Summary
Denne jernrødoksspekulasjonsmetoden er basert på kapillær elektroforese-induktivt kombinert plasmamassespektrometri med prøvestabling kombinert med kort analyse i ett løp. Metoden analyserer raskt og gir lave grenser for kvantifisering for jernrødoksarter på tvers av et variert utvalg av vev og biofluidprøver.
Abstract
Dyshomeostase av jernmetabolismen er regnskapset i det patofysiologiske rammeverket av mange sykdommer, inkludert kreft og flere nevrodegenerative tilstander. Overdreven jern resulterer i gratis redoks-aktiv Fe(II) og kan forårsake ødeleggende effekter i cellen som oksidativt stress (OS) og død ved lipidperoksidasjon kjent som ferroptose (FPT). Derfor er kvantitative målinger av jernholdig (Fe(II)) og ferric (Fe(III)) jern i stedet for total Fe-besluttsomhet nøkkelen for nærmere innsikt i disse skadelige prosessene. Siden Fe(II)/(III) bestemmelser kan hindres av raske redoks-tilstandsskift og lave konsentrasjoner i relevante prøver, som cerebrospinalvæske (CSF), bør metoder være tilgjengelige som analyserer raskt og gir lave grenser for kvantifisering (LOQ). Kapillær elektroforese (CE) gir fordelen av rask Fe(II)/Fe(III) separasjon og fungerer uten en stasjonær fase, noe som kan forstyrre redoksbalansen eller forårsake analytt stikker. CE kombinert med induktivt kombinert plasma massespektrometri (ICP-MS) som en detektor gir ytterligere forbedring av deteksjonsfølsomhet og selektivitet. Den presenterte metoden bruker 20 mM HCl som bakgrunnselektrolytt og en spenning på +25 kV. Toppformer og konsentrasjonsdeteksjonsgrenser forbedres ved konduktivitet-pH-stabling. For reduksjon av 56[ArO]+ble ICP-MS operert i drc-modus (Dynamic Reaction Cell) med NH3 som reaksjonsgass. Metoden oppnår en grense for deteksjon (LOD) på 3 μg/ L. På grunn av stabling var høyere injeksjonsvolumer mulig uten å hemme separasjon, men forbedre LOD. Kalibreringer relatert til toppområdet var lineære opp til 150 μg/l. Målepresisjonen var 2,2 % (Fe(III)) til 3,5 % (Fe(II)). Migrasjonstidspresisjonen var <3 % for begge artene, bestemt i 1:2 fortynnede lysater av humane neuroblastomceller (SH-SY5Y). Recovery eksperimenter med standard tillegg viste nøyaktighet på 97% Fe (III) og 105 % Fe (II). I virkelige bioprøver som CSF kan migrasjonstiden variere i henhold til varierende konduktivitet (det vil si saltholdighet). Dermed er toppidentifikasjon bekreftet av standard tillegg.
Introduction
I dag er det mest tydelig at jernmediert oksidativt stress (OS) spiller en avgjørende rolle i flere lidelser spesielt i nevrodegenerative hjernesykdommer, som Alzheimers og Parkinsons sykdom, samt i kreft1,2,3,4. OS er nært knyttet til tilstanden og balansen til redox-paret Fe(II)/Fe(III). Mens Fe(III) er redoks-inaktiv, genererer Fe(II) kraftig reaktive oksygenarter (ROS) ved å katalysere H2O2 nedbrytning etterfulgt av hydroksylradikal produksjon og membran lipidperoksidasjon5,6. På molekylært nivå er Fe(II)-generert ROS og peroksidiserte fosfolipider et sterkt angrep på integriteten til proteiner, lipider og DNA7,8. Slike skadelige cellulær dysfunksjon ble vist å indusere mitokondriedysfunksjon med redusert ATP-innhold9 og kan til og med utløse en programmert nekrotisk celledød, kjent som ferroptose (FPT)10,11. Kvantitativ Fe(II)/(III) redoksspesifikasjon er derfor av eminent betydning i et bredt spekter av redoksrelaterte lidelser.
Kjemisk spesiasjon er et veletablert verktøy for studiet av sporstoffer biologisk rolle og metabolisme generelt7,8 samt i nevrodegenerative forhold12,13,14,15,16,17. Metoder for Fe-redox-spesifikasjon funnet i litteraturen er vanligvis basert på væskekromatografi (LC) separasjon. Noe av litteraturen bruker induktivt skrevet plasmamassespektrometri (ICP-MS) som et element selektiv detektor. Men i rutinemessig LC-arbeid var det nødvendig med overdreven utrenskningstider mellom løpene. Enda mer problematisk, batch-til-batch-variant av LC-kolonner tvunget re-optimalisering av elution betingelsene etter hver kolonneendring. Disse problemene hindrer høy gjennomstrømning. Ytterligere tid er nødvendig for å få akseptabel pålitelighet og grundig vurdere metoden igjen.
For å omgå disse ulempene, presenteres en metode her for Fe(II) / Fe (III) redoksspesifikasjon basert på kapillær elektroforese induktivt skrevet plasmamassespektrometri (CE-ICP-MS). CE tilbyr ulike fordeler sammenlignet med LC18. Kapillærer har ingen stasjonær fase og er dermed avhengig (nesten) ikke på batchidentitet. Når de blir eldre eller blokkert, erstattes de raskt, og viser vanligvis uendret ytelse. Rense- og rengjøringstrinnene mellom prøvene er effektive og korte, og analysetiden per prøve er også kort.
Den presenterte metoden er pålitelig med gode tall av fortjeneste. Som et bevis på prinsippet brukes metoden på humant dopaminerg neuroblastom (SH-SY5Y) cellelylat, en prøvetype som er viktig i nevrodegenerasjon samt kreftforskning19.
Protocol
FORSIKTIG: Metoden bruker saltsyre (HCl, starter fortynninger fra ultrapure, konsentrasjon 1 M) og tetramethylammoniumhydroksid (TMAH, starter fortynninger fra ultrapure, konsentrasjon 25%). Begge stoffene er sterkt korroderende. Bruk hud- og øyevern.
1. Klargjøre elektrolytter
- Klargjøre HCl-elektrolytter: bakgrunnselektrolytt (20 mM HCl), utløpselelektrolytt (5 mM HCl) og avsluttende elektrolytt (0,05 mM HCl)
- Forbered 20 mM HCl i en 100 ml kolbe: Pipette 2 ml 1 M HCl inn i kolben, fyll opp til merket med ultrarent vann og rist forsiktig.
- Forbered 5 mM HCl i en 100 ml kolbe: Pipette 500 μL på 1 M HCl i kolben, fyll opp til merket med ultrarent vann og rist forsiktig.
- Forbered 0,05 mM HCl i to trinn: Pipette 1 ml 20 mM HCl i en 100 ml kolbe, og fyll deretter opp til merket med ultrarent vann og rist forsiktig. Deretter pipette 2,5 ml av sistnevnte oppløsning i en 15 ml konisk rør (Table of Materials) og tilsett 7,5 ml ultrapure vann, deretter riste forsiktig.
- Klargjør ledende elektrolytt 12% TMAH i et konisk rør på 15 ml: Pipette 4,8 ml 25 % TMAH i røret, tilsett 5,2 ml ultrarent vann og rist forsiktig.
MERK: 12 % TMAH brukes til å rense og rengjøre kapillæren før hver kjøring og som en ledende elektrolytt foran den injiserte prøven).
2. Forberedelse og lagring av standarder og prøver
- Standarder
- For Fe(II) veie 35,61 mg Fe(II)Cl2·4H2O i en 100 ml kolbe og fyll opp til 100 ml merket med ultrarent vann for en 100 mg Fe(II)/L lagerkonsentrasjon. Rist forsiktig til fullstendig oppløsning.
- For Fe(III) veier du 29,04 mg Fe(III)Cl3 i en 100 ml kolbe og fyll opp til 100 ml merket med ultrarent vann for en 100 mg Fe(III)/L lagerkonsentrasjon. Rist forsiktig til fullstendig oppløsning.
- Fortynn hver standardløsning i henhold til tabell 1 for å klargjøre arbeidsstandardløsningene.
MERK: Etter klargjøring av de daglige lagerløsningene fra 100 mg/l lageroppløsningen, må sistnevnte oppbevares frosset. Etter å ha klargjørt de daglige standardene i henhold til tabell 1,må 1 mg/l lagerløsningen bli aliquoted i 1,5 ml volumer og lagret frosset (best uten luft igjen på toppen) i 1,5 ml rør. For hver ny dag tines en daglig lagerhette for utarbeidelse av daglige standarder og trekkes tilbake etter bruk.
| Starte konsentrasjon | Pipetteringsvolum | Fyll opp med Milli-Q vann | Resulterende konsentrasjon | Endelig volum | Bruk av løsning |
| 100 mg/l | 50 μL | 4950 μL | 1 mg/l | 50 ml | Daglig lagerløsning |
| 1 mg/l | 200 μL | 1800 μL | 100 μg/L | 2 ml | Standard (standard) |
| 100 μg/L | |||||
| 1 mg/l | 100 μL | 1900 μL | 50 μg/L | 2 ml | Standard (standard) |
| 50 μg/L | |||||
| 1 mg/l | 50 μL | 1950 μL | 25 μg/L | 2 ml | Standard (standard) |
| 25 μg/L | |||||
| 1 mg/l | 25 μL | 1975μL | 12,5 μg/l | 2 ml | Standard (standard) |
| 12,5 μg/l | |||||
| 1 mg/l | 20 μL | 1980μL | 10 μg/l | 2 ml | Standard (standard) |
| 10 μg/l | |||||
| 0 | 2000 μL | 0 μg/l | 2 ml | Tom |
Tabell 1: Pipetteringsordning for utarbeidelse av standardene.
- SH-SY5Y cellelylat
MERK: Cellelylat (SH-SY5Y) fungerte som Fe(II)/(III)-relevant biomatrise for å vise ytelsen og påliteligheten til metoden.- Bruk lysate fra tidligere kjørende eksperimenter16. Følg denne cellelylatpreparatet unngå pH-endringer eller kjemikalier som kan påvirke redoksbalansen. Bruk en modifisert radioimmunoprecipitation analyse (RIPA) lysis buffer (PBS pH 7.4, 0,5 % natriumdeoksykollat, 1 % NP-40), unngå metallchelatorer (som EDTA), reduksjonsmidler (som DTT, 2-Mercaptoethanol) og anioniske overflateaktive vaskemidler og metallkomplekser (for eksempel SDS) for å minimere endringer etter innsamling av fe(II)/Fe(III)-forholdet.
- Arbeid under en N2-atmosfærehemmet oksidasjon av O2 fra omgivelsesluft og arbeid på is for å minimere eventuell autoksidasjon til lysatet ble lagret så snart som mulig ved -80 °C under nitrogenatmosfæren.
3. Sette opp instrumenter for orddeling av CE til ICP-MS
- Sett opp kapillærelektroforeseinstrumentet.
MERK: For denne delen henvises leseren hovedsakelig til håndboken til det respektive instrumentet som er tilgjengelig i laboratoriet.- Monter en kapillær med en passende lengde for å nå fra innløps hetteglasset på CE-instrumentet til forstøveren til ICP-MS. Monter kapillæren bare på innløpssiden og led den utenfor instrumentet mot CE-ICP-MS-grensesnittet.
MERK: For å binde CE til ICP-MS, i denne protokollen ble en 90 cm smeltet silikakapillær (ID 50 μm) installert i henhold til den generelle instrumentelle oppsettbeskrivelsen. Vanligvis vil kapillære størrelser på 70-100 cm være nødvendig, avhengig av plasseringen av instrumentene i laboratoriet. - Deaktiver utløpsheisen til CE-instrumentet i programvaren for jevn drift, da det ikke er i bruk når kapillæren er rettet ut til CE-ICP-MS-grensesnittet.
- Installer en utløserkabel fra CE-instrumentutløser-OUT for å utløse INN i ICP-MS-instrumentet.
- Velg posisjoner for alle nødvendige løsninger (20 mM HCl, 0,05 mM HCl, 12% TMAH), standarder og prøver i instrumentets prøve- og løsningsrotor og definer posisjonene i instrumentprogramvaren som vanlig (se instrumenthåndboken).
- Velg rotor og kapillærtemperatur som identisk ved 20 °C, som identisk med den kontrollerte laboratorietemperaturen.
MERK: Ingen temperaturgradient til kapillærdelene i og utenfor CE-instrumentet oppstår.
- Monter en kapillær med en passende lengde for å nå fra innløps hetteglasset på CE-instrumentet til forstøveren til ICP-MS. Monter kapillæren bare på innløpssiden og led den utenfor instrumentet mot CE-ICP-MS-grensesnittet.
- Konfigurere ICP-MS-instrumentet
- Optimaliser ICP-MS-instrumentet i henhold til de daglige instrumentstandardoppsett- og driftsprosedyrene. Bruk produsentens protokoll.
- Bruk drc-teknologi (Dynamic Reaction Cell) med NH3 som DRC-gass, med 0,6 ml/min NH3–flowrate og RPq-verdi = 0,45.
MERK: For jernspesifikasjon er en metode programmert med 56Fe, som er den mest tallrike Fe isotop (91.754% relativ overflod), men blir sterkt forstyrret fra [40Ar16O]+ klyngen. En quadrupole basert ICP-MS i standardmodus er praktisk talt blind og detektoren i overløp på denne isotopen. Med innstillingene ovenfor (se trinn 3.2.2), oppnås lave baselines og høy følsomhet (for vanlig total jernbestemmelse oppnås LOD i lav ng/L-området). - Velg en oppholdstidsinnstilling per isotop på 50 ms for overvåking av selv skarpe og korte topper under CE-separasjon.
- Programmer ICP-MS-metoden som skal utløses av CE-instrumentet.
- Konfigurere CE-ICP-MS-grensesnittet
MERK: Det er hovedsakelig to alternativer for å koble CE-kapillæren til ICP-MS. Følg de angitte beskrivelsene om oppsettet hvis et kommersielt grensesnitt brukes. Denne protokollen bruker et enkelt, hjemmelaget grensesnitt basert på en tidligere publikasjon etter modifikasjoner20. Viktige spørsmål er en effektiv forstøvning med muligens mindre fortynning av kapillær efflux bortsett fra vedtakelsen av den totale strømningshastigheten til forstøver for best forstøvning. Også minimering av en sugestrøm gjennom å skille kapillær forårsaket av selvaspirasjon fra forstøver, og den elektriske tilkoblingen til jordet utløpselelektrode til kapillær ende er obligatorisk.- Valg av forstøver
- Bruk en konsentrisk forstøver med lavt selvaspirerende volum (f.eks. 100 μL/min) som passer inn i et sprøytekammer med lavt volum.
MERK: Det lave opptaket vil bare føre til moderat fortynning av kapillær efflux parallelt fra den fortsatt optimaliserte nebuliseringen. Elektrisk tilkobling av utløpselelektroden oppnås ved en elektrolyttstrøm rundt utløpselelektroden og rundt kapillærenden. - Bruk selvaspirasjonen til forstøveren til å minimere sugekraften gjennom separeringskapillæren og for innføring av strømningshastigheten til den optimale verdien som forstøveren trenger.
- Klargjør følgende deler fra tabell 2 for å montere dette hjemmelaget grensesnitt.
- Bruk en konsentrisk forstøver med lavt selvaspirerende volum (f.eks. 100 μL/min) som passer inn i et sprøytekammer med lavt volum.
- Oppsett av det enkle grensesnittet
MERK: Bruk figur 1 til å følge beskrivelsen av delmontering for det enkle grensesnittet. Tallene i figur 1 og i teksten nedenfor refererer til tallene i tabell 2.- Begynn å montere grensesnittet ved å koble de to 3-veis kvinnelige Luer-kontaktene (nr. 3) med en mannlig kjegle Luer-kontakt (nr. 4). Koble den venstre enden av den nedre 3-veis Luer-linjen til den mannlige kontakten, og den til den midterste tilkoblingen til den øvre 3-veis Luer.
- Sett et 1 cm rør (nr. 1) over Pt-ledningen (nr. 7) og et 1 cm silikonrør (nr. 5) over den sistnevnte og dysen på en mannlig Luer-kontakt (nr. 2). Fest monteringen til den midterste tilkoblingen til den nedre 3-veis Luer-kontakten (nr. 3) ved Luer-typisk skrurotasjon.
- Skyv et 1 cm rør (nr.1) over utløpsenden av CE-kapillæren og plasser det ca. 8-9 cm fra enden.
- Sett et silikonrør på 1 cm (nr. 5) over den sistnevnte og dysen på en mannlig Luer-kontakt (nr. 2).
- Sett hele forsamlingen fra venstre gjennom baren på den øvre 3-veis-T-kontakten og fest den mannlige Luer-kontakten og venstre ende av den kvinnelige 3-veis Luer-kontakten (nr. 3) ved Luer-typisk skruerotasjon.
- Fest silikonrøret på 25 cm (nr. 5) ved dysen på en mannlig Luer-kontakt (nr. 2) og fest hele enheten i den nedre (høyre) enden av baren fra den nedre 3-veis Luer-kontakten (nr. 3) ved Luer-typisk skruerotasjon.
- Ta silikonrøret på 1 cm (nr. 6) og skyv det 5 mm over enden av forstøveren tett, mens den andre mannlige Luer-kjeglekontakten (nr. 4) er koblet tett inn i den utstikkende delen av silikonrøret.
- Flytt den ovennevnte grensesnittet delen senere med utstående CE kapillær til den mannlige kjegle på forstøveren. Sett CE kapillæren forsiktig gjennom den mannlige kjeglen og videre gjennom den bredere delen av forstøverkapillæren til sistnevnte blir smal. Gitt at den utstående lengden på kapillæren ble valgt passende, passer den øvre kvinnelige 3-veis Luer-kontakten nå også tett til den mannlige kjeglen.
- Korriger lengden på den utstående kapillærlengden om nødvendig ved å flytte kapillæren (forover/bakover) på røret (nr. 1) der du går inn i det selvproderte grensesnittet.
MERK: Den optimale posisjonen til CE-kapillæren i begynnelsen av forstøverkapillæren er ikke så kritisk. Men ikke skyv CE-kapillæren for nær den smale delen av forstøverkapillæren. Dette kan hindre eller blokkere utløpselelektrolyttstrømmen. Dette ville også forstyrre den elektriske tilkoblingen til utløpselelektroden og ville øke suget gjennom CE-kapillær, noe som resulterte i forstyrret separasjon. I sin tur, ikke holde CE kapillær slutten for langt unna nebulizer kapillær siden da skarpe separerte topper ville bli utvidet og oppløsning vil gå tapt. - Bruk et objektiv til å identifisere den beste posisjonen.
MERK: Figur 1 (nederst til høyre) viser den optimale posisjonen til CE-kapillær inne i forstøveren.
- Valg av forstøver
Figur 1: Skjematisk og montering av CE-ICP-MS-grensesnittet. Skjematisk identifiserer enkeltdelene for trinnvis montering av det enkle og billige CE-ICP-MS-grensesnittet. Vinduet viser et bilde av optimal posisjonering av CE-kapillæren i forstøveren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| nei. | Del | brukes til |
| 1 | Rør (grønn-oransje fargekode), 2 x ca. 1 cm | ce kapillær og utløpselelektrode på Luer-deler og holde tett |
| 2 | Luer, hann, 3 x, egnet for 1,6 mm ID silikonrør | tilkobling av silikonrør til utløpselektrolytt og som hjelpemiddel for å feste CE kapillær og Pt-wire elektrode |
| 3 | 3-veis Luer, kvinne, 2 x | T-stykker for å koble til elektrode, kapillær og aspirert utløpsstrøm |
| 4 | Luer kjegle, mann, 2 x | koble kvinnelige Luers til hverandre og til forstøver |
| 5 | Silikonrør, 1,6 mm ID, 0,8 mm vegg, 2 x 1 cm, 1x ca. 25 cm | a) 1cm; tetting CE kapillær til grensesnitt, b) 1cm; tetting Pt-wire til grensesnitt c) 25 cm; tilkobling fra utløpselelektrolyttkolbe til grensesnitt |
| 6 | Silikonrør, 3 mm ID, 1,2 mm vegg, ca. 1 cm | tetting Luer kjegle til forstøver |
| 7 | Platina-ledning | Uttak elektrode |
Tabell 2: Deler for å bygge det enkle, selvproddne CE-ICP-MS-grensesnittet. Tallene refererer også til figur 1 og beskrivelse i teksten.
4. Forberedelse til måling
MERK: Før måling skal kapillæren skylles med sterk alkalisk oppløsning (her: 12 % TMAH) for rengjøring og deretter fylles med bakgrunnselektrolytt. For forbedret separasjon er en stabling buffersandwich bygget rundt prøven basert på konduktivitet og pH-graderinger. Tabell 3 oppsummerer de påfølgende tilberedningstrinnene til kapillæren, som behandles automatisk av instrumentet i henhold til programmert metode:
| Trinn-Nei | Trinn | Kjemiske | Tilstand |
| Utarbeidelse av CE-kolonne | |||
| Forberedelse 1 | Kapillær rengjøring | 12 % TMAH | 4 bar, 1 min. |
| Forberedelse 2 | Kapillær rensing med bakgrunnselektrolytt | 20 mM HCl | 4 bar, 1 min. |
| Forberedelse 3 | Stabling: ledende elektrolytt | 12 % TMAH | 150 mbar, 3 s |
| Forberedelse 4 | Injeksjon | Eksempel | 150 mbar, 3 s |
| Forberedelse 5 | Stabling: avslutte elektrolytt | 0,05 mM HCl | 150 mbar, 3 s |
Tabell 3: Trinn for kapillærforberedelse før måling. Disse trinnene er programmert med CE-system-programvaren i CE-metoden og inkluderer trykksatt prøveinjeksjon og oppbygging av en "stabling sandwich" rundt prøven.
- Programmer en CE-metode, som utfører fortløpende trinnene som er angitt i tabell 3.
- Definer en eksempeltabell og sekvens i CE-programvare, og kopier denne sekvensen også til ICP-MS-programvare.
5. Måling og dataevaluering
- Start metoden ved CE-instrumentet. Etter den programmerte tilberedningen og fyllingen av kapillæren starter målingen automatisk så snart hetteglasset med innløp, som inneholder 20 mM HCl, er på plass ved kapillærinntak. "Start-trigger" sendes til ICP-MS, som starter on-line overvåking av Fe-isotoper.
MERK: Separasjonen bruker en spenning på +25 kV. Den utvidede lengden på kapillæren, som er nødvendig for å koble CE-instrumentet til ICP-MS, fører til at separasjonstiden blir unødvendig økt. Derfor støttes separasjonen av et lavt trykk på 250 mbar ved innløp. Den selv aspirerte elektrolytten ved utløpet er 5 mM HCl. Den totale analysen varer 3 minutter for prøver med moderat ledningsevne. I signalvinduet til ICP-MS-programvaren kan elektroferogramet observeres under kjøringen. På slutten av hvert eksempel genereres to datafiler automatisk, en bare tilgjengelig fra instrumentprogramvare fra intern databank, en annen i eksportmappen som ".xl" eller ".txt" -format, tilgjengelig ved importfunksjon fra vanlig kromatografiprogramvare. - Se programvarehåndboken for ICP-MS-instrumentet for eksport av filene til kromatografiprogramvare.
Representative Results
Målinger av standarder og kalibrering
Migrasjonstider ble belyst ved enkeltstandardinjeksjoner: Fe(III)-standarden ble overvåket ved 118 s av migrasjonstiden og Fe(II)-standarden ved 136 s migrasjonstid. Grensene for deteksjon ble beregnet ved hjelp av 3 σ kriterium som refererer til baseline støy og en standard konsentrasjon på 50 μg/ L. LOD(Fe(II) var 3,1 μg / L og LOD(Fe (III) var 3,2 μg / L. Peak områdebasert kalibrering for begge jernarter var lineær fra LOD til 150 μg / L. Mens linearitet av Fe(III) ble bevist også for høyere konsentrasjon, ble hellingen av kalibreringskurven for Fe(II) redusert. En øvre konsentrasjonsgrense på 150 μg/l ble ansett å være tilstrekkelig siden bioprøver som er relevante for Fe(II)/(III) bestemmelse vanligvis har lavere Fe-konsentrasjon. Ved høyere konsentrasjon kan prøvene fortynnes tilsvarende. Topphøydekalibrering ble kontrollert opp til 600 μg/l og viste linearitet over hele det testede området. Dette vises i figur 2.
Figur 2: Kalibreringskurver (topphøyde) på Fe(III) og Fe(II). Topp høyderelaterte kalibreringer av begge Fe redox arter er lineære med en skråning på ca. 161 * X Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Analyse av SH-SY5Y cellelylat
Analysen av SH-SY5Y cellelylat viste en litt langsommere migrasjon for jern redox arter på grunn av noe høyere ledningsevne. Fe(III) ble overvåket ved 124 s av migrasjonstiden, Fe(II) ved 158 s av migrasjonstiden. Presisjonen for overføringstid i SH-SY5Y-cellelylat var 2 % for Fe(III) og 3 % for Fe(II). Kvantitative Fe(II) og Fe(III)-målinger ved hjelp av denne metoden viste Fe(III) konsentrasjon på 330 μg/l og Fe(II) konsentrasjon 84 μg/l, som begge resulterte i et Fe(II)/Fe(III) forhold på 0,25. Det respektive 56Fe-selektive elektrofrogram er vist i figur 3.
Figur 3: 56Fe-spesifikt elektroferogram av SH-SY5Y cellelylat. Fe(III) overvåkes ved 123 s nå 58025 cps topp høyde, blir tydelig atskilt fra Fe (II) på 158 s, nå 22800 cps Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Siden jern spiller en fremtredende rolle i OS-progresjon, og dermed tilrettelegge mitokondrie dysfunksjon eller FTP, en allsidig CE-ICP-MS basert kvantitativ metode for samtidig Fe(II) / Fe (III) spesiasjon er presentert i denne artikkelen, og dens anvendelse er eksemplarisk demonstrert i cellelysater. Metoden gitt kort analysetid og tallene for fortjeneste (LOQ, presisjon, utvinning) er egnet for prøver som er relevante for jern redox spesifikasjon spesielt i nevrodegenerativ og kreft forskning. Sammenlignet med tidligere metoder basert på LC, er denne CE-baserte metoden praktisk talt uavhengig av kolonnepartier og tidligere observerte reproduserbarhetsproblemer etter LC-kolonneendring. Kapillærforberedelse før hvert løp er <4 minutter og analysetid per prøve med moderat saltholdighet opptil 3 min. Bortsett fra molekylladning og størrelse, avhenger migrasjonstiden i CZE av konduktivitet ved prøvepluggen, noe som forårsaker migrasjonstidsvariasjon eller skift når prøvene selv påvirker konduktiviteten betydelig. Slike endringer i migrasjonstiden er godt kjent i kapillær elektroforese. Dette er et CZE-immanent problem, kjent fra litteratur21,22. Standarder og SH-SY5Y cellelyater hadde moderat og homogen ledningsevne. Derfor viste migrasjonstider bare små endringer med god presisjon. For prøver med høy ledningsevne kan imidlertid langvarige migrasjonstider observeres opptil 5 min. Derfor anbefales standardtillegg for klar artsidentifikasjon.
Et kritisk problem i jernrødox-spesifisasjon er artsstabilitet (det vil vil vil at vedlikehold av Fe(II)/(III) likevekt) under prøveforberedelsen8,13. Upassende pH- eller chelating-kjemikalier samt upassende lagringsforhold som oksygen (luft) i kontakt med prøve eller en pause i dypfrosset lagring kan enkelt endre Fe(II)/(III)-balansen. Derfor, for fremstilling av SH-SY5Y cellelylater, ble en lysisbuffer valgt uten chelating kjemikalier, fysiologisk pH, men inert gassoverlegg under prøveforberedelse, i prøvebeholdere og umiddelbar dyp frysing ble brukt for disse prøvene.
I litteraturen kan man finne semi-kvantitative tilnærminger for å overvåke Fe(II). For bedre forståelse av jernets rolle i oksidativt stress utviklet flere forskningsgrupper Fe(II)-spesifikke sonder for å halvkvantitativt overvåke og visualisere avvikende heving av jernholdig jern in vitro. Men viktig å merke seg, slike sonder anser ikke Fe (III) og ikke kvantifisere, men rapportere bare "mer" eller "mindre" Fe (II)). Til dags dato er bare noen få biomarkører tilgjengelige for å bestemme OS og FPT, på grunn av mangel på pålitelige metoder for samtidig å kvantifisere Fe(II) / Fe (III) redoksarter23,24. Å ha dette i tankene, kan den presenterte metoden - som letter rask kvantifisering av begge, Fe(III) og Fe(II) i ett løp - bli et lovende verktøy for å utdype innsikten i jernavhengige molekylære prosesser.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
VV ble støttet av det intramurale forskningsstipendet (Forschungsförderung) ved Universitetets medisinske senter Göttingen og Else Kröner forskningsprogram for Else Kröner-Fresenius-Stiftung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CE capillary | CS-Chromatographie Service, Langerwehe, Germany | 105180-25 | |
| CE system | PrinCe technolgies | 0005.263 | model PrinCe 760 |
| Conical Superclear Tubes 15 ml | Analytics-shop.com by Altmann Analytik | PEN0777704 | |
| Conical Superclear Tubes 50 ml | Analytics-shop.com by Altmann Analytik | PEN0777694 | |
| FeCl2 * 4H2O | Merck | 103861 | |
| FeCl3 | Merck | 803945 | |
| Fluidflex Silikon HG-Schlauch | ProLiquid | 4001106HG | |
| Fused silica capillary OD 360 µm, ID 50 µm | Chromatographie Service GmbH | 105180-25 | |
| hydrochloric acid, 1 M | Merck | 1101652500 | corrosive |
| ICP-MS | Perkin Elmer | N814003 | |
| Luer, 3-way female | BioRad | 7318229 | |
| Luer, cone male | neoLab Migge | 2-1895 | |
| Luer, male | neoLab Migge | 2-1880 | |
| Peakfit peak evaluation software | Systat | PeakFit 4.12 | |
| Pt-wire | Carl Roth | 0737.1 | |
| PVC tube | ProLiquid | 6000002 | |
| RIPA buffer | Abcam | ab156034 | |
| Tetramethylammoniumhydroxide, 25 % | Merck | 814748 | corrosive |
| TYGON-tube R-3607 | ProLiquid | 3700203A |
References
- Hare, D. J., et al. Is early-life iron exposure critical in neurodegeneration. Nature Reviews Neurology. 11 (9), 536-544 (2015).
- Ashraf, A., Clark, M., So, P. W. The Aging of Iron Man. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, (2018).
- Hare, D. J., Cardoso, B. R., Szymlek-Gay, E. A., Biggs, B. A. Neurological effects of iron supplementation in infancy: finding the balance between health and harm in iron-replete infants. Lancet Child Adolesc Health. 2 (2), 144-156 (2018).
- Torti, S. V., Torti, F. M. Iron and cancer: more ore to be mined. Nature Reviews Cancer. 13 (5), 342-355 (2013).
- Kehrer, J. P. The Haber-Weiss reaction and mechanisms of toxicity. Toxicology. 149 (1), 43-50 (2000).
- Gaschler, M. M., Stockwell, B. R. Lipid peroxidation in cell death. Biochemical and Biophysical Research Communications. 482 (3), 419-425 (2017).
- Michalke, B., Halbach, S., Nischwitz, V. JEM Spotlight: Metal speciation related to neurotoxicity in humans. Journal of Environmental Monitoring. 11 (5), 939-954 (2009).
- Solovyev, N., Vinceti, M., Grill, P., Mandrioli, J., Michalke, B. Redox speciation of iron, manganese, and copper in cerebrospinal fluid by strong cation exchange chromatography - sector field inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 973, 25-33 (2017).
- Lee, H. J., et al. Effect of excess iron on oxidative stress and gluconeogenesis through hepcidin during mitochondrial dysfunction. Journal of Nutritional Biochemistry. 26 (12), 1414-1423 (2015).
- Dixon, S. J., Lemberg, K. M., Lamprecht, M. R., Skouta, R., Zaitsev, E. M., Gleason, C. E., et al. Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell. 149 (5), 1060-1072 (2012).
- Stockwell, B. R., et al. Ferroptosis: A Regulated Cell Death Nexus Linking Metabolism, Redox Biology, and Disease. Cell. 171 (2), 273-285 (2017).
- Michalke, B., Berthele, A., Mistriotis, P., Ochsenkuhn-Petropoulou, M., Halbach, S. Manganese speciation in human cerebrospinal fluid using CZE coupled to inductively coupled plasma MS. Electrophoresis. 28 (9), 1380-1386 (2007).
- Fernsebner, K., Zorn, J., Kanawati, B., Walker, A., Michalke, B. Manganese leads to an increase in markers of oxidative stress as well as to a shift in the ratio of Fe(II)/(III) in rat brain tissue. Metallomics. 6 (4), 921-931 (2014).
- Neth, K. Manganese: Species Pattern and Mechanisms of Brain Injury. , Technical University of Munich, Analytical Food Chemistry. Doctoral Dissertation (2015).
- Neth, K., et al. Changes in Brain Metallome/Metabolome Pattern due to a Single i.v. Injection of Manganese in Rats. Plos One. 10 (9), (2015).
- Venkataramani, V., et al. Manganese causes neurotoxic iron accumulation via translational repression of Amyloid Precursor Protein (APP) and H-Ferritin. Journal of Neurochemistry. 147 (6), 831-848 (2018).
- Willkommen, D., Lucio, M., Schmitt-Kopplin, P., Gazzaz, M., Schroeter, M., Sigaroudi, A., Michalke, B. Species fractionation in a case-control study concerning Parkinson's disease: Cu-amino acids discriminate CSF of PD from controls. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 49, 164-170 (2018).
- Thibault, P., Dovichi, N. J. General instrumentation and detection systems including mass spectrometry. Capillary Electrophoresis - Theory and Practice. Camilleri, P. , CRC Press. Boca Raton, Boston, New York, Washington D.C., London. 23-89 (1998).
- Iliff, J. J., et al. A Paravascular Pathway Facilitates CSF Flow Through the Brain Parenchyma and the Clearance of Interstitial Solutes, Including Amyloid beta. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Michalke, B. Manganese speciation using capillary electrophoresis-ICP-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1050 (1), 69-76 (2004).
- Kuhn, R., Hofstetter-Kuhn, S. Capillary electrophoresis: Principles and practice. , Springer. Berlin, Heidelberg. (1993).
- Michalke, B. Capillary electrophoretic methods for a clear identification of selenoamino acids in complex matrices such as human milk. Journal of Chromatography A. 716 (1-2), 323-329 (1995).
- Yang, W. S., et al. Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4. Cell. 156 (1-2), 317-331 (2014).
- Shimada, K., Hayano, M., Pagano, N. C., Stockwell, B. R. Cell-Line Selectivity Improves the Predictive Power of Pharmacogenomic Analyses and Helps Identify NADPH as Biomarker for Ferroptosis Sensitivity. Cell Chemical Biology. 23 (2), 225-235 (2016).
