Summary
We presenteren hier een verbeterd protocol voor de hele montering van drosophila-teelballen, geschikt voor confocale microscopie en ook reproduceerbaar en betrouwbaar labelen mogelijk. We illustreren dit protocol door 3D-representatie en kwantificering van colocalisatie-experimenten op de grote S4-S5 spermatocyten.
Abstract
Drosophila-teelballen zijn een krachtig modelsysteem voor het bestuderen van biologische processen, waaronder stamcelbiologie, nucleaire architectuur, meiose en spermaontwikkeling. Immunolabeling van de hele Drosophila-testis wordt echter vaak geassocieerd met significante niet-uniformiteit van kleuring als gevolg van antilichaampenetratie. Geplette preparaten overwinnen het probleem slechts gedeeltelijk, omdat het de 3D-kwaliteit van de analyses vermindert. Hierin beschrijven we een whole-mount protocol met NP40 en heptaan tijdens fixatie samen met immunolabeling in vloeibare media. Het behoudt het volume dat geschikt is voor confocale microscopie samen met reproduceerbare en betrouwbare etikettering. We laten verschillende voorbeelden zien van 3D reconstitutie van spermatocytkernen uit confocale secties. De reproduceerbaarheid van intra- en intertesten maakt 3D-kwantificering en vergelijking van fluorescentie tussen afzonderlijke cellen van verschillende genotypen mogelijk. We gebruikten verschillende componenten van de intranucleaire MINT-structuur (Mad1-bevattend Intra Nuclear Territory) en twee componenten die verband houden met het nucleaire poriecomplex om dit protocol en de toepassingen ervan op de grootste cellen van de testis, de S4-S5 spermatocyten, te illustreren.
Introduction
Drosophila-teelballen zijn een waardevol model voor de studie van nucleaire architectuur. In mitotische spermatogoniale cellen wordt het nucleaire volume grotendeels ingenomen door chromatine. Deze cellen ondergaan vier delingsrondes en produceren een cyste van 16 primaire spermatocyten. In de komende dagen passeren de spermatocyten 6 ontwikkelingsstadia (S1-S6), sterk toenemend in volume, ongeveer 20-voudig1,2. Ze veranderen ook hun nucleaire morfologie. De omtrek van de kern, onthuld door de lamin Dm0, wordt onregelmatig en vertoont diepe invaginaties1,3. Dit gaat gepaard met uitgebreide genexpressieveranderingen en wijzigingen in chromatineorganisatie1,4,5,6,7. De interfasechromosomen zijn goed gedefinieerd in stadium S4-S5 en vormen drie verschillende massa's die overeenkomen met de 2 grote bivalente autosomen en het X-Y-paar aangemeerd met de nucleolus.
Mad1 werd oorspronkelijk geïsoleerd als een belangrijk onderdeel van het mitotische controlepunt (beoordeeld in8). In interfase wordt beschreven als voornamelijk gelegen aan de nucleaire envelop, maar ook in het nucleoplasma9,10,11. In Drosophila testis meldden we dat Mad1 prominent aanwezig is in het nucleoplasma, nauw verbonden met de twee belangrijkste autosomale chromatinemassa's en in mindere mate met de XY chromatine. We definieerden deze chromatine-geassocieerde structuur als MINT (Mad1-containing IntraNuclear Territory)12. Vier andere eiwitten werden geassocieerd met MINT's in spermatocyten: de nucleoporine Mtor/Tpr, het SUMO peptidase Ulp1, het mitotische checkpoint-eiwit Mad2 en een subeenheid van een Polycomb-achtig complex Raf212.
Om de beschrijving van DE's te voltooien, moesten we antilichamen gebruiken en werden we geconfronteerd met de technische problemen die over het algemeen worden ondervonden met immunostaining bij testis: een slechte permeabiliteit die resulteert in een significante niet-uniformiteit van kleuring in de diepte van de testis, met name in de grote spermatocyten. Svernietigde preparaten verhoogden de toegang tot antilichamen, maar leidden tot gecomprimeerde beelden, waardoor de 3D-analyses werden beperkt en het meten van kwantitatieve fluorescentie, waaronder colocalisatie, werdvoorkomen. Het probleem van antilichaampenetratie kan ook worden aangepakt door permeabiliserende middelen zoals 0,3% Na-deoxycholaat13, maar deze procedure leverde in onze handen geen reproduceerbare resultaten op. Omdat we veel co-labeling experimenten hebben uitgevoerd, hebben we gekeken naar het verbeteren van het permeabilisatieprotocol. De combinatie van 1% NP40 plus heptaan resulteerde in meer reproduceerbaarheid, met name in het bestuderen van de grote spermatocyten.
Dit protocol voert fixatie en immunostaining van teelballen in suspensie uit, verbetert de monsterkwaliteit en verbetert de reproduceerbaarheid en maakt het geschikt voor confocale microscopie. We gebruikten het protocol om de ruimtelijke relaties van bepaalde nucleaire envelopeiwitten met de nucleoplasmatische structuren van grote spermatocyten beter te definiëren. Deze methode zal een beter onderzoek mogelijk maken naar de veranderingen die gepaard gaan met de ontwikkeling van spermatocyt, bijvoorbeeld de dynamische structurele veranderingen van de kern, waaronder chromatine, nucleoplasma en de nucleaire poriën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Drosophila testes collectie
OPMERKING: Jonge mannetjes (0-15 uur post-eclosie) zijn nodig voor het onderzoeken van diploïde kiemcellen (d.w.z. spermatogonia en spermatocyten).
- Selecteer jonge vliegen zoveel mogelijk om interferentie door het ontwikkelen van spermatids te minimaliseren.
- Verdoof vliegen door korte blootstelling aan kooldioxide en breng over op een vliegenkussen14,15.
- Gebruik onder een ontleedmicroscoop (10x vergroting) een tang om het hoofd te verwijderen.
- Breng 5 tot 10 onthoofde vliegen over naar 100 μL ringersbuffer (183 mM KCI, 47 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, complete eiwitremmer, pH 6,8) op een glazen glijbaan met siliconencoating op een zwarte achtergrondsteun.
- Gebruik met een ontleedmicroscoop bij een vergroting van 40x één paar nummer 5-tangen om een vlieg tussen de thorax en de buik vast te houden en trek met een andere tang de buik weg van de thorax. Isoleer snel de teelballen en aangrenzende weefsels van het vliegkarkas15 en plaats in een nieuwe druppel Ringer's buffer op dezelfde dia.
- Zodra alle teelballen klaar zijn, reinigt u de teelballen van de resterende weefsels (accessoireklier en uitwendige genitaliën).
- Verwijder overtollige buffer uit de druppel met de ontlede teelballen. Gebruik meestal een p200 pipet met een tip van 10 μL bovenop een tip van 200 μL. Dit maakt het mogelijk om het overtollige vocht door een klein diafragma te verwijderen. Plaats een druppel van 4% paraformaldehyde fixatief bovenop de druppel met de ontlede teelballen en breng de teelballen vervolgens snel over in een buis met verse fixatieve oplossing.
2. Paraformaldehyde fixatie
- Bereid vlak voor gebruik 2 ml fixatieve oplossing: 600 μL 4% paraformaldehyde verdund in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 30 μL NP40 20% plus 1200 μL heptaan in een 2 ml gesiliconiseerde microcentrifugebuis. Gebruik 4% paraformaldehyde in PBS bereid in 600 μL aliquots en bewaard bij -20°C.
Let op: Heptaan en paraformaldehyde zijn giftig en moeten in een zuurkast worden behandeld. Gooi ze weg volgens de voorschriften van het gastinstituut. - Breng de teelballen met behulp van een p200 micropipet met een brede diafragmatip over naar de PFA/NP40/heptaanoplossing. Schud de buis 30 s met de hand op en neer. Blijf de teelballen gedurende 30 minuten op kamertemperatuur op een roterende mixer bevestigen.
- Stop de roterende mixer en plaats de buis in een buizenrek om fasescheiding mogelijk te maken en voor de teelballen om zich op de bodem van de buis te nestelen.
- Verwijder alle heptaan en de fixatieve oplossing en spoel de teelballen drie keer snel af met 1x PBS.
- Breng over op een schone individuele buis van 200 μL. Voer alle incubaties uit in deze kleine buisjes om de hoeveelheden gebruikte antilichamen te minimaliseren.
- Verwijder overtollige buffer met behulp van een 200 μL micropipet met zowel een P200 als een P10 tip bevestigd. Zorg ervoor dat je geen teelballen aspireert.
- Houd teelballen in 1x PBS op ijs totdat alle monsters klaar zijn.
3. Antilichaamkleuring in oplossing
- Gooi de PBS weg en laat de teelballen 30 minuten in 0,3% PBS-T bij kamertemperatuur staan om celmembranen te permeabiliseren.
- Incubeer gedurende 1 uur in dezelfde buffer plus 5% normaal geitenserum (NGS).
- Voeg 200 μL van het primaire antilichaam verdund in 0,3% PBS-T plus 5% NGS (Tabel van materialen) toe.
- Incubeer het primaire antilichaam 's nachts bij 4 °C (of kamertemperatuur) met zachte agitatie op een rocker.
- Was 3 keer in 0,3% PBS-T gedurende 15 minuten op een schommel op kamertemperatuur. Laat de teelballen zich door de zwaartekracht op de bodem van de buis nestelen.
- Voeg 200 μL secundair antilichaam verdund 1:500 uit de DyLight geconjugeerde serie toe.
- Incubeer het secundaire antilichaam gedurende 4 uur bij kamertemperatuur in een donkere kamer.
- Was 0,3% PBS-T gedurende 15 minuten op een schommel op kamertemperatuur. Herhaal dit vervolgens met 0,2% PBS-T en 0,1% PBS-T, telkens gedurende 30 min op een rocker bij kamertemperatuur. Was het wasmiddel 30 minuten in 1x PBS.
- Voeg 180 μL DAPI-oplossing toe bij 1 μg/ml in 1x PBS gedurende 15 min. De stamoplossing is 10 mg/ml in H2O. Vermijd het maken van voorraadoplossing in PBS, die het DAPI-kleuringssignaal op diffuse chromatine in grotere spermatocyten kan verminderen.
- Was 3x voor elk 5 minuten.
- Gebruik een hydrofobe barrièrepen om een cirkel op een schone dia te tekenen.
- Aspireer teelballen en zet ze op de glijbaan. Het voorspoelen van de brede diafragmatip met 0,1% PBS-T voorkomt dat de teelballen aan de punt blijven plakken. Verwijder overtollige PBS.
- Voeg een druppel (ongeveer 100 μL) Citifluor AF1 toe.
- Plaats voorzichtig een glazen afdeklip over het weefsel en zorg ervoor dat er geen luchtbellen vallen.
- Sluit de afdeklip af op de glijbaan met duidelijke nagellak.
- Observeer dia's op een microscoop.
4. Colocalisatie analyses
- Verkrijg confocale afbeeldingen. We gebruikten een Zeiss LSM 710 confocale microscoop (63x Plan Apochromatische olie) met een z-resolutie van 0,5 of 1 μm.
- Selecteer verschillende cellen uit onafhankelijke teelballen.
- Importeer afbeeldingen in verwerkingssoftware (bijv. Imaris).
- Definieer de kern door handmatige segmentatie om de naburige kernen uit te sluiten. Gebruik de Coloc software; het verzamelt de correlatiecoëfficiënten (PCC's) van Pearson binnen het gehele volume tussen 2 fluoroforen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het belangrijkste obstakel voor het verkrijgen van adequate kleuring van Drosophila-teelballen is de beperkte penetrante doordringbaarheid van antilichamen, die gedeeltelijk is opgelost door het gebruik van geplette preparaten, maar ten koste van het induceren van een beperking van de 3D-analyses (bijvoorbeeld 3D-representatie of meting van colocalisatie). De procedure maakt uniforme etikettering mogelijk en behoudt het volume van alle cellen van de testis. Hier hebben we de illustratie van de methode gericht op de 3D-representatie van S4-S5 spermatocyten, omdat ze de grootste cellen zijn en dus gevoeliger voor vervorming door squashing. We gebruikten verschillende nucleaire markers, waaronder nucleoporines en de etikettering van het intranucleaire MINT-domein (Mad1-bevattend Intra Nuclear Territory) beschreven door het mitotische eiwit Mad112. Omdat MINT's door verschillende antilichamen konden worden onthuld, gebruikten we ze om de robuustheid van het protocol voor kwantitatieve 3D-colocalisatie te testen, een methode die een juiste ruimtelijke resolutie vereist.
Het hierboven beschreven protocol maakt het mogelijk om confocale beelden van voldoende kwaliteit te verkrijgen om vervolgens te worden behandeld voor 3D-reconstitutie. Vier aangrenzende seriële secties van een stadium S5 spermatocyt zijn afgebeeld in figuur 1A, met een representatieve immunostaining van MINT (Mad1 immunolabeling met GFP booster in rood) samen met DAPI (in cyaan). De chromosomen zijn georganiseerd in de karakteristieke 3 grote verschillende clusters en de MINT-structuur wordt in detail weergegeven rond het DNA, intiem geassocieerd met --maar verschillend van--de autosomale chromatinemassa's. De resolutie maakt het ook mogelijk om de aanwezigheid van Mad1 in de nucleaire periferie en tussen de autosomale massa's van chromosomen 2 en 3 te detecteren. We gebruikten Imaris software voor de 3D-weergave. Het nucleaire oppervlak werd gedefinieerd door de lage aanwezigheid van Mad1 bij de nucleaire envelop (in grijs) en MINT werd gedefinieerd door een hoge accumulatie van Mad1 in de kern (in rood) samen met DAPI-kleuring (in blauw) (Figuur 1A). De 3D reconstitutiefilm illustreert goed het volume en de relatie van Mad1 (bij de nucleaire envelop en in de MINT) samen met de chromosomen in stadium S4-S5 spermatocyten.
De verdeling van nucleoporines is slechts slecht beschreven in deze cellen, waarschijnlijk vanwege de moeilijkheid om ze te detecteren in deze grote misvormde kernen. De distributie van Nup154 is slechts één keer eerder gemeld16 en Nup153 en Nup98 werden alleen onderzocht in de spermatogonia en kleine, vroege spermatocyten17. De 3D-reconstituties van grote S5 spermatocyten gekleurd door het nucleoporine Nup62 en door importine β (product van het ketelgen) waren haalbaar en zijn weergegeven in respectievelijk figuur 1C en figuur 1D. Deze met kernporiën geassocieerde componenten lijken niet uniform verdeeld over de nucleaire rand als stippen van onregelmatige grootte. Bijvoorbeeld, de importin β verzamelt zich rond de autosomale chromatine op dezelfde manier als waar een lamin netwerk al is beschreven3. Dit soort distributie met porierijke gebieden en grote porievrije gebieden is beschreven door elektronenmicroscopie in spermatocyten van knaagdieren18. Inzicht in de veranderingen in de distributie van lamin en nucleoporine zou helpen om de nucleaire envelopstructuur in deze G2-cellen te begrijpen vlak voor mannelijke meiose.
Met behoud van het 3D-volume van de cellen laat dit protocol ook antilichamen uniform doordringen in de diepte van elke cel, waardoor kwantitatieve analyse zoals colocalisatie mogelijk is. De Pearson correlatiecoëfficiënt (PCC) is een gevestigde metriek. Het kan variëren van +1 (wat een perfecte positieve correlatie aanduidt) tot −1 (perfecte negatieve correlatie)19. Om de lokalisatie van MINT-partnereiwitten ten opzichte van Mad1 in spermatocyten te evalueren, hebben we eerder het PCC geschat op een enkele sectie van 0,5 μm met behulp van ImageJ in S5 spermatocyten12 (Figuur 2A,B). We hebben het protocol dieper getest door 3D-colocalisatie op de hele kernen te gebruiken in plaats van alleen een oppervlak. Het volume van de kernen werd bepaald door handmatige segmentatie en het PCC werd gemeten met behulp van de Colocatietool. We analyseerden acht S5 spermatocytkernen, van dezelfde testis of verschillende teelballen. Figuur 2B toont een 3D-weergave van een kern die diende om het PCC te meten. Figuur 2D toont de meting van het PCC op acht verschillende S5 spermatocytkernen uit drie verschillende teelballen. PCC-waarden verschillen niet, variërend van 0,6 en 0,75, wat wijst op een hoge waarde voor colocalisatie. Deze zijn niet te onderscheiden van het PCC dat in één sectie is gedefinieerd. De procedure maakt dus een reproduceerbare uniforme etikettering mogelijk en behoudt een goed volume van alle cellen van de testis.
Omdat het protocol een betrouwbare meting van colocalisatie van onafhankelijke teelballen mogelijk maakt, maakte het het mogelijk om vlekken van verschillende vlieggenotypes te vergelijken. Dit werd hier geïllustreerd door vergelijking van WT vliegen en vliegen RNAi uitgeput voor Mtor (gegenereerd door expressie van dsRNA UAS lijnen en de Bam-Gal4 driver die aanzienlijke uitputting bereiken in late spermatogonia en vroege spermatocyten20). Zoals beschreven voor de colocalisatie-experimenten, werden Mtor-RNAi-uitgeputte teelballen en wilde typen teelballen ontleed en aan elkaar bevestigd en werden de confocale beelden onder constante instellingen verkregen. Met inachtneming van deze voorwaarden wordt de vergelijking van individuele cellen mogelijk. We hebben geconstateerd dat de MINT meer wordt beïnvloed dan de nucleaire enveloppe door het verlies van Mtor , zoals blijkt uit representatieve Mtor RNAi-uitgeputte (bovenste) en wt (onderste) cellen (Figuur 3)12.
Figuur 1: Illustratie van immunostaining van Drosophila S4-S5 spermatocyten kernen met behulp van verschillende sondes. (A) Beelden van een enkele fase 5 spermatocyt nucleus immunostained met α-GFP antilichaam (GFP booster) detecteren van de MINT structuur door Mad1-GFP (rood) samen met DAPI kleuring (blauw). Het toont met precisie de relatie tussen Mad1 en de twee autosomale chromatinemassa's (weergegeven als sterretjes). Mad1 wordt ook zwak gedetecteerd aan de rand van de kern. Alle afbeeldingen zijn seriële Z-projecties van een stapel van 3 (0,5 μm) opeenvolgende confocale plakjes. Confocale beelden werden verkregen op een confocale microscoop (63x, Plan Apochromatische olie DIC objectieve lens). Schaalbalken zijn 5 μm. (B) Frame van een filmweergave van dezelfde spermatocytkern. Het nucleaire oppervlak werd gedefinieerd door een lage expressie van Mad1 bij de nucleaire envelop (in grijstinten) en MINT werd gedefinieerd door een hoge expressie van Mad1 in de kern (in het rood). (A, B) Herdrukt met toestemming van eerder gepubliceerde figuur (vanaf12). (C) 3D-beeld van een stadium 5 spermatocytkern met gelijktijdige immunostaining van Nup62 (geel) en MINT (GFP-booster in rood). Schaalbalk is 4 μm. (D) 3D-beeld van een stadium 5 spermatocytkern met gelijktijdige immunostaining van de importine-β Ketel (geel) samen met DNA (DAPI in blauw). Schaalbalken zijn 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: 2D en 3D Colocalization kwantificering van Mad1 samen met Ulp1. (A) Samengevoegde beelden van een stadium 5 spermatocytkern immunostained met GFP booster antilichaam detecteren Mad1 (groen) en met anti-Ulp1 antilichaam (rood) vertegenwoordigd als een 1 μm dikke stapel van een spermatocyt kern. Aan de rechterkant wordt de Pearson intensiteit correlatiecoëfficiënt aangegeven berekend met behulp van de Coloc-2 ImageJ plugin. Het PCC werd geschat op 0,73 (herdrukt met toestemming van Raich12). (B) Samengevoegd beeld van stadium 5 spermatocytkern (overeenkomend met kern G in de aangrenzende tabel) immunostained met GFP booster antilichaam detecteren Mad1 (groen) en met anti-Ulp1 antilichaam (rood) weergegeven in een 3D projectie. Het volume van de kern werd bepaald door handmatige segmentatie. Aan de rechterkant bevat de tabel de Pearson intensiteitscorrelatiecoëfficiënten berekend op 8 verschillende spermatocyten (A tot H) van 3 verschillende teelballen (1 tot 3). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Immunofluorescentieanalyse van met Mtor RNAi behandelde spermatocyten in vergelijking met wild type. Cellen die uitgeput raakten van Mtor met behulp van MtorRNAi (ID 110218) cellen (bovenste panelen) en wilde type cellen (onderste panelen) werden gekleurd voor Mad1, Raf2 en Mtor eiwitten. De teelballen werden bevestigd en aan elkaar gebeitst, gemonteerd op dezelfde dia en afbeeldingen verkregen met dezelfde parameters. De RNAi-cellen kunnen van WT worden onderscheiden door respectievelijk de afwezigheid of aanwezigheid van Mad1-GFP. Het cijfer is representatief voor maximale projecties van 4 x 0,5 μm stapels. Schaalbalk is 5 μm (Herdrukt met toestemming van eerder gepubliceerde figuur in12). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol biedt een methode voor succesvolle immunolabeling van volwassen Drosophila-teelballen. Zoals gemeld in andere procedures moeten jonge mannetjes worden gebruikt (we hebben zelfs de leeftijd verkort tot minder dan 20 uur na eclosie) om de aanwezigheid van zich ontwikkelend sperma te minimaliseren, wat de spermatocyten dreigt te belemmeren. De dissectie moet snel zijn en de antilichaamverdunning moet worden aangepast om de signaal-ruisverhouding21,22,23te optimaliseren . Omdat we met behulp van andere protocollen geen kleuring hebben waargenomen gedurende de diepte van de testis, hebben we een fixatiemethode ontwikkeld die PFA combineert met NP40 en heptaan. We gebruiken nu routinematig 600 μL 4% paraformaldehyde in PBS met 30 μL van 20% NP40 plus twee volumes heptaan. Dit is van cruciaal belang om voldoende permeabilisatie mogelijk te maken. Door de hoeveelheid NP40 tot 10 μL zichtbaar te verminderen, wordt de etikettering verminderd. Alle daaropvolgende stappen werden uitgevoerd in suspensie en de overtollige buffer werd verwijderd door de teelballen door de zwaartekracht zachtjes naar de bodem van de buis te laten dalen. Voor de laatste stap waarbij monsters naar een dia worden overgebracht, spoelen we de punt in 0,1% PBS-T om te voorkomen dat de teelballen aan de kegel blijven plakken. Volgens observaties werkt het immunohistologische kleuringsprotocol goed met een verscheidenheid aan nucleaire eiwitten, waaronder de markers die hier worden gebruikt, evenals sondes van epigenetische histonmodificaties, lamin en nucleoporines. We merken op dat het protocol ook kan worden gebruikt voor larvale teelballen, in welk geval het heptaan moet worden weggelaten, omdat het de teelballen moeilijker intact maakt om te herstellen.
Het protocol is speciaal ontworpen om onbeschadigde stapels spermatocyten bij elkaar te houden voor een efficiënte en uniforme etikettering van de testis. We illustreerden het protocol met de grote late stadium spermatocyten, waarvan de misvormde kernen ze tot een van de moeilijkste cellen maken om te behouden. Bovendien wordt in deze spermatocyten de nucleaire etikettering vaak verdund, waarschijnlijk vanwege de grootte van de kernen. Er wordt bijvoorbeeld vaak waargenomen dat DAPI of lamin labeling sterker is in de cellen aan de testis apex en steeds zwakker wordt en zich meer verspreidt naarmate de spermatocytengroeien 3,24. Dit kan ook een van de redenen zijn waarom de distributie van nucleoporines alleen is beschreven in cellen in een eerder stadium (spermatogonia en vroege spermatocyten)17.
Uitstekende beelden van immunostaining van Drosophila S5 spermatocyten zijn gepubliceerd, met name voor de testis-specifieke t-BRD en dany-eiwitten25,26 met behulp van ofwel 0,3% natriumdeoxycholaatprotocol of na het verpletteren van het weefsel21,22. In onze handen leiden pompoenen tot een significante niet-uniformiteit van vlekken in de diepten van het orgel en ook tot het opofferen van de 3D-structuur. Zelfs als het gebruik van 0,3% natriumdeoxycholaat betere resultaten gaf, hebben we nog steeds niet-uniformiteit waargenomen. Daarom geven we de voorkeur aan NP40 vanwege de reproduceerbaarheid en kwaliteit van etikettering. De confocale beelden maken reconstructie van 3D-beelden voor nucleaire eiwitten mogelijk. We hebben deze methode bijvoorbeeld met succes toegepast met behulp van veel verschillende sondes, hier geïllustreerd door het intranucleaire MINT-domein, nauw verbonden met de autosomale chromatinemassa's en het nucleaire porienetwerk. Intrigerende 3D-verdeling van nucleaire poriën van deze spermatocytkernen is nu beschikbaar voor verder onderzoek. De beelden maken reproduceerbare kwantificering van colocalisatie mogelijk van verschillende spermatocyten uit dezelfde testis en uit verschillende teelballen. Voor zover wij weten is dit de eerste keer dat nauwkeurige kwantificering door Pearson correlatiecoëfficiënt is gemeten op dergelijke monsters. Het geeft het vertrouwen dat nodig is voor nauwkeurige immunolabeled eiwitniveaus vergelijking van verschillende teelballen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
Wij danken P. Verrijzer, J. Johansen H., Okhura voor antilichamen en A. Debec, de Bloomington en Vienna stock centers for flies. Met dank aan C. Jackson voor suggesties en stimulerende discussies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila srains | |||
| ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO | Gift from A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France) | ||
| Mad1-GFP | J Cell Sci. 2011 May 15;124(Pt 10):1664-71. | ||
| Mtor RNAi | VDRC | ID 110218 | Vienna Drosophila RNAi Center |
| Materials | |||
| DAPI | Thermo | D1306 | Stock solution must be prepared in H2O |
| Dumont # 5 Fine Forseps | Fine Science Tools | ||
| MBP Wide Bore Pipette Tips | Fisherbrand | 11917744 | Wide aperture tip |
| Thermo Scientific 0.2 mL Individual Tube | Thermo | AB-0620 | |
| 2 ml micro centrifuge tubes | Sigma | T3531-200EA | Siliconized 2ml tube |
| Citifluor AF1 | Citifluor | AF1 | |
| Dakopen | Sigma | Z377821-1EA | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Sigma | NS02L-1ML | |
| Paraformaldehyde 4% | Sigma | P6148-500G | Paraformaldehyde (4%) dissolved in PBS 1X ; aliquot by 600 ml |
| PBS 1X | Thermo | 14190094 | DPBS, no calcium, no magnesium |
| 0.1% (0.2 or 0.3%) PBS-T | PBS 1X containing 0.1% (0.2 % or 0.3%) Triton X-100 | ||
| Triton X-100, for molecular biology, | Sigma | T8787 | |
| Antibodies | |||
| GFP booster | Chromotek | gba488 | 1/200 |
| Mouse anti-Mtor | 1/40 gift from J. Johansen, Iowa State University | ||
| Rat anti-Nup62 | 1/200 gift from H. Ohkura (University of Edinburgh, UK | ||
| Guinea-pig anti-Ulp1 | 1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam | ||
| Rabbit anti-Raf2 | 1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam | ||
| DyLight conjugated series | Thermo | 1/500 Donkey anti-(guinea-pig, mouse, rabbit or rat) as second antibodies |
References
- Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. Journal of Cell Science. 107, 3521-3534 (1994).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Gatti, M. Spindle assembly in Drosophila neuroblasts and ganglion mother cells. Nature Cell Biology. 2 (1), 54-56 (2000).
- Fabbretti, F., et al. Confocal Analysis of Nuclear Lamina Behavior during Male Meiosis and Spermatogenesis in Drosophila melanogaster. PLoS One. 11 (3), 0151231 (2016).
- Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinas-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-148 (1993).
- Hiller, M., et al. Testis-specific TAF homologs collaborate to control a tissue-specific transcription program. Development. 131 (21), 5297-5308 (2004).
- Chen, X., Hiller, M., Sancak, Y., Fuller, M. T. Tissue-specific TAFs counteract Polycomb to turn on terminal differentiation. Science. 310 (5749), 869-872 (2005).
- White-Cooper, H., Davidson, I. Unique aspects of transcription regulation in male germ cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), (2011).
- Luo, Y., Ahmad, E., Liu, S. T. MAD1: Kinetochore Receptors and Catalytic Mechanisms. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 51 (2018).
- Chen, R. H., Shevchenko, A., Mann, M., Murray, A. W. Spindle checkpoint protein Xmad1 recruits Xmad2 to unattached kinetochores. Journal of Cell Biology. 143 (2), 283-295 (1998).
- Campbell, M. S., Chan, G. K., Yen, T. J. Mitotic checkpoint proteins HsMAD1 and HsMAD2 are associated with nuclear pore complexes in interphase. Journal of Cell Science. 114, Pt 5 953-963 (2001).
- Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components. Molecular Biology of the Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).
- Raich, N., Mahmoudi, S., Emre, D., Karess, R. E. Mad1 influences interphase nucleoplasm organization and chromatin regulation in Drosophila. Open Biology. 8 (10), (2018).
- Chang, Y. J., Pi, H., Hsieh, C. C., Fuller, M. T. Smurf-mediated differential proteolysis generates dynamic BMP signaling in germline stem cells during Drosophila testis development. Developmental Biology. 383 (1), 106-120 (2013).
- Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).
- Zamore, P. D., Ma, S.
- Gigliotti, S., et al. Nup154, a new Drosophila gene essential for male and female gametogenesis is related to the nup155 vertebrate nucleoporin gene. Journal of Cell Biology. 142 (5), 1195-1207 (1998).
- Chen, H., Chen, X., Zheng, Y. The nuclear lamina regulates germline stem cell niche organization via modulation of EGFR signaling. Cell Stem Cell. 13 (1), 73-86 (2013).
- Fawcett, D. W., Chemes, H. E. Changes in distribution of nuclear pores during differentiation of the male germ cells. Tissue Cell. 11 (1), 147-162 (1979).
- Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224, Pt 3 213-232 (2006).
- White-Cooper, H. Tissue, cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis. Spermatogenesis. 2 (1), 11-22 (2012).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Immunostaining of Drosophila testes. 2011 (10), Cold Spring Harbor Protocols. 1273-1275 (2011).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. 2012 (1), Cold Spring Harbor Protocols. 102-104 (2012).
- White-Cooper, H. Spermatogenesis: analysis of meiosis and morphogenesis. Methods in Molecular Biology. 247, 45-75 (2004).
- Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis. Analytical Biochemistry. 436 (1), 55-64 (2013).
- Theofel, I., et al. tBRD-1 and tBRD-2 regulate expression of genes necessary for spermatid differentiation. Biology Open. 6 (4), 439-448 (2017).
- Trost, M., Blattner, A. C., Leo, S., Lehner, C. F. Drosophila dany is essential for transcriptional control and nuclear architecture in spermatocytes. Development. 143 (14), 2664-2676 (2016).
