Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) plattform for undersøkelse av peptidbiosyntetiske enzymer

Published: May 4, 2020 doi: 10.3791/61053
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry, McGill University

Summary

Lanthipeptide synthetases katalyserer multistep reaksjoner under biosyntesen av peptid naturlige produkter. Her beskriver vi en kontinuerlig, nedenfra-og-opp, hydrogen-deuterium utveksling masse spektrometri (HDX-MS) arbeidsflyt som kan brukes til å studere konformasjonsdynamikken til lanthipeptid synthetaser, samt andre lignende enzymer involvert i peptid naturlig produkt biosyntese.

Abstract

Hydrogen-deuterium utveksling massespektrometri (HDX-MS) er en kraftig metode for biofysisk karakterisering av enzymkonformasjonsendringer og enzym-substratinteraksjoner. Blant de mange fordelene bruker HDX-MS bare små mengder materiale, kan utføres under nær innfødte forhold uten behov for enzym / substratmerking, og kan gi romlig løst informasjon om enzymkonformasjonsdynamikk - selv for store enzymer og multiproteinkomplekser. Metoden er initiert ved fortynning av enzymet av interesse i buffer utarbeidet i D2O. Dette utløser utveksling av protium i peptidbinding (N-H) med deuterium (N-D). På de ønskede utvekslingstidspunktene blir reaksjons aliquots slokket, enzymet proteolysert i peptider, peptidene er skilt av ultraytelses væskekromatografi (UPLC), og endringen i massen av hvert peptid (på grunn av utveksling av hydrogen for deuterium) registreres av MS. Mengden av deuteriumopptak ved hvert peptid er sterkt avhengig av det lokale hydrogenbindingsmiljøet i det peptidet. Peptider tilstede i svært dynamiske områder av enzymet utveksling deuterium svært raskt, mens peptider avledet fra velordnede regioner gjennomgår utveksling mye langsommere. På denne måten rapporterer HDX-frekvensen om lokal enzymkonformasjonsdynamikk. Perturbasjoner til deuteriumopptaksnivåer i nærvær av forskjellige ligander kan deretter brukes til å kartlegge ligandbindingssteder, identifisere allosteriske nettverk og forstå rollen som konformasjonsdynamikk i enzymfunksjon. Her illustrerer vi hvordan vi har brukt HDX-MS for bedre å forstå biosyntesen til en type peptid naturlige produkter kalt lanthipeptides. Lanthipeptider er genetisk kodede peptider som er post-translasjonelt modifisert av store, multifunksjonelle, konforme dynamiske enzymer som er vanskelige å studere med tradisjonelle strukturelle biologi tilnærminger. HDX-MS gir en ideell og tilpasningsdyktig plattform for å undersøke de mekanistiske egenskapene til disse typer enzymer.

Introduction

Proteiner er strukturelt dynamiske molekyler som prøver forskjellige konformasjoner på tidsskalaer som spenner fra femtosecond-skala bindingsvibrasjon til omorganiseringer av hele proteindomener som kan oppstå over mange sekunder1. Disse konformasjonssvingningene er ofte kritiske aspekter ved enzym/proteinfunksjon. For eksempel er konformasjonsendringer forårsaket av ligandbinding ofte kritisk viktige for modulerende enzymfunksjon, enten ved å organisere aktive stedsrester som trengs for katalyse, definere substratbindingssteder i sekvensielle kinetiske mekanismer, skjerme reaktive mellomprodukter fra miljøet, eller ved å modulere enzymfunksjon via allosteriske nettverk. Nyere studier har også vist at konformasjonsdynamikk kan bevares gjennom evolusjonen, og at perturbasjoner til konserverte molekylære bevegelser kan korreleres med endringer i substratspesifikkitet og fremveksten av nye enzymfunksjoner2,3.

De siste årene har hydrogen-deuterium utveksling massespektrometri (HDX-MS) raskt dukket opp som en kraftig teknikk for å undersøke hvordan proteinkonformasjonslandskap reagerer på perturbasjoner som ligandbinding eller mutagenese4,5,6,7. I et typisk HDX-MS-eksperiment (figur 1) plasseres et protein av interesse i buffer fremstilt i D2O, som utløser utskifting av løsningsmiddelutskiftbare protoner med deuteria. Valutakursen for midte moiety av peptidbindingene avhenger sterkt av pH, den lokale aminosyresekvensen og på det lokale strukturelle miljøet i midt8. Amider som er engasjert i hydrogenbindingsinteraksjoner (som de som er tilstede i α-hæler og β ark) utveksles langsommere enn amider i ustrukturerte områder av proteinet som er utsatt for bulkløsningsmiddel. Dermed er omfanget av deuteriumopptak en refleksjon av enzymets struktur. Enzymer som er konforme dynamiske, eller som gjennomgår strukturelle overganger ved ligandbinding, forventes å gi en målbar HDX-respons.

Det mekanistiske grunnlaget for den langsomme valutakursen for en strukturert amide vises i figur 25,8,9. For å gjennomgå HDX må den strukturerte regionen først midlertidig prøve en utfoldet konformasjon, slik at løsningsmiddelmolekylene som katalyserer HDX-utveksling via en bestemt syre / base kjemisk mekanisme, har tilgang til den utskiftbare amiden. Til syvende og sist bestemmer de relative størrelsene på den kjemiske valutakursen (kchem) og folde- og brettehastighetene (kåpen og klukking) HDX-hastigheten målt i eksperimentet5,8. Fra denne enkle kinetiske modellen er det klart at omfanget av deuteriumopptak vil gjenspeile den underliggende konformasjonsdynamikken (som definert av kåpen og kclose). De fleste HDX-MS-eksperimenter utføres i en nedenfra-og-opp-arbeidsflyt der, etter utvekslingsreaksjonen, fordøyes proteinet av interesse i peptider og deuteriumopptaket ved hvert peptid måles som en økning i masse7. På denne måten tillater HDX-MS perturbasjoner til enzymkonformasjonsdynamikk som skal kartlegges på den lokale romlige skalaen av peptider, slik at forskeren kan vurdere hvordan perturbasjonen endrer dynamikken i forskjellige regioner av interesseens enzym.

Fordelene med HDX-MS-tilnærmingen for å belyse proteinstrukturelle dynamikker er mange. For det første kan metoden utføres med små mengder innfødt protein eller på proteinkomplekser i systemer med kvartær struktur10. Det er ikke engang nødvendig for enzympreparatet som brukes i analysen å være svært renset11,12, så lenge den nederste HDX-MS-arbeidsflyten gir et tilstrekkelig antall trygt identifiserte peptider som dekker proteinsekvensen av interesse. Videre kan HDX-MS gi informasjon om konformasjonsdynamikk under nær innfødte forhold uten behov for stedsspesifikk proteinmerking som vil bli brukt i enkeltmolekylet fluorescensstudier13, og det er ingen størrelsesgrense for protein- eller proteinkomplekset som kan undersøkes (som gjør tilnærminger som kjernemagnetisk resonans [NMR] spektroskopi utfordrende)7,14. Til slutt kan tidsavklarte HDX-MS-metoder brukes til å studere iboende uordnede proteiner, som er vanskelige å studere med røntgenkrystallografi15,16,17,18. Hovedbegrensningen til HDX-MS er at dataene har lav strukturell oppløsning. HDX-MS-data er nyttige for å peke på hvor konformasjonsdynamikken endrer seg og for å avsløre koblede konformasjonsendringer, men de gir ikke ofte mye innsikt i den nøyaktige molekylære mekanismen som driver den observerte endringen. Nylige fremskritt i kombinasjonen av elektronfangst dissosiasjonsmetoder med protein HDX-MS-data har vist løfte om kartlegging av utvekslingssteder til enkelt aminosyrerester19, men oppfølging av biokjemiske og strukturelle studier er fortsatt ofte nødvendig for å gi klarhet til strukturelle modeller videresendt av HDX-MS-data.

Nedenfor presenteres en detaljert protokoll for utvikling av en HDX-MS-analyse20. Prøveprepareringsprotokollene som presenteres nedenfor, bør generelt gjelde for ethvert protein som har god løselighet i vandige buffere. Mer spesialiserte prøveprepareringsmetoder og HDX-MS-arbeidsflyter er tilgjengelige for proteiner enn det som er nødvendig for å bli analysert i nærvær av vaskemiddel eller fosfolipider21,22,23,24. Instrumentelle innstillinger for HDX-MS-datainnsamling er beskrevet for et høyoppløselig quadrupole-tid-av-fly massespektrometer kombinert med flytende kromatografisystem. Data om lignende kompleksitet og oppløsning kan samles inn på et hvilket som helst av en rekke kommersielt tilgjengelige spektromatografi-massespektrometrisystemer (LC-MS). Viktige aspekter ved databehandlingen ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig programvarepakke tilbys også. Vi presenterer også retningslinjer for datainnsamling og analyse som er i samsvar med anbefalinger fra det bredere HDX-MS-fellesskapet12. Den beskrevne protokollen brukes til å studere de dynamiske strukturelle egenskapene til HalM2, en lanthipeptidsyntetase som katalyserer multistep modningen av et antimikrobielt peptid naturlig produkt20. Vi illustrerer hvordan HDX-MS kan brukes til å avdekke substratbindingsområder og allosteriske egenskaper som har unngått tidligere karakterisering. Flere andre protokoller om protein HDX-MS har blitt publisert de siste årene25,26. Sammen med det nåværende arbeidet skal disse tidligere bidragene gi leseren en viss fleksibilitet i eksperimentell design.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling av deutererte reagenser og enzymbestandsløsninger

  1. Forbered reagenser som trengs for HDX-reaksjonene (inkludert buffere, salter, substrater, ligander, etc.) som 100-200x konsentrerte lagerløsninger i D2O (99,9% atomfraksjon D). Klargjør minst 50 ml bufferlagerløsning.
    MERK: For karakterisering av HalM2, Følgende løsninger ble utarbeidet: 500 mM MgCl2, 100 mM tris (2-karboksyetyl)fosfin (TCEP), 750 mM ATP (i HEPES buffer), 800 mM HEPES pD 7,1, 500 μM HalA2 og 500 mM AMPPNP.
  2. Frys og lyofiliser lagerløsningene til tørrhet.
  3. Oppløs på nytt i D2O, og gjenta lyofiliseringssyklusen minst en ekstra gang for å erstatte så mange av de utskiftbare protonene med deuteroner som mulig.
  4. Juster pD for det deutererte HEPES-bufferlageret til ønsket verdi med konsentrert NaOD/DCl, med tanke på følgende forhold27:
    Equation 1
    MERK: Midt i HDX-hastigheten er sterkt avhengig av pL av oppløsningen (pL = pH eller pD)5. Ulike partier med bufferlagerløsninger må utarbeides, lagres og brukes på en identisk måte for å unngå liten pL-drift mellom eksperimenter.
  5. Beregn mengden av hvert reagens som trengs for en 300 μL HDX-analyse og lagre som engangs aliquots ved -80 °C.
  6. Forbered en konsentrert enzymbestandsløsning (~100−200 μM) i protiated enzymlagringsbuffer ved hjelp av et sentrifugalfilter (Tabell over materialer) eller tilsvarende enhet.
    MERK: Den nøyaktige bufferen og sentrifugalfilterets molekylvektavskjæring vil avhenge av proteinet/enzymet av interesse. HalM2 lagres i 50 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM KCl og 10% glyserol. 10 kDa-filtre ble brukt til å forberede det konsentrerte enzymet.
  7. Aliquot enzymet i engangsdeler og lagre ved -80 °C.
    MERK: Dette kan være et stoppested. Alle lagerløsninger som er beskrevet i avsnitt 1, kan utarbeides i forkant av HDX-reaksjonene. Hvis de lagres ved -80 °C, vil de fleste enzymer/deutererte lagerløsninger være stabile i mange måneder.

2. Kalibrering av HDX slukkevolumet

  1. Forbered en 300 μL HDX-reaksjon i D2O ved hjelp av de deutererte reagensene og konsentrerte enzymbestandene som er utarbeidet i avsnitt 1.
    1. Bruk en endelig enzymkonsentrasjon på 1-5 μM.
    2. Bruk en endelig deutert HEPES-bufferkonsentrasjon på minst 50−100 mM.
    3. Sørg for at konsentrasjonene av andre komponenter er tilstrekkelige til å opprettholde ønsket enzymaktivitet/funksjon.
  2. Forbered 1 L HDX slukkeløsning (100 mM fosfat, 0,8 M guanidin-HCl, pH 1,9). Frys og oppbevar i både 50 ml deler (for langtidslager) og 1 ml porsjoner (for engangs aliquots).
    MERK: Den nøyaktige sammensetningen av slukkebufferen vil avhenge av enzymet som brukes i proteolysetrinnet i HDX-MS-arbeidsflyten nederst opp (trinn 3.3.3). Slukkebufferen som er gitt her, er kompatibel med pepsin, den mest brukte protease for HDX-MS. Hvis en annen protease brukes, må du ta kontakt med proteaseleverandøren for å sikre bufferkompatibilitet.
  3. Kalibrer volumet av slukkebufferen som trengs for å justere den endelige pLen til den slokkede HDX-reaksjonsblandingen til en pH-måleravlesningsverdi på 2,3.
    MERK: Oppløsningsmiddelets H/D-valutakurs for peptidet midt i N-H-bindingen er en pH-avhengig prosess som er gjenstand for både syre- og basiskaalyse. Minste valutakurs skjer med en verdi på pH 2,5 (pH-måleravlesning = 2,3 for en 50:50 H2O:D2O-blanding). Dermed vil en endelig pL-verdi nær 2,5 minimere hydrogenbackutveksling som oppstår under den nedenfra-og-opp LC-MS-analysen, og dermed bevare deuteriumetiketten i peptidene.
    1. Bland 50 μL av HDX-reaksjonsblandingen fra trinn 2.1 med 50 μL slukkebuffer og mål pL av den slukkede blandingen med en mikrotipelektrode.
    2. Øk volumet av slukkeløsning etter behov for å justere den endelige pH-måleravlesningen til en verdi på 2,3.
    3. Når riktig slukkevolum er bestemt, gjenta slukkingsprosessen flere ganger ved hjelp av ferske 50 μL aliquots fra HDX-reaksjonen (trinn 2.1) for å sikre at en konsekvent endelig pL oppnås ved tilsetning av en fast mengde slukkebuffer.

3. Utarbeidelse av referanseprøver og optimalisering av den nedenfra-og-opp LC-MS-arbeidsflyten

  1. Forbered uberegnede referanseprøver for proteinet av interesse for triplikat i 0,5 ml rør. Påse at de endelige reaksjonsblandingsforholdene er identiske med de som brukes i de autentiske HDX-reaksjonene (trinn 2.1), bortsett fra at reaksjonene fremstilles i H2O ved hjelp av reagenslagerløsninger som også fremstilles i H2O.
  2. Slukk prøvene som i trinn 2.3 ved å legge til riktig volum av slukkebuffer for å justere den endelige pH-en til 2,5. Blitsfrys prøvene i flytende nitrogen og oppbevar dem ved -80 °C til de er klare til analyse.
  3. Analyser de protierte enzymreferanseprøvene ved hjelp av en LC-MS-arbeidsflyt fra bunnen av.
    MERK: Før du utfører disse trinnene, bør LC-MS-systemet som skal brukes til datainnsamling, kalibreres riktig og være klart til bruk. Tidsberegningen og temperaturen for alle trinnene i den nederste LC-MS-arbeidsflyten må kontrolleres nøye for å minimere forskjeller i tilbakeutveksling mellom prøver. Med MS-instrumenteringen som brukes i denne protokollen (Tabell over materialer Og Informasjon om støtte), kan de fleste trinnene styres gjennom instrumentprogramvaren. For å sikre innsamling av presise replikeringer anbefales det å automatisere så mange av trinnene i arbeidsflyten som mulig.
    1. Fjern en individuell enzymreferanseprøve (fremstilt som i trinn 3.2) fra fryseren og tine ved 37 °C i 1 min i et vannbad.
    2. Nøyaktig 2 min etter at prøven er fjernet fra fryseren og tiningen, injiserer du en 40 μL del av den slokkede referanseprøven i en ultraytelses væskekromatografi (UPLC)-kolonne (2,1 x 30 mm, 300 Å, 5 μM) som inneholder en stasjonær fase funksjonalisert med pepsin (en syrestabil protease).
    3. Fordøy prøven med en strømningshastighet på 100 μL/min i 3 minutter ved 15 °C ved bruk av 0,1 % maursyre i H2O (pH = 2,5) som løsningsmiddel.
    4. Samle peptiske peptider som de elute fra pepsin kolonnen på en C18 felle kolonne holdt ved 0,4 °C for å minimere tilbake utveksling.
    5. Send de avsaltede peptiske peptidene fra fellesøylen til en C18 analytisk søyle (1 mm x 100 mm, 1,7 μM, 130 Å) holdt og operert ved 0,4 °C for separasjon av peptiske peptider.
      MERK: Trinn 3.3.3−3.3.5 kan automatiseres av visse LC-MS-systemer som brukes til HDX-MS-datainnsamling. Alternativt kan disse trinnene utføres uavhengig, med tanke på at tidspunktet og temperaturen på hvert trinn må kontrolleres nøye for å oppnå en konsekvent lav ryggutveksling.
    6. Elute C18-kolonnen med et acetonitril/vann/0,1 % formic acid løsningsmiddelsystem. Optimaliser LC-gradienten for proteinet av interesse for å maksimere separasjonen av og for å bevare deuteriumetiketten i peptiske peptider.
      MERK: Gradient elution detaljer er gitt i Støtteinformasjon.
    7. Utsett peptisk fordøyelse for elektrosprayionisering (ESI) massespektrometri.
      MERK: Kildebetingelsene i støtteinformasjonen vil gi tilstrekkelig iionisering for de fleste peptiske peptider.
      1. Når det er ionisert i MS-instrumentet, utfør en gassfase ionmobilitetsseparasjon ved hjelp av nitrogen som buffergass for å forbedre metodens toppkapasitet.
      2. Etter ionmobilitetsseparasjonen utsetter du peptisk peptid forløper til en MSE-arbeidsflyt som involverer vekslende sykluser med lav kollisjonsenergi (4 V) og høy kollisjonsenergi (21−40 V).
        MERK: De vekslende energiregimene med lav og høy kollisjon muliggjør innsamling av MS-data (lav kollisjonsenergi) samtidig med MSMS-data (høy kollisjonsenergi). Dette tillater i sin tur tidskorrelasjon av forløperioner med sine respektive fragmentioner. Denne sammenhengen er avgjørende for sikker peptididentifikasjon beskrevet i avsnitt 4.
      3. Oppdag peptidforløperen og fragmentionene ved hjelp av en masseanalysator med en løsekraft på minst 20.000.
      4. Samtidig med datainnsamlingen innhenter du MS-data for en ekstern standard av [Glu-1]-fibrinopeptid B (GluFib).
        MERK: MS-arbeidsflyten som er beskrevet i trinn 3.3.7, kalles en MSE-protokoll. Du finner fullstendige instrumentelle innstillinger for en MSE-protokoll som passer for HDX-MS nedenfra og opp, i Støtteinformasjon.
    8. Vurder kvaliteten på LC-MS-dataene.
      MERK: Ved hjelp av protokollen som er beskrevet ovenfor og de instrumentelle innstillingene i støtteinformasjonen, skal referanseprøvene produsere et totalt ionkromatogram med en maksimal signalintensitet på ca. 1 x 108. Det bør være mange peptiske peptider som rømmer mellom 3-9 min (Figur 3A-C).
    9. Injiser 40 μL blanke prøver (0,1% maursyre i vann) for å rengjøre pepsin og analytisk C18 kolonner.
      MERK: Generelt bør 2-3 blanke være tilstrekkelig.
    10. Gjenta trinn 3.3.1−3.3.9 for hver av triplikatreferanseproteinprøvene.

4. Behandling av referansedataene og definering av peptidliste

  1. Analyser rå MSE-data (trinn 3.3.7) ved hjelp av proteomikkprogramvare (Tabell over materialer). Bruk proteomikkprogramvaren til å navigere til Biblioteker | Proteinsekvensdatabanker for å definere proteindatabasen ved å importere aminosyresekvensen av proteinet av interesse.
    MERK: Målet med dette trinnet er å søke i MS-referansedataene etter peptiske peptider avledet fra proteinet av interesse, og å bruke MSMS-dataene (samlet samtidig med MS-dataene) for å validere eventuelle putative peptididentifikasjoner.
  2. Gi et navn til proteinsekvensen av interesse. Importer proteinsekvensen (i FASTA-format). Programvaren vil utføre en i silico fordøyelse av databasen protein for å generere en liste over peptider som vil bli brukt til å søke LC-MS data.
  3. Definer behandlingsparameterne (på Bibliotek-menyen). Velg Electrospray MSE som datainnsamlingstype. I feltet Lås masse for gebyr 2 angir du 785,8426 for m/z for 2+ ion av [Glu-1]-fibrinopeptid B (GluFib) og klikker fullfør.
  4. Definer arbeidsflytparameterne (på Bibliotek-menyen).
    1. Velg Elektrospray MSE for søketypen. Under arbeidsflyt-| Overskriften Spørring for databasesøk velger du databaseproteinet som ble opprettet i trinn 4.2, i Databank-feltet.
    2. Endre Primær sammendragsreagens til ikke-spesifikk, og fjern merket for Reagens med fast modifikator ved å holde nede Ctrl -knappen mens du klikker Carbamidomethyl C.
  5. Angi utdatamappen ved å navigere til alternativer | automatiseringsoppsett | Identitet E. Merk av i boksene for Apex 3D og Peptide 3D Output og Ion Accounting Output og spesifiser ønsket katalog.
  6. Behandle referanseeksempeldataene.
    1. På venstre verktøylinje i arbeidsområdet for proteomikkplattformen oppretter du en ny plate ved å høyreklikke på Microtiter Plate. Fremhev tre brønner i mikrotiterplaten (en for hver referanseprøve som er samlet inn i avsnitt 3). Venstreklikk i en brønn, hold og dra til tre brønner.
    2. Høyreklikk, og velg Legg til rådata. I vinduet som vises, navigerer du til katalogen som inneholder de tre referansefilene fra avsnitt 3, og velger dem samtidig.
    3. Klikk på neste og velg behandlingsparametrene som er definert i trinn 4.3. Klikk neste og velg arbeidsflytparameterne som er definert i trinn 4.4. Klikk deretter Fullfør.
  7. Når rådataene, prosessparametrene og arbeidsflytparametrene er tilordnet hver brønn på platen, vil brønnene se blå ut. Velg brønnene, høyreklikk og velg behandle de nyeste rådataene. Klikk på høyre nedre hjørne av vinduet for å spore behandlingen av dataene. Når meldingen Ingen jobb som skal kjøres, vises, er behandlingen ferdig.
  8. Etter at databehandlingen er fullført, blir brønnene i platen grønne. Høyreklikk brønnene, og velg vis arbeidsflytresultater. Det åpnes et eget vindu for hver referansedatafil.
  9. Inspiser dataene for å sikre at flertallet av MS-signalene i referanseprøvedataene ble kartlagt til peptider som er spådd fra in-silico-fordøyelsen av proteinet av interesse. Matchede peptider vil bli farget blå i utgangsspekteret (Figur 4). Dobbeltklikk ok-filteret, og kontroller at prosentdekningen er større enn 99 %.
    MERK: Ved behandling lagres datautgangen automatisk med filtypen(raw_data_file_name_IA_final_peptide) i katalogen som er angitt i trinn 4.5.
  10. Importer proteomics-programvareutdataene til HDX-prosesseringsprogramvaren (Tabell over materialer) for ytterligere terking.
    1. Klikk på Data i venstre hjørne av programvarevinduet for HDX-behandling. Klikk på import PLGS resultater og klikk på legg til ikonet. Velg de behandlede datafilene fra trinn 4.9 ved å navigere til riktig katalog.
    2. Klikk på Neste og spesifiser følgende parametere: minimum påfølgende ioner ≥ 2, massefeil = 5 ppm, og filterskel = 3. Klikk Fullfør.
  11. Når du er fornøyd med terningsparametrene, lagrer du HDX-prosjektet. Alle HDX-data vil bli importert til dette prosjektet for analyse og visning.
    MERK: Deuteriumbyttede prøvene som er beskrevet i neste avsnitt, må behandles med en identisk LC-MS-arbeidsflyt. Før du fortsetter med HDX-analyser (avsnitt 5), må du derfor kontrollere at prøveprepareringen (avsnitt 2), den nederste LC-MS-arbeidsflyten (avsnitt 3) og arbeidsflyter for databehandling (avsnitt 4) gir ønsket reproduserbarhet og sekvensdekning av målproteinet. Hvis noen av disse prosessene må endres for å forbedre dekningen, anbefales det å gå tilbake til trinn 2.1, forberede ferske referanseprøver i triplikat og gjenta seksjonene 2−4 (mens du foretar de nødvendige justeringene i protokollen) for å sikre at hvert peptid kan reproduseres og oppdages.

5. Gjennomføre HDX-reaksjoner

  1. Klargjør arbeidsområdet for HDX-reaksjoner.
    1. Pre-aliquot slukke buffer i riktig merket 0,5 ml rør. Forbered et annet rør for hvert tidspunkt, hver replikering og hver biokjemisk tilstand som skal analyseres. Bruk riktig volum av slukkebuffer fra trinn 2.2 som trengs for å justere den endelige pH-måleravlesningen av en 50 μL-del av HDX-reaksjonen til en verdi på 2,3.
    2. Sentrifuger kort de 0,5 ml karene for å overføre all slukkebufferen til bunnen av røret. Plasser rørene på isen.
    3. Fyll en liten Dewar med flytende nitrogen og hold deg ved siden av arbeidsområdet.
  2. Forbered HDX-reaksjonene. Forsikre deg om at det er tilstrekkelig reaksjonsvolum for å samle ønsket antall utvekslingstidspunkter (en 50 μL aliquot for hvert ønsket tidspunkt). Samle minst 4−5 tidspunkter over 3−4 størrelsesordener i tidsskala (f.eks. slukketider på 15 s, 60 s, 300 s [5 min], 1800 s [30 min], og 14 400 s [4 t] gir tilstrekkelig dekning av utvekslingsdynamikk for de fleste enzymer).
    1. Bland alle de deutererte komponentene (minus enzym) fra trinn 1,1 i D2O.
    2. For hver biokjemisk tilstand som skal undersøkes (fritt enzym, enzym + ligand, enzym + inhibitor, etc.), lag HDX-reaksjoner i minst triplikat.
    3. Inkuber reaksjonsblandingene i et temperaturkontrollert vannbad ved 25 °C i 10 minutter før tilsetning av enzymet.
      MERK: Enzymet skal fremstilles som en konsentrert lagerløsning (~100−200 μM, trinn 1.6) for å minimere tilsetningen av protium i HDX-analysen.
    4. Når du legger enzymet til en endelig konsentrasjon på 1-5 μM, start timeren. Bland løsningen forsiktig og raskt ved hjelp av en 200 μL pipette for å sikre at enzymet fordeles jevnt i prøven.
    5. På de ønskede utvekslingstidspunktene fjerner du 50 μL aliquots fra HDX-reaksjonen og blander seg raskt og jevnt med den forhånds-aliquoted, iskald slukkebufferen i et 0,5 ml rør.
      MERK: Blandevolumene og blandeprosedyren må være så presise og reproduserbare som mulig for å sikre at ønsket siste slukkepL på 2,3 oppnås raskt i alle prøver. Å holde slukkebufferen iskald vil bidra til å minimere tilbakeutveksling ved denaturering av enzym.
    6. Umiddelbart etter slukking av HDX-prøven, hette røret og blitsfrysing i flytende nitrogen.
    7. Fortsett å samle inn tidspunkter til alle analysene er fullført, og overfør deretter prøver til -80 °C fryseren for lagring.
      MERK: Dette kan være et stoppested. Etter å ha samlet alle HDX-tidspunkter, kan prøvene lagres ved -80 °C til de er klare for LC-MS-analyse. Ideelt sett bør triplikat HDX-reaksjoner utføres for alle biokjemiske tilstander av interesse samme dag. I det minste bør alle replikere HDX-reaksjoner for en gitt biokjemisk tilstand kjøres parallelt på samme dag.
  3. Når du har samlet inn alle de slokkede HDX-tidspunktene, kan du utsette eksemplene for den optimaliserte nedenfra-og-opp LC-MS-arbeidsflyten som er utviklet som beskrevet i trinn 3.3. Injiser HDX-prøver i randomisert rekkefølge med et passende antall emner mellom prøver for å sikre at enhver peptidoverbæring er minimal.
    MERK: HDX-data trenger ikke å samles inn i MS E-modus. Dermed bør det høye kollisjonsenergisegmentet (trinn 3.3.7.2) fjernes fra MS-driftssyklusen. Dette bør være den eneste endringen som er gjort i arbeidsflyten som er beskrevet i trinn 3.3.
  4. Vurder kvaliteten på HDX-dataene etter hvert som de samles inn.
    1. Kontroller at kromatografiske topper som finnes i det totale ionkromatogrammet i de ubesluttnede referanseprøvene, vises samtidig i de deutererte prøvene (som i figur 3D-F).
    2. Kontroller at massespektra oppsummert over bestemte tidsintervaller fra referanse- og deuterte prøver viser bevis for deuterasjon (dvs. et skifte i den isotopiske konvolutten av individuelle peptider til høyere m/z-verdier i de deutererte prøvene [Figur 6]).

6. Behandling av HDX-data

  1. Importer HDX-dataene til HDX-prosjektet som ble opprettet i trinn 4.11, ved å klikke på Data | MS Files på den øverste verktøylinjen.
    1. Klikk på New State og New Exposure etter behov for å definere de biokjemiske tilstandene (f.eks. fritt enzym, enzym + ligand, etc.) og deuteriumeksponeringstider, henholdsvis, som er relevante for analysen.
    2. Klikk på New Raw for å velge HDX-datafilene som skal analyseres. Tilordne riktige utvekslingstider og biokjemisk tilstand til hver rådatafil som importeres.
      MERK: Dataene kan importeres og behandles i grupper, eller alle samtidig. Hvis du legger til data i prosjektet, angres ingen analyse som tidligere er utført i prosjektet.
  2. Når datafilene er lagt til, klikker du Fullfør for å starte databehandlingen. Etter en kort forsinkelse vil programvaren spørre om brukeren vil lagre dataene før han fortsetter. Klikk Ja.
    MERK: Den første behandlingen kan ta opptil flere timer, avhengig av hvor mange prøver som analyseres, hvor mange peptider som er i den endelige peptidlisten (trinn 4.10), størrelsen på det kromatografiske vinduet og hyppigheten av spektral oppkjøp.
  3. Hvis du vil, kan du endre behandlingsparameterne i Konfigurasjon -menyen for å endre ion-søkeparameterne. Sørg for å bruke de samme ion-søkeparameterne for alle data i et gitt prosjekt.

7. Analyse og visualisering av HDX-dataene

MERK: Når den første behandlingen av rådataene er fullført (trinn 6.2), vil HDX-prosesseringsprogramvaren ha funnet peptider fra peptidlisten (generert i trinn 4.10) i hver av rå datafilene som ble analysert. Når isotopfordelingen for et peptid i listen er plassert i en rå datafil, representerer HDX-prosesseringsprogramvaren hver isotop med en "pinne" (som i figur 6C−E). De relative intensitetene til pinnene for et gitt peptid brukes deretter til å beregne deuteriumopptaket i forhold til referansespektraet. Mens HDX-prosesseringsprogramvaren gjør en beundringsverdig jobb med å tilordne "pinner" til de fleste peptider, vil det fortsatt være nødvendig med betydelig manuell kurering av deuteriumopptaksverdiene.

  1. Analysere peptiddeuteriumopptaksverdier
    1. Velg det første peptidet i peptidlisten, og åpne den stablede spektralplottet fra Visninger-menyen. Rull opp og ned i det stablede spektrategningsvinduet for å se massespektraet for det valgte peptidet som funksjon av deuteriumutvekslingstid (figur 7D,E).
    2. Tilordne og fjern tilordning av pinner etter behov ved hjelp av museklikk for å sikre at riktig isotopfordeling er plassert i dataene, og at hver isotoptopp er tildelt (tildelte pinner vises blå). Hvis du klikker på et av spektraene i den stablede spektralplottet (Figur 7D,E), kan brukeren tilordne/oppheve tilordning av pinner i det aktive datavisningsvinduet (Figur 7C).
    3. Kontroller pinneoppdragene for hver ladetilstand ved å slå på ladetilstanden øverst i det stablede spektralplottvinduet.
    4. Gjenta trinn 7.1.1−7.1.3 for hver biokjemiske interessetilstand. Den biokjemiske tilstanden kan også veksles øverst i det stablede spektralplottvinduet. For de mest nøyaktige deuteriumopptaksforskjellsmålingene, må du sørge for at pinner er tildelt for samme sett med ladetilstander for hver biokjemiske tilstand.
    5. Gjenta trinn 7.1.1−7.1.4 for hvert peptid i peptidlisten.
    6. Kontroller standardavviket for peptiddeuteriumopptaksverdier ved hjelp av dekningskartet.
      1. Få tilgang til dekningskartet fra Visninger -menyen, som viser hvert peptid i peptidlisten som er kartlagt langs aminosyresekvensen av interesseproteinet (Figur 8C). Farge peptidene i henhold til relativ standardavvik (enheter av Da).
      2. Søk visuelt på kartet etter ytre peptider med høy relativ standardavvik. Klikk på de ytterste peptidene i dekningskartet for å fylle de stablede spektralplottene (figur 8B) og datavisningsvinduet (figur 8A) med målpeptidet.
      3. Bruk den stablede spektralplottet, kontroller nøye at alle ladetilstander og alle tidspunkter i det ytterste peptidet har riktig tildelte pinner.
        MERK: Oftest har peptider med store standardavvik (>0,3 Da) isotoper som ikke var riktig tildelt pinner av programvaren (som angitt i figur 8B). Tildeling av manglende pinner vil vanligvis gjøre det mulig å redusere det relative standardavviket for et peptid til <0,3 Da.
      4. Skjul peptidet fra listen hvis det relative standardavviket ikke kan reduseres til mindre enn 0,3 Da.
  2. Eksporter HDX-forskjellsdata mellom to biokjemiske tilstander for kartlegging til en strukturell modell av proteinet av interesse.
    1. Vis interesseforskjellen i dekningskartet. Høyreklikk på dekningskartet for å eksportere differansedataene til en .csv fil. Eksporter tilstandsdataene (i .csv format) ved å navigere til data | Eksporter tilstandsdata på hovedverktøylinjen.
      MERK: Riktig formatering av forskjellen data og tilstand datafiler er gitt i Støtteinformasjon.
    2. Importer differensdataene, tilstandsdataene og PDB-filen for proteinet av interesse til Deuteros28. Velg konfidensintervallet på 99 %, velg aktiver sum, og behandle dataene.
      MERK: MATLAB må være installert på PCen for å kunne kjøre Deuteros. Deuteros vil bruke replikeringsmålingene i datasettet til å beregne standardavviket for opptaksdataene for hvert peptid. Dette standardavviket vil bli brukt til å definere konfidensintervallet for betydelig utveksling, som vises på plottene.
    3. Velg eksportopptak under PyMOL-alternativer | eksportere for å generere et Pymol-skript for å kartlegge regioner med betydelig utvekslingsforskjell på pdbstrukturen til proteinet av interesse ved hjelp av PyMOL-programvare.
      MERK: Ved hjelp av arbeidsflyten som er beskrevet i denne protokollen, er 99% konfidensintervall for betydelig deuteriumopptaksforskjell for et gitt peptid på et enkelt tidspunkt vanligvis 0,3-0,5 Da. Konfidensintervallet på 99 % for differansen summert over alle utvekslingstidspoeng er vanligvis 0,7−1,0 Da.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det er nødvendig å vurdere kvaliteten på den proteolytiske fordøyelsen og arbeidsflytens reproduserbarhet for hvert sett med prøveinjeksjoner. Før HDX-MS-analyser utføres, er det derfor viktig å etablere effektive forhold for proteolysen av proteinet av interesse, for separasjon av peptider ved hjelp av omvendt fase flytende kromatografi og gassfase ionmobilitet, og for påvisning av peptider ved hjelp av MS. Til dette formål bør referanseprøvene for proteinet av interesse (samlet i fravær av deuterium) undersøkes først (avsnitt 3). De kromatografiske dataene i figur 3A-C viser de totale ionkromatogrammer (TICer) for tre referanseprøver av HalM2 lanthipeptidsyntetase. TIC er tidsavhengig endring i summen av alle iontall ved alle m/z-verdier som er inkludert i massespektralskanningen. Nærmere utsikt over TICene mellom 3 og 8 min er vist i figur 3D-F. Massespektraet vist i figur 3G−I representerer en oppsummering av alt massespektra over et lite tidsintervall (fra 5,0 til 5,1 min) av hver TIC. Det bør tas særlig hensyn til følgende funksjoner i figur 3.

For det første representerer den store toppen nær 9,3 min på slutten av gradienten ufullstendig fordøyd (og dermed store og mer hydrofobe) fragmenter av HalM2 (Figur 3A-C). Fordøyelsen kan gjøres mer effektiv ved å redusere HalM2-konsentrasjonen, men dette vil redusere peptidsignalintensiteten og signal:støyforholdet. Fordøyelsen kan også gjøres mer effektiv ved å øke kontakttiden (fra 3 min, protokoll trinn 3.3.3) med pepsin-kolonnen. Økt kontakttid vil imidlertid føre til mer tilbakeutveksling. Til syvende og sist må disse parametrene balanseres for proteinet av interesse for å gi ønsket sekvensdekning, signalintensitet og deuteriumretensjon. For det andre bør formen og intensiteten til TIC-profilene være lik (som i figur 3D-F). Dette antyder at den proteolytiske fordøyelsen av HalM2 er reproduserbar og har lignende effektivitet i alle tre referanseprøvene. Forventningen er at en lignende fordøyelse av en deuterium-byttet prøve vil produsere samme sett med peptider med lignende oppbevaringstider. For det tredje bør massespektraet over et gitt tidsintervall også være likt (Figur 3G−I). En rask visuell sammenligning av det oppsummerte massespektraet over tidsintervallet på 5,0-5,1 minutter i den kromatografiske separasjonen viser at massespektralsignaler i hver prøve faktisk er svært like, noe som gir tillit til at lignende peptider er til stede i hver prøve og eluterer på lignende tidspunkter fra C18-kolonnen. En lignende rask visuell inspeksjon bør utføres over andre tidsintervaller over kromatogrammet.

Etter å ha visuelt bekreftet likheten i LC-MS-dataene i referanseprøvene, brukes proteomikkprogramvare til å søke i MS-dataene etter peptider avledet fra aminosyresekvensen av proteinet av interesse. Etter å ha definert proteinsekvensdatabanken (aminosyresekvensen av proteinet av interesse), prosesserings- og arbeidsflytparametrene som beskrevet i protokolltrinnene 4.2-4.4, behandles hver enkelt referanseprøve for å oppdage peptiske peptider som samsvarer med predikerte peptider avledet fra proteinet av interesse. Et eksempel på proteomics-programvareutdataene for et ukjent HalM2-referanseeksempel vises i Figur 4. Spesiell oppmerksomhet bør gis til følgende funksjoner. For det første vil ethvert MS-signal som samsvarer med et bestemt peptid i proteinet av interesse i henhold til verdiene som er definert i behandlings- og arbeidsflytparametrene, bli farget blå i bunnspekteret. Hvis et referanseeksempel "vellykket" behandles, vil de fleste signalene vises blå (som det er tilfellet for dataene i figur 4). Videre, I øverste venstre panel, sørg for at "OK Filter" er vekslet til den grønne haken. Når dette er gjort, vil statistikken i topplinjen i panelet øverst til høyre (uthevet i blått i figur 4) bare gjenspeile de peptidene som gir høye konfidenspoeng. Disse peptidene viser lav ppm massenøyaktighet, flere fragmentioner og god korrelasjon mellom fragment- og foreldreionretensjonstider, og anses å være sikre identifikasjoner. For den viste HalM2-referanseprøven ble det oppdaget 1421 peptider med høye score, som dekker 99,6% av HalM2-sekvensen. Nesten 100 % sekvensdekning bør være oppnåelig for de fleste proteiner ved hjelp av den nedenfra-og-opp LC-MS-arbeidsflyten som er beskrevet i protokolldel 3. Videre er ytterligere nyttig statistikk for hvert peptid tabulert i øverste høyre panel, inkludert massefeil, forløper oppbevaringstid, antall fragmenter (produktioner), den komplette listen over fragmentioner etter navn og ionmobilitetsdriftstid. Denne informasjonen er nyttig for tolkning av resultater, som alltid bør fokuseres på de mest trygt identifiserte peptidene.

Den endelige peptidlisten bør bestemmes av ytterligere terskler i HDX-prosesseringsprogramvaren. Etter å ha analysert referansedataene for å generere peptidlisten (protokolldel 4), bør utgangen importeres til HDX-prosesseringsprogramvaren for ytterligere terskler. Utdatafilene lagres i en mappe som definert i protokolltrinn 4.5 med filtypen "..._IA_final_peptide.csv". Når du laster opp utdataene til HDX-prosesseringsprogramvaren , vises den fullstendige listen over peptider i panelet "peptidforhåndsvisning" (figur 5), og antall peptider, sekvensdekning og redundans vises nederst til høyre i vinduet. Disse verdiene endres i sanntid etter hvert som ytterligere terskler brukes. Når du har klikket neste, kan terskelverdier angis i de angitte feltene. De mest kritiske filtrene er "filterskelen" som krever at alle peptider er plassert i hver av de tre referanseprøvene, "maksimal MH+ feil (ppm)" som skal settes til en verdi <10 ppm, og "minimum påfølgende produkter", som krever at peptidet genererer minst to påfølgende fragmentioner under MSMS -fasen (dvs. høy kollisjonsenergi) i MSE-arbeidsflyten (protokolltrinn 3.3.7.2).

Den viktigste tekniske begrensningen i HDX-MS-analysen er tilbakeutvekslingen av deuterium for protium som oppstår så snart deuteriumbyttede prøver slukkes (med protiated buffer). Tilbakeutvekslingen fortsetter under proteasefordøyelsen og LC-MS-delene av arbeidsflyten. Ryggutveksling er uunngåelig, men hvis pH, temperatur og tidspunkt for alle post-slukketrinn er nøye kontrollert som beskrevet i protokollen, kan 60% − 70% av deuteriumetiketten opprettholdes. Av denne grunn er det viktig å sjekke i de tidlige stadiene av analyseutviklingen at de fleste peptidene beholder deuterium. Dette kan oppnås raskt ved å sammenligne rådataene i et deuterert utvalg med dataene i et referanseeksempel. Som det ble gjort for å sikre reproduserbarhet av referanseprøvene (figur 3), sammenligner du TICene til deuteriumbyttede og ubesluttnede referanseeksemplene, og sikrer at profilenes former ligner hverandre. I tillegg summerer du massespektraet over samme kromatografiske tidsintervall i begge prøvene. De fleste peptidene i deuteriumbyttet prøve bør vise åpenbare endringer i deres isotopiske fordelinger mot høyere m/z-verdier (som i figur 6). Disse dataene indikerer at en betydelig brøkdel av deuteriumetiketten opprettholdes gjennom hele syreslukking, pepsin fordøyelse og LC-MS datainnsamling.

Etter å ha kontrollert at arbeidsflyten gir tilstrekkelig deuterium oppbevaring, må deuteriumopptaket kvantifiseres. Dermed importeres rådataene for deuterium-byttede prøver til HDX-prosesseringsprogramvaren. Ved hjelp av referanseprøvene og den endelige peptidlisten vil HDX-prosesseringsprogramvaren finne peptidene fra peptidlisten i hver av rå datafilene og tildele "pinner" til hver av de isotopene. I de representative dataene for HalM2 som vises i figur 7, er de tilordnede pinnene farget blå i hele spektraet. Etter å ha tildelt pinner, vil centroid m / z-verdien for den isotopiske fordelingen bestemmes av programvaren og brukes til å beregne deuteriumopptak i forhold til den ubesluttede referanseprøven. Deuteriumutvekslingsverdien for hvert peptid bør kontrolleres manuelt. I figur 7vises det valgte peptidet (HIDKLTVGL, som spenner over HalM2-rester 110−118) i venstre panel i hoveddatavisningsprogrammet (Figur 7A). De andre panelene viser HDX-data knyttet til dette peptidet. Ved å klikke på et peptid i peptidlisten vil du fylle ut de andre panelene med HDX-data fra det peptidet. Figur 7B viser deuteriumopptaksplottene for peptid 110−118. Dette datasettet inneholder fire utvekslingstidspunkter: 0,5, 5, 30 og 240 min (samlet inn i triplikat). Utvekslingsdata ble samlet inn for to biokjemiske tilstander: fritt HalM2-enzym (rødt) og HalM2-enzymet kompleks til AMPPNP og dets substratpeptid HalA2 (blå). Legg merke til den betydelige deuteriumopptaksforskjellen i peptid 110-118 gjennom hele tidsforløpet og den høye presisjonen til replikeringsmålingene (feilfelt vises på plottet i figur 7B). Generelt vil lignende presisjon i opptaksmålingen oppnås for de fleste peptider, noe som understreker reproduserbarheten til arbeidsflyten som presenteres i denne protokollen. Ved ligandbinding (blå kurve i figur 7B)gjennomgår peptidbindingen i 110-118-regionen av HalM2 tilsynelatende betydelig beskyttelse mot deuteriumutveksling, noe som tyder på at aminosyrene i 110-118-regionen blir mer stabilt strukturert ved ligandbinding. Etterfølgende mutagenese i denne regionen indikerte en rolle i binding til forløperpeptid, HalA220. Vist også i figur 7 er de stablede spektralplottene for HalM2-tilstanden (Figur 7D) og HalM2:AMPPNP:HalA2 -tilstanden (Figur 7E). I disse tomtene øker utvekslingstiden fra bunnen til toppen. Masseøkningen av peptid 110-118 ved deuteriumutveksling på lengre tidspunkter fremgår av visuell inspeksjon. Det er også tydelig at peptid 110-118 tar mer deuterium i HalM2-tilstanden (figur 7D) enn i fullstendig liganded tilstand (Figur 7E). Hvis det er nødvendig å klikke på noen av delplottene i figur 7D eller figur 7E, kan brukeren manuelt endre tildelingen av pinner i hoveddatavisningsprogrammet (figur 7C). Ved pinnetilordning/ utmelding vil HDX-prosesseringsprogramvaren omberegne deuteriumopptaksverdiene, og alle plottene vil bli oppdatert i sanntid. På samme måte vil det å klikke på individuelle datapunkter i panel B fylle dataviseren i panel C for manuell pinnetilordning.

Etter at pinner er tildelt for hvert peptid og utvekslingstidspunkt for alle biokjemiske tilstander, bør standardavviket for de målte opptaksverdiene kontrolleres. Dette er enklest å utføre med dekningskartet og stablet spektralplott (figur 8). I dekningskartet (Figur 8C) velger du rentetilstanden og utvekslingstiden, og deretter velger du relativt opptaksstandardavvik. Peptidene i dekningskartet vil bli farget i henhold til standardavviket i den målte deuteriumopptaksverdien. På denne måten vil det være veldig enkelt å visuelt identifisere peptider som har isotoppinne feiloppdrag. Ved å klikke på det ytterste peptidet (med høy standardavvik) i dekningskartet, fylles hoveddataviseren og den stablede spektraplottet med HDX-data fra det ytterste peptidet. Pinnetilordningene for hvert tidspunkt og hver ladetilstand kan deretter endres etter behov for å korrigere den målte opptaksverdien. Igjen vil HDX-prosesseringsprogramvaren oppdatere alle dataene som vises i sanntid etter hvert som pinneoppgavene endres.

Etter fullstendig kuratering av HDX-datasettet, må betydningen av deuteriumopptaksforskjellsmålingen for hvert peptid vurderes før datatolkning. Ved hjelp av en tilnærming beskrevet av Engen og medarbeidere29, har vi estimert en gjennomsnittlig opptaksverdi på 0,1 ± 0,1 Da for HalM2-proteinet ved hjelp av arbeidsflyten beskrevet i protokollenovenfor 20. Denne verdien samsvarer med feilene som rapporteres av andre for lignende HDX-arbeidsflyter for kontinuerlig utveksling av HDX29,30. Nylig utviklet Politis og medarbeidere Deuteros, et nyttig åpen kildekodeverktøy (implementert i MATLAB) for raskt å bestemme betydelige opptaksforskjeller i HDX-datasett28. Representative inndatafiler for Deuteros ("State_Data_for_Deuteros" og "Difference_Data_for_Deuteros") er inkludert i støtteinformasjonen. Hvis den eksporteres direkte fra HDX-prosesseringsprogramvaren som er beskrevet i denne protokollen (Materialfortegnelse), vil forskjellen og tilstandsdatafilene ha riktig format for fillesing av Deuteros. Hvis HDX-data genereres på et annet LC-MS-system, må datafiler som ligner de som er oppgitt i støtteinformasjonen, konstrueres manuelt.

Arbeidsområdet Dueteros vises i figur 9. Når dataene er importert til Deuteros, velger brukeren ønsket konfidensgrense (>98 % anbefales) og klikker Importer og beregn. For den sammenslåtte datatilordningen velger du dekning for datatype og absolutt for fargeskala. Klikk tegne . For tretegningene velger du binærfilter som datatype, ønsket konfidensfilter og aktiverer summen. Ved klikkplottvil Deuteros plotte alle peptider på hvert utvekslingstidspunkt som en funksjon av deres posisjon i aminosyresekvensen og deres deuteriumopptaksverdier. Peptider som viser betydelig utveksling vil bli farget enten rød eller blå, avhengig av om peptidet tar opp mer eller mindre deuterium, henholdsvis i henhold til forskjellen som beregnes. Signifikansverdien som rapporteres i hvert plott (fra 0,39 til 0,72 Da i dataene som er tegnet inn i figur 9), beregnes ut fra standardavvikene for opptaksforskjellene målt for hvert peptid som bestemt fra replikeringsmålingene som finnes i datasettet. Konfidensintervallene vises som stiplede stolper på tvers av hvert enkelt plott. Hvis den er aktivert, legger "Sum" ganske enkelt til opptaksdifferansen målt på hvert tidspunkt for hvert peptid. Til slutt, for visualisering av opptaksdataene på den tredimensjonale strukturen til proteinet av interesse, velg eksportopptak under PyMOL-alternativer, og eksporterderetter . Deuteros vil generere et PyMOL-skript som kan dras og slippes inn i PyMOL-arbeidsområdet som inneholder den åpne pdbfilen av interesseproteinet.

HDX-MS-arbeidsflyten som presenteres i denne protokollen, ble brukt til å karakterisere de biokjemiske egenskapene til et enzym (HalM2) som katalyserer en rekke postoversettelsesendringer på et genetisk kodet peptid (HalA2)20. I figur 10vises representative HDX-MS-resultater for bindingen av HalA2 forløperpeptid til HalM2:AMP-PNP-komplekset. Panel A viser HalM2-dekningskartet, der fargen indikerer den relative opptaksforskjellen mellom [HalM2:AMPPNP] biokjemisk tilstand og [HalM2:AMPPNP:HalA2]-tilstanden. Deuteros ble brukt til å kartlegge disse opptaksforskjellene på en homologimodell av HalM2-enzymet (Figur 10B, C). Peptider som er farget røde indikerer en reduksjon i deuteriumopptaket ved HalA2-binding, noe som tyder på at disse regionene i HalM2 kan være involvert direkte i binding av forløperpeptidet. For å undersøke denne hypotesen ble regioner I-III mutert og de kinetiske egenskapene til variantenzymene ble undersøkt. Mutasjoner i region I og III førte begge til betydelige perturbasjoner i HalA2 peptidbindende affinitet, noe som tyder på at disse regionene i HalM2 enten samhandler med peptidsubstratet direkte, eller er pålagt å danne strukturer som muliggjør HalA2-binding. Mutasjon av region II hadde derimot ingen effekt på HalA2-bindende affinitet, men denne mutanten var nesten blottet for katalytisk aktivitet. En forklaring på dette funnet er at organiseringen av region II observert ved HalA2-binding utløser en konformasjonsendring som aktiverer enzymet. Det skal bemerkes at før denne studien var det ikke tilgjengelig informasjon om HalM2-HalA2 bindingsmodus eller på de katalytisk relevante konformasjonsendringene i systemet, hovedsakelig fordi den store størrelsen og den fleksible naturen til både HalM2 og HalA2 har utelukket strukturelle studier. Dermed illustrerer disse representative dataene på HalM2 lanthipeptidsyntetase hvordan HDX-MS raskt kan brukes til å raskt finne funksjonelt relevante regioner av strukturelt dynamiske enzymsystemer - selv i fravær av strukturelle data med høy oppløsning.

Figure 1
Figur 1: En kontinuerlig utveksling, nedenfra-og-opp HDX-MS-arbeidsflyt. Se tekst for mer informasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: HDX-raten avhenger av proteinkonformasjonsdynamikk (kåpen og kclose) og den pH-avhengige hastigheten for kjemisk utveksling av N-H-bindingene i proteinryggbenet for N-D-bindinger (kchem). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representative LC-MS-data for de triplikate HalM2-referanseprøvene. Tallet øverst til høyre i hvert panel representerer det totale antallet ioner. Hver rad viser data for et annet referanseeksempel. Den første kolonnen (A-C) viser de totale ionkromatogrammer (TICer). Den store toppen på 9,3 min representerer store, ufordøyde peptider. Den midterste kolonnen (D−F) viser en nærmere visning av TPC-ene mellom 3 og 8 minutter. Legg merke til den gode avtalen om profilenes former, noe som indikerer en lignende underliggende blanding av peptidsignaler i hver referanseprøve over hele kromatogrammet. Den tredje kolonnen (G−I) viser massespektra for hvert referanseeksempel som genereres ved å summere alle massespektraene som er registrert mellom tidspunkt 5,0 og 5,1 min av det kromatografiske løpet. Visuell inspeksjon av disse dataene indikerer at mange av de samme peptidene oppdages i hver prøve. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Representativ proteomikkprogramvareutdata for et HalM2-referanseeksempel. Panelet øverst til venstre viser den komplette listen over HalM2-avledede peptiske peptider som oppdages i MS-dataene. Legg merke til at merket "OK filter" viser den grønne haken. Dette filtrerer dataene i henhold til konfidenspoengsummen og fjerner peptididentifikasjoner med lav tillit. Den øverste linjen i høyre panel (uthevet i blått) viser kumulativ statistikk for settet med peptider med høye score. Den viktigste statistikken er antall peptider som oppdages (i dette tilfellet 1421) og sekvensdekningen (i dette tilfellet 99,6%). Ytterligere statistikk for hvert peptid vises også øverst til høyre. Hver kolonne i denne datatabellen kan sorteres. Det nederste panelet viser alle MS-signalene som ble matchet med et anslått HalM2-avledet peptisk peptid. Legg merke til at de fleste MS-signaler ble tilordnet og farget blå. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Ekstra terskler i HDX-prosesseringsprogramvaren. Proteomics-programvareutgangen for hver av de tre HalM2-referanseprøvene importeres til HDX-prosesseringsprogramvaren (venstre panel). Etter import av data utføres ytterligere terring (høyre panel). Feltet "minimum påfølgende produkter" refererer til fragmentioner generert av spalting av tilstøtende peptidbindinger i peptidet. Parameteren "minimum MH + feil" lar brukeren definere akseptabel massenøyaktighet, og "filterskelen" lar brukeren begrense peptider til bare de peptidene som ble oppdaget i alle tre referansefilene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Representative data for en HalM2-referanseprøve (rød) og en HalM2-prøve inkubert i D2O-buffer i 5 min (grønn). Begge eksemplene ble utsatt for den nederste LC-MS-arbeidsflyten som er beskrevet i protokolldel 3. Den venstre kolonnen viser massespektra oppsummert over tidsvinduet på 6,0−6,1 minutter. De tre høyre kolonnene viser nærmere visninger av samme massespektra, der skiftet til høyere m/z-verdier i den deutererte prøven (grønn, topp) er åpenbar for de fleste peptidsignalene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Skjermbilde av arbeidsområdet i HDX-prosesseringsprogramvaren. (A) Listen over HalM2-avledede peptider hentet fra analyse av HalM2-referanseprøver med proteomikkprogramvaren (figur 3) og påfølgende terring i HDX-prosesseringsprogramvaren (figur 4). Det valgte peptidet (HIDKLTVGL, som spenner over HalM2-rester 110−118) er uthevet i blått. (B) Deuteriumopptakskurvene (som en funksjon av utvekslingstid) for de to biokjemiske tilstandene av interesse: det frie HalM2-enzymet, og HalM2-enzymet bundet til AMPPNP og forløper lanthipeptid, HalA2. (C) Massespekteret av det aktivt valgte utvalget (i dette tilfellet et av de ubesluttede HalM2-referanseeksemplene). De blå pinnene i panel C kan tilordnes/tilordnes manuelt etter behov hvis de ikke ble riktig tilordnet av HDX-prosesseringsprogramvaren under første databehandling. (D,E) Stablede spektralplott for HalM2-tilstanden (D) og HalM2:AMPPNP:HalA2-tilstanden (E). Den tidsavhengige økningen i deuteriumopptaket er lett synlig, og det samme er opptaksforskjellen mellom de to biokjemiske tilstandene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Minimere standardavvik i målte opptaksverdier. Dekningskartet i HDX-prosesseringsprogramvaren (panel C) gir et praktisk middel for raskt å identifisere peptider med store standardavvik i sine målte deuteriumopptaksverdier. I dette hypotetiske tilfellet er noen av isotoptoppene (blå pinner) for HalM2-avledede peptid som spenner over rester 110-118 ikke tildelt for 5 min utvekslingstidspunkter (de grå pinnene i panel B). Dette fører til et stort standardavvik i deuteriumopptaksverdien målt for 5 min utvekslingstidspunkt. Det store standardavviket er lett åpenbart fra den blå fargen på 110-118 peptid i dekningskartet (panel C) og fra datapunktspredningen og den store feillinjen i opptaksplottet (panel A). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: Arbeidsområdet Deuteros. I dette eksemplet ble differanseverdiene for opptak beregnet i HDX-prosesseringsprogramvaren ved å trekke deuteriumopptaket til HalM2:AMPPNP:HalA2-tilstanden fra HalM2:AMPPNP-tilstanden. Målet med sammenligningen var å visualisere hvordan peptid (HalA2) binding endret den strukturelle dynamikken i HalM2:AMPPNP-komplekset. Datasettet inneholdt 4 utvekslingstidspunkter (0,5, 5, 30 og 240 min). Opptaksforskjellen for hvert peptid på hvert utvekslingstidspunkt er illustrert i Woods-tomtene. De fargede peptidene i Woods-plottene indikerer peptider som viser en betydelig opptaksforskjell, som definert av standardavviket for replikeringsmålingene som finnes i datasettet og de brukerdefinerte konfidensgrensene valgt i Deuteros. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 10
Figur 10: HDX-MS-data styrer funksjonell analyse av peptidbinding og allosterisk aktivering i lanthipeptidsyntetase HalM2. Deuteriumopptaksendringen ved binding av HalA2 forløperpeptid til HalM2 lanthipeptidsyntetase ble undersøkt. Opptaksforskjellen for hvert peptid etter en 5 min utvekslingsreaksjon er plottet (A). Dette plottet ble generert i HDX-prosesseringsprogramvaren. Peptider farget rødt og blått gjennomgår henholdsvis mindre og mer deuteriumopptak i nærvær av HalA2-peptidet. Disse HDX "hot spots" er kartlagt på en HalM2 homology modell (B, C). Identifisering av peptider som gjennomgår betydelige utvekslingsforskjeller ble bestemt i Deuteros. PyMOL-skriptet som brukes til å tilordne differanseverdiene til homologimodellen ble generert i Deuteros. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HDX-MS-arbeidsflyten presentert i denne protokollen gir en bemerkelsesverdig robust plattform for kartlegging av romlig fordeling av strukturelt dynamiske elementer i proteiner og for å undersøke hvordan disse dynamikkene endres som respons på perturbasjon (ligandbinding, enzymmutagenese, etc.). HDX-MS har flere klare fordeler i forhold til andre strukturelle biologitilnærminger som ofte brukes til å undersøke konformasjonsdynamikk. Spesielt er det bare nødvendig med små mengder protein. Ved hjelp av arbeidsflyten som er beskrevet her, gir en 1 ml prøve på 1 μM protein nok materiale til å triplikere HDX-reaksjoner som hver inneholder 5 utvekslingstidspunkter. Videre er det nesten ingen størrelsesgrense på proteinet av interesse, og proteinkomplekser er like mottagelige for HDX-MS-tilnærmingen. Størrelsesgrensen begrenses bare av i hvilken grad peptiske peptider kan løses kromatografisk, og i m / z og ionmobilitetsdimensjoner. For mange proteiner/proteinkomplekser vil HDX-MS derfor gi verdifull informasjon om proteinproteininteraksjonsgrensesnitt, ligandbindingssteder, konformasjonsdynamikk og allosteriske nettverk. Til slutt utføres HDX-reaksjonen under milde, nesten innfødte forhold uten behov for stedsspesifikk merking / prosjektering av proteinet, noe som skal bidra til å sikre at den endogene aktiviteten bevares. Hovedbegrensningen av tilnærmingen (når det gjelder den mekanistiske informasjonen den gir om proteinet av interesse) er at peptidnivået HDX-data har iboende lav romlig oppløsning. Dermed er dataene tilstrekkelige til å antyde at en endring i sekundærstruktur forekommer, men de mekanistiske virkningene av den strukturelle perturbasjonen krever høyere oppløsning (f.eks. NMR, kryoEM eller røntgenkrystall) strukturer, beregningsstudier og / eller biokjemiske studier for å tolke fullt ut.

For å sikre reproduserbarhet og pålitelighet av resultatene, bør flere kritiske aspekter av protokollen huskes. For det første er omfanget av deuteriumutveksling under HDX-reaksjonen og omfanget av ryggutveksling under oppstart og analyse sterkt avhengig av pH, tid og temperatur. Dermed må prosedyrene for fremstilling av buffere, HDX-reaksjoner og LC-MS-metoder være så systematiske som mulig for å minimere variasjonen i disse fysiske parametrene på tvers av datasett. Når det er mulig, bør HDX-reaksjoner for biokjemiske tilstander sammenlignes utføres av samme forsker samme dag, og LC-MS-dataene for disse prøvene bør samles inn over påfølgende dager med samme batch av løsningsmiddel. Over tid vil effektiviteten av pepsin fordøyelsen også reduseres, så det er optimalt for prøver som vil bli sammenlignet med å bli fordøyd og analysert innen et relativt smalt tidsvindu - spesielt hvis pepsin-kolonnen brukes til å fordøye mange andre typer prøver. Det er god praksis å periodisk sjekke fordøyelseseffektiviteten til pepsinkolonnen ved hjelp av et standardprotein. For å oppnå dette kan et dedikert HDX-prosesseringsprogramvareprosjekt settes opp der nylig fordøyde prøver kan sammenlignes med eldre prøver for å sikre at det samme settet med målpeptider oppdages med lignende intensiteter.

Mens arbeidsflyten som presenteres i denne protokollen skal gi tilstrekkelige data for mange enzym/ proteinsystemer, er det flere potensielle optimaliseringspunkter. For det første kan tidsskalaen til HDX-reaksjonen endres for å fange opp dynamikk som er raskere / langsommere. Spesielt vil mange enzymer inneholde svært dynamiske elementer som blir fullstendig utvekslet i løpet av flere sekunder. Hvis disse ekstremt dynamiske elementene er av interesse, er det rapportert metoder for pre-steady state, kontinuerlig utveksling HDX-MS i litteraturen31. For det andre kan LC-metodeforholdene lett endres for å endre fordøyelseseffektiviteten (som til slutt bestemmer sekvensdekningen) og deuteriumretensjonen (som til slutt bestemmer metodens følsomhet). Tatt i betraktning varigheten og temperaturen på pepsin fordøyelsen, vil langsommere strømningshastigheter og høyere temperatur favorisere mer grundig fordøyelse av proteinet. Proteinkonsentrasjonen i HDX-analysen kan også økes hvis signalintensiteten er for lav, eller reduseres hvis pepsin fordøyelsen er for ineffektiv. Tatt i betraktning acetonitril gradienten som brukes til å skille peptiske peptider på den analytiske C18-kolonnen, vil en raskere gradient bevare deuteriumetiketten, men på bekostning av den kromatografiske oppløsningen til peptiske peptider som er tilstede i den fordøyde reaksjonsblandingen. For mindre proteiner (~ 200 aminosyrer) der færre peptiske peptider er til stede i fordøyelsen, kan en raskere LC-gradient være lettere å implementere. For større proteiner som HalM2 (~ 1000 aminosyrer), er det nødvendig med en lengre gradient for å løse den ekstra spektrale kompleksiteten som genereres av det større antallet peptider i blandingen. I dette siste scenariet kan inkludering av en gassfase ionmobilitetsseparasjon bidra til å dramatisk forbedre toppkapasiteten til analysen. Inkluderingen av ionmobilitetsseparasjonen kommer til en kostnad for et litt redusert signal-til-støy-forhold. Til slutt skal det bemerkes at MS-dataene for HDX-prøvene ikke trenger å samles inn i MSE-modus. MSMS-delen av MS E-driftssyklusen (dvs. energisegmentet med høy kollisjon, trinn 3.3.7.2) er bare nødvendig for referanseprøvene for å definere peptidlisten (protokolldel 4). Hdx-prøver bør derfor analyseres i ms-only-modus for å øke signal:støyforholdet.

Hvis arbeidsflyten som er beskrevet i denne protokollen, fungerer som den skal, bør fullstendig byttepeptider ha en relativ deuteriumopptaksverdi på 60 %−70 %. Hvis deuteriumopptaket viser seg å være vesentlig lavere enn dette (for et løsningsmiddeleksponert, ubeskyttet peptid), er den mest sannsynlige forklaringen at pH i prøven endres under en del av arbeidsopp/analyse. I dette scenariet bør en mikrotip-elektrode brukes til å nøye overvåke pH i HDX-analysen og av den slukkede reaksjonen aliquot. pH på LC-MS-løsningsmidlene bør også kontrolleres. For å minimere forekomsten av dette problemet, anbefales det sterkt å forberede og lagre konsentrerte lagerløsninger av alle buffere og reagenser som trengs for analysen (som beskrevet i protokolldel 1).

De siste årene har HDX-MS dukket opp som et kraftig analytisk verktøy for å undersøke proteinstrukturelle dynamikker. Utviklingen av kommersielt tilgjengelige LC-MS-systemer designet og optimalisert for HDX-eksperimenter (for eksempel systemet som brukes i denne studien og oppført i materialene) kombinert med kraftige programvarepakker, har utvidet HDX-MS-tilnærmingen til mange akademiske og industrielle laboratorier, og har forvandlet det som en gang var en nisjeteknikk for 15 år siden til en mer brukervennlig analytisk plattform. Til tross for begrensningene i romlig oppløsning, gir HDX-MS svært kvantitative og reproduserbare målinger på proteinbevegelser og er ideelt egnet for å studere konforme dynamiske enzymer som er vanskelige å undersøke med andre tilnærminger. På grunn av disse egenskapene fyller HDX-MS en viktig nisje i strukturbiologien til uordnede og dynamiske proteinsystemer som har relevans på mange grunnleggende områder av biologi og medisin. Som sådan forventes HDX-MS-analyser å forbli et viktig verktøy i arsenalet til strukturbiologen i overskuelig fremtid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, Fonds de Recherche du Quebec Nature et Technologie, Canadian Foundation for Innovation og McGill University oppstartsfond.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
[glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib) BioBasic NA
0.5 mL Amicon Ultracel 10k centrifugal filtration device (Millipore) Milipore Sigma UFC501096
acetonitrile Fisher A955-1
AMP-PNP SIGMA A2647-25MG
ATP SIGMA a2383-5G
D2O ALDRICH 435767-100G
formic acid Thermo Fisher 28905
guanidine-HCl VWR 97063-764
HEPES Fisher BP310-1
Magnesium chloride SiGMA-Aldrich 63068-250G
Potassium chloride BioBasic PB0440
potassium phosphate BioBasic PB0445
TCEP Hydrochloride TRC Canada T012500 peptide was synthesized upon request
Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
software
Deuteros Andy M C Lau, et al version 1.08
DynamX Waters version 3.0
MassLynx Waters version 4.1
Protein Lynx
Global Server (PLGS)		 Waters version 3.0.3
PyMOL Schrödinger version 2.2.2
Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Instrument and equipment
ACQUITY UPLC BEH C18 analytical Column Waters 186002346
ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-column Waters 186003978
ACQUITY UPLC M-Class HDX System Waters
HDX Manager Waters
microtip pH electrode Thermo Fisher 13-620-291
Waters Enzymate BEH column or Pepsin solumn Waters 186007233
Waters Synapt G2-Si Waters

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karplus, M., McCammon, J. A. Molecular dynamics simulations of biomolecules. Nature Structural & Molecular Biology. 9 (9), 646-652 (2002).
  2. Campbell, E., et al. The role of protein dynamics in the evolution of new enzyme function. Nature Chemical Biology. 12 (11), 944-950 (2016).
  3. Tokuriki, N., Tawfik, D. S. Protein dynamism and evolvability. Science. 324 (5924), 203-207 (2009).
  4. Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrometry Reviews. 25 (1), 158-170 (2006).
  5. Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chemical Society Reviews. 40 (3), 1224 (2011).
  6. Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (4), 214 (1991).
  7. Zhang, Z., Smith, D. L. Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation. Protein Science. 2 (4), 522 (1993).
  8. Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).
  9. Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17 (1), 75-86 (1993).
  10. Xiao, K., et al. Revealing the architecture of protein complexes by an orthogonal approach combining HDXMS, CXMS, and disulfide trapping. Nature Protocols. 13 (6), 1403-1428 (2018).
  11. Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).
  12. Masson, G. R., et al. Recommendations for performing, interpreting and reporting hydrogen deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) experiments. Nature Methods. 16 (7), 595-602 (2019).
  13. Liu, J., et al. An Efficient Site-Specific Method for Irreversible Covalent Labeling of Proteins with a Fluorophore. Scientific Reports. 5, 16883 (2015).
  14. Marion, D., et al. Overcoming the overlap problem in the assignment of proton NMR spectra of larger proteins by use of three-dimensional heteronuclear proton-nitrogen-15 Hartmann-Hahn-multiple quantum coherence and nuclear Overhauser-multiple quantum coherence spectroscopy: application to interleukin 1.beta. Biochemistry. 28 (15), 6150-6156 (1989).
  15. Balasubramaniam, D., Komives, E. A. Hydrogen-exchange mass spectrometry for the study of intrinsic disorder in proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1834 (6), 1202-1209 (2013).
  16. Goswami, D., et al. Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).
  17. Keppel, T. R., Howard, B. A., Weis, D. D. Mapping Unstructured Regions and Synergistic Folding in Intrinsically Disordered Proteins with Amide H/D Exchange Mass Spectrometry. Biochemistry. 50 (40), 8722-8732 (2011).
  18. Mitchell, J. L., et al. Functional Characterization and Conformational Analysis of the Herpesvirus saimiri Tip-C484 Protein. Journal of Molecular Biology. 366 (4), 1282-1293 (2007).
  19. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).
  20. Habibi, Y., Uggowitzer, K. A., Issak, H., Thibodeaux, C. J. Insights into the Dynamic Structural Properties of a Lanthipeptide Synthetase using Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 141 (37), 14661-14672 (2019).
  21. Hebling, C. M., et al. Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (13), 5415-5419 (2010).
  22. Duc, N. M., et al. Effective application of bicelles for conformational analysis of G protein-coupled receptors by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (5), 808-817 (2015).
  23. Canul-Tec, J. C., et al. Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1. Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).
  24. Reading, E., et al. Interrogating Membrane Protein Conformational Dynamics within Native Lipid Compositions. Angewandte Chemie International Edition. 56 (49), 15654-15657 (2017).
  25. Hentze, N., Mayer, M. P. Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (81), e50839 (2013).
  26. Lento, C., et al. Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics. Journal of Visualized Experiments. (122), e55464 (2017).
  27. Schowen, K. B., Schowen, R. L. Solvent isotope effects on enzyme systems. Methods in Enzymology. 87, 551-606 (1982).
  28. Lau, A. M. C., Ahdash, Z., Martens, C., Politis, A. Deuteros: software for rapid analysis and visualization of data from differential hydrogen deuterium exchange-mass spectrometry. Bioinformatics. 35 (7), 3171-3173 (2019).
  29. Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (6), 2071 (2011).
  30. Burkitt, W., O'Connor, G. Assessment of the repeatability and reproducibility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry measurements. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 22 (23), 3893-3901 (2008).
  31. Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition. Lab on a Chip. 13, 2528-2532 (2013).

Tags

Biokjemi Utgave 159 Hydrogen-deuterium utveksling massespektrometri biokjemi enzymologi biosyntese naturlige produkter peptider
En Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) plattform for undersøkelse av peptidbiosyntetiske enzymer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. A… More

Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes. J. Vis. Exp. (159), e61053, doi:10.3791/61053 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter