseret cytometrimetode blev tidligere beskrevet og i stand til at påvise lave niveauer af VLP-binding til bakterier på en semikvantitativ måde16. Denne metode blev optimeret til at muliggøre nøjagtig kvantificering af humant norovirus VLP binding til både gram-negative og gram-positive kommensal bakterier16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: De bakterievækstbetingelser, der er skitseret i protokollen, er standarddyrkningsbetingelser for Enterobacter cloacae og Lactobacillus gasseri. For at udføre virus:bakterier vedhæftet fil assay med andre bakteriearter, bør de valgte bakterier dyrkes under standard betingelser, der passer til bakterien.

1. Forberedelse bakterievækst Medium

  1. Enterobacter cloacae vækst medier
    1. Der fremstilles flydende medium ved at opløse 10 g tryptone, 5 g gærekstrakt og 10 g natriumchlorid (NaCl) i 1 L af de-ioniseret (DI) vand (se Materialetabel). Bland alle medier grundigt og sterilisere ved autoklavering i 30 min.
    2. Forbered fast medium ved at opløse 10 g tryptone, 5 g gær ekstrakt, 10 g NaCl, og 15 g agar i 1 L DI vand. Bland alle medier grundigt og sterilisere ved autoklavering i 30 min.
  2. Lactobacillus gasseri vækstmedier
    1. Forbered flydende medium ved at opløse 55 g De Man, Rogosa og Sharpe (MRS; se Materialetabel)pulver i 1 L DI vand. Brug medium inden for en måned efter klargøringen. At sterilisere, varme medium i 15 min indtil kogning efterfulgt af autoklavering i 15 min.
    2. Der fremstilles fast medium ved at opløse 55 g MRS-pulver og 15 g agar i 1 L DI-vand. At sterilisere, varme medium i 15 min indtil kogning efterfulgt af autoklavering i 15 min.

2. Etablering af en standardkurve, der korrelerer optisk massefylde (OD) og bakteriekoncentration

  1. Inokulere 5 ml passende flydende medium med en enkelt, isoleret koloni fra en agarplade (E. cloacae) eller direkte fra frossen glycerolbestand (L. gasseri).
  2. Bakterien vokser natten over under passende atmosfæriske forhold(Enterobacter cloacae: 37 °C med aerob omrystning ved 200 omdrejninger i minuttet; L. gasseri: 37 °C vandbad uden omrystning i en lufttæt beholder).
  3. 2 x 1,3 ml aliquots af natten kultur i to separate 1,5 ml centrifuge rør og centrifuge bakterier på 10.000 x g i 5 min.
  4. Supernatanten fjernes, og prøverne vaskes med 1 ml sterilt 1x fosfatbuffer (PBS). Gentag dette vasketrin for i alt 2 vaske.
  5. Prøverne centrifugeres igen ved 10.000 x g i 5 min, supernatanten fjernes, og resuspenderes i 1,3 ml steril 1x PBS.
  6. Begyndende med 0,5 ml vasket kultur fortyndes bakterierne serielt i 1x PBS fra 10-1 til 10-4.
  7. Ved hjælp af et spektrofotometer måles den optiske massefylde af den vaskede, ufortyndede kultur og hver af de fire fortyndinger ved 600 nm (OD600).
  8. Udfør 10-foldssielle fortyndinger i 1x PBS for hver fortynding fra trin 2.6. Spred plade 100 μL af de sidste 3 fortyndinger for hver serie på passende fast medium for at bestemme antallet af kolonidannende enheder pr. milliliter (CFU/ml) af hver prøve. Plader hver fortynding i tre eksemplarer.
  9. Pladerne tørres ved stuetemperatur i 5 min. Inverter pladerne og inkuberes under de relevante atmosfæriske forhold (E. cloacae: aerobic ved 37 °C, inkuberpladerne natten over; L. gasseri: anaerob ved 37 °C, inkuberplader i 48 timer i en lufttæt beholder med anerobic luftposer (se Materialetabel)).
    BEMÆRK: Brug 1 anaerob luftpose pr. 2,5 L krukke eller 3 breve pr. 7,0 L krukke (se Materialetabel).
  10. Brug pladetællinger til at bestemme CFU/ml for hver af de 5 prøver (dvs. ufortyndet, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4). Generér en standardkurve, der sammenligner OD600 vs. CFU/ml. Ligningen for denne linje vil blive brugt i VLP-bakterier vedhæftet fil analyser til at bestemme CFU / ml baseret på OD600.

3. VLP-bakterier Vedhæftet fil Assay

FORSIGTIG: Humane norovirus VLPs er en biosikkerhedsniveau (BSL)-2 fare, og alt arbejde, der involverer VLPs bør udføres i et biosikkerhedsskab. Forberedelse af bakteriekulturerne, før fastgørelsesanalysen, skal udføres under anvendelse af sikkerhedsbetingelser, der er relevante for organismen.

  1. Forberedelse af reagens
    1. 1x fosfat buffered saltvand (PBS)
      1. Forbered 1 L 10x PBS ved at opløse en hel pakke i 1 L DI-vand.
      2. Autoklaveopløsning i 30 min.
      3. Der fremstilles en 1x-opløsning ved at fortynde ovennævnte opløsning 1:10 i DI-vand.
      4. Opløsningen steriliseres ved at passere den gennem et filter på 0,22 μm og opbevares ved stuetemperatur.
    2. 5% BSA
      1. Der tilsættes 5 g b bovinalbuminpulver (BSA) til 100 ml PBS for at generere en opløsning på 5 % (w/v).
      2. Bland opløsning ved vortexing eller på en rørplade ved hjælp af en metal rørstang, indtil klumper er opløst.
      3. Filtersteriliseres ved hjælp af et filter på 0,22 μm.
      4. Opløsningen opbevares ved 4 °C.
    3. Flow cytometri plet buffer (FCSB)
      1. Filter købt FCSB (se Materialetabel) gennem et 0,22 μm filter.
      2. Den resterende opløsning opbevares ved 4 °C.
    4. 5% blokerende buffer (BB)
      BEMÆRK: Forbered frisk hver gang.
      1. Der tilsættes 0,5 g BSA til 10 ml sterilFCSB.
      2. Vortex til fuldt ud at blande prøve og lad på is, indtil brug.
  2. Antistofbøjning
    1. Konjugeret humant norovirus GII-antistof (se Materialetabel) med r-phycoerythrin (PE) ved hjælp af et R-PE antistofmærkningssæt i henhold til producentens anvisninger (se Materialetabel).
    2. Det konjugerede antistof opbevares i mørke ved 4 °C til fremtidig brug i analyse af VLP-bakteriefastgørelse.
      BEMÆRK: Det primære antistof bør titreres før brug i analysen af genmontering af VLP-bakterier for at bestemme den korrekte koncentration, der er nødvendig for flowcytometrianalyse. Antistoftitrering skal udføres, hver gang bøjningsreaktionen udføres, og for hver bakterie, der anvendes i fastgørelsesanalysen.
  3. Antistoftitrering
    1. Det konjugerede antihumane norovirus GII-antistof fortyndes 100 gange med en startfortynding på 1:100 og en endefortynding på 1:600 (seks fortyndinger i alt).
    2. Der udføres en virusvedhæftet analyse som beskrevet nedenfor med følgende undtagelse: I trin 3.5.7 suspenderes bakteriepelleten i 350 μL 5% BB.
    3. Prøven opdeles i syv 50 μL aliquots.
    4. Der tilsættes 50 μL af hvert antistoffortynding til et rør.
    5. Der tilsættes 50 μL 5% BB til det syvende rør som en ubejdet kontrol.
    6. Udfør flowcytometri på alle prøver som beskrevet nedenfor.
    7. Sammenlign fortyndede antistofprøver med ufarvede kontroller og med hinanden. Den laveste antistofkoncentration, der ikke resulterer i et fald eller tab af positivt signal, skal vælges til brug i efterfølgende analyser.
  4. Fremstilling af bakterier
    1. Avl bakterierne i 40 ml passende flydende medium under passende atmosfæriske forhold, indtil bakterierne er i stationær fase.
      1. Grow E. cloacae kulturer aerobe natten over i Luria Bouillon ved 37 °C, ryster ved 200 rpm at nå stationær fase.
      2. Grow L. gasseri kulturer i MRS bouillon i sort skrue hætte rør uden at ryste i et vandbad sat til 37 °C for 18 timer for at nå stationær fase.
    2. Stationære fasekulturer overføres til rensning af koniske 50 ml rør og centrifugeprøver ved 2.288 x g i 10 minutter for at pelletere bakterierne.
    3. Supernatanten fjernes, og resuspender esl.000 i 13 ml steril 1x PBS fjernes. Gentag dette vasketrin for i alt to vaske.
    4. Prøverne centrifugeres igen, supernatanten fjernes, og prøverne suspenderes igen i 20 ml 1x PBS.
      BEMÆRK: Hvis cellepelleterer er små, kan resuspensionsvolumenet reduceres.
    5. Mål OD600 af kulturen.
    6. Ved hjælp af den tidligere forberedte standardkurve bestemmes CFU pr. ml af den vaskede kultur.
    7. Bakterierne fortyndes efter behov med 1x PBS for at justere dyrkningskoncentrationen til 1 x 108 CFU/ml.
    8. 1 ml af 1 x 108 CFU/ml bakteriekultur overføres til det krævede antal 1,5 ml centrifugerør.
    9. Rørene centrifugeres ved 10.000 x g i 5 min.
    10. Resuspender bakteriepellet i 1 ml steril 5% BSA.
    11. Rørene inkuberes i 1 time ved 37 °C med konstant rotation.
  5. Vedhæftet virus
    1. Arbejde inde i en BSL-2 biosikkerhed kabinet, tilsættes 10 μg af HuNoV VLPs (se Tabel over materialer)til hvert rør, der indeholder bakterier resuspended i PBS og blandes grundigt ved pipettering.
      BEMÆRK: VLP-koncentrationen varierer med hver VLP-præparat. Derfor vil den mængde, der tilsættes bakterier, variere mellem tilberedningsbatcherne og justeres i overensstemmelse hermed, således at der tilsættes 10 μg til hvert rør i forsøget. For bakteriekontroller (f.eks. prøver uden VLP) tilsættes et volumen PBS, der er lig med den mængde VLP, der tilsættes forsøgsprøver.
    2. Inkuberrør i 1 time ved 37 °C med konstant rotation.
      BEMÆRK: En rørrevolver (se Materialetabel)indstillet til 40 omdrejninger i minuttet anvendes under inkubationen.
    3. Efter inkubation endes prøverne ved 10.000 x g i 5 min.
    4. Kassér supernatant og resuspender bakteriepellet i 1 ml PBS.
    5. Vasketrinnene 3.5.3 og 3.5.4 gentages.
    6. Prøverne centrifugeres ved 10.000 x g i 5 min.
    7. Supernatanten kasseres, og bakteriepellet genopkvies i 150 μL 5% BB.
  6. Antistoffarvning
    1. Forbered frisk 5% BB.
      BEMÆRK: Alt arbejde med fluorescerende mærket antistof skal udføres i mørke, og antistoffet, BB og FCSB skal opbevares på is.
    2. Fortyndet humant norovirus GII-antistof 1:125 for E. cloacaeprøver og 1:150 for L. gasseri-prøver i 5% BB, der forbereder 50 μL fortyndet antistof pr. prøve.
    3. Isotypeantistoffet fortyndes på samme måde, som det humane norovirus GII-antistof blev fortyndet for hver bakterie i 5% BB, og der blev fremstillet 50 μL fortyndet isotypekontrol pr. prøve.
    4. Hver enkelt enkelt enkelt prøve af fastgørelsesanalysen opdeles fra trin 3.3.7 i tre 50 μL-aliquots ved at overføre dem til rene 1,5 ml centrifugerør.
    5. Til det første sæt prøver tilsættes 50 μL BB. Dette sæt vil være de ubesværede (Uns) kontroller.
    6. Til andet sæt tilsættes 50 μL af GII-antistoffortyndingen. Dette resulterer i en endelig antistofkoncentration på 1:250 for E. cloacae og 1:300 for L. gasseri. Dette prøvesæt vil være de farvede (AB) prøver.
    7. Til tredje sæt tilsættes 50 μL af det fortyndede isotypeantistof. Dette sæt vil være isotype kontrol (IC). Bland godt ved pipettering. Prøverne inkuberes på is og i mørke i 30 min.
    8. Alle prøver centrifugeres ved 10.000 x g i 5 min.
    9. Supernatanten kasseres, og prøverne suspenderes igen i 100 μL FCSB.
    10. Prøverne centrifugeres ved 10.000 x g i 5 min. Supernatanten kasseres, og prøverne suspenderes igen i 100 μL FCSB.
    11. Alle prøver centrifugeres ved 10.000 x g i 5 min.
    12. Supernatanten kasseres, og prøverne suspenderes igen i 150 μL FCSB.
    13. Hver prøve overføres til et FCSB-rør, der indeholder 400 μL FCSB-buffer, til et samlet volumen på 550 μL.
    14. Prøverne opbevares ved 4 °C, indtil de analyseres ved flowcytometri.
      BEMÆRK: Flowcytometri udføres inden for 4 timer af antistoffarvning.

4. Flow cytometri

BEMÆRK: De spændingsindstillinger, der er beskrevet nedenfor, er baseret på flowcytometeret og den software, der er angivet i materialetabellen, og vil sandsynligvis variere med forskellige flowcytometre. Indstillinger skal optimeres for hver bakterie. Sørg for, at akserne for alle grafer er i en bieksponentiel fase.

  1. Konfigurere arbejdsområdet
    BEMÆRK: Opsætningen af parceller, der anvendes til at etablere arbejdsområdet, adskiller sig fra dem, der anvendes til gating og dataanalyse. Formålet med at oprette arbejdsområdet er at visualisere cellepopulationen, sikre, at der ikke er nogen overdreven sammenklumpning af bakterieceller, der kan påvirke downstream-analyse og at skelne mellem farvede og ufarvede celler, mens data indsamles.
    1. For at sikre, at bakterierne ikke klumper sammen, skal der oprettes en række tæthedsområder.
      1. Generer et fremadrettet punktområde (FSC-A) i forhold til sidepunktområdet (SSC-A) for at visualisere den samlede befolkning.
      2. Konfigurer parceller for at evaluere enkelte celler i forhold til celleklumper ved at oprette to grafer, der sammenligner både fremad (FSC-W) og sidespunktbredde (SSC-W) for at sende (FSC-H) og sidepunktshøjden (SSC-H).
      3. Opret et plot, der kun viser den positive pe-befolkning (PE-A vs. SSC-A).
    2. Sæt basisspænding til 500 for E. cloacae og 340 for L. gasseri. Disse vil blive yderligere justeret senere.
    3. Angiv det samlede antal hændelser, der er talt op, til 10.000 hændelser.
  2. Kører prøver
    1. Opret tre separate histogramparceller, der viser antal afbildet mod SSC-A, FSC-A eller PE-A.
    2. Der anbringes en ubejdet prøve på flowcytometeret, og prøvehændelserne udtages, idet det sikres, at den maksimale top på histogrammet for SSC-A er inden for 102 til 103, og at den maksimale top på histogrammet for FSC-A er mellem 104 og 105 på x-aksen. Hvis ikke, falder spidserne ikke inden for de angivne områder, og FSC- og SSC-spændingerne justeres tilsvarende.
    3. Anbring en plettet prøve (AB) på flowcytometeret, og spændingen for at opnå den maksimale top forbi 103 på x-aksen.
    4. Baseret på disse målinger skal du indstille den positive PE-port og indstille porten på PE-A versus SSC-A-tæthedsgrafen.
    5. Kør alle prøver under de fastlagte indstillinger ved lav eller middel hastighed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De gatingstrategier , der anvendes til at kvantificere humant norovirus VLP-binding til kommensalbakterier, er vist i figur 1. Repræsentativ densitetprik giver et overblik over, hvordan prøverne blev gated for at eliminere cellulære rester og celleklumper, så VLP-fastgørelseblev bestemt på enkelttpopulationer (figur 1A). Repræsentative histogrammer demonstrerer lave niveauer af anti-norovirus antistofsignal i bakterier kun prøver, der mangler norovirus VLP og lavt baggrundssignal af VLP-bakterier prøver farves med isotype kontrol antistof (Figur 1B). Isotype kontroltoppe overlapper også ufarvede prøver, mens farvning af de samme prøver med antihumant norovirus GII antistof resulterer i signifikant skift i top.

Overton-metoden til histogramsubtraktion blev anvendt til at sammenligne det PE-positive signal i antihumane norovirus GII-antistoffarvede prøver med det PE-positive signal fra den tilsvarende isotypekontrol og bestemme procentdelen af den bakteriepopulation, der er bundet af humane norovirus-VLP'er (figur 1B). Efter 1 timers inkubation med 10 μg VLP detekterede flowcytometripartikelbinding til både E. cloacae og L. gasseri (Figur 2). Faktisk, høje niveauer af binding opstod under disse betingelser for begge bakterier; binding til L. gasseri forekom lidt højere, men signifikant (p < 0,0001), niveauer i forhold til E. cloacae. Disse analyser viser, at flow cytometri kan bruges til at opdage human norovirus binding til både Gram-positive og Gram-negative bakterier.

For at bestemme grænsen for bindende kvantificering for denne analyse blev der genereret en fortyndingsserie af VLP'erne før tilsætning til bakterierne (figur 3). For begge bakteriers slægter resulterede reduktioner i mængden af VLP, der blev føjet til bakteriekulturen, i tilsvarende reduktioner i procentdelen af bakterier bundet af VLP. Ændringer i procent af E. cloacae bundet af partiklen var mere gradvis i forhold til L. gasseri, men procent vedhæftet fil for begge bakterier jævnet med jorden på trods af yderligere reduktioner i VLP koncentration. Specifikt, 0,1 μg eller mindre (data ikke vist) af VLP i 108 CFU af bakterier resulterede i et plateau af procent vedhæftet fil i gennemsnit mellem 13-19% for begge bakterier, hvilket indikerer, at denne procentdel er grænsen for kvantificering for denne analyse.

Figure 1
Figur 1: Repræsentativ flowcytometrisk analyse af human norovirus VLP binding. (A) Repræsentativ flow cytometri gating strategi for at kvantificere VLP binding til bakterier. Densitet splots blev brugt til at gate ud cellulære vragrester, efterfulgt af efterfølgende prik plot gating at fjerne bakterielle doublets og cellulære klumper. (B) Repræsentative histogrammer viser, at der mangler PE-signal i kun bakterieprøver, og at PE-signalintensiteten for PE:bakterie i VLP:bakterieprøver er blevet ændret i forhold til ubejdse- og isotypekontroller. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: VLP vedhæftet fil til E. cloacae og L. gasseri. Nattenkulturer af E. cloacae (n = 6) og L. gasseri (n = 6) blev fortyndet til 1 x 108 CFU/ml i PBS. Bakterierne blev inkuberet med 10 μg GII.4 VLPs i 1 time, og vlp-fastgørelsen blev målt ved hjælp af flowcytometri. Et repræsentativt plot findes i figur 1B. Procent vedhæftet fil blev bestemt ved hjælp af Overton metode til histogram subtraktion sammenligne PE-positive signal af GII Human Norovirus farvede prøver til PE-positive signal af den tilsvarende isotype kontrol. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af en ikke-parret Student's t-test (p < 0,0001). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: VLP-fortyndingsserier for E. cloacae og L. gasseri. 10 μg GII.4 VLPs blev seriefortyndet, og VLP-fortyndingerne blev hver især tilsat 1 x 108 bakterier i et endeligt volumen på 1 ml (n = 3 for begge bakterier). Prøverne blev inkuberet i en time ved 37 °C. VLP vedhæftet fil til bakterierne blev målt ved hjælp af flow cytometri. Procent vedhæftet fil blev bestemt ved hjælp af Overton metode til histogram subtraktion sammenligne PE-positive signal af GII Human Norovirus farvede prøver til PE-positive signal af den tilsvarende isotype kontrol. Reduktion af inputmængderne af VLP resulterede i trinvise reduktioner i procent af fastgørelsen for både (A) E. cloacae og (B) L. gasseri. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Evnen til at kvantificere binding af enteriske vira til bakterier er et kritisk første skridt for at belyse de mekanismer, som disse bakterier ændrer virusinfektion. De metoder, der er beskrevet heri, er blevet optimeret til at måle humane norovirus VLP interaktioner med både E. cloacae (gram-negative bakterie) og L. gasseri (et gram-positiv bakterie), men kan tilpasses til brug med pattedyr virus og bakterie af interesse. Mens VLPs er et ideelt alternativ til levende virus til brug i vedhæftet fil assays og disse partikler kan let kvantificeres ved hjælp af flow cytometri, P partikler er også blevet brugt til at undersøge samspillet mellem humane norovirus og bakterier24. I denne undersøgelse blev mængden af virus bundet til bakterierne kvantificeret i modsætning til bakteriepopulationen, som det er rapporteret her. P-partikler giver en fordel i forhold til VLPs , idet de er lettere at producere , samtidig med at de giver antigenlighed med både VLPs og vildvirus24,25. Men, human norovirus VLPs er kommercielt tilgængelige giver et middel til laboratorier mangler kapacitet til at generere VLPs eller P partikler. P partikler adskiller sig fra VLPs i, at mens VLPs opretholde størrelsen af en vild-type viral partikel, P partikler er mindre og har tetrahedral snarere end icosahedral symmetri25. Virkningen af disse egenskaber på interaktioner med bakterier er ikke blevet undersøgt, og P partikler kan tjene som et levedygtigt alternativ til VLPs i karakterisereoverflade interaktioner mellem human norovirus og bakterier.

Som tidligere nævnt, analysen beskrevet ovenfor kan bruges til yderligere at karakterisere interaktioner mellem humane norovirus VLPs og bakterier. Undersøgelser af, hvordan vækstbetingelser og ændringer i bakteriel overfladestruktur udtryk ændre viral binding kan udforskes ved hjælp af denne teknik. Desuden kan denne analyse også bruges til at bestemme specifikke bakteriestrukturer bundet af virus gennem konkurrencedygtige hæmningsanalyser ved hjælp af bakterielle proteiner eller glycaner, enzymatisk behandling for at fjerne specifikke overfladestrukturer eller inkubation med mutante bakteriestammer, der især mangelfuldr en struktur. Denne analyse kan også anvendes til at undersøge muligheden for andre norovirus stammer til at interagere med kommensale bakterier.

Da denne analyse kvantificerer andelen af den bakteriepopulation, der er bundet af norovirus VLP, er det afgørende præcist at bestemme sammenhængen mellem CFU/ml og OD600, så bakteriekulturkoncentrationen kan måles. Udsving i VLP:bakterier-forholdet ændrer procentdelen af bakteriepopulationen bundet af VLPs og kan føre til variabilitet i resultaterne. Der bør også drages omsorg for at tilsætte tilstrækkelige mængder viruspartikler, da detektionsgrænsen for denne analyse nærmer sig 0,1 μg VLP/108 CFU bakterier. Nøgletal under denne grænse gav konsekvent procent fastgørelsesværdier på 13-19 %. således observeret befolkning stilning på eller under disse procentsatser kan ikke være reel.

Antistof titrerings blev udført for hver nyligt konjugeret antistof og mod hver bakteriel stamme før brug i VLP: bakterier vedhæftet fil eksperimenter. De antistofkoncentrationer, der var nødvendige for hver bakterie, var ens fra 1:250 for E. cloacae og 1:300 for L. gasseri. Den lille størrelse af bakterier, i forhold til størrelsen af eukaryote celler, kræver både spændingsjustering samt brug af en binomial fordeling under dataindsamlingen til tilstrækkeligt adskille bakterier fra snavs, der kan findes i prøver eller cirkulerer i instrumentet. Efter dataindsamling, korrekt gating kan bruges til yderligere at fjerne større snavs partikler og bakterielle klumper, så kun enkelt cellepopulationer analyseres. Det er også afgørende at etablere unikke spændingsindstillinger for hver bakterieart testet, da disse svinger meget, især mellem gram-negative og gram-positive bakterier.

Inddragelse af ordentlig kontrol, herunder kun bakterier og isotype kontrol er også afgørende for en nøjagtig analyse af dataene. Begge typer kontroller informerer om niveauer af ikke-specifikt antistofbinding. Vores resultater viser, at de antistoffer, der anvendes til ikke at binde ikke-specifikt til bakteriearter testet, men ikke-specifikke bindende kunne ændre sig med ændringer i bakteriearter eller antistof.

Metoden præsenteres her kvantificerer human norovirus partikel binding til både gram-positive og gram-negative bakterier og er nyttig i at karakterisere virus: bakterielle interaktioner. Desuden kan denne basisprotokol let optimeres til brug sammen med andre genotyper af humannorovirus samt andre pattedyrvirus og -bakterier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Sutonuka Bhar og Chanel Mosby-Haundrup for deres kritiske gennemgang af det skriftlige manuskript, samt Alfonso Carrillo for hjælp til at generere bakterielle standard kurver. Dette arbejde finansieres delvist af et tilskud fra National Institute of Health (R21AI140012) og af et frøtilskud fra University of Florida, Institute of Food and Agricultural Sciences.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap Corning 352235 After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis.
Agar Sigma A7002 Used for media preparation
AnaeroPack Thermo Scientific R681001 Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri
BD FacsDiva software
BD LSR Fortessa flow cytometer
Bovine Serum Albumin Fisher Bioreagents BP1605 Used for flow cytometry
Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB) BD Biosciences 554657 Used for flow cytometry
Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience Thermo Fisher Scientific 12473281 Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer.
MRS Powder BD Biosciences 288130 Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri.
Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D) Thermo Fisher Scientific MA5-18241 Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher.
Norovirus GII.4 VLP Creative Biostructure CBS-V700 human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays.
PBS 10X Fisher Bioreagents BP665 Dilute to 1X prior to use.
SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit Thermo Fisher Scientific S10467 Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody.
Sodium Chloride Fisher Scientific S271 Used for media preparation
Tryptone Oxoid LP0042 Used for media preparation
Tube Revolver ThermoFisher Scientific 88881001 Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm).
Yeast Extract BD Biosciences 212750 Used for media preparation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention. Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).
  2. Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346 (6210), 755-759 (2014).
  3. Baldridge, M. T., et al. Commensal microbes and interferon-lambda determine persistence of enteric murine norovirus infection. Science. 347 (6219), 266-269 (2015).
  4. Lei, S., et al. Enterobacter cloacae inhibits human norovirus infectivity in gnotobiotic pigs. Scientific reports. 6, 25017 (2016).
  5. Lei, S., et al. High Protective Efficacy of Probiotics and Rice Bran against Human Norovirus Infection and Diarrhea in Gnotobiotic Pigs. Frontiers in Microbiology. 7, 1699 (2016).
  6. Rodríguez-Díaz, J., et al. Relevance of secretor status genotype and microbiota composition in susceptibility to rotavirus and norovirus infections in humans. Scientific Reports. 7, 45559 (2017).
  7. Erickson, A. K., et al. Bacteria Facilitate Enteric Virus Co-infection of Mammalian Cells and Promote Genetic Recombination. Cell Host Microbe. 23 (1), 77-88 (2018).
  8. Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. Science. 334 (6053), 249-252 (2011).
  9. Robinson, C. M., Jesudhasan, P. R., Pfeiffer, J. K. Bacterial lipopolysaccharide binding enhances virion stability and promotes environmental fitness of an enteric virus. Cell Host Microbe. 15 (1), 36-46 (2014).
  10. Berger, A. K., Yi, H., Kearns, D. B., Mainou, B. A. Bacteria and bacterial envelope components enhance mammalian reovirus thermostability. PLOS Pathogens. 13 (12), 1006768 (2017).
  11. Miura, T., et al. Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses. Journal of Virology. 87 (17), 9441-9451 (2013).
  12. Almand, E. A., Moore, M. D., Outlaw, J., Jaykus, L. A. Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota. PLOS One. 12 (3), (2017).
  13. Robinson, C. M., Woods Acevedo, M. A., McCune, B. T., Pfeiffer, J. K. Related enteric viruses have different requirements for host microbiota in mice. Journal of Virology. , (2019).
  14. Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
  15. Van Dycke, J., et al. A robust human norovirus replication model in zebrafish larvae. PLOS Pathogens. 15 (9), 1008009 (2019).
  16. Li, D., Breiman, A., le Pendu, J., Uyttendaele, M. Binding to histo-blood group antigen-expressing bacteria protects human norovirus from acute heat stress. Frontiers in Microbiology. 6, 659 (2015).
  17. Almand, E. A., Moore, M. D., Jaykus, L. -A. Characterization of human norovirus binding to gut-associated bacterial ligands. BMC Research Notes. 12 (1), 607 (2019).
  18. Debbink, K., et al. Within-host evolution results in antigenically distinct GII.4 noroviruses. Journal of Virology. 88 (13), 7244-7255 (2014).
  19. Harrington, P. R., Lindesmith, L., Yount, B., Moe, C. L., Baric, R. S. Binding of Norwalk virus-like particles to ABH histo-blood group antigens is blocked by antisera from infected human volunteers or experimentally vaccinated mice. Journal of Virology. 76 (23), 12335-12343 (2002).
  20. Harrington, P. R., Vinje, J., Moe, C. L., Baric, R. S. Norovirus capture with histo-blood group antigens reveals novel virus-ligand interactions. Journal of Virology. 78 (6), 3035-3045 (2004).
  21. Mallory, M. L., Lindesmith, L. C., Graham, R. L., Baric, R. S. GII.4 Human Norovirus: Surveying the Antigenic Landscape. Viruses. 11 (2), (2019).
  22. Prasad, B. V., et al. X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid. Science. 286 (5438), New York, N.Y. 287-290 (1999).
  23. Baric, R. S., et al. Expression and self-assembly of norwalk virus capsid protein from venezuelan equine encephalitis virus replicons. Journal of Virology. 76 (6), 3023-3030 (2002).
  24. Rubio-del-Campo, A., et al. Noroviral p-particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics. PLOS One. 9 (2), 89586 (2014).
  25. Tan, M., et al. Terminal modifications of norovirus P domain resulted in a new type of subviral particles, the small P particles. Virology. 410 (2), 345-352 (2011).

Tags

Immunologi og infektion Problem 158 Human norovirus enteriske virus-bakterielle interaktioner commensal bakterier human norovirus kvantificering human norovirus detektion virus-bakterier vedhæftet fil
Kvantificering human norovirus virus-lignende partikler bindende for commensal bakterier ved hjælp af Flow cytometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Madrigal, J. L., Jones, M. K.… More

Madrigal, J. L., Jones, M. K. Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (158), e61048, doi:10.3791/61048 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter