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Biochemistry

Una plataforma de espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX-MS) para investigar enzimas biosintéticas péptidos

Published: May 4, 2020 doi: 10.3791/61053
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry, McGill University

Summary

Las síntesis de lanthipeptide catalizan las reacciones multipaso durante la biosíntesis de productos naturales péptidos. Aquí, describimos un flujo de trabajo continuo, ascendente, de intercambio de hidrógeno-deuterio de espectrometría de masas (HDX-MS) que se puede emplear para estudiar la dinámica de conformación de las sintesis de lanthipeptide, así como otras enzimas similares implicadas en la biosíntesis de productos naturales péptidos.

Abstract

La espectrometría de masas de intercambio de deuterio de hidrógeno (HDX-MS) es un potente método para la caracterización biofísica de los cambios de conformación enzimática y las interacciones enzima-sustrato. Entre sus muchos beneficios, HDX-MS consume sólo pequeñas cantidades de material, se puede realizar en condiciones casi nativas sin necesidad de etiquetado enzimático/sustrato, y puede proporcionar información resuelta espacialmente sobre dinámicas de conformación enzimática, incluso para enzimas grandes y complejos multiproteína. El método se inicia mediante la dilución de la enzima de interés en tampón preparado en D2O. Esto desencadena el intercambio de protium en cruces de bonos péptidos (N-H) con deuterio (N-D). En los puntos de tiempo de intercambio deseados, las alícuotas de reacción se enfadan, la enzima se proteica en péptidos, los péptidos están separados por cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC), y el cambio en la masa de cada péptido (debido al intercambio de hidrógeno por deuterio) es registrado por LA. La cantidad de captación de deuterio por cada péptido depende en gran medida del entorno local de unión al hidrógeno de ese péptido. Péptidos presentes en regiones muy dinámicas del deuterio de intercambio de enzimas muy rápidamente, mientras que péptidos derivados de regiones bien ordenadas se intercambian mucho más lentamente. De esta manera, la tasa HDX informa sobre la dinámica de conformación de enzimas locales. Las perturbaciones a los niveles de captación de deuterio en presencia de diferentes ligandos se pueden utilizar para mapear sitios de unión de ligando, identificar redes alotéricas y comprender el papel de la dinámica de conformación en la función enzimática. Aquí, ilustramos cómo hemos utilizado HDX-MS para entender mejor la biosíntesis de un tipo de productos naturales péptidos llamados lanthipeptides. Los lanthipeptides son péptidos genéticamente codificados que son modificados post-traslacionalmente por enzimas grandes, multifuncionales y dinámicas conformadamente que son difíciles de estudiar con enfoques tradicionales de biología estructural. HDX-MS proporciona una plataforma ideal y adaptable para investigar las propiedades mecanicistas de este tipo de enzimas.

Introduction

Las proteínas son moléculas estructuralmente dinámicas que muestras de diferentes conformaciones en escalas de tiempo que van desde la vibración de unión a escala femtosecond hasta reordenamientos de dominios proteicos enteros que pueden ocurrir durante muchos segundos1. Estas fluctuaciones de conformación suelen ser aspectos críticos de la función enzimática/proteica. Por ejemplo, los cambios de conformación inducidos por la unión de ligando suelen ser de vital importancia para modular la función enzimática, ya sea organizando los residuos activos del sitio necesarios para la catálisis, definiendo sitios de unión de sustratos en mecanismos cinéticos secuenciales, protegiendo los intermediarios reactivos del medio ambiente o modulando la función enzimática a través de redes alotéricas. Estudios recientes también han demostrado que la dinámica de conformación se puede conservar a lo largo de la evolución y que las perturbaciones a los movimientos moleculares conservados pueden correlacionar con cambios en la especificidad del sustrato y la aparición de nuevas funciones enzimáticas2,3.

En los últimos años, la espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX-MS) ha surgido rápidamente como una poderosa técnica para sondear cómo los paisajes de conformación de proteínas responden a perturbaciones como la unión de ligando o la mutagénesis4,5,6,7. En un experimento típico de HDX-MS(Figura 1),una proteína de interés se coloca en amortiguador preparado en D2O, lo que desencadena la sustitución de protones intercambiables con disolventes con deuteria. El tipo de cambio de la mitad de la mitad de los bonos de péptido depende fuertemente del pH, la secuencia local de aminoácidos, y del entorno estructural local de la mitad8. Las amides que se dedican a interacciones de unión al hidrógeno (como las presentes en α-helices y β hojas) intercambian más lentamente que en medio de regiones no estructuradas de la proteína que están expuestas a disolvente a granel. Por lo tanto, el alcance de la captación de deuterio es un reflejo de la estructura de la enzima. Se espera que las enzimas que son dinámicas de forma conformación, o que se someten a transiciones estructurales en la unión a los ligandos, produzcan una respuesta HDX medible.

La base mecanicista para el tipo de cambio lento de un medio estructurado se muestra en la Figura 25,8,9. Para someterse a HDX, la región estructurada primero debe muestrear transitoriamente una conformación desplegada, de manera que las moléculas solventes que catalizan el intercambio HDX a través de un mecanismo químico específico ácido/base, tengan acceso a la entresuela intercambiable. En última instancia, las magnitudes relativas del tipo de cambio químico (kchem) y las tasas de plegado y reencarnamiento (kopen y kclose) determinan la tasa HDX medida en el experimento5,8. A partir de este sencillo modelo cinético, está claro que el alcance de la captación de deuterio reflejará la dinámica de conformación subyacente (definida por kopen y kclose). La mayoría de los experimentos HDX-MS se realizan en un flujo de trabajo ascendente donde, tras la reacción de intercambio, la proteína de interés se digiere en péptidos y la captación de deuterio por cada péptido se mide como un aumento de la masa7. De esta manera, HDX-MS permite mapear perturbaciones a la dinámica de conformación enzimática en la escala espacial local de péptidos, lo que permite al investigador evaluar cómo la perturbación altera la dinámica en diferentes regiones de la enzima de interés.

Las ventajas del enfoque HDX-MS para dilucidar la dinámica estructural de las proteínas son numerosas. En primer lugar, el método se puede realizar con pequeñas cantidades de proteína nativa o en complejos proteicos en sistemas con estructura cuaternaria10. Ni siquiera es necesario que la preparación enzimática utilizada en el ensayo sea altamente purificada11,12, siempre y cuando el flujo de trabajo hdx-MS de abajo hacia arriba proporcione un número suficiente de péptidos identificados con confianza que cubren la secuencia de proteínas de interés. Además, HDX-MS puede proporcionar información sobre la dinámica de conformación en condiciones casi nativas sin la necesidad de etiquetado proteico específico del sitio, como se utilizaría en los estudios de fluorescencia de molécula única13,y no hay límite de tamaño para el complejo proteico o proteico que se puede investigar (lo que hace que enfoques como la espectroscopia de resonancia magnética nuclear [NMR] sean desafiantes)7,14. Por último, se pueden emplear métodos HDX-MS resueltos en el tiempo para estudiar proteínas intrínsecamente desordenadas, que son difíciles de estudiar con cristalografía de rayos X15,16,17,18. La principal limitación de HDX-MS es que los datos son de baja resolución estructural. Los datos HDX-MS son útiles para señalar dónde están cambiando las dinámicas de conformación y para revelar cambios de conformación acoplados, pero a menudo no proporcionan mucha información sobre el mecanismo molecular preciso que impulsa el cambio observado. Los recientes avances en la combinación de métodos de disociación de captura de electrones con datos de proteínas HDX-MS han demostrado ser prometedores para mapear sitios de intercambio a residuos de aminoácidos individuales19,pero a menudo se necesitan estudios bioquímicos y estructurales de seguimiento para proporcionar claridad a los modelos estructurales reenviados por datos de HDX-MS.

A continuación, se presenta un protocolo detallado para el desarrollo de un ensayo HDX-MS20. Los protocolos de preparación de muestras que se presentan a continuación deben aplicarse generalmente a cualquier proteína que muestre una buena solubilidad en tampones acuosos. Los métodos de preparación de muestras más especializados y los flujos de trabajo HDX-MS están disponibles para proteínas que necesitan ser ensayos en presencia de detergente o fosfolípidos21,22,23,24. Los ajustes instrumentales para la recopilación de datos HDX-MS se describen para un espectrómetro de masa de tiempo de vuelo de cuadrúpeda de alta resolución acoplado al sistema de cromatografía líquida. Los datos de complejidad y resolución similares podrían recopilarse en cualquiera de una serie de sistemas de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) disponibles comercialmente. También se proporcionan aspectos clave del procesamiento de datos mediante un paquete de software disponible comercialmente. También presentamos directrices para la recopilación y el análisis de datos que sean coherentes con las recomendaciones formuladas por la comunidad más amplia de HDX-MS12. El protocolo descrito se utiliza para estudiar las propiedades estructurales dinámicas de HalM2, una sintátida de lanthipéptido que cataliza la maduración multipaso de un producto natural de péptido antimicrobiano20. Ilustramos cómo HDX-MS se puede utilizar para revelar sitios de enlace de sustratos y propiedades alotéricas que han eludido la caracterización anterior. Varios otros protocolos sobre proteína HDX-MS se han publicado en los últimos años25,26. Junto con el trabajo actual, estas contribuciones anteriores deberían proporcionar al lector cierta flexibilidad en el diseño experimental.

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Protocol

1. Preparación de reactivos deuterados y soluciones de stock enzimático

  1. Preparar reactivos necesarios para las reacciones HDX (incluyendo cualquier búfer, sales, sustratos, ligandos, etc.) como soluciones de stock concentrado de 100-200x en D2O (99,9% fracción atómica D). Prepare al menos 50 ml de solución de stock de búfer.
    NOTA: Para la caracterización de HalM2, se prepararon las siguientes soluciones: 500 mM MgCl2,100 mM tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), 750 mM ATP (en búfer HEPES), 800 mM HEPES pD 7.1, 500 μM HalA2 y 500 m AMPM AMPPNP.
  2. Congelar y liofilizar las soluciones de stock para la sequedad.
  3. Re-disolver en D2O, y repetir ciclo de liofilización al menos un tiempo adicional para reemplazar tantos de los protones intercambiables con deuterones como sea posible.
  4. Ajuste el pD del material de amortiguador HEPES deuterado al valor deseado con NaOD/DCl concentrado, teniendo en cuenta la siguiente relación27:
    Equation 1
    NOTA: La velocidad HDX de la amide depende en gran medida del pL de la solución (pL = pH o pD)5. Los diferentes lotes de soluciones de almacenamiento en búfer deben prepararse, almacenarse y utilizarse de manera idéntica para evitar una ligera deriva de pL entre experimentos.
  5. Calcule la cantidad de cada reactivo necesario para un ensayo HDX de 300 μL y almacene como coácuotas de un solo uso a -80 °C.
  6. Preparar una solución de almacenamiento enzimático concentrado (~100-200 μM) en un búfer de almacenamiento enzimático protado utilizando un filtro centrífugo(Tabla de Materiales)o dispositivo equivalente.
    NOTA: El amortiguador exacto y el corte de peso molecular del filtro centrífugo dependerán de la proteína/enzima de interés. HalM2 se almacena en HEPES de 50 mM, pH 7,5, 100 mM KCl y 10% de glicerol. Se utilizaron filtros de 10 kDa para preparar la enzima concentrada.
  7. Aliquot la enzima en porciones de un solo uso y almacenar a -80 °C.
    NOTA: Esto puede ser un punto de parada. Todas las soluciones de stock descritas en la sección 1 se pueden preparar antes de las reacciones HDX. Si se almacenan a -80 °C, la mayoría de las enzimas/soluciones de stock deuterado serán estables durante muchos meses.

2. Calibración del volumen de enfriamiento HDX

  1. Prepare una reacción HDX de 300 μL en D2O utilizando los reactivos deuterados y las poblaciones de enzimas concentradas preparadas en la sección 1.
    1. Utilice una concentración final enzimática de 1-5 μM.
    2. Utilice una concentración de búfer HEPES deuterada final de al menos 50-100 mM.
    3. Asegúrese de que las concentraciones de otros componentes sean suficientes para mantener la actividad/función enzimática deseada.
  2. Preparar 1 L de solución de enfriamiento HDX (fosfato de 100 mM, 0,8 M guanidina-HCl, pH 1.9). Congelar y almacenar en porciones de 50 ml (para stock a largo plazo) y 1 mL porciones (para aliquots de un solo uso).
    NOTA: La composición exacta del búfer de enfriamiento dependerá de la enzima que se utilice en el paso de proteolisis del flujo de trabajo HDX-MS ascendente (paso 3.3.3). El búfer de enfriamiento dado aquí es compatible con pepsina, la proteasa más utilizada para HDX-MS. Si se utiliza una proteasa diferente, consulte con el proveedor de proteasa para garantizar la compatibilidad del búfer.
  3. Calibrar el volumen de búfer de enfriamiento necesario para ajustar el pL final de la mezcla de reacción HDX saciada a un valor de lectura de medidor de pH de 2,3.
    NOTA: El tipo de cambio H/D solvente de la unión N-H de peptídica es un proceso dependiente del pH que está sujeto a catálisis ácida y base. El tipo de cambio mínimo se produce a un valor de pH 2,5 (lectura del medidor de pH = 2,3 para una mezcla de 50:50 H2O:D2O). Por lo tanto, un valor final de pL cerca de 2,5 minimizará el intercambio posterior de hidrógeno que se produce durante el análisis LC-MS de abajo hacia arriba, preservando así la etiqueta de deuterio en los péptidos.
    1. Mezcle 50 μL de la mezcla de reacción HDX del paso 2.1 con 50 μL de búfer de enfriamiento y mida el pL de la mezcla saciada con un electrodo de micro yema.
    2. Aumente el volumen de la solución de enfriamiento según sea necesario para ajustar la lectura final del medidor de pH a un valor de 2,3.
    3. Una vez determinado el volumen de enfriamiento adecuado, repita el proceso de enfriamiento varias veces utilizando alícuotas frescas de 50 μL de la reacción HDX (paso 2.1) para asegurarse de que se logra un pL final consistente al adición de una cantidad fija de búfer de enfriamiento.

3. Preparación de muestras de referencia y optimización del flujo de trabajo LC-MS de abajo hacia arriba

  1. Preparar muestras de referencia no deuteradas para la proteína de interés en triplicato en tubos de 0,5 ml. Asegúrese de que las condiciones de mezcla de reacción final sean idénticas a las utilizadas en las reacciones HDX auténticas (paso 2.1), excepto que las reacciones se preparan en H2O utilizando soluciones de stock reactivos también preparadas en H2O.
  2. Enciba las muestras como en el paso 2.3 agregando el volumen adecuado de búfer de enfriamiento para ajustar el pH final a 2.5. Flash congelar las muestras en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C hasta que estén listas para su análisis.
  3. Analice las muestras de referencia enzimática protadas utilizando un flujo de trabajo LC-MS ascendente.
    NOTA: Antes de ejecutar estos pasos, el sistema LC-MS que se utilizará para la adquisición de datos debe calibrarse correctamente y estar listo para su uso. La sincronización y la temperatura de todos los pasos en el flujo de trabajo LC-MS de abajo hacia arriba deben controlarse rigurosamente para minimizar las diferencias en el intercambio posterior entre muestras. Con la instrumentación de EM utilizada en este protocolo (Tabla de materiales y Información de apoyo), la mayoría de los pasos se pueden controlar a través del software del instrumento. Para garantizar la recopilación de réplicas precisas, se recomienda automatizar tantos de los pasos del flujo de trabajo como sea posible.
    1. Retire una muestra de referencia enzimática individual (preparada como en el paso 3.2) del congelador y descongele a 37 °C durante 1 minuto en un baño de agua.
    2. Precisamente 2 minutos después de extraer la muestra del congelador y descongelar, inyecte una porción de 40 μL de la muestra de referencia saciada en una columna de cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC) (2,1 x 30 mm, 300 Å, 5 μM) que contenga una fase estacionaria funcionalizada con pepsina (una proteasa estable en ácido).
    3. Digerir la muestra a un caudal de 100 μL/min durante 3 min a 15 °C utilizando ácido fórmico del 0,1% en H2O (pH = 2,5) como disolvente.
    4. Recoge los péptidos pépticos mientras se escapan de la columna de pepsina a una columna de trampa C18 mantenida a 0,4 °C para minimizar el intercambio posterior.
    5. Pase los péptidos pépticos desalados de la columna de trampa a una columna analítica C18 (1 mm x 100 mm, 1,7 μM, 130 Å) mantenida y operada a 0,4 °C para la separación de los péptidos pépticos.
      NOTA: Los pasos 3.3.3−3.3.5 pueden ser automatizados por ciertos sistemas LC-MS utilizados para la adquisición de datos HDX-MS. Alternativamente, estos pasos se pueden realizar de forma independiente, teniendo en cuenta que el tiempo y la temperatura de cada paso deben controlarse cuidadosamente para lograr un intercambio posterior consistentemente bajo.
    6. Elute la columna C18 con un sistema de disolvente de acetonitrilo/agua/0,1% de ácido fórmico. Optimice el gradiente LC para la proteína de interés con el fin de maximizar la separación y preservar la etiqueta de deuterio en los péptidos pépticos.
      NOTA: Los detalles de la elución de degradado se proporcionan en la información de soporte.
    7. Someta el digerido péptico a la espectrometría de masas de ionización de electrospray (ESI).
      NOTA: Las condiciones de origen proporcionadas en la información de soporte proporcionarán una ionización suficiente para la mayoría de los péptidos pépticos.
      1. Una vez ionizado en el instrumento MS, realice una separación de movilidad de iones de fase de gas utilizando nitrógeno como gas amortiguador para mejorar la capacidad máxima del método.
      2. Después de la separación de movilidad de iones, someta los iones precursores pépticos a un flujo de trabajo mse que implica ciclos alternos de baja energía de colisión (4 V) y alta energía de colisión (21-40 V).
        NOTA: Los regímenes alternos de energía de baja y alta colisión permiten la recopilación de datos de EM (baja energía de colisión) simultáneamente con datos MSMS (alta energía de colisión). Esto, a su vez, permite la correlación de tiempo de los iones precursores con sus respectivos iones de fragmento. Esta correlación es esencial para la identificación segura de péptidos descrita en la sección 4.
      3. Detecte el precursor del péptido y los iones de fragmento utilizando un analizador de masas con una potencia de resolución de al menos 20.000.
      4. Simultáneamente con la adquisición de datos, adquiera datos de EM para un estándar externo [Glu-1]-fibrinopeptide B (GluFib).
        NOTA: El flujo de trabajo de MS descrito en el paso 3.3.7 se conoce como un protocolo MSE. Los ajustes instrumentales completos de un protocolo MSE adecuado para HDX-MS de abajo hacia arriba se proporcionan en la información de soporte.
    8. Evaluar la calidad de los datos de LC-MS.
      NOTA: Utilizando el protocolo descrito anteriormente y los ajustes instrumentales proporcionados en la información de soporte,las muestras de referencia deben producir un cromatograma iónico total con una intensidad máxima de señal de aproximadamente 1 x 108. Debe haber muchos péptidos pépticos que eluden entre 3-9 min(Figura 3A-C).
    9. Inyecte 40 μL de muestras en blanco (0,1% de ácido fórmico en agua) para limpiar las columnas de pepsina y analíticas C18.
      NOTA: En general, 2-3 espacios en blanco deben ser suficientes.
    10. Repita los pasos 3.3.1−3.3.9 para cada una de las muestras de proteína de referencia triplicada.

4. Tratamiento de los datos de referencia y definición de una lista de péptidos

  1. Analice los datos sin procesar de MSE (paso 3.3.7) utilizando software de proteómica (Tabla de materiales). Con el software proteomics, vaya a Bibliotecas | Bancos de datos de secuencia de proteínas para definir la base de datos de proteínas importando la secuencia de aminoácidos de la proteína de interés.
    NOTA: El objetivo de este paso es buscar péptidos pépticos derivados de la proteína de interés y utilizar los datos MSMS (adquiridos simultáneamente con los datos de EM) para validar cualquier identificación de péptido putativo.
  2. Dar un nombre a la secuencia proteica de interés. Importe la secuencia de proteínas (en formato FASTA). El software realizará una digestión en silico de la proteína de la base de datos para generar una lista de péptidos que se utilizarán para buscar los datos de LC-MS.
  3. Defina los parámetros de procesamiento (ubicados en el menú Biblioteca). Seleccione Electrospray MSE como tipo de adquisición de datos. En el campo Bloquear masa para cargar 2, escriba 785.8426 para el m/z para el 2+ ión de [Glu-1]-fibrinopeptide B (GluFib) y haga clic en finalizar.
  4. Defina los parámetros de flujo de trabajo (ubicados en el menú Biblioteca).
    1. Seleccione Electrospray MSE para el tipo de búsqueda. En el | flujo de trabajo Encabezado Consulta de búsqueda de base de datos, seleccione la proteína de base de datos creada en el paso 4.2 en el campo Banco de datos.
    2. Cambie El reactivo de resumen primario a inespecífico y desactive el campo Reactivo modificador fijo manteniendo pulsado el botón Ctrl mientras hace clic en Carbamidomethyl C.
  5. Especifique el directorio de salida navegando a las opciones | configuración de automatización | Identidad E. Marque las casillas apex 3D y péptido salida 3D y salida de contabilidad de iones y especifique el directorio deseado.
  6. Procese los datos de ejemplo de referencia.
    1. En la barra de herramientas izquierda del espacio de trabajo de la plataforma proteómica, cree una nueva placa haciendo clic con el botón derecho en La placa de microtitro. Resalte tres pozos en la placa de microtíter (uno por cada muestra de referencia recogida en la sección 3). Haga clic izquierdo en un pozo, mantenga pulsado y arrastre a tres pozos.
    2. Haga clic con el botón derecho y seleccione Agregar datos sin procesar. En la ventana que aparece, vaya al directorio que contiene los tres archivos de referencia de la sección 3 y selecciónelos al mismo tiempo.
    3. Haga clic en siguiente y elija los parámetros de procesamiento definidos en el paso 4.3. Haga clic en siguiente y seleccione los parámetros de flujo de trabajo definidos en el paso 4.4. A continuación, haga clic en finalizar.
  7. Una vez que los datos sin procesar, los parámetros de procesamiento y los parámetros de flujo de trabajo se han asignado a cada pozo de la placa, los pozos aparecerán azules. Seleccione los pozos, haga clic con el botón derecho y seleccione procesar los últimos datos sin procesar. Haga clic en la esquina inferior derecha de la ventana para realizar un seguimiento del procesamiento de los datos. Una vez que aparece el mensaje No hay trabajo que ejecutar, el procesamiento se realiza completamente.
  8. Una vez completado el procesamiento de datos, los pozos de la placa se volverán verdes. Haga clic con el botón derecho en los pozos y seleccione ver los resultados del flujo de trabajo. Se abrirá una ventana independiente para cada archivo de datos de referencia.
  9. Inspeccione los datos para asegurarse de que la mayoría de las señales de EM en los datos de la muestra de referencia se asignaron con éxito a péptidos predichos a partir de la digestión en silico de la proteína de interés. Los péptidos coincidentes se colorearán en azul en el espectro de salida (Figura 4). Haga doble clic en el filtro OK y compruebe que la cobertura porcentual es superior al 99%.
    NOTA: Al procesar, la salida de datos se guardará automáticamente con la extensión de archivo(raw_data_file_name_IA_final_peptide) en el directorio especificado en el paso 4.5.
  10. Importe la salida de software de proteómica en el software de procesamiento HDX (Tabla de materiales) para umbrales adicionales.
    1. Haga clic en Datos en la esquina izquierda de la ventana de software de procesamiento HDX. Haga clic en importar resultados PLGS y haga clic en el icono agregar. Elija los archivos de datos procesados del paso 4.9 navegando al directorio adecuado.
    2. Haga clic en Siguiente y especifique los siguientes parámetros: iones consecutivos mínimos ≥ 2, error de masa = 5 ppm y umbral de archivo = 3. Haga clic en finalizar.
  11. Una vez satisfecho con los parámetros de umbral, guarde el proyecto HDX. Todos los datos HDX se importarán a este proyecto para su análisis y visualización.
    NOTA: Las muestras intercambiadas de deuterio descritas en la siguiente sección deberán procesarse con un flujo de trabajo LC-MS idéntico. Por lo tanto, antes de continuar con los ensayos HDX (sección 5), asegúrese de que la preparación de la muestra (sección 2), el flujo de trabajo LC-MS ascendente (sección 3) y los flujos de trabajo de procesamiento de datos (sección 4) están proporcionando la reproducibilidad deseada y la cobertura de secuencia de la proteína objetivo. Si es necesario cambiar cualquiera de estos procesos para mejorar la cobertura, se recomienda volver al paso 2.1, preparar muestras de referencia nuevas en triplicato y repetir las secciones 2-4 (mientras se realizan los ajustes necesarios en el protocolo) para asegurarse de que cada péptido se puede generar y detectar reproduciblemente.

5. Realización de reacciones HDX

  1. Prepare el espacio de trabajo para las reacciones HDX.
    1. Búfer de enfriamiento pre-alícuota en tubos de 0,5 ml correctamente etiquetados. Prepare un tubo diferente para cada punto de tiempo, cada réplica y cada estado bioquímico a analizar. Utilice el volumen adecuado de búfer de enfriamiento del paso 2.2 necesario para ajustar la lectura final del medidor de pH de una porción de 50 μL de la reacción HDX a un valor de 2,3.
    2. Centrífuga brevemente las tinas de 0,5 ml para transferir todo el búfer de enfriamiento a la parte inferior del tubo. Coloque los tubos sobre hielo.
    3. Llene un pequeño Dewar con nitrógeno líquido y manténgalo junto al espacio de trabajo.
  2. Prepare las reacciones HDX. Asegúrese de que haya suficiente volumen de reacción para recoger el número deseado de puntos de tiempo de intercambio (una alícuota de 50 μL por cada punto de tiempo deseado). Recoger al menos 4-5 puntos de tiempo sobre 3-4 órdenes de magnitud en escala de tiempo (por ejemplo, tiempos de enfriamiento de 15 s, 60 s, 300 s [5 min], 1.800 s [30 min] y 14.400 s [4 h] proporcionan una cobertura adecuada de la dinámica de intercambio para la mayoría de las enzimas).
    1. Premezcla todos los componentes deuterados (menos enzima) del paso 1.1 en D2O.
    2. Para cada estado bioquímico a examinar (enzima libre, enzima + ligando, enzima + inhibidor, etc.), preparar reacciones HDX en al menos triplicato.
    3. Incubar las mezclas de reacción en un baño de agua con temperatura controlada a 25 °C durante 10 minutos antes de la adición de la enzima.
      NOTA: La enzima debe prepararse como una solución de stock concentrado (~100−200 μM, paso 1.6) para minimizar la adición de protium en el ensayo HDX.
    4. Al añadir la enzima a una concentración final de 1-5 μM, comience el temporizador. Mezcle cuidadosamente y rápidamente la solución utilizando una pipeta de 200 μL para asegurarse de que la enzima se distribuye uniformemente en la muestra.
    5. En los puntos de tiempo de intercambio deseados, retire 50 alícuotas de μL de la reacción HDX y mezcle rápida y uniformemente con el búfer de enfriamiento helado pre-alícuota en un tubo de 0,5 ml.
      NOTA: Los volúmenes de mezcla y el procedimiento de mezcla deben ser lo más precisos y reproducibles posible para garantizar que el pL de enfriamiento final deseado de 2.3 se alcance rápidamente en todas las muestras. Mantener frío el tampone de tampones de enfriamiento ayudará a minimizar el intercambio posterior tras la desnaturalización de la enzima.
    6. Inmediatamente después de apagar la muestra HDX, tapar el tubo y congelar el flash en nitrógeno líquido.
    7. Continúe recogiendo puntos de tiempo hasta que se completen todos los ensayos y, a continuación, transfiera muestras al congelador -80 °C para su almacenamiento.
      NOTA: Esto puede ser un punto de parada. Después de recopilar todos los puntos de tiempo HDX, las muestras se pueden almacenar a -80 °C hasta que estén listas para el análisis de LC-MS. Idealmente, las reacciones HDX triplicada deben realizarse para todos los estados bioquímicos de interés en el mismo día. Como mínimo, todas las reacciones HDX de réplica para un estado bioquímico determinado deben ejecutarse en paralelo el mismo día.
  3. Después de recopilar todos los puntos de tiempo HDX saciados, someta las muestras al flujo de trabajo optimizado de LC-MS ascendente desarrollado como se describe en el paso 3.3. Inyecte muestras HDX en un orden aleatorio con un número adecuado de espacios en blanco entre muestras para asegurarse de que cualquier transporte de péptidos sea mínimo.
    NOTA: Los datos HDX no necesitan ser recogidos en modo MSE. Por lo tanto, el segmento de energía de colisión alta (paso 3.3.7.2) debe ser eliminado del ciclo de trabajo MS. Esta debe ser la única alteración realizada en el flujo de trabajo descrito en el paso 3.3.
  4. Evalúe la calidad de los datos HDX a medida que se recopilan.
    1. Asegúrese de que los picos cromatográficos presentes en el cromatograma iónico total de las muestras de referencia no deuteradas aparezcan al mismo tiempo de retención en las muestras deuteradas (como en la Figura 3D-F).
    2. Asegúrese de que los espectros de masas resumidos en intervalos de tiempo específicos a partir de muestras de referencia y deuteradas muestren evidencia de deuteración (es decir, un cambio en el sobre isotópico de péptidos individuales a valores m/z más altos en las muestras deuteradas [Figura 6]).

6. Procesamiento de datos HDX

  1. Importe los datos HDX en el proyecto HDX creado en el paso 4.11 haciendo clic en Datos | MS Archivos en la barra de herramientas superior.
    1. Haga clic en Nuevo estado y Nueva exposición según sea necesario para definir los estados bioquímicos (por ejemplo, enzima libre, enzima + ligando, etc.) y los tiempos de exposición al deuterio, respectivamente, que son pertinentes para el análisis.
    2. Haga clic en Nuevo raw para seleccionar los archivos de datos HDX que se analizarán. Asigne los tiempos de intercambio adecuados y el estado bioquímico a cada archivo de datos sin procesar que se importe.
      NOTA: Los datos se pueden importar y procesar en lotes, o todos a la vez. Agregar datos al proyecto no deshacerá ningún análisis que se haya realizado previamente dentro de ese proyecto.
  2. Una vez agregados los archivos de datos, haga clic en Finalizar para iniciar el procesamiento de datos. Después de un breve retraso, el software preguntará si el usuario desea guardar los datos antes de continuar. Haga clic en Sí.
    NOTA: El procesamiento inicial puede tardar hasta varias horas dependiendo de cuántas muestras se estén analizando, cuántos péptidos hay en la lista final de péptidos (paso 4.10), el tamaño de la ventana cromatográfica y la frecuencia de adquisición espectral.
  3. Si lo desea, modifique los parámetros de procesamiento en el menú Configuración para cambiar los parámetros de búsqueda de iones. Asegúrese de emplear los mismos parámetros de búsqueda de iones para todos los datos de un proyecto determinado.

7. Análisis y visualización de los datos HDX

NOTA: Una vez completado el procesamiento inicial de los datos sin procesar (paso 6.2), el software de procesamiento HDX habrá localizado péptidos de la lista de péptidos (generados en el paso 4.10) en cada uno de los archivos de datos sin procesar que se analizaron. Una vez que la distribución del isótopo para un péptido en la lista se encuentra en un archivo de datos sin procesar, el software de procesamiento HDX representa cada isótopo con un "palo" (como en la figura 6C-E). Las intensidades relativas de los palos para un péptido dado se utilizan para calcular la captación de deuterio en relación con los espectros de referencia. Mientras que el software de procesamiento HDX hace un trabajo admirable de asignar correctamente "palos" a la mayoría de los péptidos, todavía se requerirá una curación manual significativa de los valores de captación de deuterio.

  1. Análisis de los valores de captación de péptidos
    1. Seleccione el primer péptido en la lista de péptidos y abra el trazado espectral apilado en el menú Vistas. Desplázate hacia arriba y hacia abajo en la ventana de trazado de espectros apilados para ver los espectros de masas del péptido seleccionado en función del tiempo de intercambio de deuterio (Figura 7D,E).
    2. Asigne y desasigne palos según sea necesario utilizando clics del ratón para asegurarse de que la distribución adecuada del isótopo se ha ubicado en los datos y que cada pico isótopo se ha asignado (los palos asignados aparecerán azules). Al hacer clic en cualquiera de los espectros de la gráfica espectral apilada (Figura 7D,E) permitirá al usuario asignar/anular la asignación de sticks en la ventana visor de datos activa (Figura 7C).
    3. Compruebe las asignaciones de stick para cada estado de carga alternando el estado de carga en la parte superior de la ventana de trazado espectral apilado.
    4. Repita los pasos 7.1.1−7.1.3 para cada estado de interés bioquímico. El estado bioquímico también se puede alternar en la parte superior de la ventana de trazado espectral apilado. Para las mediciones de diferencia de absorción de deuterio más precisas, asegúrese de que los palos se asignan para el mismo conjunto de estados de carga para cada estado bioquímico.
    5. Repita los pasos 7.1.1−7.1.4 para cada péptido en la lista de péptidos.
    6. Compruebe la desviación estándar de los valores de captación de deuterio péptido utilizando el mapa de cobertura.
      1. Acceda al mapa de cobertura desde el menú Vistas, que muestra cada péptido de la lista de péptidos asignada a lo largo de la secuencia de aminoácidos de la proteína de interés (Figura 8C). Coloree los péptidos según la desviación estándar relativa (unidades de Da).
      2. Busque visualmente en el mapa péptidos atípicos con una desviación estándar relativa alta. Haga clic en los péptidos atípicos en el mapa de cobertura para rellenar los trazados espectrales apilados(Figura 8B)y la ventana visor de datos (Figura 8A) con el péptido de destino.
      3. Utilizando la gráfica espectral apilada, compruebe cuidadosamente que todos los estados de carga y todos los puntos de tiempo del péptido atípico tienen palos asignados adecuadamente.
        NOTA: Muy a menudo, los péptidos con grandes desviaciones estándar (>0.3 Da) tienen picos isotópicos que el software no asignó adecuadamente palos (como se indica en la Figura 8B). La asignación de los palos que faltan generalmente permitirá reducir la desviación estándar relativa de un péptido a <0.3 Da.
      4. Oculte el péptido de la lista si la desviación estándar relativa no se puede reducir a menos de 0,3 Da.
  2. Exporte datos de diferencia HDX entre dos estados bioquímicos para mapear un modelo estructural de la proteína de interés.
    1. Muestre la diferencia de interés en el mapa de cobertura. Haga clic con el botón derecho en el mapa de cobertura para exportar los datos de diferencia a un archivo .csv. Exporte los datos de estado (en formato .csv) navegando a Data | Exportar datos de estado en la barra de herramientas principal.
      NOTA: El formato adecuado de los datos de diferencia y los archivos de datos de estado se proporciona en la información de soporte.
    2. Importe los datos de diferencia, los datos de Estado y el archivo pdb de la proteína de interés en Deuteros28. Elija el intervalo de confianza del 99%, seleccione habilitar sumay procese los datos.
      NOTA: MATLAB debe estar instalado en el PC para poder ejecutar Deuteros. Deuteros utilizará las mediciones de réplica en el conjunto de datos para calcular la desviación estándar de los datos de captación para cada péptido. Esta desviación estándar se utilizará para definir el intervalo de confianza para un intercambio significativo, que se mostrará en los trazados.
    3. En Opciones PyMOL, seleccione | de captación de exportación exportar para generar un script Pymol para asignar regiones de diferencia de intercambio significativa en la estructura pdb de la proteína de interés utilizando el software PyMOL.
      NOTA: Utilizando el flujo de trabajo descrito en este protocolo, el intervalo de confianza del 99% para la diferencia significativa de absorción de deuterio para un péptido dado en un único punto de tiempo es típicamente 0,3−0,5 Da. El intervalo de confianza del 99% para la diferencia resumida sobre todos los puntos de tiempo de intercambio es típicamente 0,7−1,0 Da.

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Representative Results

Es necesario evaluar la calidad de la digestión proteótica y la reproducibilidad del flujo de trabajo para cada conjunto de inyecciones de muestra. Por lo tanto, antes de realizar ensayos HDX-MS, es esencial establecer condiciones efectivas para la proteolisis de la proteína de interés, para la separación de péptidos utilizando cromatografía líquida en fase inversa y movilidad de iones de fase de gas, y para la detección de péptidos utilizando EM. A tal fin, las muestras de referencia para la proteína de interés (recogidas en ausencia de deuterio) deben investigarse primero (sección 3). Los datos cromatográficos de la Figura 3A-C muestran el total de cromatogramas iónicos (TIC) para tres muestras de referencia de la sintátiptido de lanthipéptido HalM2. El TIC es el cambio dependiente del tiempo en la suma de todos los recuentos de iones en todos los valores m/z incluidos en el escaneo espectral de masas. Las vistas más cercanas de los CCI entre 3 y 8 min se muestran en el cuadro 3D-F. Los espectros de masa mostrados en la Figura 3G-I representan un resumen de todos los espectros de masa durante un pequeño intervalo de tiempo (de 5.0 a 5.1 min) de cada TIC. Debe prestarse especial atención a las siguientes características de la Figura 3.

En primer lugar, el gran pico cerca de 9,3 min al final del gradiente representa fragmentos digeridos (y por lo tanto, grandes y más hidrofóbicos) de HalM2(Figura 3A-C). La digestión podría hacerse más eficiente mediante la reducción de la concentración HalM2, pero esto reducirá la intensidad de la señal de péptido y la relación señal:ruido. La digestión también podría hacerse más eficiente aumentando el tiempo de contacto (a partir de 3 min, paso de protocolo 3.3.3) con la columna de pepsina. Sin embargo, el aumento del tiempo de contacto dará lugar a más intercambio posterior. En última instancia, estos parámetros deben equilibrarse para la proteína de interés con el fin de proporcionar la cobertura de secuencia deseada, intensidad de la señal y retención de deuterio. En segundo lugar, la forma y la intensidad de los perfiles TIC deben ser similares (como en la Figura 3D-F). Esto sugiere que la digestión proteolítica de HalM2 es reproducible y es de eficiencia similar en las tres muestras de referencia. La expectativa es que una digestión similar de una muestra intercambiada por deuterio producirá el mismo conjunto de péptidos con tiempos de retención similares. En tercer lugar, los espectros de masa durante un intervalo de tiempo determinado también deben ser similares(Figura 3G-I). Una comparación visual rápida de los espectros de masas resumidos sobre el intervalo de tiempo de 5.0-5.1 min de la separación cromatográfica muestra que las señales espectrales de masa en cada muestra son realmente muy similares, proporcionando confianza de que péptidos similares están presentes en cada muestra y están eluting en momentos similares de la columna C18. Se debe realizar una inspección visual rápida similar durante otros intervalos de tiempo a través del cromatograma.

Después de verificar visualmente la similitud en los datos de LC-MS de las muestras de referencia, el software de proteómica se utiliza para buscar péptidos de EM derivados de la secuencia de aminoácidos de la proteína de interés. Después de definir el banco de datos de secuencia de proteínas (la secuencia de aminoácidos de la proteína de interés), el procesamiento y los parámetros de flujo de trabajo como se describe en los pasos de protocolo 4.2−4.4, cada muestra de referencia individual se procesa para detectar péptidos pépticos que coinciden con péptidos predichos derivados de la proteína de interés. En la figura 4se muestra un ejemplo de la salida de software de proteómica para una muestra de referencia HalM2 no desértilada. Se debe prestar especial atención a las siguientes características. En primer lugar, cualquier señal de EM que coincida con un péptido específico dentro de la proteína de interés de acuerdo con los valores definidos en los parámetros de procesamiento y flujo de trabajo se coloreará de azul en el espectro inferior. Si una muestra de referencia se procesa "correctamente", la mayoría de las señales aparecerán azules (como es el caso de los datos de la Figura 4). Además, en el panel superior izquierdo, asegúrese de que el "Filtro OK" esté alternado a la marca de verificación verde. Cuando esto se hace, las estadísticas en la barra superior derecha del panel superior derecho (resaltado en azul en la Figura 4)reflejarán sólo aquellos péptidos que dan puntuaciones de alta confianza. Estos péptidos exhiben baja precisión de masa ppm, iones de fragmento múltiples y una buena correlación entre los tiempos de retención de iones de fragmento y padre, y se consideran identificaciones seguras. Para la muestra de referencia HalM2 mostrada, se detectaron 1.421 péptidos con puntuaciones altas, cubriendo el 99,6% de la secuencia HalM2. La cobertura de secuencia cercana al 100% debe ser alcanzable para la mayoría de las proteínas utilizando el flujo de trabajo LC-MS ascendente descrito en la sección de protocolo 3. Además, las estadísticas útiles adicionales para cada péptido se tabulan en el panel superior derecho, incluyendo el error de masa, el tiempo de retención de precursores, el número de fragmentos (iones de producto), la lista completa de iones de fragmento por nombre y el tiempo de deriva de movilidad de iones. Esta información es útil para la interpretación de los resultados, que siempre deben centrarse en los péptidos más identificados con más confianza.

La lista final de péptidos debe determinarse mediante umbrales adicionales en el software de procesamiento HDX. Después de analizar los datos de referencia para generar la lista de péptidos (sección 4 del protocolo), la salida debe importarse al software de procesamiento HDX para umbrales adicionales. Los archivos de salida se almacenarán en un directorio tal como se define en el paso de protocolo 4.5 con la extensión de archivo "..._IA_final_peptide.csv." Al cargar la salida en el software de procesamiento HDX, la lista completa de péptidos se mostrará en el panel "vista previa del péptido"(Figura 5),y el número de péptidos, cobertura de secuencia y redundancia se mostrará en la esquina inferior derecha de la ventana. Estos valores cambiarán en tiempo real a medida que se apliquen umbrales adicionales. Después de hacer clic en siguiente, los valores de umbral se pueden establecer en los campos indicados. Los filtros más críticos son el "umbral de archivo" que requiere que todos los péptidos se encuentren en cada una de las tres muestras de referencia, el "error máximo MH+ (ppm)" que se debe establecer en un valor <10 ppm, y "productos consecutivos mínimos", que requiere que el péptido genere al menos dos iones de fragmento consecutivos durante la fase MSMS (es decir, alta energía de colisión) del flujo de trabajo MSE (paso de protocolo 3.3.7.2).

La limitación técnica más significativa del ensayo HDX-MS es el intercambio posterior de deuterio por protium que se produce tan pronto como se enfadan las muestras intercambiadas por deuterio (con búfer protado). El back exchange continúa durante las porciones de digestión de proteasa y LC-MS del flujo de trabajo. El intercambio posterior es inevitable, pero si el pH, la temperatura y la sincronización de todos los pasos posteriores a la sofoca se controlan cuidadosamente como se describe en el protocolo, se puede mantener el 60%-70% de la etiqueta de deuterio. Por esta razón, es esencial comprobar durante las primeras etapas del desarrollo del ensayo que la mayoría de los péptidos están reteniendo el deuterio. Esto se puede lograr rápidamente comparando los datos sin procesar de una muestra deuterada con los de una muestra de referencia. Como se hizo para garantizar la reproducibilidad de las muestras de referencia(Figura 3),compare los TIC de las muestras de referencia intercambiadas por deuterio y no desorquiladas, asegurándose de que las formas de los perfiles se parezcan entre sí. Además, sumar los espectros de masa sobre el mismo intervalo de tiempo cromatatográfico en ambas muestras. La mayoría de los péptidos de la muestra intercambiada por deuterio deben mostrar cambios obvios en sus distribuciones isotópicas hacia valores m/z más altos (como en la Figura 6). Estos datos indican que se está manteniendo una fracción sustancial de la etiqueta de deuterio a lo largo del enfriamiento ácido, la digestión de pepsinas y la recopilación de datos de LC-MS.

Después de comprobar que el flujo de trabajo proporciona suficiente retención de deuterio, es necesario cuantificar la captación de deuterio. Por lo tanto, los datos sin procesar para muestras intercambiadas por deuterio se importan al software de procesamiento HDX. Utilizando las muestras de referencia y la lista de péptidos finalizados, el software de procesamiento HDX localizará los péptidos de la lista de péptidos en cada uno de los archivos de datos sin procesar y asignará "sticks" a cada uno de los picos isotópicos. En los datos representativos de HalM2 que se muestran en la Figura 7,los palos asignados correctamente se colorean de color azul en todos los espectros. Después de asignar palos, el valor centroide m/z para la distribución isotópica será determinado por el software y utilizado para calcular la captación de deuterio en relación con la muestra de referencia no desduterada. El valor de intercambio de deuterio para cada péptido debe comprobarse manualmente. En la Figura 7, el péptido seleccionado actualmente (HIDKLTVGL, que abarca residuos HalM2 110-118) se muestra en el panel izquierdo del visor de datos principal (Figura 7A). Los otros paneles muestran datos HDX asociados con este péptido. Al hacer clic en cualquier péptido de la lista de péptidos se rellenarán los otros paneles con datos HDX de ese péptido. La Figura 7B muestra las gráficas de captación de deuterio para péptido 110-118. Este conjunto de datos contiene cuatro puntos de tiempo de intercambio: 0,5, 5, 30 y 240 min (recogidos en triplicado). Se recopilaron datos de intercambio para dos estados bioquímicos: la enzima HalM2 libre (roja) y la enzima HalM2 compleja a AMPPNP y su péptido de sustrato HalA2 (azul). Observe la diferencia significativa de absorción de deuterio en péptido 110-118 a lo largo de todo el curso de tiempo y la alta precisión de las mediciones de réplica (las barras de error se muestran en la gráfica en la Figura 7B). En general, se obtendrá una precisión similar en la medición de captación para la mayoría de los péptidos, subrayando la reproducibilidad del flujo de trabajo presentado en este protocolo. Tras la unión de ligando (curva azul en la Figura 7B),las amides de unión de péptidos en la región 110-118 de HalM2 aparentemente sufren una protección significativa contra el intercambio de deuterio, lo que sugiere que los aminoácidos en la región 110-118 se están estructurando más establemente sobre la unión del ligando. La mutagénesis posterior de esta región indicaba un papel en la unión al péptido precursor, HalA220. También se muestran en la Figura 7 los trazados espectrales apilados para el estado HalM2 (Figura 7D) y el estado HalM2:AMPPNP:HalA2 (Figura 7E). En estas gráficas, el tiempo de intercambio aumenta de abajo a arriba. El aumento masivo del péptido 110-118 al intercambio de deuterio en puntos de tiempo más largos es evidente de la inspección visual. También es evidente que el péptido 110-118 ocupa más deuterio en el estado HalM2(Figura 7D)que en el estado totalmente ligado (Figura 7E). Si es necesario, al hacer clic en cualquiera de las subtramas de la Figura 7D o figura 7E, permitirá al usuario modificar manualmente la asignación de palos en el visor de datos principal (Figura 7C). Tras la asignación/desasignación de stick, el software de procesamiento HDX recalculará los valores de captación de deuterio y todas las gráficas se actualizarán en tiempo real. Del mismo modo, al hacer clic en puntos de datos individuales en el panel B se rellenará el visor de datos en el panel C para la asignación manual de sticks.

Después de que se hayan asignado palos para cada péptido y punto de tiempo de intercambio para todos los estados bioquímicos, se debe comprobar la desviación estándar de los valores de absorción medidos. Esto es más fácil de realizar con el mapa de cobertura y la gráfica espectral apilada (Figura 8). En el mapa de cobertura (Figura 8C), seleccione el estado y el tiempo de intercambio de intereses y, a continuación, seleccione desviación estándar de absorción relativa. Los péptidos en el mapa de cobertura se colorearán de acuerdo con la desviación estándar en el valor de captación de deuterio medido. De esta manera, será muy fácil identificar visualmente péptidos que tienen asignaciones erróneas de palo isótopo. Al hacer clic en el péptido atípico (con alta desviación estándar) en el mapa de cobertura se rellenará el visor de datos principal y la gráfica de espectros apilados con datos HDX del péptido atípico. Las asignaciones de stick para cada punto de tiempo y estado de carga se pueden modificar según sea necesario para corregir el valor de absorción medido. Una vez más, el software de procesamiento HDX actualizará todas las pantallas de datos en tiempo real a medida que se cambian las asignaciones de stick.

Después de seleccionar completamente el conjunto de datos HDX, la importancia de la medición de la diferencia de captación de deuterio para cada péptido debe considerarse antes de la interpretación de los datos. Utilizando un enfoque descrito por Engen y sus compañeros de trabajode 29años, hemos estimado un valor medio de captación de 0,1 ± 0,1 Da para la proteína HalM2 utilizando el flujo de trabajo descrito en el protocoloanterior 20. Este valor es coherente con los errores notificados por otros para flujos de trabajo HDX de intercambio continuo y ascendente similar29,30. Recientemente, Politis y sus compañeros de trabajo desarrollaron Deuteros, una útil herramienta de código abierto (implementada en MATLAB) para determinar rápidamente diferencias significativas de absorción en los conjuntos de datos HDX28. Los archivos de entrada representativos de Deuteros ("State_Data_for_Deuteros" y "Difference_Data_for_Deuteros") se incluyen en la información justificativa. Si se exporta directamente desde el software de procesamiento HDX descrito en este protocolo (Tabla de materiales), la diferencia y los archivos de datos de estado tendrán el formato adecuado para la lectura de archivos por Deuteros. Si se generan datos HDX en un sistema LC-MS diferente, los archivos de datos que se asemejan a los proporcionados en la información de soporte tendrán que construirse manualmente.

El área de trabajo Dueteros se muestra en la Figura 9. Una vez importados los datos a Deuteros, el usuario selecciona el límite de confianza deseado (>98% recomendado) y hace clic en Importar y calcular. Para el mapa de datos acoplados, seleccione cobertura para el tipo de datos y absoluta para la escala de color. Haga clic en trazar. Para los trazados de madera, seleccione filtro binario como tipo de datos, el filtro de confianza deseado y habilite la suma. Al hacer clic en la gráfica,Deuteros trazará todos los péptidos en cada punto de tiempo de intercambio en función de su posición en la secuencia de aminoácidos y sus valores de captación de deuterio. Los péptidos que exhiben un intercambio significativo se colorearán ya sea rojo o azul, dependiendo de si el péptido ocupa más o menos deuterio, respectivamente, según la diferencia que se calcule. El valor de significancia notificado en cada trazado (que oscila entre 0,39 y 0,72 Da en los datos trazados en la Figura 9)se calcula a partir de las desviaciones estándar de las diferencias de absorción medidas para cada péptido según se determine a partir de las mediciones de réplica presentes en el conjunto de datos. Los intervalos de confianza se muestran como barras discontinuas en cada trazado individual. Si está habilitada, la "Suma" simplemente agrega la diferencia de absorción medida en cada punto de tiempo para cada péptido. Por último, para la visualización de los datos de captación sobre la estructura tridimensional de la proteína de interés, seleccione la captación de exportación en opciones PyMOL y, a continuación, exporte. Deuteros generará un script PyMOL que se puede arrastrar y soltar en el espacio de trabajo PyMOL que contiene el archivo pdb abierto de la proteína de interés.

El flujo de trabajo HDX-MS presentado en este protocolo se utilizó para caracterizar las propiedades bioquímicas de una enzima (HalM2) que cataliza una serie de modificaciones post-traslacionales en un péptido genéticamente codificado (HalA2)20. En la Figura 10, se muestran resultados representativos de HDX-MS para la unión del péptido precursor HalA2 al complejo HalM2:AMP-PNP. El panel A muestra el mapa de cobertura HalM2, donde el color indica la diferencia relativa de absorción entre el estado bioquímico [HalM2:AMPPNP] y el estado [HalM2:AMPPNP:HalA2]. Deuteros se utilizó para mapear estas diferencias de absorción en un modelo de homología de la enzima HalM2 (Figura 10B,C). Péptidos que son de color rojo indican una disminución en la captación de deuterio en la unión HalA2, lo que sugiere que estas regiones de HalM2 pueden estar involucradas directamente en la unión del péptido precursor. Para investigar esta hipótesis, las regiones I-III fueron mutadas y se investigaron las propiedades cinéticas de las enzimas variantes. Las mutaciones en la región I y III condujeron a perturbaciones significativas en la afinidad de unión de péptidos HalA2, lo que sugiere que estas regiones de HalM2 están interactuando con el sustrato péptido directamente, o están obligadas a formar estructuras que permitan la unión HalA2. Por el contrario, la mutación de la región II no tuvo ningún efecto en la afinidad de unión HalA2, pero este mutante estaba casi desprovisto de actividad catalítica. Una explicación para este hallazgo es que la organización de la región II observada en la unión HalA2 desencadena un cambio de conformación que activa la enzima. Cabe señalar, que antes de este estudio, no había información disponible sobre el modo de unión HalM2-HalA2 o sobre los cambios de conformación catalíticos relevantes en el sistema, principalmente porque el gran tamaño y la naturaleza flexible tanto de HalM2 como de HalA2 han impedido estudios estructurales. Por lo tanto, estos datos representativos sobre la sintetetase halm2 lanthipeptide ilustran cómo hdx-MS se puede utilizar para localizar rápidamente regiones funcionalmente relevantes de sistemas de enzimas estructuralmente dinámicos, incluso en ausencia de datos estructurales de alta resolución.

Figure 1
Figura 1: Un intercambio continuo, flujo de trabajo HDX-MS ascendente. Consulte el texto para obtener más información. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: La tasa HDX depende de la dinámica de conformación de proteínas(kopen y kclose)y de la tasa de cambio química dependiente del pH de los enlaces N-H en la columna vertebral proteica para los enlaces N-D (kchem). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Datos representativos de LC-MS para las muestras de referencia halm2 triplicadas. El número en la esquina superior derecha de cada panel representa el recuento total de iones. Cada fila muestra datos para un ejemplo de referencia diferente. La primera columna (A-C) muestra los cromatogramas iónicos totales (TIC). El gran pico a 9,3 min representa péptidos grandes e indignos. La columna central (D-F) muestra una vista más cercana de los TIC entre 3 y 8 min. Tenga en cuenta el buen acuerdo de las formas de los perfiles, que indica una mezcla subyacente similar de señales de péptido en cada muestra de referencia a través de todo el cromatograma. La tercera columna (G-I) muestra espectros de masa para cada muestra de referencia generada sumando todos los espectros de masa registrados entre el punto de tiempo 5.0 y 5.1 min de la carrera cromatográfica. La inspección visual de estos datos indica que muchos de los mismos péptidos se detectan en cada ejemplo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Salida representativa del software proteómico para una muestra de referencia HalM2. El panel superior izquierdo muestra la lista completa de péptidos pépticos derivados de HalM2 detectados en los datos de EM. Tenga en cuenta que el "Filtro OK" muestra la marca de verificación verde. Esto filtra los datos de acuerdo con la puntuación de confianza y elimina las identificaciones de péptidos de baja confianza. La barra superior del panel derecho (resaltada en azul) muestra estadísticas acumulativas para el conjunto de péptidos con puntuaciones altas. Las estadísticas más importantes son el número de péptidos detectados (en este caso 1.421) y la cobertura de secuencia (en este caso el 99,6%). Las estadísticas adicionales de cada péptido también se muestran en el panel superior derecho. Cada columna de esta tabla de datos se puede ordenar. El panel inferior muestra todas las señales de EM que se correspondían con un péptido péptico derivado de HalM2 predicho. Tenga en cuenta que la mayoría de las señales ms fueron asignadas y son de color azul. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Umbral adicional en el software de procesamiento HDX. La salida de software de proteómica para cada una de las tres muestras de referencia HalM2 se importa al software de procesamiento HDX (panel izquierdo). Después de importar datos, se realizan umbrales adicionales (panel derecho). El campo "productos consecutivos mínimos" se refiere a los iones de fragmento generados por el escote de los enlaces de péptidos adyacentes en el péptido. El parámetro "error mínimo MH+" permite al usuario definir la precisión de masa aceptable, y el "umbral de archivo" permite al usuario restringir los péptidos a solo aquellos péptidos que se detectaron en los tres archivos de referencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Datos representativos de una muestra de referencia HalM2 (rojo) y una muestra HalM2 incubada en el búfer D2O durante 5 min (verde). Ambas muestras fueron sometidas al flujo de trabajo LC-MS ascendente descrito en la sección 3 del protocolo. La columna izquierda muestra espectros de masas resumidos en la ventana de tiempo de 6.0-6.1 min. Las tres columnas derechas muestran vistas más cercanas de los mismos espectros de masa, donde el cambio a valores m/z más altos en la muestra deuterada (verde, superior) es obvio para la mayoría de las señales de péptido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Captura de pantalla del espacio de trabajo en el software de procesamiento HDX. (A) La lista de péptidos derivados de HalM2 obtenidos del análisis de muestras de referencia HalM2 con el software de proteómica (Figura 3) y umbrales posteriores en el software de procesamiento HDX (Figura 4). El péptido seleccionado actualmente (HIDKLTVGL, que abarca residuos HalM2 110-118) se resalta en azul. (B) Las curvas de captación de deuterio (en función del tiempo de intercambio) para los dos estados bioquímicos de interés: la enzima halm2 libre, y la enzima HalM2 unida a AMPPNP y el precursor lanthipeptide, HalA2. (C) Espectro de masa de la muestra seleccionada activamente (en este caso, una de las muestras de referencia HalM2 no desinuteradas). Los palos azules en el panel C se pueden asignar manualmente/ sin asignar según sea necesario si no fueron asignados correctamente por el software de procesamiento HDX durante el procesamiento de datos inicial. (D,E) Gráficas espectrales apiladas para el estado HalM2 (D) y el estado HalM2:AMPPNP:HalA2 (E). El aumento dependiente del tiempo en la captación de deuterio es fácilmente visible, al igual que la diferencia de absorción entre los dos estados bioquímicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Minimizar la desviación estándar en los valores de captación medidos. El mapa de cobertura en el software de procesamiento HDX (panel C) proporciona un medio conveniente para identificar rápidamente péptidos con grandes desviaciones estándar en sus valores de captación de deuterio medidos. En este caso hipotético, algunos de los picos isótopos (palos azules) para el péptido derivado HalM2 que abarca residuos 110-118 no están asignados para los puntos de tiempo de intercambio de 5 minutos (los palos grises en el panel B). Esto está dando lugar a una gran desviación estándar en el valor de captación de deuterio medido para el punto de tiempo de intercambio de 5 minutos. La gran desviación estándar es fácilmente obvia del color azul del péptido 110-118 en el mapa de cobertura (panel C) y de la dispersión del punto de datos y la barra de error grande en la gráfica de captación (panel A). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: El espacio de trabajo Deuteros. En este ejemplo, los valores de diferencia de absorción se calcularon en el software de procesamiento HDX restando la absorción de deuterio del estado HalM2:AMPPNP:HalA2 del estado HalM2:AMPPNP. El objetivo de la comparación era visualizar cómo la unión del péptido (HalA2) alteró la dinámica estructural del complejo HalM2:AMPPNP. El conjunto de datos contenía 4 puntos de tiempo de intercambio (0,5, 5, 30 y 240 min). La diferencia de aceptación para cada péptido en cada punto de tiempo de intercambio se ilustra en las tramas de Woods. Los péptidos de color en las gráficas de Woods indican péptidos que exhiben una diferencia de absorción significativa, tal como se define por la desviación estándar de las mediciones de réplica presentes en el conjunto de datos y los límites de confianza definidos por el usuario seleccionados en Deuteros. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 10
Figura 10: Los datos HDX-MS guían el análisis funcional de la unión de péptidos y la activación alotérica en la sintáltida de lanthipeptide HalM2. Se investigó el cambio de captación de deuterio tras la unión del péptido precursor HalA2 a la sintetetase de lanthipéptido HalM2. La diferencia de absorción para cada péptido después de una reacción de intercambio de 5 minutos se traza (A). Esta gráfica se generó en el software de procesamiento HDX. Péptidos de color rojo y azul sufren cada vez menos captación de deuterio, respectivamente, en presencia del péptido HalA2. Estos "puntos calientes" HDX se asignan a un modelo de homología HalM2 (B,C). La identificación de péptidos sometidos a importantes diferencias de intercambio se determinó en Deuteros. El script PyMOL utilizado para asignar los valores de diferencia al modelo de homología se generó en Deuteros. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El flujo de trabajo HDX-MS presentado en este protocolo proporciona una plataforma notablemente robusta para mapear la distribución espacial de elementos estructuralmente dinámicos en proteínas y para investigar cómo estas dinámicas cambian en respuesta a la perturbación (unión de ligando, mutagénesis enzimática, etc.). HDX-MS tiene varias ventajas distintas sobre otros enfoques de biología estructural que se utilizan comúnmente para investigar la dinámica de conformación. En particular, sólo se necesitan pequeñas cantidades de proteínas. Utilizando el flujo de trabajo descrito en este documento, una muestra de 1 ml de proteína de 1 μM proporciona suficiente material para reacciones HDX triplicada cada una que contiene 5 puntos de tiempo de intercambio. Además, prácticamente no hay límite de tamaño en la proteína de interés, y los complejos proteicos son igualmente aptos para el enfoque HDX-MS. El límite de tamaño sólo está restringido por la medida en que los péptidos pépticos se pueden resolver cromatográficamente, y en las dimensiones de movilidad m/z e iones. Por lo tanto, para muchas proteínas/complejos proteicos, HDX-MS proporcionará información valiosa sobre interfaces de interacción proteína-proteína, sitios de unión de ligando, dinámicas de conformación y redes alotéricas. Por último, la reacción HDX se realiza en condiciones suaves y casi nativas sin necesidad de etiquetado/ingeniería de la proteína específica del sitio, lo que debería ayudar a garantizar que se conserve la actividad endógena. La principal limitación del enfoque (en términos de la información mecanicista que proporciona sobre la proteína de interés) es que los datos HDX de nivel de péptido son de resolución espacial inherentemente baja. Por lo tanto, los datos son suficientes para inferir que se está produciendo un cambio en la estructura secundaria, pero los impactos mecanicistas de la perturbación estructural requieren una mayor resolución (por ejemplo, NMR, crioEM o cristal de rayos X), estudios de cálculo y/o estudios bioquímicos para interpretar plenamente.

Con el fin de garantizar la reproducibilidad y fiabilidad de los resultados, deben tenerse en cuenta varios aspectos críticos del protocolo. En primer lugar, el alcance del intercambio de deuterio durante la reacción HDX y el alcance del intercambio posterior durante el trabajo y el análisis dependen en gran medida del pH, el tiempo y la temperatura. Por lo tanto, los procedimientos para la preparación de búferes, reacciones HDX y métodos LC-MS deben ser lo más sistemáticos posible para minimizar la variación en estos parámetros físicos entre conjuntos de datos. Siempre que sea posible, las reacciones HDX para los estados bioquímicos a comparar deben ser realizadas por el mismo investigador el mismo día, y los datos de LC-MS para estas muestras deben ser recogidos durante días consecutivos con el mismo lote de disolvente. Con el tiempo, la eficiencia de la digestión de pepsinas también disminuirá, por lo que es óptimo para muestras que serán comparadas para ser digeridas y analizadas dentro de un plazo relativamente estrecho, especialmente si la columna de pepsina se está utilizando para digerir muchos otros tipos de muestras. Es una buena práctica comprobar periódicamente la eficiencia de digestión de la columna de pepsina utilizando una proteína estándar. Para ello, se puede configurar un proyecto de software de procesamiento HDX dedicado donde se pueden comparar muestras recién digeridas con muestras más antiguas para garantizar que se detecte el mismo conjunto de péptidos de destino con intensidades similares.

Si bien el flujo de trabajo presentado en este protocolo debe proporcionar datos adecuados para muchos sistemas de enzimas/proteínas, hay varios puntos potenciales de optimización. En primer lugar, la escala de tiempo de la reacción HDX se puede modificar para capturar dinámicas que son más rápidas/lentas. Más notablemente, muchas enzimas contendrán elementos altamente dinámicos que se intercambian completamente en varios segundos. Si estos elementos extremadamente dinámicos son de interés, métodos para el estado pre-estable, el intercambio continuo HDX-MS se ha divulgado en la literatura31. En segundo lugar, las condiciones del método LC se pueden cambiar fácilmente para alterar la eficiencia de digestión (que en última instancia determina la cobertura de secuencia) y la retención de deuterio (que en última instancia determina la sensibilidad del método). Teniendo en cuenta la duración y temperatura de la digestión de la pepsina, los caudales más lentos y la temperatura más alta favorecerán una digestión más exhaustiva de la proteína. La concentración de proteínas en el ensayo HDX también puede aumentar si la intensidad de la señal es demasiado baja, o disminuir si la digestión de pepsina es demasiado ineficiente. Teniendo en cuenta el gradiente de acetonitrilo utilizado para separar los péptidos pépticos en la columna analítica C18, un gradiente más rápido preservará la etiqueta de deuterio, pero a expensas de la resolución cromatográfica de los péptidos pépticos presentes en la mezcla de reacción digerida. Para las proteínas más pequeñas (~200 aminoácidos) donde hay menos péptidos pépticos en el resumen, un gradiente LC más rápido puede ser más fácil de implementar. Para proteínas más grandes como HalM2 (~ 1,000 aminoácidos), se necesita un gradiente más largo para resolver la complejidad espectral adicional generada por el mayor número de péptidos en la mezcla. En este último escenario, la inclusión de una separación de movilidad de iones de fase de gas puede ayudar a mejorar drásticamente la capacidad máxima del análisis. La inclusión de la separación de movilidad de iones tiene un costo de una relación señal/ruido ligeramente reducida. Por último, debe tenerse en cuenta que los datos de EM para las muestras HDX no necesitan ser recogidos en modo MSE. La parte MSMS del ciclo de trabajo MSE (es decir, el segmento de energía de colisión alta, paso 3.3.7.2) sólo es necesaria para las muestras de referencia para definir la lista de péptidos (sección 4 del protocolo). Por lo tanto, las muestras HDX deben analizarse en modo ms-only para aumentar la relación señal:ruido.

Si el flujo de trabajo descrito en este protocolo funciona correctamente, los péptidos de intercambio completo deben mostrar un valor de captación de deuterio relativo del 60%-70%. Si se descubre que la captación de deuterio es sustancialmente menor que esta (para un péptido sin protección expuesto a disolventes), la explicación más probable es que el pH de la muestra está cambiando durante alguna parte del trabajo/análisis. En este escenario, se debe utilizar un electrodo de microtip para monitorear cuidadosamente el pH del ensayo HDX y de la reacción saciada aliquot. También se debe comprobar el pH de los disolventes LC-MS. Para minimizar la aparición de este problema, se recomienda encarecidamente preparar y almacenar soluciones de stock concentrados de todos los búferes y reactivos necesarios para el ensayo (como se describe en la sección 1 del protocolo).

En los últimos años, HDX-MS ha surgido como una poderosa herramienta analítica para investigar la dinámica estructural de las proteínas. El desarrollo de sistemas LC-MS disponibles comercialmente diseñados y optimizados para experimentos HDX (como el sistema utilizado en este estudio y enumerado en los materiales) junto con potentes paquetes de software, ha extendido el enfoque HDX-MS en muchos laboratorios académicos e industriales, y ha transformado lo que una vez fue una técnica de nicho hace 15 años en una plataforma analítica más fácil de usar. A pesar de las limitaciones en la resolución espacial, HDX-MS proporciona mediciones altamente cuantitativas y reproducibles sobre los movimientos proteicos y es ideal para estudiar enzimas dinámicas conformación que son difíciles de investigar con otros enfoques. Debido a estas características, HDX-MS llena un nicho esencial en la biología estructural de sistemas proteicos desordenados y dinámicos que tienen relevancia en muchas áreas fundamentales de la biología y la medicina. Como tal, se espera que los análisis de HDX-MS sigan siendo una herramienta importante en el arsenal del biólogo estructural en el futuro previsible.

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Disclosures

No tenemos nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá, los Fonds de Recherche du Quebec Nature et Technologie, la Fundación Canadiense para la Innovación y los fondos de puesta en marcha de la Universidad McGill.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
[glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib) BioBasic NA
0.5 mL Amicon Ultracel 10k centrifugal filtration device (Millipore) Milipore Sigma UFC501096
acetonitrile Fisher A955-1
AMP-PNP SIGMA A2647-25MG
ATP SIGMA a2383-5G
D2O ALDRICH 435767-100G
formic acid Thermo Fisher 28905
guanidine-HCl VWR 97063-764
HEPES Fisher BP310-1
Magnesium chloride SiGMA-Aldrich 63068-250G
Potassium chloride BioBasic PB0440
potassium phosphate BioBasic PB0445
TCEP Hydrochloride TRC Canada T012500 peptide was synthesized upon request
Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
software
Deuteros Andy M C Lau, et al version 1.08
DynamX Waters version 3.0
MassLynx Waters version 4.1
Protein Lynx
Global Server (PLGS)		 Waters version 3.0.3
PyMOL Schrödinger version 2.2.2
Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Instrument and equipment
ACQUITY UPLC BEH C18 analytical Column Waters 186002346
ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-column Waters 186003978
ACQUITY UPLC M-Class HDX System Waters
HDX Manager Waters
microtip pH electrode Thermo Fisher 13-620-291
Waters Enzymate BEH column or Pepsin solumn Waters 186007233
Waters Synapt G2-Si Waters

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References

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Bioquímica Número 159 Espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno-deuterio bioquímica enzimología biosíntesis productos naturales péptidos
Una plataforma de espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX-MS) para investigar enzimas biosintéticas péptidos
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Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. A… More

Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes. J. Vis. Exp. (159), e61053, doi:10.3791/61053 (2020).

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