Las síntesis de lanthipeptide catalizan las reacciones multipaso durante la biosíntesis de productos naturales péptidos. Aquí, describimos un flujo de trabajo continuo, ascendente, de intercambio de hidrógeno-deuterio de espectrometría de masas (HDX-MS) que se puede emplear para estudiar la dinámica de conformación de las sintesis de lanthipeptide, así como otras enzimas similares implicadas en la biosíntesis de productos naturales péptidos.
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Artículo de método
Una plataforma de espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX-MS) para investigar enzimas biosintéticas péptidos
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Resumen
Resumen
La espectrometría de masas de intercambio de deuterio de hidrógeno (HDX-MS) es un potente método para la caracterización biofísica de los cambios de conformación enzimática y las interacciones enzima-sustrato. Entre sus muchos beneficios, HDX-MS consume sólo pequeñas cantidades de material, se puede realizar en condiciones casi nativas sin necesidad de etiquetado enzimático/sustrato, y puede proporcionar información resuelta espacialmente sobre dinámicas de conformación enzimática, incluso para enzimas grandes y complejos multiproteína. El método se inicia mediante la dilución de la enzima de interés en tampón preparado en D2O. Esto desencadena el intercambio de protium en cruces de bonos péptidos (N-H) con deuterio (N-D). En los puntos de tiempo de intercambio deseados, las alícuotas de reacción se enfadan, la enzima se proteica en péptidos, los péptidos están separados por cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC), y el cambio en la masa de cada péptido (debido al intercambio de hidrógeno por deuterio) es registrado por LA. La cantidad de captación de deuterio por cada péptido depende en gran medida del entorno local de unión al hidrógeno de ese péptido. Péptidos presentes en regiones muy dinámicas del deuterio de intercambio de enzimas muy rápidamente, mientras que péptidos derivados de regiones bien ordenadas se intercambian mucho más lentamente. De esta manera, la tasa HDX informa sobre la dinámica de conformación de enzimas locales. Las perturbaciones a los niveles de captación de deuterio en presencia de diferentes ligandos se pueden utilizar para mapear sitios de unión de ligando, identificar redes alotéricas y comprender el papel de la dinámica de conformación en la función enzimática. Aquí, ilustramos cómo hemos utilizado HDX-MS para entender mejor la biosíntesis de un tipo de productos naturales péptidos llamados lanthipeptides. Los lanthipeptides son péptidos genéticamente codificados que son modificados post-traslacionalmente por enzimas grandes, multifuncionales y dinámicas conformadamente que son difíciles de estudiar con enfoques tradicionales de biología estructural. HDX-MS proporciona una plataforma ideal y adaptable para investigar las propiedades mecanicistas de este tipo de enzimas.
Introducción
Las proteínas son moléculas estructuralmente dinámicas que muestras de diferentes conformaciones en escalas de tiempo que van desde la vibración de unión a escala femtosecond hasta reordenamientos de dominios proteicos enteros que pueden ocurrir durante muchos segundos1. Estas fluctuaciones de conformación suelen ser aspectos críticos de la función enzimática/proteica. Por ejemplo, los cambios de conformación inducidos por la unión de ligando suelen ser de vital importancia para modular la función enzimática, ya sea organizando los residuos activos del sitio necesarios para la catálisis, definiendo sitios de unión de sustratos en mecanismos cin....
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Protocolo
1. Preparación de reactivos deuterados y soluciones de stock enzimático
- Preparar reactivos necesarios para las reacciones HDX (incluyendo cualquier búfer, sales, sustratos, ligandos, etc.) como soluciones de stock concentrado de 100-200x en D2O (99,9% fracción atómica D). Prepare al menos 50 ml de solución de stock de búfer.
NOTA: Para la caracterización de HalM2, se prepararon las siguientes soluciones: 500 mM MgCl2,100 mM tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), 750 mM ATP (en búfer HEPES), 800 mM HEPES pD 7.1, 500 μM HalA2 y 500 m AMPM AMPPNP. - Congelar y liofilizar las soluciones de stock para la sequedad.
- Re-disolve....
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Resultados
Es necesario evaluar la calidad de la digestión proteótica y la reproducibilidad del flujo de trabajo para cada conjunto de inyecciones de muestra. Por lo tanto, antes de realizar ensayos HDX-MS, es esencial establecer condiciones efectivas para la proteolisis de la proteína de interés, para la separación de péptidos utilizando cromatografía líquida en fase inversa y movilidad de iones de fase de gas, y para la detección de péptidos utilizando EM. A tal fin, las muestras de referencia para la proteína de interés (recogid.......
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Discusión
El flujo de trabajo HDX-MS presentado en este protocolo proporciona una plataforma notablemente robusta para mapear la distribución espacial de elementos estructuralmente dinámicos en proteínas y para investigar cómo estas dinámicas cambian en respuesta a la perturbación (unión de ligando, mutagénesis enzimática, etc.). HDX-MS tiene varias ventajas distintas sobre otros enfoques de biología estructural que se utilizan comúnmente para investigar la dinámica de conformación. En particular, sólo se necesitan pequeñas cantid.......
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Divulgaciones
No tenemos nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá, los Fonds de Recherche du Quebec Nature et Technologie, la Fundación Canadiense para la Innovación y los fondos de puesta en marcha de la Universidad McGill.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| [glu-1]-fibrinopéptido B (Glu-Fib) | BioBasic | NA | |
| 0,5 mL Amicon Ultracel 10k dispositivo de filtración centrífuga (Millipore) | Milipore Sigma | UFC501096 | |
| acetonitrilo | Fisher | A955-1 | |
| AMP-PNP | SIGMA | A2647-25MG | |
| ATP | SIGMA | a2383-5G | |
| D2O | ALDRICH | 435767-100G | |
| ácido fórmico | Thermo Fisher | 28905 | |
| guanidina-HCl | VWR | 97063-764 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Cloruro de magnesio | SiGMA-Aldrich | 63068-250G | |
| Cloruro de | potasioFosfato de potasio BioBasic | PB0440 | |
| TCEP se sintetizó a pedido | |||
| Nombre del material/equipo | Compañía | Número de catálogo | >Comments/Description |
| software | |||
| Deuteros | Andy M C Lau, et al | versión 1.08 | |
| DynamX | Waters | versión 3.0 | |
| MassLynx | Waters | versión 4.1 | |
| Protein Lynx Global Server (PLGS) | Waters | versión 3.0.3 | |
| PyMOL | Schrö versión | 2.2.2 | |
| Nombre del Material/ Equipo | Compañía | Número de catálogo | Comentarios/Descripción |
| Instrumentos y equipos | |||
| ACQUITY UPLC BEH C18 analítica Aguas | de columna | 186002346 | |
| ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Precolumna | de Waters | 186003978 | |
| Sistema ACQUITY UPLC M-Class HDX | Waters | ||
| Waters | |||
| Electrodo de pH de micropunta Thermo | Fisher | 13-620-291 | |
| Waters Enzymate BEH columna o pepsina solumn | Waters | 186007233 | |
| Waters Synapt Aguas |
Referencias
- Karplus, M., McCammon, J. A. Molecular dynamics simulations of biomolecules. Nature Structural & Molecular Biology. 9 (9), 646-652 (2002).
- Campbell, E., et al. The role of protein dynamics in the evolution of new enzyme function. Nature Chemical Bi....
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Reimpresiones y permisos
