Summary
Lanthipeptide synthetases يحفز ردود الفعل متعددة الخطوات خلال التمثيل الحيوي للمنتجات الطبيعية الببتيد. هنا، ونحن نصف مستمر، من أسفل إلى أعلى، الهيدروجين الديوتريوم تبادل الطيف الكتل (HDX-MS) سير العمل التي يمكن استخدامها لدراسة الديناميات التركيبية من synthetases lanthipeptide، فضلا عن الإنزيمات المماثلة الأخرى المشاركة في التمثيل الحيوي للمنتج الطبيعي الببتيد.
Abstract
قياس الطيف الكتلي لتبادل الهيدروجين والديوتريوم (HDX-MS) هو طريقة قوية لتوصيف البيوفيزيائي للتغيرات في تشكيل الإنزيم والتفاعلات بين الإنزيم والركيزة. من بين فوائده العديدة ، يستهلك HDX-MS كميات صغيرة فقط من المواد ، ويمكن إجراؤه في ظل ظروف محلية قريبة دون الحاجة إلى وضع علامات الإنزيم / الركيزة ، ويمكن أن يوفر معلومات محلولة مكانيا عن ديناميكيات تشكيل الإنزيم - حتى بالنسبة للإنزيمات الكبيرة ومجمعات متعددة البروتين. يتم البدء في هذه الطريقة عن طريق تخفيف إنزيم الفائدة في المخزن المؤقت المعد في D2O. وهذا يؤدي إلى تبادل البروتيوم في السندات الببتيد amides (N-H) مع الديوتريوم (N-D). في نقاط وقت التبادل المطلوبة ، يتم إخماد تفاعل aliquots ، ويتم إعادة دمج الإنزيم في الببتيدات ، ويتم فصل الببتيدات عن طريق الكروماتوغرافيا السائلة فائقة الأداء (UPLC) ، ويتم تسجيل التغير في كتلة كل ببتيد (بسبب تبادل الهيدروجين للديوتريوم) من قبل MS. تعتمد كمية امتصاص الديوتريوم من قبل كل ببتيد بشكل كبير على بيئة الترابط الهيدروجيني المحلية لذلك الببتيد. الببتيدات الموجودة في مناطق ديناميكية جدا من الديوتريوم تبادل الانزيم بسرعة كبيرة، في حين الببتيدات المستمدة من المناطق مرتبة جيدا تخضع لتبادل ببطء أكثر من ذلك بكثير. وبهذه الطريقة، يبلغ معدل HDX عن ديناميكيات تشكيل الإنزيم المحلية. يمكن بعد ذلك استخدام الاضطرابات إلى مستويات امتصاص الديوتريوم في وجود ليغاندس مختلفة لرسم خريطة لمواقع الربط ليغاند، وتحديد شبكات allosteric، وفهم دور ديناميات تشكيلية في وظيفة الانزيم. هنا، نوضح كيف استخدمنا HDX-MS لفهم التمثيل الحيوي لنوع من المنتجات الطبيعية الببتيد يسمى lanthipeptides بشكل أفضل. اللانثيبتيدات هي الببتيدات المشفرة وراثيا التي يتم تعديلها بعد الترجمة من قبل إنزيمات كبيرة متعددة الوظائف وديناميكية تشكيلية يصعب دراستها مع نهج البيولوجيا الهيكلية التقليدية. يوفر HDX-MS منصة مثالية وقابلة للتكيف للتحقيق في الخصائص الميكانيكية لهذه الأنواع من الإنزيمات.
Introduction
البروتينات هي جزيئات ديناميكية هيكليا التي عينة تشكيلات مختلفة على نطاقات زمنية تتراوح بين اهتزاز السندات على نطاق femtosecond لإعادة ترتيب مجالات البروتين بأكملها التي يمكن أن تحدث على مدى ثوان عديدة1. هذه التقلبات تشكيلية غالبا ما تكون الجوانب الحاسمة للانزيم / وظيفة البروتين. على سبيل المثال ، غالبا ما تكون التغييرات التشكيلية الناجمة عن الربط الرابط ذات أهمية حاسمة لتعديل وظيفة الإنزيم ، إما عن طريق تنظيم بقايا الموقع النشطة اللازمة للحفز ، أو تحديد مواقع ربط الركيزة في آليات حركية متسلسلة ، أو حماية الوسيطات التفاعلية من البيئة ، أو عن طريق تعديل وظيفة الإنزيم عبر شبكات allosteric. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أيضا أن ديناميات تشكيلية يمكن الحفاظ عليها في جميع أنحاء التطور، وأنه يمكن ربط الاضطرابات إلى الحركات الجزيئية المحفوظة مع التغيرات في خصوصية الركيزة وظهور وظائف إنزيم جديدة2،3.
في السنوات الأخيرة ، ظهر قياس الطيف الكتلي لتبادل الهيدروجين والديوتريوم (HDX-MS) بسرعة كتقنية قوية للتحقيق في كيفية استجابة المناظر الطبيعية المطابقة للبروتين للاضطرابات مثل الربط ليغاند أو موتاجينيسيس4،5،6،7. في تجربة HDX-MS النموذجية (الشكل 1)، يتم وضع بروتين مثير للاهتمام في المخزن المؤقت المعد في D2O ، مما يؤدي إلى استبدال البروتونات القابلة للتبادل مع الديوتيريا. سعر الصرف من moiety أميدي من السندات الببتيد يعتمد بقوة على درجة الحموضة، وتسلسل الأحماض الأمينية المحلية، وعلى البيئة الهيكلية المحلية من أميدي8. Amides التي تشارك في التفاعلات الترابط الهيدروجين (مثل تلك الموجودة في α helices وأوراق β) تبادل أبطأ من وسط في المناطق غير المنظمة من البروتين التي تتعرض للمذيبات السائبة. وبالتالي ، فإن مدى امتصاص الديوتريوم هو انعكاس لهيكل الإنزيم. ومن المتوقع أن الإنزيمات التي هي ديناميكية تشكيليا، أو التي تخضع لتحولات هيكلية على الربط ليغاند، أن تسفر عن استجابة HDX قابلة للقياس.
يظهر الأساس الميكانيكي لسعر الصرف البطيء للamide منظم في الشكل 2 5،8،9. من أجل الخضوع ل HDX ، يجب على المنطقة المنظمة أولا أن تقوم أولا بأخذ عينات عابرة من تشكيل تم الكشف عنه ، بحيث يمكن للجزيئات المذيبة التي تحفز تبادل HDX عبر آلية كيميائية حمضية / أساسية محددة ، الوصول إلى أميد القابلة للتبادل. في نهاية المطاف ، فإن المقادير النسبية لسعر الصرف الكيميائي(ككيم)ومعدلات الطي وإعادة طي (كمفتوحة وك إغلاق) تحديد معدل HDX تقاس في التجربة5،8. من هذا النموذج الحركي البسيط ، من الواضح أن مدى امتصاص الديوتريوم سيعكس الديناميكيات التوافقية الأساسية (كما يحددها kopen و kclose). يتم تنفيذ معظم التجارب HDX-MS في سير العمل من أسفل إلى أعلى حيث، بعد رد فعل تبادل، يتم هضم البروتين من الفائدة في الببتيدات ويتم قياس امتصاص الديوتريوم من قبل كل الببتيد كزيادة في كتلة7. وبهذه الطريقة ، يسمح HDX-MS بالاضطرابات لديناميكيات تشكيل الإنزيم ليتم تعيينها على النطاق المكاني المحلي للببتيدات ، مما يسمح للباحث بتقييم كيفية تغيير الاضطراب للديناميكيات في مناطق مختلفة من إنزيم الاهتمام.
مزايا نهج HDX-MS لتوضيح الديناميات الهيكلية البروتين عديدة. أولا ، يمكن تنفيذ هذه الطريقة بكميات صغيرة من البروتين الأصلي أو على مجمعات البروتين في أنظمة ذات بنية رباعية10. ليس من الضروري حتى لإعداد الانزيم المستخدمة في المقايسة أن يكون تنقية عالية11،12، طالما أن من أسفل إلى أعلى HDX - MS سير العمل يوفر عددا كافيا من الببتيدات التي تم تحديدها بثقة التي تغطي تسلسل البروتين من الفائدة. وعلاوة على ذلك، HDX-MS يمكن أن توفر معلومات عن ديناميات تشكيلية في ظل ظروف محلية قريبة دون الحاجة إلى وضع العلامات البروتين موقع محدد كما يمكن استخدامها في دراسات مضان جزيء واحد13،وليس هناك حد لحجم البروتين أو البروتين المعقدة التي يمكن التحقيق فيها (مما يجعل النهج مثل الرنين المغناطيسي النووي [NMR] الطيف تحديا)7،14. وأخيرا، يمكن استخدام طرق HDX-MS التي تم حلها زمنيا لدراسة البروتينات المضطربة في جوهرها، والتي يصعب دراستها مع التصوير البلوري بالأشعة السينية15و16و17و18. القيد الرئيسي ل HDX-MS هو أن البيانات ذات دقة هيكلية منخفضة. إن بيانات HDX-MS مفيدة للإشارة إلى الأماكن التي تتغير فيها الديناميكيات التوافقية وللكشف عن التغيرات التوافقية المقترنة ، ولكنها لا توفر في كثير من الأحيان الكثير من البصيرة في الآلية الجزيئية الدقيقة التي تقود التغيير الملحوظ. وقد أظهرت التطورات الأخيرة في الجمع بين أساليب التفكك التقاط الإلكترون مع البروتين HDX-MS البيانات واعدة لرسم خرائط مواقع تبادل لبقايا الأحماض الأمينية واحد19،ولكن لا تزال هناك حاجة في كثير من الأحيان متابعة الدراسات الكيميائية الحيوية والهيكلية لتوفير الوضوح للنماذج الهيكلية التي أحالها HDX-MS البيانات.
أدناه، يتم تقديم بروتوكول مفصل لتطوير فحص HDX-MS20. يجب أن تنطبق بروتوكولات إعداد العينة المعروضة أدناه بشكل عام على أي بروتين يظهر قابلية جيدة للذوبان في المخازن المؤقتة المائية. تتوفر طرق إعداد عينات أكثر تخصصا وسير عمل HDX-MS للبروتينات من الحاجة إلى الفحص في وجود المنظفات أو الفوسفوليبيدات21و22و23و24. يتم وصف الإعدادات الفعالة لجمع بيانات HDX-MS لمطياف كتلة رباعي القطب عالي الدقة مقرون بنظام الكروماتوغرافيا السائلة. ويمكن جمع بيانات مماثلة التعقيد والدقة على أي واحد من عدد من نظم قياس الطيف الكروماتوغرافيا الكتلية السائلة المتاحة تجاريا. كما يتم توفير الجوانب الرئيسية لمعالجة البيانات باستخدام حزمة برامج متاحة تجاريا. كما نقدم إرشادات لجمع البيانات وتحليلها تتسق مع التوصيات التي قدمها مجتمع HDX-MSالأوسع 12. يستخدم البروتوكول الموصوف لدراسة الخصائص الهيكلية الديناميكية ل HalM2 ، وهو موالفة lanthipeptide التي تحفز نضوج متعدد الخطوات لمنتج الببتيد الطبيعي المضاد للميكروبات20. نحن نوضح كيف يمكن استخدام HDX-MS للكشف عن مواقع الربط الركيزة والخصائص التستوستيرون التي استعصت على التوصيف السابق. وقد نشرت العديد من البروتوكولات الأخرى على البروتين HDX-MS في السنوات الأخيرة25,26. وإلى جانب العمل الحالي، ينبغي أن توفر هذه المساهمات السابقة للقارئ بعض المرونة في التصميم التجريبي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الكواشف deuterated وحلول مخزون الانزيم
- إعداد الكواشف اللازمة لتفاعلات HDX (بما في ذلك أي مخازن مؤقتة أو أملاح أو ركائز أو ليغاند، وما إلى ذلك) كحلول مخزون مركزة 100−200x في D2O (99.9٪ جزء الذرة D). قم بإعداد ما لا يقل عن 50 مل من حلول المخزون المؤقت.
ملاحظة: لتوصيف HalM2، تم إعداد الحلول التالية: 500 mM MgCl2، 100 mM tris (2-carboxyethyl) فوسفين (TCEP)، 750 مللي متر ATP (في المخزن المؤقت HEPES)، 800 mM HEPES pD 7.1، 500 μM HalA2، و 500 mM AMPPNP. - تجميد وlyophilize الأسهم حلول لجفاف.
- إعادة حل في D2O، وتكرار دورة الليتوفيلية مرة إضافية واحدة على الأقل لاستبدال أكبر عدد ممكن من البروتونات القابلة للاستبدال مع الديوترونات ممكن.
- ضبط PD من مخزون المخزن المؤقت HEPES deuterated إلى القيمة المطلوبة مع مركزة NaOD / DCl، مع الأخذ في الاعتبار العلاقة التالية27:
ملاحظة: يعتمد معدل AMIDE HDX بشدة على pL للحل (pL = pH أو pD)5. يجب إعداد مجموعات مختلفة من حلول المخزون المؤقت وتخزينها واستخدامها بطريقة متطابقة لتجنب انحراف pL طفيف بين التجارب. - حساب كمية كل كاشف اللازمة ل300 ميكرولتر HDX المقايسة وتخزينها على أنها aliquots استخدام واحد في -80 درجة مئوية.
- قم بإعداد محلول مخزون إنزيم مركز (~100−200 ميكرومتر) في مخزن تخزين الإنزيم المحمي باستخدام فلتر طرد مركزي(جدول المواد)أو جهاز مكافئ.
ملاحظة: سوف العازلة الدقيقة والطرد المركزي تصفية قطع الوزن الجزيئي تعتمد على البروتين / إنزيم الفائدة. يتم تخزين HalM2 في 50 MM HEPES، pH 7.5، 100 MM KCl، و 10٪ الجلسرين. استخدمت فلاتر 10 kDa لإعداد الإنزيم المركز. - Aliquot الإنزيم في أجزاء استخدام واحد وتخزينها في -80 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن أن يكون هذا نقطة توقف. يمكن إعداد جميع حلول المخزون الموضحة في القسم 1 قبل ردود فعل HDX. إذا تم تخزينها عند -80 درجة مئوية ، فإن معظم الإنزيمات / حلول المخزون deuterated ستكون مستقرة لعدة أشهر.
2. معايرة حجم إخماد HDX
- إعداد رد فعل HDX 300 ميكرولتر في D2O باستخدام الكواشف deuterated ومخزونات الانزيم المركزة المعدة في القسم 1.
- استخدم تركيز إنزيم نهائي من 1−5 ميكرومتر.
- استخدم تركيز احتياطي HEPES النهائي من 50−100 متر على الأقل.
- تأكد من تركيزات المكونات الأخرى كافية للحفاظ على نشاط الانزيم المطلوب / وظيفة.
- إعداد 1 لتر من محلول إخماد HDX (فوسفات 100 mM، 0.8 M guanidine-HCl، pH 1.9). تجميد وتخزينها في كل من أجزاء 50 مل (للمخزون على المدى الطويل) وأجزاء 1 مل (لاستخدام واحد aliquots).
ملاحظة: يعتمد التركيب الدقيق لحاجز التبريد على الإنزيم المستخدم في خطوة التحلل البروتيني لسير عمل HDX-MS من أسفل إلى أعلى (الخطوة 3.3.3). المخزن المؤقت للإرواء المعطى هنا متوافق مع البيبسين ، وهو البروتيز الأكثر استخداما ل HDX-MS. إذا تم استخدام بروتياز مختلفة، تحقق مع المورد بروتياز لضمان التوافق العازلة. - قم بمعايرة حجم المخزن المؤقت ل quench اللازم لضبط pL النهائي لخليط تفاعل HDX المروي إلى قيمة قراءة مقياس درجة الحموضة 2.3.
ملاحظة: سعر الصرف H/D المذيب للببتيد amide N-H السندات هي عملية تعتمد على درجة الحموضة التي تخضع لكل من حمض وقاعدة الحفز. يحدث سعر الصرف الأدنى بقيمة 2.5 درجة الحموضة (قراءة مقياس الحموضة = 2.3 لخليط 50:50 H2O:D2O). وبالتالي، فإن قيمة pL النهائية بالقرب من 2.5 ستقلل من تبادل الهيدروجين مرة أخرى الذي يحدث أثناء تحليل LC-MS من أسفل إلى أعلى، وبالتالي الحفاظ على تسمية الديوتريوم في الببتيدات.- مزيج 50 ميكرولتر من خليط رد فعل HDX من الخطوة 2.1 مع 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للإرواء وقياس pL من الخليط المروي مع قطب microtip.
- زيادة حجم محلول التبريد حسب الحاجة لضبط قراءة عداد درجة الحموضة النهائية إلى قيمة 2.3.
- بمجرد تحديد حجم التبريد المناسب، كرر عملية التبريد عدة مرات باستخدام 50 ميكرولتر من تفاعل HDX (الخطوة 2.1) لضمان تحقيق pL نهائي ثابت عند إضافة كمية ثابتة من المخزن المؤقت للرواية.
3. إعداد عينات مرجعية وتحسين سير عمل LC-MS من أسفل إلى أعلى
- إعداد عينات مرجعية غير مقلية للبروتين من الفائدة في ثلاثية في أنابيب 0.5 مل. تأكد من أن ظروف خليط التفاعل النهائي مطابقة لتلك المستخدمة في ردود فعل HDX الأصلية (الخطوة 2.1) ، باستثناء أن ردود الفعل يتم إعدادها في H2O باستخدام حلول مخزون الكاشف المعدة أيضا في H2O.
- إخماد العينات كما في الخطوة 2.3 بإضافة الحجم المناسب من المخزن المؤقت quench لضبط درجة الحموضة النهائي إلى 2.5. فلاش تجميد العينات في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى جاهزة للتحليل.
- تحليل عينات مرجع الإنزيم protiated باستخدام سير عمل LC-MS من أسفل إلى أعلى.
ملاحظة: قبل تنفيذ هذه الخطوات، يجب معايرة نظام LC-MS الذي سيتم استخدامه للحصول على البيانات بشكل صحيح وجاهز للاستخدام. توقيت ودرجة حرارة جميع الخطوات في سير العمل LC-MS من أسفل إلى أعلى يجب أن تكون مراقبة صارمة من أجل تقليل الاختلافات في تبادل الظهر بين العينات. باستخدام أجهزة التصلب المتعدد المستخدمة في هذا البروتوكول (جدول المواد و معلومات داعمة) ، يمكن التحكم في معظم الخطوات من خلال برنامج الأدوات. لضمان تجميع النسخ المتماثلة الدقيقة، يوصى بأتمتة أكبر عدد ممكن من الخطوات في سير العمل.- إزالة عينة مرجعية إنزيم الفردية (أعدت كما هو الحال في الخطوة 3.2) من الثلاجة وتذوب في 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة في حمام مائي.
- في الدقيقة 2 بالضبط بعد إزالة العينة من الثلاجة والذوبان، وحقن جزء 40 ميكرولتر من العينة المرجعية المروية في عمود كروماتوغرافيا سائلة فائقة الأداء (UPLC) (2.1 × 30 ملم، 300 Å، 5 ميكرومتر) تحتوي على مرحلة ثابتة تعمل مع بيبسين (بروتياز حمض مستقر).
- هضم العينة بمعدل تدفق 100 ميكرولتر /دقيقة لمدة 3 دقائق عند 15 درجة مئوية باستخدام حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ في H2O (درجة الحموضة = 2.5) كمذيب.
- جمع الببتيدات الببتيدية لأنها elute من العمود pepsin على عمود فخ C18 عقد في 0.4 درجة مئوية للحد من تبادل الظهر.
- مرر الببتيدات الببتيدية المجففة من عمود الفخ إلى عمود تحليلي C18 (1 مم × 100 مم ، 1.7 ميكرومتر ، 130 Å) تم الاحتفاظ به وتشغيله عند 0.4 درجة مئوية لفصل الببتيدات الببتيدية.
ملاحظة: يمكن أتمتة الخطوات 3.3.3-3.3.5 بواسطة بعض أنظمة LC-MS المستخدمة للحصول على بيانات HDX-MS. بدلا من ذلك، يمكن تنفيذ هذه الخطوات بشكل مستقل، مع الأخذ في الاعتبار أن توقيت ودرجة حرارة كل خطوة تحتاج إلى التحكم بعناية لتحقيق تبادل الظهر منخفضة باستمرار. - Elute العمود C18 مع acetonitrile / الماء / 0.1 ٪ نظام المذيبات حمض الفورميك. تحسين التدرج LC للبروتين من الفائدة من أجل تحقيق أقصى قدر من الفصل والحفاظ على تسمية الديوتريوم في الببتيدات الببتيدية.
ملاحظة: يتم توفير تفاصيل التدرج elution في المعلومات الداعمة. - تخضع الهضم الهضمي لتأين الكهروسبراي (ESI) قياس الطيف الكتلي.
ملاحظة: توفر شروط المصدر المتوفرة في المعلومات الداعمة تأينا كافيا لمعظم الببتيدات الببتيدية.- بمجرد تأينها في أداة التصلب المتعدد، قم بفصل حركة أيونات مرحلة الغاز باستخدام النيتروجين كغاز عازل لتعزيز قدرة الذروة للطريقة.
- بعد فصل حركة الأيونات، أخضع أيونات سلائف الببتيد الببتيدية لسير عمل MSE يتضمن دورات متناوبة من طاقة الاصطدام المنخفضة (4 فولت) وطاقة الاصطدام العالية (21−40 فولت).
ملاحظة: تسمح أنظمة طاقة التصادم المنخفضة والعالية المتناوبة بجمع بيانات MS (طاقة تصادم منخفضة) في وقت واحد مع بيانات MSMS (طاقة تصادم عالية). وهذا بدوره يسمح بالارتباط الزمني بين أيونات السلائف والأيونات المجزأة لكل منها. هذا الارتباط ضروري لتحديد الببتيد الواثق الموصوف في القسم 4. - الكشف عن السلائف الببتيد والأيونات جزء باستخدام محلل الشامل مع قوة حل ما لا يقل عن 20،000.
- بالتزامن مع الحصول على البيانات، احصل على بيانات MS لمعيار خارجي [Glu-1]-fibrinopeptide B (GluFib).
ملاحظة: سير العمل MS الموضحة في الخطوة 3.3.7 يشار إلى بروتوكولMS E. يتم توفير الإعدادات الفعالة الكاملة لبروتوكول MSE المناسب ل HDX-MS من أسفل إلى أعلى في المعلومات الداعمة.
- تقييم جودة بيانات LC-MS.
ملاحظة: باستخدام البروتوكول المذكور أعلاه والإعدادات الفعالة المتوفرة في المعلومات الداعمة، يجب أن تنتج العينات المرجعية رسما لونيا أيونا إجماليا بحد أقصى لشدة الإشارة تبلغ حوالي 1 × 108. يجب أن يكون هناك العديد من الببتيدات الببتيدية التي تتراوح بين 3-9 دقائق(الشكل 3A−C). - حقن 40 ميكرولتر من عينات فارغة (0.1٪ حمض الفورميك في الماء) لتنظيف أعمدة بيبسين والتحليل C18.
ملاحظة: بشكل عام، يجب أن تكون الفراغات 2-3 كافية. - كرر الخطوات 3.3.1−3.3.9 لكل عينة من عينات البروتين المرجعية الثلاثية.
4. معالجة البيانات المرجعية وتحديد قائمة الببتيد
- تحليل البيانات الخامMS E (الخطوة 3.3.7) باستخدام برنامج بروتيوميكس(جدول المواد). باستخدام برنامج بروتيوميكس، انتقل إلى المكتبات | بروتين تسلسل Databanks لتحديد قاعدة بيانات البروتين عن طريق استيراد تسلسل الأحماض الأمينية للبروتين من الفائدة.
ملاحظة: الهدف من هذه الخطوة هو البحث في بيانات MS المرجعية عن الببتيدات الببتيدية المشتقة من البروتين المهم، واستخدام بيانات MSMS (التي تم الحصول عليها في وقت واحد مع بيانات MS) للتحقق من صحة أي تحديدات الببتيد المفترضة. - إعطاء اسم لتسلسل البروتين من الفائدة. استيراد تسلسل البروتين (في شكل FASTA). سيقوم البرنامج بإجراء عملية هضم في سيليكو لبروتين قاعدة البيانات لتوليد قائمة بالببتيدات التي سيتم استخدامها للبحث في بيانات LC-MS.
- تعريف معلمات المعالجة (الموجودة ضمن القائمة مكتبة). حدد Electrospray MSE كنوع الحصول على البيانات. في حقل Lock Mass for Charge 2، أدخل 785.8426 ل m/z ل 2+ أيون [Glu-1]-fibrinopeptide B (GluFib) وانقر فوق إنهاء.
- حدد معلمات سير العمل (الموجودة ضمن قائمة المكتبة).
- حدد الرذاذ الكهربائي MSE لنوع البحث. ضمن | سير العمل عنوان استعلام البحث في قاعدة البيانات، حدد بروتين قاعدة البيانات الذي تم إنشاؤه في الخطوة 4.2 في حقل Databank.
- تغيير المضموم الأساسي إلى غير محدد، ومسح حقل كاشف المعدل الثابت عن طريق الضغط على زر Ctrl أثناء النقر على Carbamidomethyl C.
- حدد دليل الإخراج بالانتقال إلى الخيارات | | إعداد التشغيل التلقائي الهوية E. حدد المربعات الخاصة ب Apex 3D و الببتيد 3D الإخراج و الإخراج المحاسبي أيون وحدد الدليل المطلوب.
- معالجة بيانات عينة المرجع.
- على شريط الأدوات الأيسر من مساحة العمل منصة بروتيوميكس، إنشاء لوحة جديدة عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على لوحة Microtiter. تسليط الضوء على ثلاثة آبار في لوحة microtiter (واحد لكل عينة مرجعية تم جمعها في القسم 3). انقر على اليسار في بئر واحد، اضغط واسحب إلى ثلاثة آبار.
- انقر بزر الماوس الأيمن وحدد إضافة بيانات أولية. في الإطار الذي يظهر، انتقل إلى الدليل الذي يحتوي على الملفات المرجعية الثلاثة من القسم 3 وحددها في نفس الوقت.
- انقر على التالي واختر معلمات المعالجة المحددة في الخطوة 4.3. انقر على التالي وحدد معلمات سير العمل المحددة في الخطوة 4.4. ثم انقر على النهاية.
- بمجرد تعيين البيانات الخام ومعلمات المعالجة ومعلمات سير العمل لكل بئر على اللوحة ، ستظهر الآبار باللون الأزرق. حدد الآبار، انقر بزر الماوس الأيمن وحدد عملية أحدث البيانات الأولية. انقر على الزاوية السفلية اليمنى من النافذة لتتبع معالجة البيانات. بمجرد ظهور الرسالة لا توجد مهمة لتشغيلها، تتم المعالجة بشكل كامل.
- بعد اكتمال معالجة البيانات ، ستتحول الآبار في اللوحة إلى اللون الأخضر. انقر بزر الماوس الأيمن على الآبار وحدد عرض نتائج سير العمل. سيتم فتح إطار منفصل لكل ملف بيانات مرجع.
- فحص البيانات للتأكد من أن غالبية إشارات التصلب المتعدد في بيانات العينة المرجعية تم تعيينها بنجاح إلى الببتيدات المتوقعة من عملية الهضم داخل السيليكو للبروتين المثير للاهتمام. سيتم تلوين الببتيدات المتطابقة باللون الأزرق في طيف الإخراج (الشكل 4). انقر نقرا مزدوجا فوق عامل التصفية موافق وتحقق من أن تغطية النسبة المئوية أكبر من 99٪.
ملاحظة: عند المعالجة، سيتم حفظ إخراج البيانات تلقائيا مع ملحق الملف(raw_data_file_name_IA_final_peptide) في الدليل المحدد في الخطوة 4.5. - استيراد إنتاج البرمجيات بروتيوميكس في برنامج HDX المعالجة(جدول المواد)للحصول على عتبات إضافية.
- انقر على البيانات في الزاوية اليسرى من نافذة برنامج معالجة HDX. انقر على نتائج PLGS الاستيراد وانقر على أيقونة إضافة. اختر ملفات البيانات المعالجة من الخطوة 4.9 بواسطة التنقل إلى الدليل المناسب.
- انقر على التالي وحدد المعلمات التالية: الحد الأدنى من الأيونات المتتالية ≥ 2، خطأ جماعي = 5 ppm، و عتبة الملف = 3. انقر على النهاية.
- مرة واحدة راض عن المعلمات عتبة، حفظ مشروع HDX. سيتم استيراد جميع بيانات HDX إلى هذا المشروع لتحليلها وعرضها.
ملاحظة: يجب معالجة عينات تبادل الديوتريوم الموضحة في المقطع التالي مع سير عمل LC-MS متطابقة. ولذلك، قبل الشروع في اختبارات HDX (القسم 5)، تأكد من أن إعداد العينة (القسم 2)، وسير عمل LC-MS من أسفل إلى أعلى (القسم 3) وسير عمل معالجة البيانات (القسم 4) توفر قابلية النسخ المطلوبة وتغطية التسلسل للبروتين المستهدف. إذا كان هناك حاجة إلى تغيير أي من هذه العمليات لتحسين التغطية، ينصح بالعودة إلى الخطوة 2.1، وإعداد عينات مرجعية جديدة في ثلاثية الخطوط، وتكرار الأقسام 2-4 (مع إجراء التعديلات اللازمة على البروتوكول) لضمان إمكانية توليد كل ببتيد واكتشافه بشكل مستنسخ.
5. إجراء ردود فعل HDX
- قم بإعداد مساحة العمل لتفاعلات HDX.
- قبل aliquot إخماد العازلة في أنابيب 0.5 مل المسمى بشكل صحيح. إعداد أنبوب مختلف لكل نقطة زمنية، كل تكرار، وكل حالة البيوكيميائية ليتم تحليلها. استخدم الحجم المناسب من المخزن المؤقت ل quench من الخطوة 2.2 المطلوبة لضبط القراءة النهائية لمقياس درجة الحموضة لجزء 50 ميكرولتر من رد فعل HDX إلى قيمة 2.3.
- طرد مركزي لفترة وجيزة أحواض 0.5 مل لنقل كل من العازلة إرواء إلى الجزء السفلي من الأنبوب. ضع الأنابيب على الجليد.
- ملء ديوار صغيرة مع النيتروجين السائل والحفاظ على المتاخمة لمساحة العمل.
- إعداد ردود فعل HDX. تأكد من وجود حجم رد فعل كاف لجمع العدد المطلوب من نقاط وقت الصرف (واحد 50 ميكرولتر aliquot لكل نقطة زمنية مرغوب فيها). جمع ما لا يقل عن 4-5 نقاط زمنية أكثر من 3−4 أوامر من حجم في مقياس الوقت (على سبيل المثال، أوقات إخماد من 15 s، 60 s، 300 s [5 دقيقة]، 1800 s [30 دقيقة]، و 14400 s [4 h] توفير تغطية كافية لديناميات الصرف لمعظم الإنزيمات).
- قبل خلط جميع المكونات deuterated (ناقص انزيم) من الخطوة 1.1 في D2O.
- لكل حالة بيوكيميائية ليتم فحصها (إنزيم حر ، إنزيم + ليغند ، إنزيم + مثبط ، وما إلى ذلك) ، قم بإعداد تفاعلات HDX في ثلاث نسخ على الأقل.
- احتضان خليط التفاعل في حمام مائي يتم التحكم فيه بدرجة حرارة عند 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق قبل إضافة الإنزيم.
ملاحظة: يجب إعداد الإنزيم كمحلول مخزون مركز (~100−200 ميكرومتر، الخطوة 1.6) لتقليل إضافة البروتيوم إلى المقايسة HDX. - عند إضافة الإنزيم إلى تركيز نهائي من 1−5 ميكرومتر، ابدأ المؤقت. امزج المحلول بعناية وبسرعة باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر لضمان توزيع الإنزيم بالتساوي في العينة.
- في نقاط وقت التبادل المطلوبة، قم بإزالة 50 ميكرولتر من تفاعل HDX واخلط بسرعة وبالتساوي مع المخزن المؤقت لإرواء الجليد البارد قبل المزج في أنبوب 0.5 مل.
ملاحظة: يجب أن تكون أحجام الخلط وإجراءات الخلط دقيقة وقابلة للاستنساخ قدر الإمكان لضمان تحقيق pL quench النهائي المطلوب من 2.3 بسرعة في جميع العينات. الحفاظ على التبريد الجليد العازلة إخماد سوف تساعد على تقليل تبادل الظهر على التشبع من الانزيم. - مباشرة بعد إخماد عينة HDX، سقف الأنبوب وتجميد فلاش في النيتروجين السائل.
- استمر في جمع النقاط الزمنية حتى تكتمل جميع عمليات الفحص، ثم قم بنقل العينات إلى ثلاجة -80 درجة مئوية للتخزين.
ملاحظة: يمكن أن يكون هذا نقطة توقف. بعد جمع جميع النقاط الزمنية HDX، يمكن تخزين العينات عند -80 درجة مئوية حتى تكون جاهزة لتحليل LC-MS. من الناحية المثالية ، يجب إجراء ردود فعل HDX ثلاثية الليكات لجميع الحالات الكيميائية الحيوية ذات الأهمية في نفس اليوم. كحد أدنى ، يجب تشغيل جميع ردود فعل HDX المتماثلة لحالة كيميائية حيوية معينة بالتوازي في نفس اليوم.
- بعد جمع كافة النقاط الزمنية HDX مروي، تخضع العينات إلى سير العمل LC-MS محسنة من أسفل إلى أعلى المتقدمة كما هو موضح في الخطوة 3.3. حقن عينات HDX في ترتيب عشوائي مع عدد مناسب من الفراغات بين العينات لضمان أن أي الببتيد ترحيل الحد الأدنى.
ملاحظة: لا تحتاج إلى تجميع بيانات HDX في وضع MSE. وبالتالي، ينبغي إزالة قطاع طاقة الاصطدام العالي (الخطوة 3-3-7-2) من دورة واجب التصلب المتعدد. يجب أن يكون هذا التغيير الوحيد الذي تم إجراؤه على سير العمل الموضح في الخطوة 3.3. - تقييم جودة بيانات HDX أثناء جمعها.
- تأكد من ظهور القمم الكروماتوغرافية الموجودة في الشكل اللوني الأيوني الإجمالي للعينات المرجعية غير المذابة في نفس وقت الاحتفاظ في العينات المذابة (كما هو الحال في الشكل 3D−F).
- تأكد من أن الأطياف الكتلية التي تم تلخيصها على فترات زمنية محددة من العينات المرجعية والعينات التي تم خلعها تظهر أدلة على الديوتر (أي التحول في المغلف النظيري للببتيدات الفردية إلى قيم أعلى m/z في العينات المذابة [الشكل 6]).
6. معالجة بيانات HDX
- قم باستيراد بيانات HDX إلى مشروع HDX الذي تم إنشاؤه في الخطوة 4.11 بالنقر على البيانات | MS Files في شريط الأدوات العلوي.
- انقر على حالة جديدة والتعرض الجديد حسب الحاجة لتحديد الدول الكيميائية الحيوية (على سبيل المثال، إنزيم الحرة، إنزيم + ليغاند، الخ) وأوقات التعرض الديوتريوم، على التوالي، التي هي ذات الصلة للتحليل.
- انقر على جديد الخام لتحديد ملفات البيانات HDX ليتم تحليلها. تعيين أوقات التبادل المناسبة وحالة البيوكيميائية لكل ملف بيانات خام يتم استيراده.
ملاحظة: يمكن استيراد البيانات ومعالجتها على دفعات، أو دفعة واحدة. لن تؤدي إضافة بيانات إلى المشروع إلى التراجع عن أي تحليل تم تنفيذه مسبقا ضمن هذا المشروع.
- بمجرد إضافة ملفات البيانات، انقر فوق إنهاء لبدء معالجة البيانات. بعد تأخير قصير، سيسأل البرنامج عما إذا كان المستخدم يريد حفظ البيانات قبل المتابعة. انقر فوق نعم.
ملاحظة: قد تستغرق المعالجة الأولية عدة ساعات اعتمادا على عدد العينات التي يتم تحليلها وعدد الببتيدات الموجودة في قائمة الببتيد النهائية (الخطوة 4.10) وحجم النافذة الكروماتوغرافية وتواتر الاستحواذ الطيفي. - إذا رغبت في ذلك، قم بتغيير معلمات المعالجة في قائمة التكوين لتغيير معلمات البحث الأيونية. تأكد من استخدام معلمات البحث الأيونية نفسها لكافة البيانات في مشروع معين.
7. تحليل وتصور بيانات HDX
ملاحظة: بمجرد الانتهاء من المعالجة الأولية للبيانات الأولية (الخطوة 6.2) ، سيكون برنامج معالجة HDX قد حدد موقع الببتيدات من قائمة الببتيد (التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.10) في كل ملف من ملفات البيانات الأولية التي تم تحليلها. بمجرد أن يتم تحديد موقع توزيع النظائر للببتيد في القائمة في ملف بيانات خام ، يمثل برنامج معالجة HDX كل نظير ب "عصا" (كما هو الحال في الشكل 6C−E). ثم يتم استخدام الكثافة النسبية من العصي للببتيد معين لحساب امتصاص الديوتريوم بالنسبة إلى الأطياف المرجعية. في حين أن برنامج معالجة HDX يقوم بعمل مثير للإعجاب من تعيين "العصي" بشكل صحيح لمعظم الببتيدات ، فإن المعالجة اليدوية الهامة لقيم امتصاص الديوتريوم ستظل مطلوبة.
- تحليل قيم امتصاص الديوتريوم الببتيد
- حدد الببتيد الأول في قائمة الببتيد وافتح المؤامرة الطيفية المكدسة من قائمة Views. انتقل صعودا وهبوطا في إطار مؤامرة الأطياف مكدسة لرؤية أطياف الكتلة للببتيد المحدد كدالة لوقت تبادل الديوتريوم(الشكل 7D, E).
- تعيين العصي وفكها حسب الضرورة باستخدام نقرات الماوس لضمان وجود توزيع النظائر المناسب في البيانات وتعيين كل قمم النظائر (ستظهر العصي المخصصة باللون الأزرق). النقر على أي من الأطياف في مؤامرة الطيفية مكدسة (الشكل 7D، E) سوف تسمح للمستخدم لتعيين / unassign العصي في إطار عارض البيانات النشطة ( الشكل7C).
- تحقق من تعيينات العصا لكل حالة شحنة عن طريق قلب حالة الشحن في الجزء العلوي من نافذة الرسم الطيفي المكدسة.
- كرر الخطوات 7.1.1−7.1.3 لكل حالة حيوية كيميائية ذات أهمية. يمكن أيضا تبديل الحالة الكيميائية الحيوية في الجزء العلوي من نافذة المؤامرة الطيفية المكدسة. للحصول على قياسات الفرق امتصاص الديوتريوم الأكثر دقة، تأكد من أن يتم تعيين العصي لنفس المجموعة من الدول تهمة لكل دولة البيوكيميائية.
- كرر الخطوات 7.1.1−7.1.4 لكل ببتيد في قائمة الببتيد.
- تحقق من الانحراف المعياري لقيم امتصاص الديوتريوم الببتيد باستخدام خريطة التغطية.
- الوصول إلى خريطة التغطية من القائمة وجهات النظر، والذي يعرض كل الببتيد في قائمة الببتيد المعينة على طول تسلسل الأحماض الأمينية للبروتين من الفائدة (الشكل 8C). لون الببتيدات وفقا للانحراف المعياري النسبي (وحدات دا).
- البحث بصريا الخريطة عن الببتيدات المتطرفة مع الانحراف المعياري النسبي عالية. انقر على الببتيدات المتطرفة في خريطة التغطية لملء المؤامرات الطيفية المكدسة(الشكل 8B)ونافذة عارض البيانات (الشكل 8A) مع الببتيد المستهدف.
- باستخدام مؤامرة الطيفية مكدسة، تحقق بعناية من أن جميع الدول تهمة وجميع النقاط الزمنية للببتيد المتطرفة قد خصصت بشكل مناسب العصي.
ملاحظة: في معظم الأحيان، الببتيدات مع الانحرافات المعيارية الكبيرة (>0.3 دا) لديها قمم النظائر التي لم يتم تعيينها بشكل مناسب العصي من قبل البرنامج (كما هو مبين في الشكل 8B). تعيين أي عصي مفقودة سيمكن بشكل عام من تقليل الانحراف المعياري النسبي للببتيد إلى < 0.3 Da. - إخفاء الببتيد من القائمة إذا كان لا يمكن تخفيض الانحراف المعياري النسبي إلى أقل من 0.3 دا.
- تصدير بيانات الفرق HDX بين اثنين من الدول الكيميائية الحيوية لرسم الخرائط على نموذج هيكلي للبروتين من الفائدة.
- عرض اختلاف الاهتمام في خريطة التغطية. انقر بزر الماوس الأيمن على خريطة التغطية لتصدير بيانات الفرق إلى ملف .csv. تصدير بيانات الحالة (بتنسيق .csv) عن طريق التنقل إلى البيانات | تصدير بيانات الحالة في شريط الأدوات الرئيسي.
ملاحظة: يتم توفير التنسيق المناسب من البيانات الفرق وملفات بيانات الحالة في معلومات الدعم. - استيراد بيانات الفرق، وبيانات الدولة، وملف pdb من البروتين من الفائدة في Deuteros28. اختر الفاصل الزمني للثقة بنسبة 99٪، وحدد تمكين المجموع،وعالج البيانات.
ملاحظة: يجب تثبيت MATLAB على جهاز الكمبيوتر لتشغيل Deuteros. سيستخدم Deuteros القياسات المتماثلة في مجموعة البيانات لحساب الانحراف المعياري لبيانات الامتصاص لكل ببتيد. سيتم استخدام هذا الانحراف المعياري لتحديد فاصل الثقة للتبادل الهام، والذي سيتم عرضه على المؤامرات. - ضمن خيارات PyMOL، حدد امتصاص التصدير | تصدير لتوليد سيناريو بيمول لرسم خريطة المناطق من فرق كبير في الصرف على هيكل pdb من البروتين من الفائدة باستخدام برنامج PyMOL.
ملاحظة: باستخدام سير العمل الموضح في هذا البروتوكول، يكون الفاصل الزمني للثقة بنسبة 99٪ لفارق امتصاص الديوتريوم الكبير للببتيد المعطى عند نقطة زمنية واحدة عادة 0.3−0.5 Da. عادة ما تكون فترة الثقة 99٪ للفرق الذي تم جمعه على جميع نقاط وقت الصرف هي 0.7−1.0 Da.
- عرض اختلاف الاهتمام في خريطة التغطية. انقر بزر الماوس الأيمن على خريطة التغطية لتصدير بيانات الفرق إلى ملف .csv. تصدير بيانات الحالة (بتنسيق .csv) عن طريق التنقل إلى البيانات | تصدير بيانات الحالة في شريط الأدوات الرئيسي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
من الضروري تقييم نوعية الهضم البروتيوليكي وقابلية تكرار سير العمل لكل مجموعة من حقن العينة. وبالتالي ، قبل إجراء فحوصات HDX-MS ، من الضروري وضع ظروف فعالة للتحلل البروتيني للبروتين المهم ، لفصل الببتيدات باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة للمرحلة العكسية وحركة أيونات مرحلة الغاز ، والكشف عن الببتيدات باستخدام التصلب المتعدد. ولهذا الغرض، ينبغي أولا دراسة العينات المرجعية للبروتين ذي الأهمية (التي تجمع في حالة عدم وجود الديوتريوم) (الفرع 3). تظهر البيانات الكروماتوغرافية في الشكل 3A−C مجموع الكروماتوجرامات الأيونية (TICs) لثلاث عينات مرجعية من موالف HalM2 lanthipeptide. وTIC هو تغيير الوقت تعتمد في مجموع جميع التهم أيون في جميع القيم م / ض المدرجة في المسح الطيفي الشامل. وتظهر وجهات نظر أقرب من TICs بين 3 و 8 دقائق في الشكل 3D-F. تمثل أطياف الكتلة الموضحة في الشكل 3G−I خلاصة لجميع أطياف الكتلة على مدى فترة زمنية صغيرة (من 5.0 إلى 5.1 دقيقة) لكل TIC. وينبغي إيلاء اهتمام خاص للميزات التالية في الشكل 3.
أولا، تمثل الذروة الكبيرة القريبة من 9.3 دقيقة في نهاية التدرج أجزاء مهضومة بشكل غير كامل (وبالتالي، كبيرة وأكثر كراهية للماء) من HalM2(الشكل 3A−C). يمكن جعل الهضم أكثر كفاءة عن طريق تقليل تركيز HalM2 ، ولكن هذا سيقلل من كثافة إشارة الببتيد ونسبة الإشارة إلى الضوضاء. ويمكن أيضا أن يكون الهضم أكثر كفاءة عن طريق زيادة وقت الاتصال (من 3 دقائق، والبروتوكول الخطوة 3.3.3) مع العمود pepsin. ومع ذلك، زيادة وقت الاتصال سيؤدي إلى مزيد من تبادل الظهر. في نهاية المطاف، هذه المعلمات تحتاج إلى أن تكون متوازنة للبروتين من الفائدة من أجل توفير تغطية التسلسل المطلوب، وكثافة الإشارة، والاحتفاظ الديوتريوم. ثانيا، يجب أن يكون شكل وشدة ملفات تعريف TIC متشابهين (كما هو الحال في الشكل 3D−F). وهذا يشير إلى أن الهضم البروتيوليكي ل HalM2 قابل للاستنساخ وبنفس الكفاءة في جميع العينات المرجعية الثلاث. ومن المتوقع أن عملية هضم مماثلة لعينة تبادل الديوتريوم سوف تنتج نفس المجموعة من الببتيدات مع أوقات الاحتفاظ مماثلة. ثالثا، ينبغي أن تكون أطياف الكتلة على مدى فترة زمنية معينة متشابهة أيضا(الشكل 3G−I). تظهر المقارنة البصرية السريعة لأطياف الكتلة المتلخيصة على مدى الفترة الزمنية 5.0-5.1 دقيقة من الفصل اللوني أن الإشارات الطيفية الكتلية في كل عينة متشابهة جدا بالفعل ، مما يوفر الثقة في وجود ببتيدات مماثلة في كل عينة وتسيل في أوقات مماثلة من عمود C18. وينبغي إجراء فحص بصري سريع مماثل على فترات زمنية أخرى عبر الرسم اللوني.
بعد التحقق بصريا من التشابه في بيانات LC-MS للعينات المرجعية ، يتم استخدام برنامج البروتيوميات للبحث في بيانات MS عن الببتيدات المشتقة من تسلسل الأحماض الأمينية للبروتين المثير للاهتمام. بعد تحديد بنك بيانات تسلسل البروتين (تسلسل الأحماض الأمينية للبروتين المثير للاهتمام) والمعالجة ومعلمات سير العمل كما هو موضح في خطوات البروتوكول 4.2-4.4 ، تتم معالجة كل عينة مرجعية فردية للكشف عن الببتيدات الببتيدية التي تتطابق مع الببتيدات المتوقعة المشتقة من البروتين المثير للاهتمام. يظهر مثال على إخراج برنامج بروتيوميكس لعينة مرجعية HalM2 غير مقلد في الشكل 4. وينبغي إيلاء اهتمام خاص للميزات التالية. أولا، أي إشارة MS التي يتم مطابقتها مع الببتيد محددة ضمن البروتين من الفائدة وفقا للقيم المحددة في المعالجة والمعلمات سير العمل سوف تكون ملونة الأزرق في الطيف السفلي. إذا تمت معالجة عينة مرجعية "بنجاح"، ستظهر غالبية الإشارات باللون الأزرق (كما هو الحال بالنسبة للبيانات في الشكل 4). علاوة على ذلك، في أعلى اللوحة اليسرى، تأكد من تبديل "عامل التصفية موافق" إلى علامة الاختيار الخضراء. عندما يتم ذلك، فإن الإحصاءات في أعلى شريط من أعلى لوحة اليمين (أبرز باللون الأزرق في الشكل 4)تعكس فقط تلك الببتيدات التي تعطي درجات ثقة عالية. تظهر هذه الببتيدات دقة كتلة منخفضة في جزء في المليون ، أيونات مجزأة متعددة ، وارتباط جيد بين أوقات الاحتفاظ بالشظايا والأيونات الأم ، وتعتبر هويات واثقة. بالنسبة للعينة المرجعية HalM2 الموضحة ، تم اكتشاف 1421 ببتيدات بدرجات عالية ، تغطي 99.6٪ من تسلسل HalM2. يجب أن تكون تغطية التسلسل بنسبة 100٪ تقريبا قابلة للتحقيق بالنسبة لمعظم البروتينات باستخدام سير عمل LC-MS من أسفل إلى أعلى الموضح في القسم 3 من البروتوكول. وعلاوة على ذلك، يتم جدولة إحصاءات مفيدة إضافية لكل الببتيد في لوحة أعلى اليمين، بما في ذلك الخطأ الشامل، وقت الاحتفاظ بالسلائف، وعدد من جزء (أيونات المنتج)، والقائمة الكاملة من الأيونات جزء بالاسم، ووقت الانجراف التنقل أيون. هذه المعلومات مفيدة لتفسير النتائج ، والتي يجب أن تركز دائما على الببتيدات الأكثر ثقة.
يجب تحديد قائمة الببتيد النهائية من خلال عتبات إضافية في برنامج معالجة HDX. بعد تحليل البيانات المرجعية لإنشاء قائمة الببتيد (قسم البروتوكول 4) ، يجب استيراد الإخراج إلى برنامج معالجة HDX للحصول على عتبات إضافية. سيتم تخزين ملفات الإخراج في دليل كما هو معرف في الخطوة البروتوكول 4.5 مع ملحق الملف "..._IA_final_peptide.csv". عند تحميل الإخراج إلى برنامج معالجة HDX ، سيتم عرض القائمة الكاملة للببتيدات في لوحة "معاينة الببتيد" (الشكل 5) ، وسيتم عرض عدد الببتيدات وتغطية التسلسل والتكرار في الزاوية اليمنى السفلية من النافذة. ستتغير هذه القيم في الوقت الحقيقي مع تطبيق عتبات إضافية. بعد النقر فوق التالي، يمكن تعيين قيم العتبة في الحقول المشار إليها. المرشحات الأكثر أهمية هي "عتبة الملف" التي تتطلب أن تكون جميع الببتيدات موجودة في كل عينة من العينات المرجعية الثلاث ، "الحد الأقصى للخطأ MH+ (جزء في المليون)" الذي يجب تعيينه إلى قيمة < 10 جزء في المليون ، و "الحد الأدنى من المنتجات المتتالية" ، والذي يتطلب الببتيد لتوليد اثنين على الأقل من أيونات الأجزاء المتتالية أثناء مرحلة MSMS (أي طاقة الاصطدام العالية) من سير عمل MSE (خطوة البروتوكول 3.3.7.2).
القيد التقني الأكثر أهمية من فحص HDX-MS هو تبادل الديوتريوم الخلفي للبروتيوم الذي يحدث بمجرد إخماد عينات الديوتريوم المتبادلة (مع العازلة بروتياتيد). يستمر تبادل الخلفي أثناء الهضم protease و LC-MS أجزاء من سير العمل. التبادل الخلفي أمر لا مفر منه، ولكن إذا كان درجة الحموضة ودرجة الحرارة وتوقيت جميع خطوات ما بعد التبريد يتم التحكم فيها بعناية كما هو موضح في البروتوكول، يمكن الحفاظ على 60٪-70٪ من تسمية الديوتريوم. لهذا السبب ، من الضروري التحقق خلال المراحل المبكرة من تطور المقايسة من أن معظم الببتيدات تحتفظ بالديوتريوم. ويمكن تحقيق ذلك بسرعة بمقارنة البيانات الأولية لعينة مقلدة مع بيانات عينة مرجعية. كما تم القيام به لضمان استنساخ العينات المرجعية(الشكل 3)،قارن TICs من العينات المرجعية التي يتم تبادلها مع الديوتريوم وغير المصنفة، مما يضمن أن أشكال الملامح تشبه بعضها البعض. بالإضافة إلى ذلك، جمع أطياف الكتلة على نفس الفاصل الزمني الكروماتوغرافي في كلتا العينتين. وينبغي أن تظهر معظم الببتيدات في عينة الديوتريوم المتبادلة تحولات واضحة في توزيعاتها النظيرية نحو قيم أعلى m/z (كما هو الحال في الشكل 6). تشير هذه البيانات إلى أنه يتم الحفاظ على جزء كبير من ملصق الديوتريوم طوال فترة إخماد الحمض وهضم البيبسين وجمع بيانات LC-MS.
وبعد التحقق من أن سير العمل يوفر احتباس الكافي من الديوتريوم، يلزم تحديد كمية امتصاص الديوتريوم. وبالتالي، يتم استيراد البيانات الأولية لعينات تبادل الديوتريوم إلى برنامج معالجة HDX. وباستخدام العينات المرجعية وقائمة الببتيد النهائية، سيقوم برنامج معالجة HDX بتحديد موقع الببتيدات من قائمة الببتيد في كل ملف من ملفات البيانات الخام وسيعين "عصيا" لكل قمة من قمم النظائر. في البيانات التمثيلية ل HalM2 الموضحة في الشكل 7، يتم تلوين العصي المعينة بنجاح باللون الأزرق في جميع الأطياف. بعد تعيين العصي، سيتم تحديد قيمة m/z المائية للتوزيع النظيري بواسطة البرنامج واستخدامها لحساب امتصاص الديوتريوم بالنسبة للعينة المرجعية غير المذابة. وينبغي التحقق يدويا من قيمة تبادل الديوتريوم لكل ببتيد. في الشكل 7، يظهر الببتيد المختار حاليا (HIDKLTVGL ، الذي يمتد على بقايا HalM2 110−118) في اللوحة اليسرى لمشاهد البيانات الرئيسي(الشكل 7A). تظهر اللوحات الأخرى بيانات HDX المرتبطة بهذا الببتيد. النقر على أي الببتيد في قائمة الببتيد سوف تملأ لوحات أخرى مع بيانات HDX من هذا الببتيد. يظهر الشكل 7B قطع امتصاص الديوتريوم للببتيد 110−118. تحتوي مجموعة البيانات هذه على أربع نقاط زمنية للتبادل: 0.5 و5 و30 و240 دقيقة (تم جمعها في ثلاث نسخ). تم جمع بيانات التبادل لدولتين كيميائيتين حيويتين: إنزيم HalM2 الحر (الأحمر) وانزيم HalM2 المعقد إلى AMPPNP وببتيده الركيزة HalA2 (أزرق). لاحظ فرق امتصاص الديوتريوم الكبير في الببتيد 110−118 عبر مسار الوقت بأكمله والدقة العالية للقياسات المتماثلة (تظهر أشرطة الخطأ على المؤامرة في الشكل 7B). وبشكل عام، سيتم الحصول على دقة مماثلة في قياس الامتصاص بالنسبة لمعظم الببتيدات، مما يؤكد على إمكانية إعادة إنتاج سير العمل المعروض في هذا البروتوكول. عند الربط الليجاندي (المنحنى الأزرق في الشكل 7B)،يبدو أن رابطة الببتيد في منطقة HalM2 110−118 تخضع لحماية كبيرة من تبادل الديوتريوم، مما يشير إلى أن الأحماض الأمينية في منطقة 110-118 أصبحت أكثر تنظيما بشكل ثابت عند الربط الليجاندي. وأشار الطفرات اللاحقة من هذه المنطقة دورا في ربط الببتيد السلائف, HalA220. كما هو موضح في الشكل 7 هي المؤامرات الطيفية مكدسة للدولة HalM2 (الشكل 7D) وHalM2: AMPPNP: HalA2 الدولة (الشكل 7E). في هذه المؤامرات، يزيد وقت التبادل من الأسفل إلى الأعلى. الزيادة الجماعية للببتيد 110−118 عند تبادل الديوتريوم في نقاط زمنية أطول واضحة من الفحص البصري. ومن الواضح أيضا أن الببتيد 110−118 يملتصاص المزيد من الديوتريوم في حالة HalM2(الشكل 7D)مما هو عليه في الحالة المتربطة بالكامل(الشكل 7E). إذا لزم الأمر ، فإن النقر على أي من المؤامرات الفرعية في الشكل 7D أو الشكل 7E، سيسمح للمستخدم بتعديل تعيين العصي يدويا في عارض البيانات الرئيسي (الشكل 7C). عند تعيين عصا / unassignment ، فإن برنامج معالجة HDX إعادة حساب قيم امتصاص الديوتريوم ، وسيتم تحديث جميع المؤامرات في الوقت الحقيقي. وبالمثل ، فإن النقر على نقاط البيانات الفردية في اللوحة B سيملأ عارض البيانات في اللوحة C لتعيين العصا اليدوية.
بعد تعيين العصي لكل نقطة زمنية للببتيد والتبادل لجميع الدول الكيميائية الحيوية ، يجب التحقق من الانحراف المعياري لقيم الامتصاص المقاسة. هذا هو أسهل لأداء مع خريطة التغطية ومؤامرة الطيفية مكدسة (الشكل 8). في خريطة التغطية (الشكل 8C)، حدد الولاية ووقت تبادل الاهتمام، ثم حدد الانحراف المعياري النسبي للإقبال. سيتم تلوين الببتيدات في خريطة التغطية وفقا للانحراف المعياري في قيمة امتصاص الديوتريوم المقاسة. وبهذه الطريقة، سيكون من السهل جدا تحديد الببتيدات بصريا التي تحتوي على النظائر عصا سوء المهام. سيؤدي النقر على الببتيد المتطرف (مع انحراف معياري عال) في خريطة التغطية إلى ملء عارض البيانات الرئيسي ومؤامرة الأطياف المكدسة ببيانات HDX من الببتيد المتطرف. يمكن بعد ذلك تعديل تعيينات العصا لكل نقطة زمنية وحالة الشحن حسب الحاجة لتصحيح قيمة الامتصاص المقاسة. مرة أخرى ، سيقوم برنامج معالجة HDX بتحديث جميع عروض البيانات في الوقت الفعلي مع تغيير تعيينات العصا.
بعد تنظيم مجموعة بيانات HDX بشكل كامل ، يجب النظر في أهمية قياس فرق امتصاص الديوتريوم لكل ببتيد قبل تفسير البيانات. باستخدام نهج وصفه إنجين وزملاء العمل29، قمنا بتقدير متوسط قيمة امتصاص 0.1 ± 0.1 Da لبروتين HalM2 باستخدام سير العمل الموصوف في البروتوكولأعلاه 20. تتسق هذه القيمة مع الأخطاء التي أبلغ عنها الآخرون لعمليات سير عمل HDX تبادل مستمر مماثلة من أسفل إلى أعلى29،30. في الآونة الأخيرة ، وضعت Politis وزملاء العمل Deuteros ، أداة مفيدة مفتوحة المصدر (نفذت في MATLAB) لتحديد الاختلافات الكبيرة في امتصاص سريع في مجموعات بيانات HDX28. يتم تضمين ملفات الإدخال التمثيلية ل Deuteros ("State_Data_for_Deuteros" و "Difference_Data_for_Deuteros") في المعلومات الداعمة. إذا تم تصديرها مباشرة من برنامج معالجة HDX الموضح في هذا البروتوكول (جدول المواد) ، فإن ملفات بيانات الفرق والدولة سيكون لها التنسيق المناسب لقراءة الملفات من قبل Deuteros. إذا تم إنشاء بيانات HDX على نظام LC-MS مختلف، يجب إنشاء ملفات البيانات التي تشبه تلك المتوفرة في المعلومات الداعمة يدويا.
يتم عرض مساحة عمل Dueteros في الشكل 9. بمجرد استيراد البيانات إلى Deuteros ، يحدد المستخدم حد الثقة المطلوب (> 98٪ مستحسن) والنقر فوق استيراد وحساب. بالنسبة لخريطة البيانات التي تم تسويتها، حدد تغطية لنوع البيانات ومطلقة لمقياس الألوان. انقر فوق الرسم. لمؤامرات الغابة، حدد عامل التصفية الثنائي كنوع بيانات، وفلتر الثقة المطلوب وتمكين المجموع. عند النقر على مؤامرة، وسوف مؤامرة Deuteros جميع الببتيدات في كل نقطة وقت الصرف كدالة على موقفهم في تسلسل الأحماض الأمينية وقيم امتصاص الديوتريوم الخاصة بهم. سيتم تلوين الببتيدات التي تظهر تبادلا كبيرا إما باللون الأحمر أو الأزرق ، اعتمادا على ما إذا كان الببتيد يتناول الديوتريوم أكثر أو أقل ، على التوالي ، وفقا للفرق الذي يتم حسابه. يتم حساب قيمة الأهمية المبلغ عنها في كل قطعة أرض (تتراوح بين 0.39 إلى 0.72 دا في البيانات المرسومة في الشكل 9)من الانحرافات المعيارية لاختلافات الامتصاص التي تقاس لكل ببتيد كما تم تحديده من القياسات المتماثلة الموجودة داخل مجموعة البيانات. يتم عرض فواصل الثقة كأشرطة متقطعة عبر كل قطعة فردية. إذا تم تمكينه ، فإن "Sum" يضيف ببساطة فرق الامتصاص الذي يقاس في كل نقطة زمنية لكل ببتيد. وأخيرا ، لتصور بيانات امتصاص على بنية ثلاثية الأبعاد من البروتين من الفائدة ، واختيار امتصاص التصدير في إطار خيارات PyMOL ، ثم تصدير. سيقوم Deuteros بإنشاء سيناريو PyMOL يمكن سحبه وإسقاطه في مساحة عمل PyMOL التي تحتوي على ملف pdb المفتوح للبروتين المثير للاهتمام.
تم استخدام سير عمل HDX-MS المعروض في هذا البروتوكول لتوصيف الخصائص الكيميائية الحيوية لأنزيم (HalM2) الذي يحفز سلسلة من التعديلات اللاحقة للترجمة على الببتيد المشفر وراثيا (HalA2)20. في الشكل 10، تظهر نتائج HDX-MS التمثيلية لربط الببتيد HalA2 بمجمع HalM2:AMP-PNP. تعرض اللوحة A خريطة تغطية HalM2، حيث يشير اللون إلى فرق الامتصاص النسبي بين الحالة الكيميائية الحيوية [HalM2:AMPPNP] وحالة [HalM2:AMPPNP:HalA2]. تم استخدام الديوترو لرسم خريطة هذه الاختلافات امتصاص على نموذج التشوهولوجيا لانزيم HalM2 (الشكل 10B, C). الببتيدات التي هي حمراء ملونة تشير إلى انخفاض في امتصاص الديوتريوم على HalA2 ملزمة، مما يشير إلى أن هذه المناطق من HalM2 قد تشارك مباشرة في ربط الببتيد السلائف. للتحقيق في هذه الفرضية، تم تحور المناطق I-III وتم التحقيق في الخصائص الحركية للإنزيمات المتغيرة. أدت الطفرات في المنطقة 1 و3 إلى اضطرابات كبيرة في تقارب ربط الببتيد HalA2 ، مما يشير إلى أن هذه المناطق من HalM2 إما تتفاعل مع ركيزة الببتيد مباشرة ، أو مطلوب منها تشكيل هياكل تمكن HalA2 ملزمة. وعلى النقيض من ذلك، لم يكن للطفرة في المنطقة الثانية أي تأثير على تقارب HalA2 الملزم، ولكن هذا المتحول كان خاليا تقريبا من النشاط الحفاز. أحد التفسيرات لهذه النتيجة هو أن تنظيم المنطقة الثانية التي لوحظت عند ربط HalA2 يؤدي إلى تغيير تشكيلي ينشط الإنزيم. وتجدر الإشارة إلى أنه قبل هذه الدراسة، لم تكن هناك معلومات متاحة عن وضع الربط HalM2-HalA2 أو عن التغيرات التكوينية ذات الصلة الحفازة في النظام، ويرجع ذلك أساسا إلى أن الحجم الكبير والطبيعة المرنة لكل من HalM2 وHalA2 قد حالت دون إجراء دراسات هيكلية. وبالتالي، توضح هذه البيانات التمثيلية عن موالف HalM2 lanthipeptide كيف يمكن استخدام HDX-MS لتحديد المناطق ذات الصلة وظيفيا بسرعة لأنظمة الإنزيم الديناميكية هيكليا - حتى في غياب بيانات هيكلية عالية الدقة.
الشكل 1: تبادل مستمر، من أسفل إلى أعلى HDX-MS سير العمل. راجع النص للحصول على التفاصيل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: يعتمد معدل HDX على ديناميات تشكيل البروتين(kopen و kclose)ومعدل التبادل الكيميائي المعتمد على الرقم القياسي للروابط N-H في العمود الفقري للبروتين لسندات N-D (kchem). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: البيانات التمثيلية LC-MS لعينات HalM2 المرجعية الثلاثية. يمثل الرقم في الزاوية اليمنى العليا من كل لوحة إجمالي عدد الأيونات. يعرض كل صف بيانات لعينة مرجع مختلفة. يعرض العمود الأول(A−C)مجموع كروماتوز الأيونات (TICs). تمثل الذروة الكبيرة عند 9.3 دقيقة الببتيدات الكبيرة غير المهضومة. يظهر العمود الأوسط(D−F)رؤية أقرب ل TICs بين 3 و 8 دقائق. لاحظ الاتفاق الجيد لأشكال التشكيلات الجانبية ، مما يشير إلى مزيج كامن مماثل من إشارات الببتيد في كل عينة مرجعية عبر الرسم اللوني بأكمله. يظهر العمود الثالث(G−I)أطياف الكتلة لكل عينة مرجعية تم إنشاؤها من خلال تلخيص جميع أطياف الكتلة المسجلة بين النقطة الزمنية 5.0 و 5.1 دقيقة من المدى الكروماتوغرافي. ويشير الفحص البصري لهذه البيانات إلى أن العديد من الببتيدات نفسها يجري اكتشافها في كل عينة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مخرجات برامج بروتيوميكس التمثيلية لعينة مرجعية من HalM2. تعرض اللوحة العلوية اليسرى القائمة الكاملة للببتيدات الببتيدية المشتقة من HalM2 التي تم اكتشافها في بيانات التصلب المتعدد. لاحظ أن "عامل تصفية موافق" يظهر علامة الاختيار الخضراء. هذا تصفية البيانات وفقا لدرجة الثقة ويزيل تحديد الببتيد من انخفاض الثقة. يظهر الشريط العلوي من اللوحة اليمنى (المميز باللون الأزرق) إحصاءات تراكمية لمجموعة الببتيدات ذات الدرجات العالية. وأهم الإحصاءات هي عدد الببتيدات المكتشفة (421 1 في هذه الحالة) وتغطية التسلسل (99.6 في المائة في هذه الحالة). وتظهر أيضا إحصاءات إضافية لكل الببتيد في أعلى لوحة اليمنى. كل عمود في جدول البيانات هذا قابل للفرز. تظهر اللوحة السفلية جميع إشارات التصلب المتعدد التي تمت مطابقتها مع الببتيد الببتيدي المشتق من HalM2 المتوقع. لاحظ أنه تم تعيين معظم إشارات MS وهي زرقاء ملونة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: عتبات إضافية في برنامج معالجة HDX. يتم استيراد مخرجات برامج البروتيوميات لكل عينة من العينات المرجعية الثلاث HalM2 إلى برنامج معالجة HDX (اللوحة اليسرى). بعد استيراد البيانات، يتم تنفيذ عتبات إضافية (اللوحة اليمنى). يشير حقل "الحد الأدنى للمنتجات المتتالية" إلى أيونات الشظايا الناتجة عن انشقاق سندات الببتيد المجاورة في الببتيد. تسمح المعلمة "الحد الأدنى لخطأ MH+ " للمستخدم بتحديد دقة الكتلة المقبولة ، وتسمح "عتبة الملف" للمستخدم بتقييد الببتيدات فقط لتلك الببتيدات التي تم اكتشافها في جميع الملفات المرجعية الثلاثة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: بيانات تمثيلية لعينة مرجعية من نوع HalM2 (حمراء) وعينة HalM2 محتضنة في المخزن المؤقت D2O لمدة 5 دقائق (باللون الأخضر). وقد خضعت كلتا العينتين لسير عمل LC-MS من أسفل إلى أعلى الموصوف في القسم 3 من البروتوكول. يظهر العمود الأيسر أطياف الكتلة التي تم تلخيصها خلال النافذة الزمنية 6.0-6.1 دقيقة. تظهر الأعمدة اليمنى الثلاثة وجهات نظر أقرب لنفس أطياف الكتلة ، حيث يكون التحول إلى قيم m / z أعلى في العينة deuterated (أخضر ، أعلى) واضحا لمعظم إشارات الببتيد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: لقطة شاشة لمساحة العمل في برنامج معالجة HDX. (أ)قائمة الببتيدات المشتقة من HalM2 التي تم الحصول عليها من تحليل العينات المرجعية HalM2 مع برنامج البروتيوميات(الشكل 3)والعتبة اللاحقة في برنامج معالجة HDX (الشكل 4). يتم تمييز الببتيد المختار حاليا (HIDKLTVGL، الذي يمتد على بقايا HalM2 110−118) باللون الأزرق. (ب)منحنيات امتصاص الديوتريوم (كدالة لوقت التبادل) للدولتين الكيميائية الحيوية ذات الاهتمام: إنزيم HalM2 الحر ، وانزيم HalM2 المرتبط ب AMPPNP والسلائف lanthipeptide ، HalA2. (ج)الطيف الكتلي للعينة المختارة بنشاط (في هذه الحالة، واحدة من العينات المرجعية HalM2 غير المذابة). يمكن تعيين/إلغاء تعيين العصي الزرقاء في اللوحة C يدويا حسب الحاجة إذا لم يتم تعيينها بشكل صحيح من قبل برنامج معالجة HDX أثناء معالجة البيانات الأولية. (D,E) المؤامرات الطيفية مكدسة للدولة HalM2(D)وHalM2:AMPPNP:HalA2 الدولة (ه). الزيادة المعتمدة على الوقت في امتصاص الديوتريوم مرئية بسهولة ، وكذلك فرق الامتصاص بين الولايتين الكيميائيتين الحيويتين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: تقليل الانحراف المعياري في قيم الامتصاص المقاسة. توفر خريطة التغطية في برنامج معالجة HDX (لوحة C) وسيلة مريحة للتعرف بسرعة على الببتيدات ذات الانحرافات المعيارية الكبيرة في قيم امتصاص الديوتريوم المقاسة. في هذه الحالة الافتراضية، يتم إلغاء تعيين بعض قمم النظائر (العصي الزرقاء) للببتيد المشتق من HalM2 الذي يمتد على المخلفات 110−118 لنقاط وقت التبادل لمدة 5 دقائق (العصي الرمادية في اللوحة B). وهذا يؤدي إلى انحراف معياري كبير في قيمة امتصاص الديوتريوم التي تقاس لنقطة وقت الصرف 5 دقائق. الانحراف المعياري الكبير واضح بسهولة من اللون الأزرق للببتيد 110−118 في خريطة التغطية (لوحة C) ومن نقطة البيانات مبعثر وشريط خطأ كبير في مؤامرة امتصاص (لوحة A). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: مساحة عمل ديوتيروس. في هذا المثال، قيم الفرق امتصاص تم حسابها في برنامج معالجة HDX عن طريق طرح امتصاص الديوتريوم من HalM2:AMPPNP:HalA2 الحالة من حالة HalM2:AMPPNP. كان الهدف من المقارنة هو تصور كيف غير ربط الببتيد (HalA2) الديناميكيات الهيكلية لمجمع HalM2:AMPPNP. تحتوي مجموعة البيانات على 4 نقاط وقت تبادل (0.5 و5 و30 و240 دقيقة). ويتضح الفرق امتصاص لكل الببتيد في كل نقطة وقت الصرف في المؤامرات وودز. تشير الببتيدات الملونة في قطع وودز إلى الببتيدات التي تظهر فرقا كبيرا في الإقبال ، كما هو محدد من خلال الانحراف المعياري للقياسات المتماثلة الموجودة في مجموعة البيانات وحدود الثقة التي يحددها المستخدم المحددة في Deuteros. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 10: HDX-MS البيانات أدلة التحليل الوظيفي للربط الببتيد وتنشيط allosteric في synthetase lanthipeptide HalM2. تم التحقيق في تغيير امتصاص الديوتريوم عند ربط الببتيد السلائف HalA2 إلى موالف HalM2 lanthipeptide. يتم رسم الفرق امتصاص لكل الببتيد بعد رد فعل تبادل 5 دقائق (A). تم إنشاء هذه المؤامرة في برنامج معالجة HDX. الببتيدات الملونة الأحمر والأزرق تخضع امتصاص الديوتريوم أقل وأكثر، على التوالي، في وجود الببتيد HalA2. يتم تعيين هذه HDX "النقاط الساخنة" على نموذج HalM2 homology (B ، C). تم تحديد الببتيدات التي تمر باختلافات كبيرة في الصرف في ديوتيروس. تم إنشاء البرنامج النصي PyMOL المستخدمة لتعيين قيم الاختلاف على نموذج homology في Deuteros. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوفر سير عمل HDX-MS المعروض في هذا البروتوكول منصة قوية بشكل ملحوظ لرسم خرائط التوزيع المكاني للعناصر الديناميكية هيكليا في البروتينات والتحقيق في كيفية تغير هذه الديناميكيات استجابة للاضطرابات (الربط الرابط ، وتولد الانزيم ، وما إلى ذلك). يحمل HDX-MS العديد من المزايا المتميزة على نهج البيولوجيا الهيكلية الأخرى التي تستخدم عادة للتحقيق في الديناميكيات التركيبية. وعلى الأخص، هناك حاجة إلى كميات صغيرة فقط من البروتين. باستخدام سير العمل الموصوف هنا ، توفر عينة 1 مل من بروتين 1 ميكرومتر ما يكفي من المواد لتفاعلات HDX ثلاثية الليكات التي تحتوي كل منها على 5 نقاط زمنية للتبادل. وعلاوة على ذلك، لا يوجد تقريبا حد لحجم البروتين من الفائدة، ومجمعات البروتين قابلة على قدم المساواة لنهج HDX-MS. الحد الأقصى للحجم مقيد فقط بمدى إمكانية حل الببتيدات الببتيدية كروماتوغرافيا، وفي أبعاد حركة m/z وأيون. وبالتالي ، بالنسبة للعديد من البروتينات / مجمعات البروتين ، سوف توفر HDX-MS معلومات قيمة عن واجهات التفاعل بين البروتين والبروتين ، ومواقع الربط ليغاند ، وديناميات تشكيلية ، وشبكات allosteric. وأخيرا ، يتم إجراء رد فعل HDX في ظل ظروف لطيفة وشبه أصلية دون الحاجة إلى وضع علامات / هندسة خاصة بالموقع للبروتين ، والتي يجب أن تساعد على ضمان الحفاظ على النشاط الداخلي. القيد الرئيسي للنهج (من حيث المعلومات الميكانيكية التي يوفرها عن البروتين من الفائدة) هو أن بيانات HDX مستوى الببتيد هو من الدقة المكانية منخفضة بطبيعتها. وبالتالي، فإن البيانات كافية للاستدلال على أن تغييرا في البنية الثانوية يحدث، ولكن التأثيرات الميكانيكية للاضطرابات الهيكلية تتطلب دقة أعلى (على سبيل المثال، NMR، cryoEM، أو بلورة الأشعة السينية) الهياكل، ودراسات الحساب، و / أو الدراسات الكيميائية الحيوية لتفسيرها بشكل كامل.
ولضمان إعادة إنتاج النتائج وموثوقيتها، ينبغي مراعاة عدة جوانب حاسمة من البروتوكول. أولا ، يعتمد مدى تبادل الديوتريوم أثناء تفاعل HDX ومدى التبادل الخلفي أثناء العمل والتحليل بشكل كبير على درجة الحموضة والوقت ودرجة الحرارة. وبالتالي، يجب أن تكون إجراءات إعداد المخازن المؤقتة وتفاعلات HDX وأساليب LC-MS منهجية قدر الإمكان لتقليل التباين في هذه المعلمات المادية عبر مجموعات البيانات. كلما كان ذلك ممكنا، يجب أن يتم إجراء تفاعلات HDX للدول الكيميائية الحيوية التي سيتم مقارنتها من قبل نفس الباحث في نفس اليوم، وينبغي جمع بيانات LC-MS لهذه العينات على مدى أيام متتالية مع نفس الدفعة من المذيبات. مع مرور الوقت ، ستنخفض كفاءة هضم البيبسين أيضا ، لذلك فهو الأمثل للعينات التي سيتم مقارنتها ليتم هضمها وتحليلها في غضون فترة زمنية ضيقة نسبيا - خاصة إذا كان عمود البيبسين يستخدم لهضم العديد من أنواع العينات الأخرى. من الممارسات الجيدة التحقق بشكل دوري من كفاءة الهضم لعمود البيبسين باستخدام بروتين قياسي. ولتحقيق ذلك، يمكن إنشاء مشروع مخصص لتجهيز ال HDX حيث يمكن مقارنة العينات المهضومة حديثا مع العينات القديمة لضمان الكشف عن نفس المجموعة من الببتيدات المستهدفة بكثافة مماثلة.
في حين أن سير العمل المعروض في هذا البروتوكول يجب أن يوفر بيانات كافية للعديد من أنظمة الإنزيم / البروتين ، هناك العديد من النقاط المحتملة للتحسين. أولا، يمكن تعديل المقياس الزمني لرد فعل HDX لالتقاط الديناميكيات الأسرع/الأبطأ. وعلى الأخص، فإن العديد من الإنزيمات تحتوي على عناصر ديناميكية للغاية التي تصبح متبادلة بالكامل في غضون عدة ثوان. إذا كانت هذه العناصر الحيوية للغاية هي ذات أهمية، وقد تم الإبلاغ عن أساليب لحالة ما قبل ثابت، تبادل مستمر HDX-MS في الأدب31. ثانيا، يمكن تغيير شروط طريقة LC بسهولة لتغيير كفاءة الهضم (التي تحدد في نهاية المطاف تغطية التسلسل) واحتباس الديوتريوم (الذي يحدد في نهاية المطاف حساسية الطريقة). وبالنظر إلى مدة ودرجة حرارة الهضم البيبسين، ومعدلات تدفق أبطأ وارتفاع درجة الحرارة سوف تفضل الهضم أكثر شمولا من البروتين. يمكن أيضا زيادة تركيز البروتين في فحص HDX إذا كانت كثافة الإشارة منخفضة جدا ، أو انخفضت إذا كان هضم البيبسين غير فعال للغاية. وبالنظر إلى تدرج الأسيتونتريل المستخدم لفصل الببتيدات الببتيدية على عمود C18 التحليلي ، فإن التدرج الأسرع سيحافظ على تسمية الديوتريوم ، ولكن على حساب الدقة اللونية للببتيدات الببتيدية الموجودة في خليط التفاعل المهضوم. بالنسبة للبروتينات الأصغر (~200 من الأحماض الأمينية) حيث يوجد عدد أقل من الببتيدات الببتيدية في الخلاصة، قد يكون من الأسهل تنفيذ تدرج LC الأسرع. بالنسبة للبروتينات الكبيرة مثل HalM2 (~ 1000 حمض أميني) ، هناك حاجة إلى تدرج أطول لحل التعقيد الطيفي الإضافي الناتج عن العدد الأكبر من الببتيدات في الخليط. وفي هذا السيناريو الأخير، يمكن أن يساعد إدراج فصل حركة أيونات مرحلة الغاز على تحسين القدرة القصوى للتحليل بشكل كبير. ويأتي إدراج فصل الحركة الأيونية بتكلفة إشارة منخفضة قليلا إلى نسبة الضوضاء. وأخيرا، تجدر الإشارة إلى أن بيانات MS لعينات HDX لا تحتاج إلى جمعها في وضع MSE. ولا يشترط الجزء المتعلق ب MSMS من دورة واجب MSE (أي الجزء العالي من طاقة الاصطدام، الخطوة 3-3-7-2) إلا بالنسبة للعينات المرجعية من أجل تحديد قائمة الببتيد (الباب 4 من البروتوكول). وبالتالي، يجب تحليل عينات HDX في وضع MS فقط لزيادة نسبة الإشارة:الضوضاء.
إذا كان سير العمل الموضح في هذا البروتوكول يعمل بشكل صحيح، يجب أن تظهر الببتيدات التبادل الكامل قيمة امتصاص الديوتريوم النسبية من 60٪-70٪. إذا تم العثور على امتصاص الديوتريوم لتكون أقل بكثير من هذا (للببتيد المذيبات المعرضة، غير المحمية)، والتفسير الأكثر احتمالا هو أن درجة الحموضة للعينة يتغير خلال جزء من العمل / التحليل. في هذا السيناريو، يجب استخدام قطب كهربائي microtip لمراقبة درجة الحموضة بدقة من المقايسة HDX ورد الفعل المروي aliquot. وينبغي أيضا التحقق من رقم الحموضة للمذيبات LC-MS. لتقليل حدوث هذه المشكلة، يوصى بشدة بإعداد وتخزين حلول المخزون المركزة لكافة المخازن المؤقتة والكواشف اللازمة للمسايسة (كما هو موضح في قسم البروتوكول 1).
في السنوات الأخيرة، ظهرت HDX-MS كأداة تحليلية قوية للتحقيق في الديناميات الهيكلية البروتين. وقد أدى تطوير أنظمة LC-MS المتاحة تجاريا والمصممة والمحسنة لتجارب HDX (مثل النظام المستخدم في هذه الدراسة والمدرجة في المواد) إلى جانب حزم البرامج القوية ، إلى توسيع نهج HDX-MS ليشمل العديد من المختبرات الأكاديمية والصناعية ، وحول ما كان في السابق تقنية متخصصة قبل 15 عاما إلى منصة تحليلية أكثر سهولة للمستخدم. على الرغم من القيود المفروضة على الاستبانة المكانية ، يوفر HDX-MS قياسات كمية وقابلة للاستنساخ للغاية على حركات البروتين ومناسب بشكل مثالي لدراسة الإنزيمات الديناميكية المطابقة التي يصعب التحقيق فيها مع النهج الأخرى. وبسبب هذه الخصائص، يملأ HDX-MS مكانة أساسية في البيولوجيا الهيكلية لأنظمة البروتين المضطربة والديناميكية التي لها صلة في العديد من المجالات الأساسية للبيولوجيا والطب. وعلى هذا النحو، من المتوقع أن تظل تحليلات HDX-MS أداة هامة في ترسانة عالم الأحياء الهيكلي في المستقبل المنظور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا ما نكشفه
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل من قبل مجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية في كندا، ومؤسسة كيبيك للطبيعة والتكنولوجيات، والمؤسسة الكندية للابتكار، وصناديق بدء جامعة ماكغيل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| [glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib) | BioBasic | NA | |
| 0.5 mL Amicon Ultracel 10k centrifugal filtration device (Millipore) | Milipore Sigma | UFC501096 | |
| acetonitrile | Fisher | A955-1 | |
| AMP-PNP | SIGMA | A2647-25MG | |
| ATP | SIGMA | a2383-5G | |
| D2O | ALDRICH | 435767-100G | |
| formic acid | Thermo Fisher | 28905 | |
| guanidine-HCl | VWR | 97063-764 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Magnesium chloride | SiGMA-Aldrich | 63068-250G | |
| Potassium chloride | BioBasic | PB0440 | |
| potassium phosphate | BioBasic | PB0445 | |
| TCEP Hydrochloride | TRC Canada | T012500 | peptide was synthesized upon request |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| software | |||
| Deuteros | Andy M C Lau, et al | version 1.08 | |
| DynamX | Waters | version 3.0 | |
| MassLynx | Waters | version 4.1 | |
| Protein Lynx Global Server (PLGS) |
Waters | version 3.0.3 | |
| PyMOL | Schrödinger | version 2.2.2 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Instrument and equipment | |||
| ACQUITY UPLC BEH C18 analytical Column | Waters | 186002346 | |
| ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-column | Waters | 186003978 | |
| ACQUITY UPLC M-Class HDX System | Waters | ||
| HDX Manager | Waters | ||
| microtip pH electrode | Thermo Fisher | 13-620-291 | |
| Waters Enzymate BEH column or Pepsin solumn | Waters | 186007233 | |
| Waters Synapt G2-Si | Waters |
References
- Karplus, M., McCammon, J. A. Molecular dynamics simulations of biomolecules. Nature Structural & Molecular Biology. 9 (9), 646-652 (2002).
- Campbell, E., et al. The role of protein dynamics in the evolution of new enzyme function. Nature Chemical Biology. 12 (11), 944-950 (2016).
- Tokuriki, N., Tawfik, D. S. Protein dynamism and evolvability. Science. 324 (5924), 203-207 (2009).
- Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrometry Reviews. 25 (1), 158-170 (2006).
- Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chemical Society Reviews. 40 (3), 1224 (2011).
- Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (4), 214 (1991).
- Zhang, Z., Smith, D. L. Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation. Protein Science. 2 (4), 522 (1993).
- Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).
- Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17 (1), 75-86 (1993).
- Xiao, K., et al. Revealing the architecture of protein complexes by an orthogonal approach combining HDXMS, CXMS, and disulfide trapping. Nature Protocols. 13 (6), 1403-1428 (2018).
- Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).
- Masson, G. R., et al. Recommendations for performing, interpreting and reporting hydrogen deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) experiments. Nature Methods. 16 (7), 595-602 (2019).
- Liu, J., et al. An Efficient Site-Specific Method for Irreversible Covalent Labeling of Proteins with a Fluorophore. Scientific Reports. 5, 16883 (2015).
- Marion, D., et al. Overcoming the overlap problem in the assignment of proton NMR spectra of larger proteins by use of three-dimensional heteronuclear proton-nitrogen-15 Hartmann-Hahn-multiple quantum coherence and nuclear Overhauser-multiple quantum coherence spectroscopy: application to interleukin 1.beta. Biochemistry. 28 (15), 6150-6156 (1989).
- Balasubramaniam, D., Komives, E. A. Hydrogen-exchange mass spectrometry for the study of intrinsic disorder in proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1834 (6), 1202-1209 (2013).
- Goswami, D., et al. Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).
- Keppel, T. R., Howard, B. A., Weis, D. D. Mapping Unstructured Regions and Synergistic Folding in Intrinsically Disordered Proteins with Amide H/D Exchange Mass Spectrometry. Biochemistry. 50 (40), 8722-8732 (2011).
- Mitchell, J. L., et al. Functional Characterization and Conformational Analysis of the Herpesvirus saimiri Tip-C484 Protein. Journal of Molecular Biology. 366 (4), 1282-1293 (2007).
- Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).
- Habibi, Y., Uggowitzer, K. A., Issak, H., Thibodeaux, C. J. Insights into the Dynamic Structural Properties of a Lanthipeptide Synthetase using Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 141 (37), 14661-14672 (2019).
- Hebling, C. M., et al. Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (13), 5415-5419 (2010).
- Duc, N. M., et al. Effective application of bicelles for conformational analysis of G protein-coupled receptors by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (5), 808-817 (2015).
- Canul-Tec, J. C., et al. Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1. Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).
- Reading, E., et al. Interrogating Membrane Protein Conformational Dynamics within Native Lipid Compositions. Angewandte Chemie International Edition. 56 (49), 15654-15657 (2017).
- Hentze, N., Mayer, M. P. Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (81), e50839 (2013).
- Lento, C., et al. Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics. Journal of Visualized Experiments. (122), e55464 (2017).
- Schowen, K. B., Schowen, R. L. Solvent isotope effects on enzyme systems. Methods in Enzymology. 87, 551-606 (1982).
- Lau, A. M. C., Ahdash, Z., Martens, C., Politis, A. Deuteros: software for rapid analysis and visualization of data from differential hydrogen deuterium exchange-mass spectrometry. Bioinformatics. 35 (7), 3171-3173 (2019).
- Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (6), 2071 (2011).
- Burkitt, W., O'Connor, G. Assessment of the repeatability and reproducibility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry measurements. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 22 (23), 3893-3901 (2008).
- Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition. Lab on a Chip. 13, 2528-2532 (2013).
